APONTAMENTOS

TOXICOLOGIA E ANLISES TOXICOLGICAS

- Aulas Laboratoriais -

FACULDADE DE FARMCIA

UNIVERSIDADE DE COIMBRA

I- EXTRACO E IDENTIFICAO DE TXICOS

1 - Generalidades

No meio em que actualmente vivemos somos confrontados com uma vastido de produtos qumicos e biolgicos que, pela sua natureza, concentrao, modo de administrao, emprego, entre outros, podem desencadear reaces adversas ou txicas. Para contrariar essa toxicidade necessrio conhecer a natureza do composto txico, os seus efeitos e o seu antdoto. A pesquisa de um txico num meio compreende a sua extraco do meio e a sua identificao.

2 - Extraco

2.1. Introduo

Para promover um correcto isolamento de um veneno necessrio conhecer previamente a sua natureza, nomeadamente as suas propriedades fsico-qumicas (solubilidade e ionizao), grupos funcionais, etc. Um txico de natureza mineral isola-se destruindo o substrato orgnico que o acompanha por um processo de mineralizao. Se o txico de natureza complexa, orgnica ou mineral, deve-se ter em conta a sua solubilidade (ou dos seus derivados) em diferentes solventes, relativamente a outras substncias que o acompanham, bem como a polaridade da sua molcula sob a influncia de um campo elctrico. Txicos volteis, ou volatilizveis, so facilmente extrados do meio em que se encontram, por este ser normalmente fixo.

2.2. Separao de venenos volteis

A separao deste tipo de venenos das amostras de tecidos normalmente efectuada por destilao por arrastamento de vapor, substituda, na prtica, por uma destilao simples. O tecido, triturado e homogeneizado em gua destilada. A mistura acidificada com cido tartrico e colocada num aparelho de destilao pelo vapor. O destilado recolhido em 5 fraces (50 ml). Este mtodo permite isolar dos tecidos, lcoois, aldedos, teres, acetona, fenis, sulfureto de carbono, leos e hidrocarbonetos volteis, clorofrmio, cido ciandrico, entre outros.

Aps a recolha destas fraces (que vo sendo analisadas) deixa-se arrefecer o aparelho, alcaliniza-se o meio com magnsia e recomea-se a destilao recolhendo, pelo menos, mais duas fraces. Obtm-se, neste destilado, amnia, anilina, nicotina e outras bases volteis presentes nos tecidos.

2.3. Separao de venenos minerais

O resduo que permanece no balo de destilao aps a separao dos venenos volteis usado para a pesquisa de venenos metlicos. O primeiro passo a efectuar implica a destruio da matria orgnica por oxidao com cloro, cido ntrico, cido perclrico, entre outros. O tecido aquecido com o agente oxidante at a mistura ficar com uma consistncia fluida, cor amarela uniforme e sem partculas de matria orgnica. A mistura filtrada a quente e o resduo lavado com gua. O resduo apresenta prata, sob a forma de cloretos insolveis, chumbo, brio e estrncio sob a forma de sulfatos insolveis. O filtrado, que contm os restantes metais presumivelmente existentes na amostra, aquecido e o excesso de cloro removido por passagem atravs da soluo duma corrente de anidrido carbnico. A adio de sulfito de sdio, em quantidade suficiente para produzir um cheiro a anidrido sulfuroso, vai converter o arsnio pentavalente em arsnio trivalente. A mistura aquecida at que desaparea o cheiro a anidrido sulfuroso. Neutraliza-se o excesso de cido (caso exista) com carbonato de sdio, para no impedir a precipitao do antimnio e do estanho com uma corrente de gs sulfdrico. Coloca-se o filtrado num banho de gua mantendo-se a temperatura a cerca de 70 C. Faz-se passar pela soluo e durante pelo menos uma hora uma corrente de gs sulfdrico e deixa-se em repouso durante a noite. Este processo permite a precipitao do arsnio, antimnio, estanho, mercrio, chumbo, cobre, bismuto e cdmio, sob a forma de sulfuretos. O filtrado conter todos os restantes metais, todos os vestgios de chumbo e qualquer poro de brio e estrncio que no tenha sido retido no filtro sob a forma de sal insolvel. A separao e identificao dos vrios metais pode ser efectuada por mtodos qualitativos e quantitativos especficos. Em casos de suspeita de envenenamento por metais existem testes qualitativos extremamente rpidos e que podem servir para despiste. O Teste de Reinsch, aplicado em amostras contendo matria orgnica, permite a identificao dos venenos metlicos mais comuns e mais txicos: Hg, As, Sb, Bi. O Teste de Gutzeit um mtodo qualitativo bastante eficaz na pesquisa do arsnio e baseia-se no facto da arsina decompor o nitrato de prata com formao de prata metlica.

Outro processo de destruio da matria orgnica o da mineralizao por via seca (incinerao e calcinao). Este mtodo tem a vantagem de levar a uma concentrao mxima do txico e obteno de cinzas isentas de compostos orgnicos, com os metais sob a forma de carbonatos, no entanto, alm de ser moroso, pode ocasionar perdas importantes por volatilidade de alguns metais (Hg, Zn, Cd) e dos seus derivados (xidos de arsnio e cloretos de antimnio).

2.4. Separao de venenos orgnicos no volteis

Para a separao da maioria destes venenos necessrio preparar um extracto relativamente puro. Usa-se normalmente o mtodo de Stas-Otto-Ogier, com algumas modificaes, e que se fundamenta na solubilidade destes compostos em gua e no lcool absoluto em presena de uma pequena quantidade de cido. O lcool tem a vantagem de ser praticamente inerte quimicamente, apresentar uma grande pureza e uma miscibilidade total com a gua. Alm disso relativamente voltil, o que facilita a sua eliminao posterior, tem um fraco poder dissolvente em relao aos txicos, floculando as protenas e as gorduras. Este processo permite extrair os alcalides e outras substncias bsicas, os glucsidos e outros princpios neutros, os cidos orgnicos e os leos, gomas e resinas. A amostra dividida, to finamente quanto possvel, por triturao ou homogeneizao, acidificada e extrada com lcool a quente. O extracto alcolico concentrado at pequeno volume e diludo com gua, eliminando-se, por filtrao, a maior parte da matria gorda. O filtrado de novo concentrado at pequeno volume e extrado com etanol absoluto eliminando a maior parte dos constituintes dos tecidos, de modo que o novo filtrado, livre de protenas, hidratos de carbono, gorduras e sais minerais, possa ser novamente concentrado e fraccionado. As fraces, concentradas, so acidificadas e extradas com ter. O extracto etreo (ter cido) poder conter glicsidos, leos, pirotoxina, cido pcrico, cido saliclico, acetanilina, derivados do cido barbitrico e outros compostos de solubilidade semelhante. A soluo aquosa agora alcalinizada com hidrxido de sdio e de novo extrada com ter. O extracto etreo (ter alcalino) contm alcalides livres. No entanto, os alcalides que contm o grupo hidroxilo fenlico (como a morfina) no so extrados por este mtodo. necessrio acidificar novamente a fase aquosa, alcaliniz-la com amnia e extra-la com clorofrmio. Concluda esta fase, pode-se efectuar os mtodos de anlise qualitativa apropriados. Para a anlise quantitativa deve-se, se possvel, efectuar o ensaio directamente nos tecidos, ou tratar padres nas mesmas condies, uma vez que estes mtodos de extraco originam perdas de produto.

3 - Identificao

3.1. Ensaios prvios

Em Toxicologia no existe um s mtodo para proceder identificao primria e rpida de um txico desconhecido. O nmero de molculas de tal modo elevado que necessrio fazer uma pesquisa prvia de modo a prever o tipo de substncia em causa. O exame do local do acidente, a recolha de recipientes e de informaes relativas pessoa e ao local, entre outros, so dados que no podem ser descurados para um procedimento que se quer correcto e rpido, com resultados fiveis. A ausncia completa de dados prvios levaria a equacionar a possibilidade de um to grande nmero de substncias, que tornaria a sua identificao impossvel, pelo menos em tempo til. No entanto, por vezes necessrio efectuar um elevado nmero de anlises para se tentar encontrar a identidade da substncia em causa. Uma fonte principalmente eleita para efectuar essas anlises, nomeadamente pela quantidade disponvel, a urina. Outro factor a ter em conta o tempo que medeia a recolha da amostra e a sua anlise efectiva. Devem estas amostras serem correctamente armazenadas, nas condies de conservao ideais e que no permitam ou provoquem qualquer alterao das substncias. As amostras recolhidas, nomeadamente amostras de tecido, devem ser separadas em vrias fraces, de acordo com o tipo de testes a efectuar e de modo a manter pelo menos uma fraco de reserva, para prevenir qualquer anomalia ou confirmao dos resultados.

