apostila fitoquimica

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PAR CENTRO DE CINCIAS DA SADE DEPARTAMENTO DE FARMCIA LABORATRIO DE FITOQUMICA

(Edio Revisada)

Wagner Luiz Ramos Barbosa Colaboradores: Etienne Quignard Isabel Ceclia de Castro Tavares Lucianna do Nascimento Pinto Francielda Queiroz de Oliveira Rodson Martins de Oliveira

Belm - PA 2001

Revista Cientfica da UFPA http://www.ufpa.br/rcientifica Vol 4, 2004

Dedicado aos povos das florestas, se de alguma valia for... INTRODUOBrevssimo histrico da Fitoterapia

Desde pocas imemoriais os seres humanos utilizam-se dos recursos naturais para a sua sobrevivncia. Os vegetais so, ainda nos dias atuais, usados na construo de casas, no fabrico de vestimentas e na saciedade da fome. Na poca pr-colombiana, antes da invaso e subjugo do continente americano pelas monarquias ibricas, as sociedades que aqui viviam, construam suas casas, em harmonia com o clima da regio que habitavam, usando folhas e troncos de rvores, as quais tambm lhes forneciam seu meio de transporte. Sobre alimentao no necessrio falar, a no ser para inferir que, pelo fato de terem uma dieta bastante rica e variada, j faziam uso medicinal dos vegetais. Os doentes eram tratados pelos chamans, pelos pajs, pelos curandeiros, estes sim, donos da arte e da cincia da cura, que associam o conhecimento da flora curativa com a capacidade de comunicarem-se diretamente com seus deuses e com os elementos da natureza, agindo assim em duas frentes contra a doena e a favor do paciente. Com a sistematizao da pilhagem dos recursos naturais, a chamada colonizao, os europeus e quase extinguiram alguns produtos como o ouro e prata nos pases andinos e o pau-brasil aqui, e quase aniquilaram esta fonte de conhecimento, que so os pajs, isso porque o invasor por pouco conseguiu transformar o indgena em mais uma espcie extinta. Nos sculos que se seguiram, no Brasil, a Medicina e a Farmcia acompanharam os moldes europeus utilizando o acervo curativo e as tcnicas importadas. Entretanto, na cozinha, o processo era bem mais dinmico e variado. Acrescida dos conhecimentos trazidos pelos negros, contrabandeados e vilipendiados numa situao degradante e abenoada de escravos, a farmacopia nativa, que j misturava a flora indgena e europia, enriqueceu-se com as espcies trazidas da frica. Com isso muitas formulaes passaram a incluir espcies vegetais que cresciam originalmente em diferentes continentes. Com o aparecimento das sulfas, dos antibiticos e com o incremento da sntese orgnica, comeou a presso dos produtos sintticos sobre os de origem natural. Sem dvida este avano trouxe alguma melhoria na qualidade de vida das pessoas, mas o que as indstrias no contavam era que uma catstrofe estava em gestao nos seus laboratrios. Uma substncia milagrosa que agia sem causar reaes adversas, o ideal dos produtos sem efeitos colaterais graves: a talidomida. E deu no que deu. Utilizada por gestantes, a substncia apresentou um efeito teratognico que fez com que milhares de bebs nascessem sem braos ou com membros deformados. Isso custa, at hoje, muito caro para alguns pases que tiveram que investir altas somas para integrar esses deficientes s suas sociedades. A isso some-se o movimento hippie que, na mesma poca, contestava a ganncia dos capitalistas, o materialismo da sociedade e o reacionarismo da igreja, propondo uma volta aos valores mais elevados da vida, com mais liberdade, mais amor e com alguns outros ingredientes que no devem ser mencionados aqui, mas que so tambm de origem vegetal! Assim como o capitalismo e o socialismo, a industrializao tambm mostrou o seu lado mau. As solues revolucionrias e definitivas como a energia nuclear, o neoliberalismo, a quimioterapia, entre outras, j criaram uma gama muito vasta de problemas, para serem hoje aceitas sem crticas; por isso essa tentativa de se sair em busca de novos caminhos para as vrias crises que enfrentamos, ainda. Com a realizao da Conferncia Mundial sobre Meio Ambiente em 1992 no Rio de Janeiro pde-se trazer de volta ao debate a questo de preservao da biodiversidade. Novas estratgias foram lanadas para, a mdio prazo, poder-se alcanar nveis de qualidade no


meio ambiente, que possam adiar o dia do juzo final, ou seja, postergar o caos ambiental. Paralelamente, pretendeu-se incentivar o desenvolvimento das naes mais pobres do planeta. Entretanto, nada disso ter uma mnima chance de ocorrer se as regras do jogo continuarem as mesmas. Nenhum pas industrializado aceitar abrir mo de seu status quo em benefcio de um mais pobre. Da mesma forma, nenhum governo neoliberal do chamado terceiro mundo ter fora, ou mesmo interesse, para defender os legtimos direitos de sua populao. Mas h uma sada! A educao, quando dirigida aos menos favorecidos, quando alia formao e informao; a educao uma arma mais forte do que a guerrilha ou uma nova constituio. Por isso de capital importncia sabermos trabalhar e explorar nossas potencialidades, defender nossa riqueza ambiental, cultural, e principalmente aquela que est dentro das pessoas. Por meio da educao devemos fazer florescer essa riqueza interior dos estudantes, pois eles que vo definir o rumo que o futuro ir tomar. E nesse futuro, no que diz respeito s mais diferentes terapias que andam en vogue neste final de sculo, est includa a fitoterapia, no mais aquela emprica dos tempos da Pharmcia, ou aquela que proclama que o que natural no tem contra-indicao. Com a utilizao consciente e crtica dos recursos naturais, escolhendo bem os parceiros e as formas de com eles interagir, pode-se contribuir para reduzir o sofrimento de um doente, o atraso de uma sociedade ou at mesmo a pobreza de um pas. O uso de plantas no tratamento de males do corpo e do esprito continua sendo objeto da curiosidade leiga e cientfica. Wagner Luiz Ramos Barbosa Rio de Janeiro, dezembro de 1992.


