PRODUÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E APLICAÇÃO DE

SÓLIDO FERMENTADO LIPÁSICO DE PENICILLIUM SP

NA OBTENÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS PELA HIDRÓLISE

DE ÓLEO DE ALGODÃO ASSISTIDO POR ULTRASSOM 

Universidade Estadual de CampinasFaculdade de Engenharia de AlimentosDepartamento de Ciências de Alimentos

Dr. Camilo Barroso TeixeiraProf. Dra. Gabriela Alves Macedo

(Orientadora)

Bioeconomia• Desenvolver processos limpos e eficientes para conversão de biomassa em produtos sustentáveis e de baixo custo como produtos biocombustíveis, químicos e farmacêuticos.

• Utilização de bioprocessos como meio de transformação;• Microrganismos e enzimas como principais biocatalisadores;• Desenvolvimento de uma economia verde e sustentável

 

Produção Agrícola Brasileira e Área para Plantio

Fonte: The economist, 2009.

Fermentação em Estado Sólido (FES)• Utiliza matrizes sólidas como meio de fermentação ou suporte;• Volume de água menor que a fermentação submersa;• Processo koji: Produção de molho de soja; produção de queijo 

roquerfort

Biocatálise: Lipase• Hidrolisa triacilglicerol e ligações ésteres; • Biossíntese: Esterificação, interesterificação • Detergentes, biodiesel, cosméticos e alimentos

Lipase

Pesquisa na área de Produção de Lipase por FES

Fonte: Scopus, 2015

BrasilÍndia

Paquistão

México

China

Malásia

Estados U

nidos

Canada

Hungria

57 57

13 126 5 5 4 4

Chart TitleDo

cum

ento

s pub

licad

os

(Sco

pus)

Ultrassom (US) • Ondas acústicas; • Melhoram a transferência de massa em sistemas homogêneos e

heterogêneos• A Cavitação gera alta energia localizada para catálise; • Aumentam taxas de conversão, diminuindo tempo de reação em

condições brandas de processo; • Permite a aplicação na extração de compostos bioativos de alimentos e

na catálise química e enzimática

Publicações com reações de lipase com US

Brasil China Índia Espanha Taiwan Estados Unidos Japão Nova

Zelândia Coré ia do Sul

0

5

10

15

20

25

2524

16

65

43 3 3

Chart Title

Axis Title

Scopus, 2015.

Objetivos• Selecionar uma nova linhagem fúngica brasileira produtora de lipase

e desenvolver um processo de fermentação em estado sólido (FES) utilizando subprodutos agroindustriais como matéria-prima e avaliação da hidrólise enzimática assistida por ultrassom do óleo de algodão.

• Seleção da linhagem, seleção de substrato e otimização da fermentação em estado sólido (FES).

• Caracterização bioquímica da enzima.• Avaliar a hidrólise do óleo de algodão usando PES em banho com agitação (Dubnoff) e por US. 

Metodologia Experimental

Capítulo 1 Produção de lipase por FES

• Seleção do substrato sólido;• Otimização dos parâmetros físicos; • Cinética para determinação do tempo ótimo de fermentação

Metodologia ExperimentalPré-inóculo

Inóculo

FES

Extração da Enzima

Atividade Enzimática

• Aplicação do desenho experimental de planejamento de misturas• Farelo  de  soja  e  de  algodão  foram  doados  pela  Bunge Brazil (Rondonópolis, Mato Grosso, Brasil) 

• Farelo de trigo (Natu’s)  foi comprado em mercado local (Campinas, São Paulo, Brasil)

• Farelo de trigo (0,45 R$/kg), farelo de algodão (0,61 R$/kg) e farelo de soja (0,86 R$/kg). 

• A  linhagem  de  Penicillium sp.  Foi  isolada  pela  Dr.  Luciana  Fleuri (UNESP – Botucatu, São Paulo, Brasil)

Seleção de Substrato

Penicillium sp.

Pré-inóculo Penicillium sp.