3.2. Identificao especfica

Aps conhecer, de um modo mais ou menos seguro, a substncia em causa, est-se em condies de recorrer a tcnicas emanadas das diversas reas cientficas: qumica analtica, farmacodinamia, etc. A escolha do mtodo ter de se basear nas caractersticas do prprio mtodo (reprodutibilidade, proporcionalidade, etc.), da disponibilidade do laboratrio que vai proceder anlise e do tempo que se dispe para a obteno dos resultados. Ter tambm de se ter em conta as caractersticas da prpria substncia, no que concerne ao seu comportamento farmacocintico.

3.3. Anlise de cidos e bases corrosivos

A identificao deste tipo de compostos vem muitas vezes dificultada pelo anterior uso de antdotos e pela sua instabilidade nos tecidos animais. Alm disso, a

concentrao de alguns ies, tais como o sdio, o potssio, os cloretos e os sulfatos, normalmente bastante elevada nas amostras biolgicas. O cido sulfrico pode ser detectado pela acidez invulgar, bem como com ensaios especficos para o io sulfato. Os cidos ntricos e clordricos podem ser concentrados por destilao. Os hidrxidos alcalinos e os carbonatos podem ser detectados por determinao do excesso de alcalinidade e pela presena de quantidades invulgares de sdio e potssio.

BARBITRICOS

1 - Introduo

O diagnstico desta intoxicao, quando no evidente, pode ser feito graas s pesquisas toxicolgicas no sangue e na urina. Embora os barbitricos no circulem livremente no plasma, a sua concentrao no sangue, pelo menos no incio da intoxicao, muito maior do que na urina, uma vez que a eliminao urinria fraca no incio da intoxicao; s depois da alcalinizao do organismo que a concentrao aumenta. O lquido de lavagem gstrico pode ser usado se no tiverem passado mais de 1-2 horas entre a ingesto da droga e a recolha do lquido. A escolha dos vrios mtodos a usar depende essencialmente do equipamento existente no laboratrio. A extraco pelo mtodo de Griffon e Le Breton, tanto para o sangue como para a urina, seguida de identificao do barbitrico em causa por cromatografia em camada fina (CCF) e a dosagem espectofotomtrica de UV esto ao alcance de qualquer laboratrio e so tcnicas rpidas e precisas. 1.1. Extraco e Purificao pelo Mtodo de Griffon e Le Breton

No almofariz, adicionar: 1 - Amostra: 20 ml de urina 2 - cido actico puro: V a X gotas (insolubiliza os barbitricos e evita a

passagem dos alcalides para o solvente orgnico. Tem o inconveniente de favorecer a passagem dos cidos gordos fisiolgicos e sobretudo dos cidos orgnicos medicamentosos cujos ies H+ podero ulteriormente interferir na espectroscopia no UV)

3 - Sulfato de sdio anidro: 35 g (promove a desidratao) Triturar lenta e progressivamente at obteno de uma mistura pulverulenta.

Preparar uma coluna de vidro introduzindo sucessivamente atravs de um tubo de vidro :

1 - Carvo vegetal activado pulverizado: 0,2 g (adsorve as impurezas e no os barbitricos)

2 - Magnsia calcinada: 0,2 g (neutraliza algum cido)

3 - Sulfato de sdio anidro: 2 g (desidratante)

4 - Mistura pulverulenta

5 - Sulfato de sdio anidro: 2 g (promove a desidratao, eliminando a fase aquosa e as impurezas que ela contm)

6 - Clorofrmio: o suficiente para impregnar toda a massa.

7 - Extrair com 30 ml de clorofrmio (gota-a-gota) de modo a que o solvente fique sempre 2 cm acima da massa.

Recolher o clorofrmio num matraz.

Nota O clorofrmio o solvente classicamente utilizado. O inconveniente que possui em formar emulses muito estveis em mtodos de extraco por agitao aqui anulado. Prefere-se ao ter (uma vez que este retm muita gua) e ao diclorometano (porque necessria uma grande quantidade).

1.2. Identificao por TLC

Aps extrair a amostra pelo mtodo de Griffon e Le Breton, evaporar o clorofrmio a presso reduzida e retomar o resduo em 0,5 ml de clorofrmio. Aplicar na placa (adsorvente: silica-gel com 0,25 mm de espessura) 3 manchas diferentes correspondentes a 20, 100 e 200 l da soluo clorofrmica (as concentraes ptimas de barbitricos para uma boa separao situam-se entre os 100 e os 200 mg). Ao lados das manchas que contm o produto a identificar, colocar depsitos de 40 l das solues padro (solues de 5 mg de barbitrico por ml de clorofrmio ou gua no caso de no serem solveis). Proceder ao desenvolvimento (eluente: clorofrmio 90 ml; acetona 10 ml) at o eluente ter migrado 15 cm. Marcar imediatamente a frente do solvente. Revelao - pulverizar as placas uniformemente com soluo de sulfato de mercrio (xido amarelo de mercrio 5 g, gua destilada 100 ml, cido sulfrico concentrado 20 ml, quando todo o xido de mercrio estiver dissolvido, completar para 250 ml; este reagente mantm-se 15 dias). Os barbitricos aparecem sob a forma de manchas brancas sobre um fundo cinzento claro. Uma segunda revelao, efectuada sobre o mesmo cromatograma, com soluo de difenilcarbazona (dissolver 10 mg de difenilcarbazona em 100 ml de clorofrmio; mantm-se 15 dias ao abrigo da luz), cora os barbitricos de azul ou violeta. Marcar o contorno das manchas e determinar os valores de Rf a partir do centro da mancha observada. Fazer a identificao, por comparao com os valores de Rf dos padres e com o tipo de mancha.

1.3. Dosagem dos barbitricos

Fundamento A dosagem efectuada pela medida de absoro diferencial a 260 nm para cada uma das duas formas ionizadas. A simples medida de intensidade de absoro a 260 nm num resduo de extraco a pH 13 proporcional ao teor em barbitricos, mas tem um erro por excesso devido presena de impurezas extradas conjuntamente. Eliminam-se estas interferncias operando por uma dupla medida a pH 10. Nestas condies a absoro devida aos barbitricos no a mesma, enquanto que a absoro de base dos extractos biolgicos idntica. Elimina-se esta interferncia fazendo a diferena entre os dois valores de pH.

Tcnica A extraco feita pelo mtodo de Griffon e Le Breton. Retoma-se o resduo com 2 x 25 ml de clorofrmio e rene-se o total numa ampola de decantao. Lava-se a fase orgnica com 2 x 5 ml de tampo fosfato pH 7,4 rejeitar de cada vez a fase aquosa superior. Juntar soluo clorofrmica contida na ampola, 5 ml de soda 0,45 N. Agita-se vigorosamente durante 5 minutos e recolhe-se a fase aquosa (superior) para tubo de centrfuga de 20 ml. Repetir o processo de extraco por mais duas vezes. Centrifugar os 15 ml de soluo sdica (indispensvel para impedir a absoro de vestgios de emulso do clorofrmio, que absorve no UV a 239 nm). Tomar 2 ml desta soluo, juntar 2 ml de soda 0,45 N (2 ionizao a pH 13-14) e agitar. Medir a absorvncia entre 230 e 270 nm contra um testemunho de soda 0,45 N. Este espectro deve apresentar um mximo a 252-255 nm e um mnimo 234-237 nm. Tomar mais 2 ml da soluo centrifugada, adicionar 2 ml de cido brico 0,6 M (1 ionizao a pH 9,8-10,5) e agitar. Medir a absorvncia entre 230 e 270 nm, contra um testemunho constitudo por 2 ml de soda 0,45 N e 2 ml de cido brico 0,6 M. Este espectro deve apresentar um mximo a 238-240nm e no deve ter um mnimo entre 240 e 270 nm. Os dois espectros devem apresentar 2 pontos de intercepo a cerca de 230 e 250 nm. Estes 5 pontos atrs referidos so caractersticos dos diversos barbitricos dissubstitudos.

Padronizao

Fazer as seguintes diluies em tubo de ensaio:

Sol. de Barbitrico a 500 mg/l (ml) 2 1 0,8 0,4 0,2 0

Sangue heparinado proveniente dum indivduo que

no recebeu qualquer teraputica (ml)

8 9 9,2 9,6 9,8 10

Concentrao de barbitrico no sangue (mg/l) 100 50 40 20 10 0

Medir a absoro diferencial a 260 nm, como para a dosagem partindo de 10 ml das diversas diluies. Traar a curva padro em - mg de barbitrico / litro.