ASPECTOS EXPERIMENTAIS DA FITOQUMICA Importncia da identificao do material vegetal Escolher o material vegetal a ser estudado , a princpio, uma tarefa ingrata, se considerarmos que, apesar da destruio sistemtica e insensata das florestas tropicais, ainda existem milhares de diferentes espcies vegetais. Para orientao da escolha existem a literatura especializada e as farmacopias humanas, ou seja, os muitos homens e mulheres que acumularam conhecimento emprico sobre medicina tradicional. Essas pessoas sabem que planta cura que mal! Baseando-se na informao dessas pessoas ou dos botnicos, dos farmaclogos, e de um nmero crescente de farmacuticos que fazem o trabalho de campo, pode-se determinar que planta ser investigada, geralmente segundo seu nome popular. A classificao taxonmica, a qual ocorre, quase sempre, com o concurso de um especialista, a determinao de um txon como idntico ou semelhante a uma descrio j existente, por comparao do material-problema com exsicatas dispostas em herbrios ou com monografias especializadas, levando a obteno da denominao cientfica do material. A anlise de um indivduo com fins de sua identificao baseia-se na prospeo, no indivduo em anlise, de caractersticas comuns a uma famlia, ficando as diferenas restritas a certos limites. Observando-se a anatomia, macro e microscpica, e a constituio qumica deste indivduo pode-se chegar a uma identificao positiva da espcie a que ele pertence. A identificao segura do vegetal empregado no preparo de fitoterpicos garante o efeito teraputico pretendido, pois este est relacionado com as propriedades farmacodinmicas da droga indicada, caracterstica de uma determinada espcie. No caso de uma identificao positiva, tambm o grau de pureza da droga deve ser controlado, avaliando-se no s os princpios ativos como tambm as possveis adulteraes, falsificaes e impurezas. Tais anomalias, apesar de freqentes, no devem ser encaradas como acontecimentos triviais, pois podem acarretar conseqncias altamente danosas, at fatais, para os usurios do produto. No mbito de pesquisa em fitoqumica, a identificao positiva e segura da planta medicinal sob investigao garante a padronizao dos mtodos e a reprodutibilidade dos resultados, os quais podem vir a ter aplicao prtica. Deve-se, ainda, atentar para o fato curioso de que uma mesma espcie botnica pode possuir diferentes nomes populares ou, ao contrrio, diferentes espcies botnicas com um mesmo nome no - sistemtico, segundo a regio ou populao que as usa. Este fato s faz aumentar a importncia de uma identificao positiva e segura da droga a ser cientificamente investigada ou farmaceuticamente utilizada. Procedimentos na coleta Muitas pessoas encarregadas da coleta de vegetais para uso farmacutico possuem largo conhecimento emprico sobre plantas medicinais, entretanto cabe ao especialista acompanhar a coleta do material e proceder as anlises necessrias para corroborar ou no com a identificao intuitiva do coletor. Ao coletar-se uma planta para anlise botnica imediata, ou seja, quando se pode contar com especialistas prximo ao local de coleta, pode-se dispensar cuidados especiais com o preparo do espcime a ser analisado. Entretanto, deve-se coletar o material o mais completo possvel, com pelo menos um ramo florido com 20 a 30 cm de altura. Ao que devese anexar informaes sobre o local e data de coleta, nome e uso popular, o porte do vegetal,


a colorao das flores e outras informaes importantes como a freqncia e o tipo de vegetao associada.

Fig. 1: Material coletado com etiqueta.

Na maioria dos casos o material vegetal precisa ser remetido para outro local a fim de ser identificado e se isso demandar mais de 24 horas, faz-se necessrio tomar certos cuidados. Os ramos floridos coletados devem ser distendidos e colocados entre folhas de papel absorvente - papel jornal, por exemplo - o conjunto deve ser ento acondicionado entre placas de papelo para ser em seguida prensado. Tambm aqui, como acima, deve-se anexar informaes relativas coleta dos espcimes. O material coletado para estudos qumicos deve ser etiquetado com os dados necessrios sua identificao no laboratrio, como no incio deste item. As partes suculentas devem ser conservadas abaixo de 10C ou dessecadas, aps fragmentao. Cascas e lenhos podem ser secos ao tempo, reduzidos a pedaos pequenos para serem triturados em moinho mecnico, aps o que so submetidos a nova secagem. O material modo deve ser acondicionado de forma a evitar-se contaminao e infestao de quaisquer tipos. Para a herborizao do material vegetal deve-se utilizar duas tbuas de 45 x 30 cm, papelo canelado e papel absorvente nas mesmas medidas. Um espcime, o mais completo possvel, deve ser acondicionado entre folhas de papel absorvente, o conjunto deve ser colocado entre as folhas de papelo e por fim entre as tbuas. A prensa deve ser firmemente amarrada com cordas (figuras 2 e 3). A secagem deve acontecer em estufa a 37C por um ou dois dias ou temperatura ambiente, por um tempo mais longo. Material suculento necessita de mais tempo para secagem.