Foto tubos

PDA 30ºC

96 horas

Inóculo5mL água esterilizada

Solução inóculo

FES

FES250mL erlenmeyer com tampão de algodão1 mL de solução de inóculo10g de misturas padrões dos farelos10g água (1:1 farelo:água)

Câmara Climática96 Horas 30ºC 90% umidade

Extração da Enzima

2 horas 100mL água destilada

• Utilizado para determinar melhor formulação para uma mistura de componentes;

• Farelo de trigo, farelo de soja e farelo de algodão como variáveis inependentes;

• Atividade de lipase(U/mL) and Custo/Unidade (U$/10³U) como variáveis resposta;

• Avaliar e obter a mistura que maximize a atividade enzimática e minimize o custo;

Planejamento de misturas

Correlação de Nutrientes da Mistura

0 10 20 30 40 50 60 700

1

2

3

4

5

6

7

8f(x) = 0.418649110910553 x + 4.17669982517546R² = 0.736504491832492

f(x) = − 0.00214428398546514 x + 5.53275313014926R² = 0.000264885852191643

f(x) = 0.00849898003736057 x + 5.04735868010881R² = 0.00411201856358012

CarboidratosLinear (Carboidratos)ProteínaLinear (Proteína)LipídeosLinear (Lipídeos)

Concentração (%)

Ativi

dade

Lip

ase

(U/m

L)

ANOVAAtividade Lipase

(L)SQT GL QM F Ftab p R²

Modelo 936.066 2 468.0328 6.94 4.25 0.015007 0.6Erro Total 606.835 9 67.4261  

Falta de ajuste 553.759 7 79.1084 2.98 19.35 0.274104Erro puro 53.076 2 26.5382  

Total Ajustado 1542.901 11 140.2637  

Atividade Lipase (Q)

SQT GL QM F Ftab p R²

Modelo 1288.262 4 322.0656 8.85 4.12 0.007163 0.83Erro Total 254.638 7 36.3769  

Falta de ajuste 201.562 5 40.3124 1.51 19.29 0.442542Erro puro 53.076 2 26.5382  

Total Ajustado 1542.901 11 140.2637  

Custo/unidade (L)SQT GL QM F Ftab p R²

Modelo 0.000387 2 0.000193 10.33 4.25 0.004660 0.69

Erro Total 0.000168 9 0.000019  

Falta de ajuste 0.000163 7 0.000023 8.01 19.35 0.115318

Erro puro 0.000006 2 0.000003  

Total Ajustado 0.000555 11 0.000050 

Custo/unidade (L)SQT GL QM F Ftab p R²

Modelo 0.000540 5 0.000108 40.99 4.38 0.000146 0.97

Erro Total 0.000016 6 0.000003  

Falta de ajuste 0.000010 4 0.000002 0.86 19.24 0.599154

Erro puro 0.000006 2 0.000003  

Total Ajustado 0.000555 11 0.000050 

Superfícies de RespostaCusto/Unidade (U$/10³U)

Atividade Lipase (U/g)

Otimização

Avaliação dos Parâmetros Físicos

• Delineamento Central Composto Rotacional (DCCR) com pontos axiais e 3 repetições no ponto central totalizando 17 replicatas

• Variáveis independentes: Temperatura, Relação água/substrato, tamanho de partícula

• Variáveis resposta: Atividade lipase (U/mL), proteína (mg/mL)

ANOVAAtividade Lipase SQT GL QM Fcal

Ftabp

Regressão* 149.556 7 21.365 11.803 3.29 0.0006Resíduos 16.291 9 1.81      

Falta de ajuste 15.803 7 2.258 9.241 19.35 0.101Erro Puro 0.489 2 0.244      

Total 182.139 16        

R² 0.88     

Proteína SQT GL QM FcalFtab

pRegressão* 0.3221 4 0.10738 28.945 3.17 0.000005

Resíduos 0.0482 13 0.0037      

Falta de ajuste 0.0461 11 0.0041 4.061 19.40 0.214

Erro Puro 0.029356 2 0.01      

Total0.374889 16        

R² 0.84         

Superfícies de resposta (Atividade)

Superfícies de resposta (Proteína)

Otimização: Perfil Desejabilidade

Cinética e Otimização

Capítulo 2: Caracterização bioquímica

• Avaliar as características de performance da enzima:• Temperatura e pH ótimos • Temperatura e pH de Estabilidade• Especificidade (Tamanho de Cadeia)• Estabilidade em Solventes