Resultados

As doses teraputicas variam entre 1 e 10 mg de barbitrico por litro de sangue. As doses txicas, variam com o tipo de barbitrico (tanto maior quanto mais lenta for a sua aco) so geralmente 10 vezes a dose teraputica. A eliminao urinria depende do pH. Valores inferiores a 50 mg/l podem, por alcalinizao, ser aumentadas para 300 mg/l. Notas

- As propriedades espectrais dos barbitricos dependem dos 2 grupos NH, entre os 3

grupos C=O. Os barbitricos substitudos no azoto no possuem, logicamente, 2

ionizao.

- A extraco em meio cido impede a extraco de aminas, como a fenotiazina, mas

faculta a extraco dos cidos orgnicos, como o saliclico que possui um espectro de

UV intenso entre 230 e 260 nm. Os cidos so, no entanto, eliminados lavando a fase

orgnica com tampo fosfato.

CIDO CIANDRICO E CIANETOS

1 - O cido ciandrico e cianetos

O cido ciandrico (cido prssico) , de entre todos os venenos, o mais rpido e mais violento devido ao efeito do io cianeto, extremamente txico. Os cianetos so facilmente hidrolizveis (formao de hidrxidos mais ou menos custicos) e facilmente decomponveis pelos cidos (mesmo pelos mais fracos como o carbnico). Assim, os cianetos conservam-se mal ao ar ocorrendo:

a) libertao de HCN gasoso, b) alcalinizao e carbonatao de onde vem a aco custica e a perda de toxicidade ao longo do tempo.

Os cianetos mais importantes so os de potssio e de sdio (solveis em gua) e os de zinco, chumbo, cobre e prata (insolveis), e o cianeto de mercrio (muito txico). Os cianetos complexos so numerosos. O agrupamento CN- satura com uma grande afinidade as valncias de coordenao dos metais com formao de complexos metlicos sendo assim dissimulado. Os complexos tm uma toxicidade relativamente baixa.

2 - Introduo

O odor ciandrico (amndoas amargas) facilmente notado em amostras que contm estes compostos. No entanto, este odor pode desaparecer por hidrlise ou oxidao do cido ciandrico em amostras expostas ao ar. Pode tambm no ser detectado, uma vez que uma em cada quatro pessoas devido a um defeito gentico, no detecta o cheiro. Nestes casos, a amostra deve ser extrada com gua destilada e o extracto verificado com papel de tornassol. Se a reaco for alcalina (positiva) deve ser confirmada com o teste do azul da Prssia. As amostras devem ser colocadas, pelo mdico que realiza a autpsia, em frascos de vidro devidamente selados e enviadas ao laboratrio sem demora. Se possvel os exames devem fazer-se imediatamente, uma vez que as possibilidades de identificao diminuem com o tempo, devido volatilidade do cido ciandrico, possibilidade de combinao com outros compostos e ainda facilidade com que se hidroliza. Como as doses letais so mnimas, e o tempo que medeia entre a ingesto e a morte curto, no vulgar fazer anlises em produtos excretados. Pelo contrrio, no estmago e na primeira parte do intestino que se encontra a maior parte do veneno aps a morte. Alm do estmago e duodeno, as anlises podem ser feitas no sangue, nos rgos ricos em sangue e, em casos de suspeita de intoxicao por inalao, nos

pulmes. frequente ainda fazer as anlises em produtos alimentares suspeitos (o caso desta aula, em que se analisa uma farinha) que permite a identificao correcta e definitiva da substncia em causa.

3 - Ensaios prvios

3.1. Pesquisa de ferricianetos alcalinos

Fundamento

Em meio cido, o ferricianeto alcalino liberta o anio que, com o sulfato ferroso,

origina o azul de Turnbull (ferricianeto ferroso), mais ntido em meio clordrico.

K3Fe(CN)6 ------> [Fe(CN)63- + 3K+

Fe(CN)63- + Fe2+ ------> Fe3[Fe(CN)6]2 (Azul de Turnbull)

Tcnica 1- Num tubo de ensaio adicionar um pouco de amostra lquida.

2- Adicionar alguns cristais de sulfato ferroso, aquecer ligeiramente e juntar umas

gotas de HCl.

A formao de uma cor azul esverdeada traduz a presena de ferricianetos alcalinos

3.2. Pesquisa de ferrocianetos alcalinos

Fundamento

Em meio cido, o ferrocianeto alcalino liberta o anio que, com o cloreto frrico

origina o azul da Prssia (ferrocianeto frrico), mais ntido em meio clordrico.

K4Fe(CN)6 ------> [Fe(CN)64- + 4 K+

Fe(CN)64- + Fe3+ -----> Fe4[Fe(CN)6]3 (Azul da Prssia)

Tcnica

1- Num tubo de ensaio deitar um pouco de amostra lquida.

2- Adicionar uns cristais de cloreto frrico, aquecer ligeiramente e juntar umas gotas

de HCl.

A formao de uma cor azul traduz a presena de ferrocianetos alcalinos. Por vezes

forma-se uma cor esverdeada que resulta da mistura da cor azul do precipitado com

a cor amarela da soluo. Por filtrao pode ver-se o precipitado azul.

3.3. Pesquisa de cianeto de mercrio

Fundamento

O cianeto de mercrio solvel em gua quente. Por aco do gs sulfdrico d um

precipitado branco de sulfureto de mercrio que imediatamente passa a negro e que

insolvel em cido aztico e solvel em gua-rgia.

Hg(CN)2 + H2S -----> HgS + 2 HCN

Tcnica

1- Tomar um pouco de amostra lquida para um tubo de ensaio e aquecer.

2- Fazer borbulhar atravs da amostra uma corrente de gs sulfdrico.

FeS + 2HCl -----> FeCl2 + H2S

Se o cianeto de mercrio estiver presente, forma-se um precipitado branco que

enegrece rapidamente passando por amarelo. 3- Confirmar a insolubilidade do precipitado em HNO3 e a solubilidade em gua-

rgia (HCl conc. + HNO3 conc. 1:1).

Em amostras que contm cianeto de mercrio, o uso de gs sulfdrico permite libertar o HCN.

4 - Destilao (Isolamento do cido ciandrico)

4.1. Notas

Para a determinao qualitativa e quantitativa do cido ciandrico e cianetos tem

de se proceder ao seu isolamento, por destilao simples. Esta destilao, que se

deve efectuar logo que se receba a amostra, pode ter trs causas de erro que, no

entanto, podem ser eliminadas.

1- Se existirem ferri ou ferrocianetos alcalinos, estes, por aco do cido tartrico,

libertam HCN que recolhido no destilado. Como estes compostos so pouco ou

nada txicos, o resultado viria assim alterado por excesso.

2- Se a amostra possuir cianeto de mercrio, que duplamente txico (cianeto e

mercrio), mas como no se decompe pelo cido tartrico, somos levados a

concluir que o produto no txico.

3- Pelos motivos apresentados, muito importante fazer as anlises de pesquisa atrs

referidas.

Se a amostra tiver ferro ou ferricianetos, e para os fixar segundo as reaces atrs

descritas, deve juntar-se respectivamente sal frrico ou ferroso antes da destilao.

Se a amostra tiver cianeto de mercrio, adicionar alguns mililitros de gua

sulfdrica recentemente preparada. O cianeto decompor-se- totalmente e passa

para o destilado sob a forma de cido ciandrico

4- Por vezes os ensaios prvios so positivos e os resultados dos testes no destilado

so negativos. Pode-se admitir a hiptese de ter havido uma grande diluio.

Deve-se fazer nova destilao (a partir do destilado inicial) num aparelho

rectificador.

4.2. Destilao

Fundamento

O cido ciandrico, em soluo cida, arrastado pelo vapor de gua. O cido tartrico que tem por fim acidificar o meio, usa-se por ser um cido fixo no passando para o destilado. Alm disso, ao contrrio de outros cidos minerais fortes, no decompe os txicos.

Tcnica

1- Tomar um pouco de amostra (4 g) para um balo, adicionar gua destilada, suficiente para evitar ebulio tumultuosa e carbonizao da amostra (200ml) e cido tartrico a 5%, suficiente para acidular. 2- Fazer a destilao, recolhendo o destilado num balo, onde se coloca previamente gua destilada e onde se mergulha o tubo de recolha, de modo a evitar que se percam as primeiras pores de HCN. Destilar cerca de metade do volume. 3- Com a gua de lavagem do condensador e da alonga, completar o volume de 200 ml e proceder aos ensaios qualitativos e de dosagem.