Fig. 2: Elementos necessrios para a herborizao de material vegetal.


Fig. 3: Conjunto amarrado.

As seguintes informaes devem constar em uma etiqueta que acompanha a exsicata: Nome da Instituio, Nmero da Amostra e Data da Coleta; Classificao Botnica; Famlia, Nome Cientfico (espcie) e Nome Popular; Procedncia, Observaes, Nome do Coletor e Nome do Especialista que identificou.

Fig. 4: Uma exsicata com etiqueta.

Parte integrante de uma identificao precisa e segura do material a ser utilizado na pesquisa fitoqumica, a determinao da poca da coleta e da procedncia do material pode evitar divergncias na sua anlise qumica, condicionada sazonalidade e s condies do solo e do ar onde o vegetal cresce.Preparao de extratos anlise fitoqumica

Considerando-se que uma determinada espcie vegetal seja recomendada para tratar determinada sintomatologia e por esse motivo deseja-se investig-la, o prximo passo a ser dado nessa investigao, aps a caracterizao botnica, a abordagem farmacolgica do material, o qual j deve ter sido botanicamente classificado. Atravs de dados etnofarmacolgicos, que fornecem informaes sobre a utilizao da planta, pode-se, pois, processar a sua extrao segundo a maneira tradicional e proceder-se, assim, a testes de atividade, com o concurso de um/a farmaclogo/a. Plantas que so usadas como chs, so extradas com gua a quente e o extrato aquoso deve ser, o mais rpido possvel, remetido para os testes, a fim de evitar-se o desenvolvimento de fungos ou a degradao de substncias pela ao da gua. Pode-se evitar estes contratempos conservando-se o extrato sob refrigerao por um curto perodo em atmosfera estril, evaporando-o sob presso reduzida ou procedendo-se liofilizao aps congelamento, sendo este o mtodo de escolha, quando possvel. Para obter-se o extrato seco, no caso da planta ser extrada com gua, deve-se secar o em um liofilizador. Este aparelho composto, basicamente, de uma bomba de alto vcuo e de uma cmara fria. Ele retira a gua do extrato, sem aquecimento. O extrato congelado introduzido num reservatrio que evacuado at em torno de 10-3cm de mercrio, nesta


condio a gua sublima, isto , passa do estado slido - gelo - para a fase de vapor, para ser de novo convertida em gelo na cmara fria (figuras 5 e 6).

Fig. 5: Construo esquemtica do equipamento.

Fig. 6: Liofilizador de bancada.Fonte: Catlogo da Empresa AMSCO/FINN-AQUA Hrth, Alemanha

Os outros extratos, alm do aquoso, devem tambm ser evaporados baixa presso at secura, evitando-se assim, a presena de resduos de solventes orgnicos que podem mascarar a atividade intrnseca do extrato. Em geral, extratos tradicionais no aquosos desta natureza com fins teraputicos so preparados com vinho ou aguardente, o que corresponde a um extrato hidroalcolico entre 10% e 40%. tambm importante atentar para a preparao de extratos que apresentem uma razovel hidrossolubilidade, pois a maioria dos testes biolgicos se faz com solues aquosas de extratos ou fraes secas. Caso a amostra no apresente esta propriedade ser necessrio o uso de agentes dispersantes ou emulgentes, o que pode dificultar a avaliao da atividade ou mesmo a execuo dos testes. Uma vez detectada ou confirmada a atividade farmacolgica do material em estudo e, caso se objetive isolar o princpio ativo, procede-se a uma extrao por solvente orgnico, no qual ser pesquisada a bioatividade j detectada, levando-se em conta o que se afirmou antes para este tipo de extrato, quanto a presena de resduos de solventes. O extrato orgnico deve ter seu perfil cromatogrfico determinado por cromatografia em camada delgada ou cromatografia lquida de alta eficincia e deve ser analisado quanto composio qumica. A atividade deve ser pesquisada tambm nas fraes brutas, que so preparadas a partir do extrato inicial. A frao ativa poder ser tratada para fornecer a substncia ativa. Este o caso ideal! No transcorrer deste procedimento pode-se isolar outras substncias que podem, da mesma forma, apresentar outro tipo de bioatividade, ou serem aproveitadas como marcadoras nos mtodos usuais de controle qualidade. A fim de se interromper os processos enzimticos correntes no vegetal deve-se, aps coleta, colocar o material vegetal em uma estufa, pr-aquecida temperatura de 60C a 80C, durante quinze a trinta minutos ou proceder-se sua extrao imediata com lcool etlico, caso se preconize a extrao do material fresco. Caso a extrao deva ser efetuada no material seco, recomendvel deix-lo desidratar em ambiente ventilado e climatizado para que no ocorra infestaes e degradaes indesejadas ou que interfiram negativamente nos resultados esperados.