Temperatura e pH ótimos e de estabilidade

Temperatura e pH ótimos e de estabilidadeDCCR 2² com pontos axiais e 3 repetições no ponto central Variáveis independentes: temperatura e pH

Variáveis resposta: atividade de lipase (U/mL) e estabilidade (4 horas)

Atividade da estabilidade medida nas condições ótimas

ANOVAAtividade Lipase SQT GL QM Fcal Ftab p

Regressão* 267.13 5 66.78 29.33 4.38 0.00044

Resíduos 13.66 6 2.28  

Falta de Ajuste 8.47 4 2.12 0.82 19.24 0.61538

Erro Puro 5.19 2 2.59  

Total 280.79 10  

R² 0.95          

Estabilidade SQT GL QM Fcal Ftab p

Regressão* 6658.467 4 2219.49 33.5588 4.12 0.00016

Resíduos 462.961 7 66.1373      

Falta de Ajuste 445.260 5 89.052 10.0617 19.29 0.09286

Erro Puro 17.701 2 8.85063      

Total 7121.428 10        

R² 0.94          

Caracterização (Atividade Ótima e Estabilidade)

Perfil de Desejabilidade

Especificidade (Tamanho de Cadeia)

Estabilidade em Solvente Orgânico

Capítulo 3. Avaliação da Hidrólise de Óleo de Algodão assistida por Ultrassom • Avaliar e comparar a performance do fermentado sólido de lipase (FSL) na hidrólise do óleo de algodão em banho com agitação e sob efeito de ultrassom.

• Obtenção do FSL: Após a fermentação, o meio foi retirado dos erlenmeyers e congelados sem nenhum tipo de tratamento; 

Hidrólise em banho DubnoffÓleo de algodão + tampão fosfato pH7 + pérolas de vidro

20 minutos 150 rpm 40ºC

Método de determinação da hidrólise do óleo• Hidrólise total do óleo: Método titulométrico (neutralização ácido-base)

• V = Volume de NaOH por amostra• M = Molaridade da solução de NaOH • Mm= Massa molecular do NaOH• m = massa de óleo da amostra• IS = índice de saponificação do óleo

ANOVAANOVA SQT GL QM Fcal

Ftab

p

Regressão*32.03532 3 10.6784 26.44

4.34

0.00034

Resíduos2.82704 7 0.40386

 

Falta de Ajuste 2.753495 0.5507 14.97

19.29

0.06378

Erro Puro 0.073552 0.03678

 

Total 34.86236 10 

R² 0.97  

   

 

 

Superfície de Resposta e Perfil de Desejabilidade

Hidrólise assistida por ultrassom

• Desruptor celular ultrasônico 19 kHz , 320 W de potência nominal (Unique, Indaiatuba, Brasil)

• Sonicação direta utilizando probe;• Sistema reacional composto por FSL, óleo de algodão e tampão fosfato pH7

Hidrólise assistida por ultrassom

Óleo de algodão

FSL

Tampão fosfato pH7

Sonda ultrasônica

Hidrólise assistida por ultrassom• (DCCR) 2³ com pontos axiais e 3 pontos centrais.• As variáveis independentes foram densidade de potência ultrassônica,

concentração enzimática e relação tampão/óleo de algodão. • Cada reação teve duração de 20 minutos. • Temperatura não controlada

ANOVAANOVA SQT GL QM Fcal Ftab p

Regressão*52.209 6 8.701 34.031

3.21

0.0000043

Resíduos2.556 10 0.255

 

Falta de Ajuste

2.272 80.284 1.996

19.37

0.376

Erro Puro 0.284 20.142

 

Total 54.766 16 

R² 0.95           

Superfície de Resposta

Perfil de Desejabilidade

Ultrassom X Banho com Agitação

Conclusão• Reações com US catalisadas por lipases podem representar uma possível integração das áreas de FES, oleoquímica e biocatálise;

• Planejamento de Misturas para formulação de meio e avaliação de custo unitário de produto

• Utilização do custo de matéria-prima como variável para otimizar formulação do meio

• Reação no US e no banho possuem perfis semelhantes com relação às variáveis [E] e relação tampão/óleo 

Agradecimentos: Laboratório de Bioprocessos-DEPAN e Laboratório de Bioquímica-DCA