Para evitar qualquer perda de HCN, o destilado deve ser recolhido em banho de gelo ou mesmo em NaOH 10%.

5 - Ensaios de pesquisa do cido ciandrico e cianetos no destilado

5.1. Reaco do azul da Prssia

Fundamento

Em presena de hidrxido de potssio o cido ciandrico transforma-se em cianeto de

potssio. O cianeto formado, reagindo com o sulfato ferroso d origem ao

ferrocianeto de potssio e este, por aco do cloreto frrico, origina o azul da Prssia.

HCN + KOH --------> KCN + H2O 6 CN- + Fe2+ -------> Fe(CN)64-

4 K4Fe(CN)6 + 4 Fe3+ --------> Fe4[Fe(CN)6]3 (Azul da Prssia)

Como se junta ao destilado um excesso de KOH, os sais de ferro precipitam sob a

forma de xidos de ferro de cor esverdeada o que dificulta a observao do azul da

Prssia. Para facilitar a observao, adiciona-se cido clordrico, que dissolve os

xidos. No entanto, a adio de muito cido pode levar a que a soluo fique

amarela.

Tcnica

1 - Ao destilado, juntar soluo de KOH 50% em excesso para tornar a soluo

alcalina.

2 - Juntar 0,5 ml de soluo recente de sulfato ferroso a 10% e 0,5 ml de soluo de

cloreto frrico a 10%. Agitar e aquecer suavemente. Arrefecer.

3 - Juntar HCl conc. gota-a-gota at dissolver o pp. castanho que se forma.

Se estiver presente HCN formar-se- um precipitado de azul da Prssia.

Se o HCN estiver muito diludo, a cor azul apenas se observa ao fim de 1-2 horas.

5.2. Reaco do azul da Prssia modificada por Cheele

Fundamento

Anlogo ao ensaio anterior, mas a sensibilidade muito aumentada por controlo dos

valores de pH. A alcalinidade em vez de ser conferida pelo KOH, dada pelo

carbonato de sdio, evitando assim a formao de xidos de ferro.

Tcnica

1 - Ao destilado, juntar I gota de soluo alcolica de fenolfetalena a 1% (Incolor

em soluo cida e rosa em soluo alcalina).

2 - Juntar cido sulfrico a 5% at que o lquido fique incolor.

3 - Alcalinizar a soluo por adio dum excesso de carbonato de sdio a 10%, at

que a cor vire de novo para rosa.

4 - Juntar III a IV gotas de soluo recente de sulfato ferroso a 10%, misturar bem e

deixar em repouso durante alguns minutos. Juntar I-II gotas de cloreto frrico a 10%.

5 - Misturar e acidificar com HCl conc. At tornar a soluo lmpida (dissolve alguns xidos formados).

A cor azul, em caso de solues diludas pode demorar um pouco a aparecer.

A sensibilidade pode ser aumentada adicionando I gota de cloreto de brio a 10%. O

cloreto de brio separa-se imediatamente e adsorve o azul da Prssia que, depois de

alguns minutos, aparece no fundo do tubo sob a forma dum precipitado branco

azulado.

5.3. Teste com acetato de cobre-acetato de benzidina

Fundamento

Os sais de cobre reagem com a benzidina, em presena de cianetos e halogenetos,

para dar azul de benzidina.

A reaco tem lugar porque o potencial de oxidao dos ies de cobre II aumenta

quando os ies de cobre I resultantes so gastos na formao do cianeto cuproso

insolvel.

Consequentemente, fazendo actuar o cido ciandrico sobre uma soluo de acetato

de cobre - acetato de benzidina, h desenvolvimento instantneo de cor azul.

Tcnica

1- Misturar I gota de soluo em ensaio com I gota de reagente (sol. de acetato de cobre/

acetato de benzidina) numa placa de reaco.

H formao instantnea de cor azul.

5.4. Teste com iodo

Fundamento

O cido ciandrico combina-se com o iodo para formar o iodeto de cianognio,

incolor:

HCN + I2 --------> HI + CNI

Consequentemente, quando o cido se liberta dos cianetos e actua sobre o papel de amido iodetado, azul, a cor desaparece.

Tcnica

1- Deitar I gota de soluo em ensaio numa tira de papel de amido iodetado (mergulhar

as tiras de papel de amido numa soluo de iodo N/100).

A cor azul do papel desaparece.

6 - Dosagem do cido ciandrico no destilado

6.1. Mtodo ciano-argentimtrico de Denigs

Fundamento

Ao juntar AgNO3 a uma soluo aquosa de cianeto, forma-se quantitativamente o

complexo argentocinico:

2 CN- + Ag+ --------> Ag(CN)2-

que solvel em amnia com formao de argentocianato de amnio.

2 CN- + NH4+ + Ag+ -------> Ag(CN)2NH4

Por sua vez, o iodeto de prata precipita em meio amoniacal. O ponto termo ento dado pela turvao devida formao duma nuvem opalescente branco azulada de iodeto de prata:

AgNO3 + KI --------> AgI + KNO3

Tcnica

1 - Tomar 25 ml de destilado para o balo Erlenmeyer.

2 - Juntar 2 ml de amnia conc. e 1 ml de sol. de iodeto de potssio a 10%.

3 - Titular com soluo de nitrato de prata N/200, at aparecimento duma turvao

permanente.

Para se obterem bons resultados, a soluo titulante deve ser adicionada

cuidadosamente prximo do ponto termo. Este mais evidente quando a titulao

realizada na semi-obscuridade fazendo-se passar um feixe de luz horizontalmente

atravs da soluo, ou, mais simplesmente, realizando a titulao sobre fundo escuro.

Clculos:

1000 ml AgNO3 N --------------- 2 x 27 = 54 g HCN

1 ml AgNO3 N/200 -------------- 0,00027 g HCN

n ml AgNO3 N/200 -------------- n x 0,00027 g HCN

n x 0,00027 g HCN ----------------- 25 ml

X g HCN -------------------------- 200 ml

Partimos de 4 g de farinha para a destilao e recolhemos 200ml de destilado. Os resultados devem vir em g de HCN / 100 g de produto. Nota: As farinhas no devem libertar mais do que 0,01g de HCN por 100g de farinha.

6.2. Mtodo de Aldridge

Fundamento

um mtodo de dosagem do cido ciandrico muito sensvel, que se baseia na

reaco de Koenig, e aplicvel a material biolgico (urina, saliva, sangue, plasma ou

soro).

O cianeto convertido a brometo de cianognio pela gua de bromo.

A piridina, em meio alcalino, forma com o brometo de cianognio um sal de

piridnio. A adio a este derivado duma amina aromtica primria abre o ciclo

piridnico entre o azoto e o carbono D com formao dum derivado do aldedo

glutacnico intensamente corado.

As reaces que se seguem traduzem o fundamento:

A natureza e a sensibilidade da cor esto na dependncia da amina aromtica posta

em jogo, sendo a amina mais prtica a benzidina que permite a obteno duma cor

alaranjada.

Tcnica 1- A 6ml do destilado (ou duma diluio na soda 0,1N), juntar sucessivamente:

- 0,5 ml de cido actico conc.

-2 ml de gua de bromo saturada (preparada recentemente)

2- Deixar em banho-maria gelado durante 10 minutos

3- Juntar, agitando:

- 2,5 ml de soluo de arsenito de sdio (3g de meta-arsenito de sdio em 100ml de NaOH N/5)

- 4 ml de soluo de piridina-benzidina [18ml de piridina em 12ml de gua destilada, 3ml de cido clordrico conc., 10ml de sol. de benzidina (0,560g de cloridrato de benzidina em

50ml de HCl N/2)]

- 5 ml de etanol a 95

4- Deixar desenvolver a cor durante 30 minutos na obscuridade e ler a sua

intensidade de cor no espectrofotmetro a O 510 nm, em relao a um testemunho preparado nas mesmas condies.

5- Comparar os resultados obtidos com uma curva de calibrao previamente

traada.

6-.Este mtodo muito sensvel e a curva de calibrao realizada com quantidades

de cido ciandrico entre 0 e 6Pg (para a preparao da curva-padro, partir de uma soluo contendo 1Pg HCN / 1ml de gua).

Nota

Na ausncia de tiocianatos (que reagem de modo semelhante) pode o processo

realizar-se na urina e saliva sem tratamento preliminar, ou no sangue, plasma e soro

depois de desproteinizado pelo cido tricloroactico (1ml de sangue tratado com 2ml de

cido tricloroactico a 5%). Uma vez que o cido tiocinico no voltil mais seguro

separar o cido ciandrico por destilao.