Anlise cromatogrfica de um extrato e determinao das condies para o seu fracionamento e para o isolamento de substncias

O extrato obtido a partir do vegetal seco ou fresco deve ser analisado cromatograficamente, tenha ele sido preparado para teste farmacolgico ou para anlise qumica propriamente dita. Aps a evaporao do solvente tem-se um extrato seco que deve ser pesado para determinao do rendimento. Uma pequena poro deste material redissolvida num mnimo de solvente orgnico; metanol, clorofrmio ou acetato de etila, por exemplo. A soluo aplicada na forma de barras sobre placas cromatogrficas, sendo desenvolvidos cromatogramas com eluentes adequados de diferentes polaridades. Estes cromatogramas devem ser observados sob luz natural, luz ultravioleta e revelados com reativos especficos para determinadas classes de metablitos secundrios. As observaes feitas so anotadas e os cromatogramas (figura 7) reproduzidos sobre papel para posterior comparao.

Fig. 7: Cromatograma e clculo do Rf.Fonte: Deutsche Apotheker Zeitung, 49, 2705, 1992.

Para evaporao de solventes orgnicos a baixa presso, utiliza-se o evaporador rotativo sob vcuo mediano de 60 at 20 cm de mercrio (presso normal: 760mmHg); podese utilizar uma trompa de jato dgua ou bomba de membrana de Teflon (presso em torno de 15 miliPascal), ideal para solventes orgnicos menos volteis ou mesmo gua. De posse da anlise cromatogrfica do extrato, quanto a sua composio por classes de substncias, seleciona-se qual substncia deve ser isolada, de acordo com o plano de investigao a ser seguido. Devido a complexidade de um extrato bruto, muitas vezes essa tarefa no to fcil, ou seja, muitas vezes torna-se necessrio dividir o extrato bruto em fraes grosseiras, para, a sim, poder-se visualizar a mancha que interessa. A denominao mancha d-se quela zona do cromatograma ocupada pelas substncias que so coradas, absorvem ou fluorescem no ultravioleta, ou ainda quelas que mostram colorao tpica (e s vezes no to tpicas tambm) de uma ou outra classe ao reagirem com um reativo especfico (ver figura 7). A obteno das fraes brutas, o fracionamento, uma estratgia que visa descomplicar o extrato bruto, possibilitando a identificao de manchas que estavamRevista Cientfica da UFPA http://www.ufpa.br/rcientifica Vol 4, 2004

mascaradas por corantes naturais (clorofilas, carotenides ou flavonides e s vezes alcalides) ou encobertas por substncias majoritrias (cidos graxos, esterides ou flavonides). Para o fracionamento pode-se utilizar diferentes tcnicas: a partio lquido lquido, que explora a imiscibilidade de alguns solventes orgnicos com gua; a desadsoro seletiva, que est baseada na capacidade de um solvente em deslocar substncias adsorvidas a um suporte inerte ou ainda; a cromatografia de coluna, s vezes sob presso (freqentemente dispensvel), que est fundamentada na capacidade de um eluente (uma mistura de solventes em propores definidas) de deslocar, arrastando sucessivamente, substncias, que se adsorvem ao suporte inerte segundo suas polaridades.

Fig. 8: Funil de decantao na separao lquido - lquido

Fig. 9: Cromatografia em coluna.

Em alguns casos, durante o fracionamento pode ocorrer a precipitao ou mesmo a cristalizao de uma substncia, que na maioria dos casos, pode tratar-se de uma substncia majoritria, geralmente ubiqitria. Para que determinada a mancha, leia-se a substncia, possa ser isolada de um extrato bruto, ou de uma frao bruta, deve-se adequar as condies cromatogrficas at poder-se visualizar a mancha escolhida numa altura superior a um quarto e inferior a um tero do caminho percorrido pelo eluente na placa. Isso o que se chama Rf timo (do ingls Retention factor) da substncia, ou seja, a razo entre as distncias percorridas pela mancha e pelo eluente na placa. Uma vez conseguida a combinao de solventes (eluente) adequados, passa-se ao isolamento propriamente dito da substncia que mostrar o Rf entre 0,25 e 0,33 nas dadas condies (ver figura 7).Cromatografia em camada delgada, preparativa, de coluna, automatizada gasosa ou de alta performance

A cromatografia o mtodo analtico bsico da fitoqumica. Na Alemanha, os qumicos sintticos costumam dizer, como piada, que eles fazem qumica verdadeira e ns fitoqumicos, somente cromatografia. Eles se esquecem, porm, que todo o desenvolvimento da qumica orgnica est baseado nos estudos dos compostos naturais. Os mtodos para


sntese e de anlise estrutural so, em grande parte, desenvolvidos e aperfeioados, por exigncia da Fitoqumica. Para se proceder anlise de extratos vegetais, para o seu fracionamento e para o isolamento de seus constituintes qumicos poder-se-ia utilizar somente a cromatografia. A anlise cromatogrfica de um extrato faz-se aplicando-se uma pequena quantidade deste sobre uma placa, geralmente de vidro, coberta com um material inerte. A cromatografia de adsoro o tipo mais comum e til, de uso geral, sendo outras variantes e desenvolvimentos aplicados a casos especficos. Deve-se registrar ainda a cromatografia de partio, a de troca inica e a filtrao em gel. O desenvolvimento do cromatograma, diagrama que mostra os constituintes qumicos do extrato distribudos sobre a placa cromatogrfica segundo suas polaridades, faz-se com o uso de um eluente, uma combinao de solventes. A posio dos compostos sobre a placa e dada pelo seu Rf (ver figura 7). O termo placa cromatogrfica se aplica a qualquer material recoberto de suporte quimicamente inerte para fins cromatogrficos, podendo ser de vidro, de alumnio ou de polmeros sintticos. Cada tipo tem suas limitaes e vantagens, mas as placas de vidro so as mais difundidas. O suporte, material que cobre a placa cromatogrfica, com uma espessura de 0,25 mm forma o que se chama de fase estacionria. Atualmente, trs tipos de suportes para cromatografia em camada delgada (CCD) atendem s necessidades dos fitoqumicos: slica gel, ou xido de silcio (SiO2). Trata-se de um mineral, cujo gro apresenta a propriedade de adsorver substncias superfcie, a qual, por apresentar muitos poros, possui uma superfcie de contato extremamente grande para a dimenso do gro. Estas substncias adsorvidas podem ser seletivamente deslocadas por um solvente orgnico ou por uma mistura deles, que flui pelo suporte; a presena de gua no eluente pode desativar a slica gel, o que s vezes necessrio; o xido de alumnio (Al2O3), tambm conhecido como alumina, pode ser empregado na forma cida ou neutra. O eluente pode conter gua. A alumina bsica e a neutra so usadas, geralmente, para a separao de alcalides; slica gel de fase reversa (Reversed phase - RP), neste caso tem-se um resduo de cadeia longa (C8 ou C18) ligado ao oxignio do xido de silcio. Adequado para separao de substncias muito polares, como por exemplo de glicosdeos, este suporte requer como eluente lcoois hidratados. Neste tipo de cromatografia contra-indicado o uso de qualquer outro solvente orgnico, mas existem excees. A mistura de solventes utilizada para o desenvolvimento de um cromatograma tem sua composio definida na observao da distribuio das substncias sobre a placa. Caso se esteja buscando o sistema (eluente + suporte, geralmente a slica gel) ideal para o fracionamento de um extrato numa coluna cromatogrfica, deve-se utilizar um eluente que abra o extrato, isto , as manchas devem suceder-se sobre a placa de forma ntida, sem contornos difusos ou sobreposio, tal feito extremamente difcil. Um outro critrio para definir uma substncia a isolar trabalhar o sistema em funo dela desde a anlise do extrato, buscando sistematicamente a melhor combinao de solventes. Uma tcnica bastante prtica e rpida para o isolamento de pequenas quantidades de substncias est embasada no uso da cromatografia de camada delgada (CCD) preparativa sobre placa de vidro. Aqui se aplica uma soluo concentrada da amostra (no mais que 5 mg por placa de 20 cm de largura) e desenvolve-se o cromatograma com o eluente escolhido. Aps evidenciar-se a posio da substncia a ser isolada, com o uso de um reagente geral aspergido sobre uma faixa estreita da placa, ou por observao sob luz ultravioleta, raspa-se a slica gel que contm a banda relativa substncia procurada. Esta slica ento lavada com


um solvente orgnico apropriado, que dissolva a substncia em questo; o metanol contraindicado, pois arrasta uma quantidade significativa de slica gel. A soluo obtida concentrada at a secura e para garantir a ausncia de slica, deve-se, de novo, dissolver o resduo da evaporao, filtrar e mais uma vez evaporar a secura. Os solventes empregados no preparo de um eluente devem ser relativamente volteis; no devem reagir entre si; quando a mistura desenvolver calor, deve-se esperar o arrefecimento da mesma antes de seu uso. O benzeno contra-indicado pela sua carcinogenicidade, deve ser substitudo por tolueno, apesar deste ferver a 110C. O clorofrmio hepatotxico, assim como o diclorometano, mas ambos so insubstituveis no isolamento de alcalides. O metanol tambm bastante txico, ele absorvido pela pele e pode provocar cegueira e morte. Os solventes clorados e metanol devem ser manuseados sob aspirao (em capela), com uso de luvas e culos de proteo. O ter etlico forma, com o tempo, perxidos que podem, ao fim de uma destilao, explodir de forma bastante violenta, recomenda-se por isso destil-lo na presena de hidrxido de potssio, antes de seu uso. Todos os produtos qumicos so nocivos sade, e alguns so muito perigosos, por isso, exigem do usurio muita ateno e cuidado no seu manuseio. A automao dos sistemas cromatogrficos levou ao desenvolvimento de aparelhos destinados a executar a separao de compostos de uma mistura de uma maneira rpida, eficiente e com alto poder de resoluo. O mtodo chama-se cromatografia lquida de alta performance. O aparelho compe-se de uma bomba injetora de eluentes, uma coluna com adsorventes slidos impregnados de fases lquidas diretas ou reversas, e um detetor baseado na diferena de ndices de refrao ou na absoro no ultravioleta, entre outros tipos. Outros acessrios so a impressora de dados e grficos referentes s condies da colunas e das fraes obtidas e o coletor automtico de fraes.

Fig. 10: Esquema de um cromatgrafo.

Este aparelho permite a padronizao mais exata das condies de isolamento de uma substncia. Tal fato levou ao desenvolvimento de mtodos de anlise (qualitativa) e controle (quantitativo) de composio de fraes e de extratos vegetais, possibilitando a identificao de substncias conhecidas e a descoberta de novas, assim como, e principalmente, o Controle de Qualidade de produtos farmacuticos, base de insumos vegetais.