LCOOL METLICO

1 - Introduo

A pesquisa toxicolgica do lcool metlico pode efectuar-se no sangue, tecidos (essencialmente fgado e intestinos), contedo estomacal, vinhos, aguardentes e outros lquidos suspeitos, ar, etc. A amostra a analisar acidulada com cido tartrico e gua destilada para a tornar fluida, destilando-se em seguida.

2 - Ensaios de pesquisa

2.1. Tcnica de Denigs

Fundamento

O lcool metlico reduz muito rapidamente a soluo de permanganato de potssio a

1:1000 em meio cido, oxidando-se a aldedo frmico (o lcool etlico oxida-se

muito lentamente):

2 (MnO4- + 8 H+ + 5 e- --------> Mn2+ + 4 H2O) 5 (CH3OH --------> HCHO + 2 H+ + 2 e-)

.

2 MnO4- + 16 H+ + 5 CH3OH --------> 2 Mn2+ + 8 H2O + 5 HCHO + 10 H+

O aldedo frmico produzido caracterizado pelo reagente de Schiff (fucsina

bissulfitada) ao qual restitui a cor violeta. O excesso de MnO4- que fica na soluo

reduzido pelo cido oxlico em meio sulfrico:

2 (MnO4- + 8 H+ + 5 e- ----------> Mn2+ + 4 H2O )

5 (C2O42- ----------> 2 CO2 + 2 e- ) .

2 MnO4- + 5 C2O42- + 16 H+ ----------> 2 Mn2+ + 10 CO2 + 8 H2O

Tcnica

1- Num tubo de ensaio deitar 2,5 ml do destilado e adicionar 0,5 ml da mistura oxidante (KMnO4 3g; H3PO4 85% 15 ml; gua destilada qbp 100 ml). 2- Aps 10 minutos temperatura ambiente, descorar com 1,5 ml de soluo de cido oxlico a 5% em cido sulfrico a 50%. 3- Juntar 2,5 ml de reagente de Schiff (fucsina bsica 0,2 g em 120 ml de gua destilada quente; arrefecer e juntar sulfito de sdio anidro 2 g dissolvido em 20 ml de gua destilada; por fim 2

ml de HCl concentrado) e esperar 10 minutos. A formao da cor violeta dentro de 10

minutos indica a presena de lcool metlico.

Notas e causas de erro:

Deve tratar-se uma amostra do destilado com reagente de Schiff sem prvia oxidao, para excluir a presena de aldedo frmico no original. Devem fazer-se outros testes do aldedo frmico para confirmao. Quando o teste realizado num destilado dum crebro fresco, uma reaco positiva pode ser interpretada com segurana como sendo uma reaco positiva ao metanol. A reaco positiva para qualquer aldedo mas s durvel para o aldedo frmico. A existncia de lcool etlico reduz a sensibilidade da tcnica de Denigs e o lquido submetido a este mtodo no deve conter mais de 5% de lcool etlico. Se contiver uma quantidade excessiva de lcool etlico, deve diluir-se a soluo, ou trabalhar com testemunhos constitudos por misturas tituladas de lcool etlico e metlico.

3 - Dosagem

3.1. Mtodo colorimtrico

Fundamento

O lcool em presena da soluo de permanganato de potssio em meio cido, sofre uma oxidao a aldedo frmico. O bissulfito de sdio tem uma aco anloga indicada para o cido oxlico na pesquisa. O cido cromotrpico em soluo cida concentrada liga-se ao aldedo originando um composto de cor prpura, com uma absoro ptima no comprimento de onda de O 570 nm. O cido estvel em meio sulfrico.

Tcnica

Oxidao a formaldedo

1- Em balo aferido de 10 ml mergulhado em banho de gelo, introduzir sucessivamente 2 ml de destilado, 0,5 ml de cido fosfrico a 85% e 0,05 ml de soluo aquosa de KMnO4 a 5%.

2- Deixar no banho de gelo durante 5 minutos, agitando ocasionalmente. 3- Descorar por adio de quantidade suficiente de soluo saturada de bissulfito de

sdio (HSO3Na) evitando qualquer excesso de reagente, o que poderia provocar uma

opalescncia ou um enfraquecimento da cor.

Dosagem espectrofotomtrica do aldedo frmico

4- Juntar por pequenas pores de 1 ml, arrefecendo depois de cada adio, 5 ml de

reagente cromotrpico (cido cromotrpico 5g/100ml em gua destilada. Na altura do emprego,

diluir 4 ml desta soluo com cido sulfrico 15 M, ou seja a 80% em volume at perfazer 100 ml).

5- Levar a banho-maria fervente durante 30 minutos.

Desenvolve-se uma cor violeta estvel durante vrias horas e cuja intensidade

proporcional concentrao de aldedo frmico.

6- Arrefecer sob uma corrente de gua.

7- Completar os 10 ml com uma soluo de H2SO4 9M (ou seja a 48% em volume) e

determinar a sua intensidade de cor no espectrofotmetro a O 570 nm.

Nota Para a curva de calibrao usar metanol puro isento de acetona, purificado por

destilao sobre xido de clcio, rejeitar o primeiro 1/3 do destilado recolhendo as

fraces de 64,5 - 65 C.

Interpretao dos resultados

A dose txica varia com a susceptibilidade individual, mas devem considerar-se extremamente perigosos para a vida, nveis superiores a 80 mg / 100 ml de sangue. Valores superiores a 2,5 mg /100 ml j revelam metilismo.

Vantagens e causas de erro

Esta tcnica especfica do metanol em presena dos seus homlogos superiores.

perfeitamente aplicvel dosagem de pequenas quantidades de metanol em presena

de quantidades relativamente elevadas de lcool etlico.

Se j existir aldedo frmico no lquido a pesquisar comete-se um erro por excesso

(causa muito rara). Pode, no entanto, entrar-se com esse valor no clculo final, pelo

que conveniente pesquisar o aldedo frmico pr-existente (a omisso do passo da

oxidao torna o mtodo aplicvel ao formaldedo). Se houver uma oxidao

enrgica o lcool metlico passa a cido frmico, o que originaria um erro por

defeito.

FLOR

1 - Pesquisa de flor e fluoretos na gua

1.1. Com o reagente de BOER

Fundamento

Ao fazer a juno, em volumes iguais, das solues A (sol. aquosa de vermelho de alizarina S [sulfo-alizarinato de sdio] a 0,17 %) e B (sol. aquosa de cloreto de zircnio a 0,81 % [ou oxicloreto de zircnio a 0,9315 %]), que constituem o reagente de Ber, forma-se uma laca vermelho-violeta (complexo de alizarina-zircnio) cuja formao envolve a ligao, por adsoro qumica, da alizarina superfcie das partculas do sal de zircnio. Acontece que o flor e os fluoretos em soluo cida tm mais afinidade para o zircnio do que a alizarina pelo que a deslocam da laca, formando com o zircnio o anio complexo fluorado, incolor (ZrF6)2-.

A alizarina livre, em meio cido, tem cor amarela, e assim, a observao desta cor na soluo indica a presena de flor ou fluoretos.

Tcnica

1- Misturar num tubo de ensaio, alguns mililitros de gua em anlise com HCl concentrado. 2- Adicionar II a III gotas de reagente de Ber. 3- A formao de uma colorao amarela, indica a presena de flor ou fluoretos.

Nota

Estas reaces podem efectuar-se em papel:

a) Impregnar uma tira de papel de filtro com soluo de alizarina-zircnio. Secar.

b) Colocar no papel uma gota de cido actico a 5% e uma gota da gua em

anlise.

c) A cor vira para amarelo se existirem fluoretos. Se a quantidade de fluoretos for

muito pequena,

recomenda-se activar a reaco, aquecendo o papel no vapor de gua.

1.2. Reaco com a slica

Fundamento

A evaporao secura, da gua em anlise, tem por fim concentrar o flor. O sulfato de prata que se junta ao resduo elimina possveis cloretos existentes na gua que precipitam sob a forma de AgCl. O vidro, que constitudo por slica, e o flor originam fluoreto de silcio (SiF4),

voltil que vai atingir a gota de acetato de brio colocada no vidro de relgio.

O fluoreto de silcio, em contacto com a soluo aquosa de brio, d origem a cido

fluossilcico e a um precipitado de hidrxido de silcio que se dispe em anel volta

da gota.