ABORDAGEM FITOQUMICA I. PREPARAO DO EXTRATOTriturar o material vegetal (50g) em triturador mecnico. Transferir para um recipiente apropriado onde se deve acrescentar lcool etlico at a completa submerso do material (anotar o volume usado). Fechar o recipiente vedando-o com folha de alumnio. Deixar em macerao por, no mnimo, 3 dias. Ao final do prazo, filtrar o material primeiramente sobre gaze e depois sobre papel filtro. Concentrar o filtrado em evaporador rotativo para depois, transferir para um frasco devidamente tarado, que deve ser levado estufa para completa secagem do extrato. Depois de seco, o extrato deve ter sua massa medida para posterior clculo do rendimento.

II. REATIVOS E SUA PREPARAO

II.1. Reativo de KEEDE para Glicosdios Cardacos: Soluo A: dissolver 2g de cido 3,5-dinitrobenzico em 50mL de Metanol. Soluo B: dissolver 5,7g de Hidrxido de Potssio em 100mL de Metanol. Adicionar II gotas da sol. A e II gotas da sol. B no momento do teste. II.2. Reativo de BOUCHARDAT para Alcalides: dissolver 4g de Iodeto de Potssio 2g de Iodo ressublimado em 100mL de gua destilada. II.3. Reativo de DRAGENDORFF para Alcalides: Soluo A: dissolver 8g de Subnitrato de Bismuto (BiONO3.H2O) em 20mL de cido Actico. Soluo B: dissolver 27,2g de Iodeto de Potssio (KI) em 50mL de gua destilada. Adicionar aos poucos a soluo A sobre a soluo B. II.4. Reativo de MAYER para Alcalides: Soluo A: dissolver 1,36g de Cloreto Mercrico (HgCl2) em 60mL de gua destilada. Soluo B: dissolver 5g de Iodeto de Potssio (KI) em 20mL de gua destilada. As solues A e B devem ser misturadas e diludas para 100mL de soluo. II.5. Reativo de PASCOV para cidos Orgnicos: Soluo A: dissolver em 100mL de Etanol 0,075g de Verde de Bromocresol e 0,25g de Azul de Bromofenol. Soluo B: dissolver em 100mL de gua destilada, 0,25g Permanganato de Potssio (KMnO4) e 0,25g de Carbonato de Sdio (Na2CO3).10H2O. Misturar 9 partes de A para 1 parte de B, somente no momento de usar. A mistura s estvel durante 5 a 10 min. II.7. Reativo de FEHLING para Acares Redutores: Soluo A: dissolver 34,65g de Sulfato de Cobre (CuSO4) em gua destilada e completar o volume para 500mL. Soluo B: dissolver 173g de Tartarato de Sdio e Potssio (KNaC4H4O6.4H2O) e 125g de Permanganato de Potssio (KOH) em gua destilada e diluir para 500mL. Utilizar na proporo de 2mL de A, para 2mL de B. II.8. LUGOL: dissolver 10g de Iodeto de Potssio (KI) e 5g de Iodo em 50mL de gua destilada e completar o volume para 100mL.


II.9. PAPEL REATIVO DE PICRATO DE SDIO para heterosdio cianogentico: dissolver 1g de cido Pcrico (C6H3N3O3) em 100mL de gua destilada; junte depois 10g de Carbonato de Sdio. Seque em temperatura ambiente. Vlido por at 4 meses se o frasco estiver bem fechado. II.10. SOLUES PULVERIZADORAS I E II para sesquiterpenolactonas: Soluo pulverizadora I: Soluo A: dissolver 20g de Cloridrato de Hidroxilamina (NH2OH.HCl) em 50mL de gua destilada, completar o volume para 200mL com lcool Etlico. Esta soluo deve ser conservada em lugar fresco. Soluo B: dissolver 50g de Hidrxido de Potssio (KOH) em gua destilada (pequeno volume) e completar com Etanol at 500mL. Misturar 1 volume da soluo A com 2 volumes de soluo B. Filtrar o precipitado formado de Cloreto de Potssio (KCl) (aguardar a formao do sal). Esta soluo deve ser guardada em refrigerador, nestas condies se mantm estvel por duas semanas. Soluo pulverizadora II: Dissolver 10g de Cloreto Frrico FeCl3 em 20mL de soluo de cido Clordrico (HCl) a 36% (concentrado), adicionar em seguida 200mL de ter Etlico (agitar no momento da pulverizao). Esta soluo bastante estvel, desde que o frasco esteja bem vedado. II.11. Anisaldedo cido Actico Reagente Geral Misturar 0,5mL de Anisaldedo a 10ml de c. Actico Glacial. Em outro recipiente, adicionar a 85mL de Metanol, 5mL de H2SO4 concentrado. As duas solues devem ser misturadas. II.12. Vanilina - cido Sulfrico Reagente Geral Soluo. A : Dissolver 1g de Vanilina em Etanol e completar o volume para 100mL. Soluo. B : Diluir 10mL de H2SO4 em Etanol e elevar o volume at 100mL Obs.: No momento da aplicao sobre a placa cromatogrfica, retirar uma alquota de cada soluo obedecendo a proporo de 1:1. III.TESTES SAPONINAS a) Saponina espumdica: dissolver alguns miligramas do extrato alcolico seco em 5mL de gua destilada. Em seguida, diluir para 15mL e agitar vigorosamente durante 2min em tubo fechado. Resultado: se a camada de espuma permanecer estvel por mais de meia hora, o resultado considerado positivo para saponina espumdica. Obs.: Existem outros compostos que ativam e desativam a espuma formada.

b) Saponina hemoltica: dissolver alguns miligramas do extrato seco, em 2mL de soluo de Etanol a 80% (filtar se necessrio). Preparar 20mL de suspenso de hemcias a 5%, em soluo de NaCl a 0,85%. Juntar 10mL da suspenso, a 1mL do extrato em sol.


etanlica, homogeneizar cuidadosamente e deixar em repouso durante 5min. Repetir o mesmo procedimento para os 10mL de suspenso restante, porm, substituindo o extrato em soluo por sol. de NaCl a 0,85%.Centrifugar as duas preparaes durante 5min a 3500rpm. Preparao da suspenso de hemcias a 5%: retirar 5mL de sangue humano ou de outro animal, transferir para um tubo de ensaio, adotar um volume padro de soluo salina (sugesto: 5mL), e proceder a lavagem das hemcias, centrifugando durante 1min a 3000rpm e desprezando o lquido sobrenadante. Repetir o procedimento de lavagem por pelo menos 3 vezes. Em seguida, retirar 1mL do concentrado de hemcias e adicionar 19mL de soluo de NaCl a 0,85% e homogeneizar. Resultado: uma colorao vermelha ou rsea no lquido sobrenadante, considerada evidncia de hemlise, quando comparada ao teste em branco. CIDOS ORGNICOS Dissolver alguns miligramas do extrato seco em 5mL de gua destilada. Filtrar se necessrio. Transferir 2mL para um tubo de ensaio, ou 1mL para uma placa escavada, e adicionar gotas do REATIVO DE PASCOV. Resultado: se houver descolorao do reativo, a reao positiva. ACARES REDUTORES Tcnica 1: dissolver alguns miligramas do extrato seco em 5mL de gua destilada. Filtrar se necessrio. Adicionar 2mL do reativo de FEHLING A e 2mL do reativo de FEHLING B. Aquecer em BM em ebulio durante 5min. Resultado: o aparecimento de um precipitado vermelho tijolo, indica presena de acares redutores. Obs.: caso no haja formao do precipitado, executar a tcnica 2. Tcnica 2: dissolver alguns miligramas do resduo em 5mL de gua destilada. Adicionar 1mL de HCl concentrado e ferver em BM durante 10min. Esfriar e neutralizar com soluo de NaOH a 20%. Filtrar se necessrio. Adicionar 2mL do reativo de FEHLING A e 2mL de FEHLING B. Aquecer em BM por 5min. Resultado: o aparecimento de precipitado vermelho, indica reao positiva para acares no redutores ou heterosdios. HETEROSDIO CIANOGENTICO Colocar num erlenmeyer 10g da planta fresca bem triturada, 10mL de gua destilada e 1mL de H2SO4 concentrado, vedar o erlenmeyer com uma rolha de cortia onde deve estar preso o papel reativo de Picrato de Sdio de modo que no entre em contato com as paredes do erlenmeyer, nem com a mistura. Aquecer a 50C durante 30. Resultado: se o papel corar de marrom avermelhado, indica reao positiva para cido Ciandrico.

POLISSACARDIOS Dissolver alguns miligramas do extrato seco em 5mL de gua destilada. Filtrar se necessrio. Adicionar duas gotas de lugol.


Resultado: o aparecimento de colorao azul, indica resultado positivo. PROTENAS E AMINOCIDOS 1. Reao de nihidrina: dissolver alguns miligramas do extrato alcolico em 3mL de gua destilada e filtrar se necessrio. Adicionar 0,5mL de soluo aquosa de Nihidrina a 1%, aquecer at a ebulio. Resultado: o aparecimento de colorao violeta persistente indica reao positiva. FENIS E TANINOS Dissolver alguns miligramas de extrato seco em 5mL de gua destilada, filtrar se necessrio e adicionar I a II gotas de soluo alcolica deFeCl3 a 1%. Resultado: qualquer mudana na colorao ou formao de precipitado indicativo de reao positiva, quando comparado com o teste em branco (gua + Sol. de FeCl3). Colorao inicial entre o azul e o vermelho, indicativo da presena de fenis, quando o teste em branco for negativo. Precipitado escuro de tonalidade azul, indica presena de taninos piroglicos (taninos hidrolisveis) e verde, presena de taninos catquicos. FLAVONIDES GERAL: dissolver alguns miligramas do extrato seco, em 10mL de Metanol, filtrar se necessrio. Adicionar V gotas de HCl concentrado e raspas de Magnsio. Resultado: o surgimento de uma colorao rsea na soluo indica reao positiva. POR CLASSES: dissolver alguns miligramas do extrato seco em 20mL de gua destilada e filtrar se necessrio. Transferir para trs tubos de ensaio, 3mL da soluo (para cada tubo). Acidular um a pH 3, alcalinizar os dois restantes a pH 8.5 e 11. Resultado:CONSTITUINTES ANTOCIANINAS E ANTOCIANIDINAS FLAVONAS, FLAVONIS E XANTONAS CHALCONAS E AURONAS FLAVANONIS COLORAO EM MEIO CIDO pH 3 VERMELHA ________ VERMELHA ________ ALCALINO pH 8.5 LILS __________ __________ __________ ALCALINO pH 11 AZUL PRPURA AMARELA VERMELHO PRPURA VERMELHO LARANJA

Obs: a presena de um constituinte pode mascarar a cor indicativa da presena de outro.