3 SiF4 + 4 H2O ----------> Si(OH)4 + 2 H2SiF6.

Por sua vez, o cido fluossilcico reage com o acetato de brio, originando cristais

incolores de fluossilicato de brio, que podem observar-se ao microscpio.

2 CH3COO- + Ba2+ + H2SiF6 ----------> BaSiF6 + 2 CH3COOH.

Tcnica

1- Em cadinho de porcelana deitar 10-20 ml de gua em anlise e evaporar secura

em bico de Bunsen.

2- Juntar ao resduo um cristal de sulfato de prata e algum vidro pulverizado.

Misturar.

3- Adicionar um pouco de HCl concentrado.

4- Tapar com vidro de relgio, no qual se coloca previamente pela parte inferior, I

gota de soluo de acetato de brio 10%.

5- A presena de flor ou fluoretos revela-se por um anel de slica e na parte central,

cristais incolores de fluossilicato de brio visveis ao microscpio.

2 - Dosagem de flor e fluoretos na gua

2.1. Mtodo Espectrofotomtrico

Fundamento

Formao do complexo flor-zircnio e libertao de alizarina, como j foi descrito

no mtodo de pesquisa com o reagente de Ber.

Tcnica

1- Numa srie de 6 tubos de ensaio proceder de acordo com a tabela seguinte.

2- A soluo me de NaF deve conter 0,1 mg flor / ml, (dissolver 0,221 g de fluoreto de

sdio em gua e completar o volume para um litro).

Soluo Me gua em anlise HCl conc. Reag. de BOER gua destilada Tubo 1 2ml 1ml 1ml 11ml Tubo 2 4ml 1ml 1ml 9ml Tubo 3 6ml 1ml 1ml 7ml Tubo 4 8ml 1ml 1ml 5ml Tubo 5 10ml 1ml 1ml 3ml Tubo 6 10ml 1ml 1ml 3ml

3- Agitar bem os tubos. Esperar 5 minutos e ler no espectrofotmetro U:V.,

Spectronic 20, a O 525nm. Referir os resultados em mg de flor por litro de gua

TESTE DE REINSCH

Permite a deteco de uma forma rpida e fcil, ainda que no definitiva, de certos metais, como o arsnio, mercrio, bismuto e antimnio (As, Hg, Bi, Sb), por deposio do metal superfcie de uma espiral de cobre, em solues fortemente cidas. A grande vantagem de que os metais podem assim ser separados dos fluidos e dos tecidos sem prvia destruio da matria orgnica.

Nota

a) - As espirais de cobre devem estar limpas e brilhantes (limpar com HCl ou HNO3

diludo 1:1).

b) - Este teste tambm pode aplicar-se a rgos finamente divididos, tais como o

fgado, rim, etc., sem prvia destruio da matria orgnica.

c) - A deposio de bismuto um pouco mais demorada.

d) - O As e o Hg podem encontrar-se por muitos dias na urina. Em exposies

crnicas, possvel encontr-los vrias semanas depois.

e) - Se o fio de cobre permanecer inalterado, pode concluir-se da ausncia de As, Sb,

Hg e Bi ou da sua presena em pequena quantidade.

f) - O aspecto do fio de cobre no pode aceitar-se como definitivo, mas to s como ponto de partida para mtodos de confirmao especficos.

Tcnica 1 - Num Erlenmeyer (ou num tubo de ensaio) contendo 20 ml de urina (ou contedo

gstrico, alimento, etc.), juntar 3 ml de HCl conc. (fazer paralelamente um ensaio em

branco com urina normal).

2 - Introduzir uma pequena espiral de cobre bem limpa e brilhante.

3 - Colocar em banho-maria fervente, durante cerca de uma hora. Evitar que entre em

ebulio para prevenir a evaporao. Se necessrio, o volume pode ser mantido com

HCl 10%.

4 - Interpretao dos resultados.

Metal Aspecto do fio de cobre Sensibilidade do teste (aprox.)

Sensibilidade

Arsnio Preto 0,010 mg % 0,5 g/ml Mercrio Prateado-brilhante 0,075 mg % 2,5 g/ml Bismuto Preto-acinzentado 0,030 mg % 1,0 g/ml Antimnio Preto-prpura brilhante 0,030 mg % 1,0 g/ml

Os resultados sero referidos como presena fraca, moderada, intensa ou negativo.

Confirmao dos resultados:

a) Mercrio (prateado brilhante)

Teste de Gettler: - Num vidro de relgio colocar uma rodela de papel de filtro,

depositar II gotas de iodeto cuproso e deixar a espiral de cobre com o depsito sobre

a mancha esperando entre 1 a 12 horas. Forma-se o iodeto mercrico cuproso de cor

salmo.

2 Cu2I2 + Hg2+ ----------> Cu2(HgI4) + Cu22+

b) Arsnio (preto)

Num tubo de ensaio colocar a espiral de cobre escurecida e X a XV gotas de KCN

10%. O depsito escuro dissolve-se aps alguns minutos se o arsnio estiver

presente.

Esta soluo ciandrica contm tambm (se estiverem presentes na amostra) selnio e

telrio.

O depsito de Hg, Bi e Sb no se dissolve.

O teste de Gutzeit, praticado na soluo depois de acidificada com cido sulfrico

10%, confirmar a presena de As.

c) Bismuto (preto acinzentado)

Coloque a espiral de cobre com o depsito preto num tubo de ensaio, II gotas de

soluo de NaHSO3 10% , X gotas de HNO3 15%. O depsito negro dissolve-se

aps 5 minutos se o bismuto estiver presente.

Os depsitos de Sb ou As no se dissolvem.

Retire a espiral adicione 1ml de reagente quinina - KI e agite.

Um precipitado laranja mais ou menos intenso indica a presena do bismuto.

A reaco especfica para o bismuto.

d) Antimnio (Preto-prpura brilhante)

Completamente diferente de a) e no reactivo a b) e c).

ARSNIO

O arsnio pode existir normalmente no solo e nos alimentos. Os seus derivados existem na indstria, nas artes e na fitofarmcia. As intoxicaes agudas podem ser causadas pela utilizao de arsnio com fins criminosos, da tentativa de suicdio e de acidentes diversos: alimentos (vinhos arsenicais, cervejas e alimentos inquinados); origem teraputica e outras (conservao de peles e animais embalsamados, luta contra parasitas agrcolas e calcinao industrial de minrios arsenferos). Na pesquisa e no doseamento de arsnio nos meios biolgicos, podem existir erros por defeito (volatilizao) e por excesso devido introduo de As pelos reagentes e pela presena de antimnio (d testes positivos). Na interpretao dos resultados das anlises deve considerar-se o arsnio normal, o arsnio impureza de substncias alimentares, o arsnio medicamentoso e o arsnio no solo.

1 - Pesquisa de arsnio na urina

1.1. Teste de BETTENDORF

Fundamento

Os compostos de arsnio trivalentes e pentavalentes so reduzidos a arsnio

elementar pelas solues de cloreto estanhoso fortemente acidificadas com cido

clordrico.

O arsnio separa-se sob a forma dum precipitado preto-acastanhado.

2 As5+ + 5 Sn2+ ----------> 2 As + 5 Sn4+

2 As3+ + 3 Sn2+ ----------> 2 As + 3 Sn4+

A reduo acelerada pelo aquecimento. S ocorre em soluo fortemente cida uma

vez que apenas os caties de arsnio reagem com o cloreto estanhoso.

Em solues fracamente cidas os caties no esto presentes devido reaco de

hidrlise:

As3+ + 3 H2O ----------> AsO33- + 6 H+

O tratamento com cloreto de magnsio em meio alcalino (amnia concentrada)

transforma o arsnio em Mg2As2O7 (piro-arsenato de magnsio), resistente ao calor,

pelo que pode ento preceder-se a um aquecimento intenso para nos libertarmos dos

sais de mercrio, volteis, no interferindo na reaco (nas condies do ensaio eles

tambm se reduzem ao estado metlico). O teste de Bettendorf bastante especfico

para o arsnio.

Tcnica

1 - Misturar num pequeno cadinho de porcelana 1ml de soluo em ensaio com I-II

gotas de amnia concentrada, I gota de perxido de hidrognio a 10% e I gota de

soluo de cloreto de magnsio a 10%.

2 - Evaporar a mistura lentamente e depois aquecer fortemente.

3 - Misturar o resduo com I-II gotas de soluo concentrada de cloreto estanhoso em

cido clordrico conc. e aquecer suavemente.

A formao de um precipitado ou de uma colorao preto-acastanhado indica a

presena de arsnio.

1.2. Teste de GUTZEIT

Fundamento

Por reaco de cido sulfrico diludo sobre o zinco, h libertao de hidrognio

nascente que, actuando sobre o AsO43- (composto oxigenado de arsnio), ou sobre o

arsnio noutros estados de oxidao, o reduz a arsina, que se desprende com o

excesso de hidrognio:

As O5 + 16 H+ ----------> As H3 + 5 H2O

H3AsO4 + 4 H2 ----------> AsH3 + 4 H2O

A arsina, em contacto com nitrato de prata, d um composto de substituio de cor

amarela que, em contacto com a gua, se torna imediatamente negra por formao de

prata metlica:

AsH3 +6 AgNO3 ----------> (Ag3As) (AgNO3)3 + 3 HNO3

(Ag3As). (AgNO3)3 + 2 H2O ----------> HAsO2 + 3 HNO3 + 6 Ag

Tcnica

1 - Num matraz de 100 ml deitar 3ml de soluo em ensaio. Misturar com alguns

gros de zinco e cido sulfrico diludo. (Praticar paralelamente um ensaio em

branco s com os reagentes).

2 - Colocar um tampo de algodo no colo do matraz e suspender uma tira de papel

de filtro embebida em soluo de nitrato de prata a 20%.

Na presena de arsnio, forma-se uma mancha negra.

2 - Dosagem do arsnio em material biolgico

2.1. Mtodo de GUTZEIT

- Aparelho de Gutzeit

Fundamento

O princpio em que se baseia esta tcnica, o da reaco da arsina proveniente dos

compostos oxigenados do arsnio com molibdato de amnio em condies

convenientes, e posteriormente reduzido pelo sulfato de hidrazina, com formao

dum complexo de molibdnio, fortemente corado de azul.

L de vidro

Balo de Digesto e Gerador

Cilindro de disperso com vidro poroso

Tcnica

A) DIGESTO - mineralizao

O balo do aparelho de Gutzeit pode servir como balo de digesto

1 - Colocar 5-10 ml de sangue, 25 ml de urina ou 5-10 g de tecido, no balo.

2 - Juntar 10 ml de cido ntrico concentrado, 4 ml de cido sulfrico concentrado e 5

ml de cido perclrico 60-70%.

3 - Colocar a mistura da digesto em banho de vapor por vrias horas at que se torne

homognea, transferir para uma placa de aquecimento e aquecer um pouco mais

fortemente at que se libertem fumos de cido perclrico (destruio da matria

orgnica).

4 - Se a mistura comear a ficar castanha, retire-a da placa de aquecimento, arrefea-

a e junte 5-10 ml de cido ntrico e 1-2 ml de cido perclrico. Continuar a aquecer

at que a mistura fique clara e ento aquecer fortemente at libertao de fumos de SO3. Arrefecer.

5 - Juntar 20 ml de gua e 0,1 g de NaHSO3.

6 - Aquecer no banho de vapor por 10 minutos e transferir depois a mistura para a placa quente aquecendo uma vez mais at libertao de fumos de SO3. A mistura, se

estiver clara e transparente, est pronta para a libertao de arsina depois de

arrefecida.

B) DESTILAO E DOSAGEM DO ARSNIO

Mtodo colorimtrico

1 - Adicionar 1 ml de soluo de SnCl2 40%, e 40 ml de gua

2 - Juntar 2 ml de KI a 15% mistura, deixar ficar 15 minutos antes de introduzir 5 g de grenalha de zinco activado com Cu SO4 e adaptar o cilindro de disperso do gs.

3 - Deixar borbulhar a arsina libertada por 1 hora atravs de 5 ml de soluo de iodo

0,001 N num tubo de ensaio introduzido em banho de gelo.

4 - Ao fim de 1 hora retirar o tubo com a mistura de iodo.

5 - Juntar 0,5 ml de soluo de molibdato de amnio (a 1% em H2SO4 5N) e 0,2 ml de

soluo de sulfato de hidrazina a15%. Misturar bem depois de cada adio

6 - Colocar a mistura num banho de gua fervente por 10 minutos, arrefecer e ler a

cor azul a 865 nm contra um branco de gua. A cor azul estvel por 24 horas. A

quantidade de arsnio na amostra determinada a partir duma curva previamente

calibrada de arsnio, preparada do mesmo modo.

Interpretao dos resultados

Concentraes aproximadas de Arsnio nos tecidos, expressas em mg/100 g,

segundo vrios autores

Fgado Rim Sangue Crebro Urina Cabelo

Adulto saudvel normal

0,001- 0,01 0,001- 0,01 0 - 0,0030 0,001 0,020-0,067

Tratado com arsenicais inorgnicos

-- -- 0,01 -0,025 -- 0,030 --

Tratado com arsenicais orgnicos

0,1 0,02 0,1 -- -- --

Envenenamento arsenical agudo

1 - 50 0,5 - 15 0,1 - 1,5 0,05 - 2,0 0,008 - 0,5

CROMATOGRAFIA

1 Generalidades

2 - Anlise

2 1- Anlise Qualitativa

A identificao de uma amostra por cromatografia GL ou HPLC baseia-se no facto de, sob idnticas condies de trabalho, os valores de reteno de uma dada substncia manterem-se constantes. O tempo de reteno de cada um dos componentes, ou seja, o tempo que decorre desde a injeco da amostra e a sada da concentrao mxima do composto, uma constante fsica para determinado componente em condies bem definidas. Este tempo, que depende exclusivamente do coeficiente de partilha entre a fase mvel e a fase estacionria, pode ser modificado por alterao de certos parmetros consoante o tipo de cromatografia GL ou HPLC. Para que a identificao possa ser possvel, os padres devem ser analisados nas mesmas condies da amostra. Deve, no entanto, notar-se que uma simples anlise de cromatografia no identifica completamente uma determinada amostra, uma vez que existe uma possibilidade real de substncias diferentes apresentarem comportamento cromatogrfico idntico para um dado sistema, sobretudo quando a origem e composio da amostra so desconhecidas. Informao mais positiva obtida pela repetio da anlise (amostra e padro), em outra coluna de polaridade diferente da primeira, (ou fazendo variar qualquer outro parmetro que influencie o tempo de reteno), uma vez que bem mais raro o fenmeno de duas substncias se comportarem identicamente em condies diferentes. Porm a identificao definitiva e inequvoca de determinada substncia s ser possvel usando um conjunto de mtodos analticos, como por exemplo, outros mtodos cromatogrficos, mtodos espectrofotomtricos de I.V., R.M.N. ou pelo acoplamento da cromatografia a outras tcnicas, como por ex. , espectrometria de massa GC-MS, LC-MS, a espectroscopia de radiao infravermelha GC-FTIR, LC-FTIR entre outras.

2.2 - Anlise quantitativa

Aps optimizar as condies de anlise, ter identificado os constituintes da amostra, procede-se quantificao de um ou de todos os seus componentes, por um dos seguintes mtodos:

A - Mtodo da normalizao de reas: A rea de cada pico calculada e directamente traduzida em percentagem da soma das reas de todos os picos. Mtodo simples, rpido e independente do tamanho da amostra. Mas no tomada em considerao a resposta especfica do detector a cada uma das substncias. um mtodo aproximativo.

B - Mtodo da normalizao de reas corrigidas. Os valores obtidos so de boa reprodutibilidade. Mas exige a avaliao e correco das reas de todos os picos do cromatograma. Pressupe a eluio e deteco de todos os componentes.

C - Mtodo do padro interno: A substncia padro adicionada amostra em anlise. Esta substncia deve ser inerte, miscvel com a amostra, originar um nico pico e ter um tempo de reteno diferente do(s) da amostra mas bem separado. Este mtodo tem a vantagem de poder ser usado quando a natureza da amostra a analisar desconhecida, podendo no serem eludos ou detectados todos os seus componentes. No to vulnervel ao tamanho da amostra e estabilidade das condies de anlise. A desvantagem prende-se com o facto da quantidade de padro adicionado influenciar os resultados.

D - Mtodo do padro externo: Preparam-se e analisam-se quantidades conhecidas de padres e calcula-se a resposta absoluta do detector para cada padro com base na relao entre a rea e a concentrao, referente a cada um. Como vantagem deste mtodo destaca-se o facto de apenas se considerarem a eluio e deteco dos compostos que interessam. No entanto, tem que se controlar com grande exactido, quer o tamanho, quer a concentrao da amostra injectada.

3 - Validao de Mtodos Cromatogrficos

A validao de um mtodo analtico o processo que, baseado em estudos de laboratrio, permite garantir a qualidade dos resultados obtidos por esse mtodo. O protocolo composto geralmente por 3 passos: (Ver ANEXO 1)

A - Aferio de instrumentos e calibrao do equipamento.

B - Padronizao analtica (linearidade, especificidade, limite de deteco, limite de quantificao, exactido, preciso, recuperao, estabilidade).

C - Controlo de qualidade.

4 - Anlise de lcoois por Cromatografia Gs-Lquido (GC)

5 - Anlise de pesticidas por Cromatografia Lquida de Alta Presso (HPLC)

DETERMINAO DE LCOOIS POR CROMATOGRAFIA

GASOSA

INTRODUO O diagnstico e tratamento de envenenamentos acidentais ou intencionais, aps ingesto de metanol, isopropanol, etanol ou etilenoglicol requerem mtodos de anlise rpidos e sensveis. Existem na literatura numerosos mtodos para a determinao de etanol em amostras biolgicas, desde qumicos, enzimticos, cromatogrficos, assim como os de deteco electroqumica (utilizados nos aparelhos para deteco da taxa de alcoolmia em condutores de veculos). A cromatografia gasosa a mais utilizada e considerada como o mtodo de referncia. A injeco directa e de fase de vapor (head-space) so as tcnicas mais comuns na determinao de compostos volteis, sendo a de fase vapor a de maior preciso e exactido. A cromatografia gasosa igualmente uma tcnica bastante utilizada na determinao do teor alcolico de bebidas alcolicas e na verificao de contaminaes ou fraudes. Duma maneira geral, as metodologias utilizadas para a sua determinao requerem a escolha da amostra, a sua colheita e armazenamento adequado bem como a melhor metodologia analtica.

MATERIAL E MTODOS

Equipamento

Cromatgrafo gasoso Varian

Detector de ionizao de chama (FID)

Integrador/ registador Spectra Physics

Coluna de empacotamento com enchimento Porapack Q 150-200 mesh

Seringa Hamilton de 10 L

Reagentes Etanol, metanol, isopropanol, acetaldedo, acetona e n-propanol Merck

Padres:

Soluo aquosa de etanol - 0,1 mL/100 mL

Soluo aquosa de isopropanol - 0,125 mL/100 mL

Soluo aquosa de metanol - 0,125 mL/100 mL

Condies cromatogrficas Coluna analtica Porapack Q 150-200 mesh

Temperatura do injector (manual) 210C

Temperatura do forno 158C/ temperatura constante ou isotrmica

Temperatura do detector 220C

Gs transportador Azoto com um fluxo de 30 mL/min

Fluxo para os gases do detector foi de 300 mL/min para o ar e 30 mL/min para o

hidrognio

Procedimento

1- Injectar 2 L de cada um dos padres

2- Injectar 2 L da amostra

3- Analisar os tempos de reteno para identificao dos componentes da amostra

4- Escolher o melhor processo de quantificao (Mtodo do padro interno e/ou

mtodo do padro externo)

5- Programar o integrador para o mtodo escolhido

6- Injectar novamente padres e amostra

Validao Linearidade Curva de calibrao determinada com solues aquosas de etanol

num intervalo de concentraes de 0,08 a 1,0 g /L, utilizando a relao rea de pico/concentrao

Especificidade, recuperao, exactido e preciso

Limite de deteco, limite de quantificao e estabilidade

RESULTADOS/CONCLUSO

Identificao do etanol existentes na amostra a partir dos cromatogramas obtidos. Determinao da quantidade de etanol na amostra pelos diferentes mtodos de

quantificao.

DETERMINAO DE ALDRINA, ENDRINA E DDT POR HPLC-

UV NUMA AMOSTRA DE GUA

INTRODUO Os pesticidas organoclorados so insecticidas que foram usados extensivamente na

dcada de 50/60 contra os parasitas que atacavam sobretudo as culturas. Dividem-se em

trs grupos: ismeros do hexaclorobenzeno (e.g. lindano), ciclodienos (endrina,

dieldrina, aldrina, endosulfo,...) e o DDT e anlogos. Destacam-se as principais

propriedades que caracterizam este grupo de compostos: baixa volatilidade, estabilidade

qumica, biotransformao e degradao ambiental lentas, baixa solubilidade na gua e

a elevada solubilidade em solventes orgnicos e lpidos. Existem pois vrias razes para

a sua bioacumulao nos sistemas biolgicos e persistncia no meio ambiente.

A determinao deste tipo de compostos seja em guas, solos, alimentos ou em fluidos

biolgicos continuam a justificar a grande preocupao que os POP (Persistent Organics

Pollutants) actualmente apresentam. Duma maneira geral, as metodologias utilizadas

para a sua determinao requerem numa primeira fase a preparao da amostra seguida

da aplicao de processos cromatogrficos (LC, GC) com deteco de UV, MS, DAD....

MATERIAL E MTODOS

Equipamento

Sistema de filtrao de solventes por vcuo Millipore com membrana de 0,45m

Banho de ultra-sons

Cromatgrafo Gilson equipado com injector Rheodyne e loop de 10 L

Detector Gilson de UV

Integrador/ registador Spectra Physics

Seringa Hamilton de 10 L

Coluna cromatogrfica de fase reversa Varian MCH10, 30x4 mm e 10 m de

tamanho de partcula, precedida de um pr-filtro metlico

Reagentes Acetonitrilo, Lichrosolv, Merck

Metanol, Lichrosolv, Merck

gua Milli-Q, Resistividade 18 Mcm

Padres:

Soluo trabalho do Padro DDT- 0,02 mg/mL

Soluo trabalho do Padro Aldrina- 0,02 mg/mL

Soluo trabalho do Padro Endrina- 0,01 mg/mL

Preparao da amostra

Partindo de 500 mL de gua de um rio, na proximidade de um campo de cultivo da

regio centro, procedeu-se concentrao dos pesticidas utilizando SPE (coluna Sep-

Pak C18) com vcuo. O DDT ficou retido na coluna e foi eludo com 1 mL de metanol.

O factor de enriquecimento da amostra foi de 500.

Condies cromatogrficas

Uso de uma coluna de fase reversa C18 para separar, identificar e quantificar

pesticidas

Uma eluio isocrtica/ Temperatura ambiente

A fase mvel escolhida para a eluio destes pesticidas foi uma mistura de metanol:

acetonitrilo: gua (73:10:17 v/v), previamente filtrada e desgaseificada.

O fluxo utilizado durante a anlise cromatogrfica foi de 1,3 mL/min

Deteco com UV/VIS a 224 nm com uma sensibilidade de 0.05 AUFS Procedimento

1- Injectar 10 L de cada um dos padres

2- Injectar 10 L da amostra

3- Analisar os tempos de reteno para identificao dos componentes da amostra

4- Escolher o melhor processo de quantificao (Mtodo do padro interno e/ou

mtodo do padro externo)

5- Programar o integrador para o mtodo escolhido

6- Injectar novamente padres e amostra

Validao Linearidade Curva de calibrao com concentraes de DDT entre 0,01 e 0,2

mg/L, utilizando a relao altura de pico/concentrao

Especificidade, recuperao, exactido e preciso

Limite de deteco, limite de quantificao e estabilidade

RESULTADOS/CONCLUSO

Identificao dos pesticidas existentes na amostra a partir dos cromatogramas

obtidos.

Determinao da quantidade de pesticida na amostra pelos diferentes mtodos de quantificao.

BIBLIOGRAFIA CASSARETT E DOULL,S Toxicologia Cincia Bsica dos Txicos MacGraw-Hill de Portugal 5 edio. 2001 ERVIN JUNGREIS "Spot Test Analysis" Clinical, Environmental, Forensic, and Geochemical Aplications John Wiley & Sons, Inc. - USA 2 ed. - 1997 H. J. CHAVES das NEVES; A. M. COSTA FREITAS "Introduo Cromatografia Gs - Lquido de Alta Resoluo" Dias de Sousa Lda - Portugal 1996

CHAMBERLAIN, JOSEPH "Analysis of Drugs in Biological Fluids" C. R. C. Press, Inc. - USA 1985 SUNSHINE, IRVING "Methodology for Analytical Toxicology" Vol. I, II, e III C. R. C. Press,.Inc. - USA 1985 BASELT, RANDALL C. "Analytical Procedures for Therapeutic Drug Monitoring and Emergency Toxicology" Biomedical Publications - USA 1980 H. J. CHAVES das NEVES "Introduo Prtica da Cromatografia Gs - Lquido" Universidade Nova de Lisboa, F.C.T.L. - Portugal 1980