LEUCOANTOCIANIDINAS, CATEQUINAS E FLAVANONAS: em dois tubos adicione 3mL da soluo preparada anteriormente, acidule o primeiro com soluo de HCl a pH 1 - 3 e alcalinize o outro a pH 11 com soluo de NaOH. Aquea-os com auxlio de uma


lmpada de lcool durante 2 3min, cuidadosamente. Observe modificaes na colorao, comparando com os tubos utilizados no teste anterior. Resultados:CONSTITUINTES LEUCOANTOCIANIDINAS CATEQUINAS (TANINOS CATQUICOS) FLAVANONAS COLORAO EM MEIO CIDO VERMELHA PARDO AMARELA _____________ ALCALINO __________ __________ VERMELHOALARANJADO

FLAVONIS, FLAVANONAS, FLAVANONIS E XANTONAS: transferir para um tubo de ensaio, 3mL da mesma soluo extrativa usada no teste anterior e acrescentar alguns miligramas de Magnsio em raspas, e 0,5mL de HCl concentrado. Aguarde o termino da efervescncia, e observe por comparao a mudana na colorao em relao aos tubos acidificados dos testes anteriores. Resultado: o aparecimento ou intensificao da cor vermelha, indicativo da presena dos metablitos a cima citados. ALCALIDES Dissolver alguns miligramas do extrato seco em 5mL de soluo de HCl a 5%, filtrar se necessrio. Separar quatro pores de 1mL em tubos de ensaio, e adicionar gotas dos reativos abaixo: a) Reativo de Bouchardat, RESULTADO: precipitado laranja avermelhado b) Reativo de Dragendorff, RESULTADO: precipitado vermelho tijolo c) Reativo de Mayer, RESULTADO: precipitado branco d) Reativo de Bertrand, RESULTADO: precipitado branco PURINAS Numa cpsula de porcelana, juntar alguns miligramas do extrato seco, III gotas de soluo de HCl 6N e duas gotas de H2O2 concentrado (30%). Evaporar em BM. Deve haver formao de um resduo corado de vermelho. Juntar III gotas de soluo de NH4OH 6N. Resultado: o surgimento de colorao violeta, indica reao positiva. GLICOSDIOS CARDACOS a) Dissolver alguns miligramas do extrato seco em 5mL de Metanol. Filtrar se necessrio. Separar em duas pores de 2mL cada e adicionar gotas do reativo de KEEDE. Resultados: Colorao azul ou violeta indica reao positiva. b) Soluo de nitroprussiato de sdio a 5% : adicionar III gotas de soluo recente Nitroprussiato de Sdio e III gotas de soluo de hidrxido de sdio 2N. Resultado: colorao roxa intensa, indica reao positiva.


CATEQUINAS Tcnica 1:Dissolver alguns miligramas do extrato seco em 3mL de Metanol. Filtrar se necessrio. Juntar 1mL de soluo aquosa de Vanilina a1% e 1mL de HCl concentrado. Resultado: o surgimento de uma colorao vermelha intensa indica reao positiva. Tcnica 2: Embeber um palito de fsforo na soluo (extrato seco + Metanol ), evapore at secar, e umedea em HCl concentrado. Seque ao calor de uma chama forte, evitando sua carbonizao. Resultado: o aparecimento de cor vermelha, indica presena de catequinas. DERIVADOS BENZAQUINONAS; NAFTOQUINONAS E FENANTRAQUINONAS: Dissolver alguns miligramas do extrato seco em 3mL de Metanol. Filtrar se necessrio. Adicionar II gotas de Na2CO3 a 25%, II gotas de Formaldeido a 4% e II gotas de o-dinitrobenzeno a 5%. Aquecer a mistura em BM. Resultado: colorao violeta, indica reao positiva. SESQUITERPENOLACTONAS E OUTRAS LACTONAS Dissolver alguns miligramas do extrato em 3mL de Metanol e filtrar se necessrio. Adicionar XII gotas de soluo alcolica de Cloridrato de Hidroxilamina a 10% e duas gotas de soluo metanlica de KOH a 10%. Aquecer suavemente em BM durante 2min. Em seguida esfriar e acidificar com soluo de HCl a 1N. Adicionar I gota de FeCl 3 1%. Resultado: o aparecimento de colorao violeta, indica reao positiva. * Outra tcnica (soluo pulverizadora) Dissolver alguns miligramas do extrato em lcool Metlico. Aplicar atravs de um capilar, sobre uma folha de papel filtro, de modo a formar uma pequena mancha. Utilizar a tcnica a seguir para revelao. PULVERIZAO: pulverizar com a soluo I, secar brevemente em temperatura ambiente, e em seguida, pulverizar com a II. Resultado: o aparecimento de colorao violeta, indica reao positiva. ESTERIDES E TRITERPENIDES Dissolver alguns miligramas do extrato seco em 10mL de Clorofrmio. Filtrar sobre carvo ativado. Transferir o filtrado para um tubo de ensaio completamente seco. Adicionar 1mL de Anidrido Actico e agitar suavemente, em seguida, adicionar cuidadosamente, III gotas de H2SO4 concentrado. Torne a agitar suavemente. Resultado: observe se h rpido desenvolvimento de cores, que vo do azul evanescente, ao verde persistente que indicam resultado positivo. Obs.: cuidado, pode haver projeo durante a agitao.

AZULENOS Dissolver alguns miligramas do extrato seco em 2mL de Clorofrmio. Filtrar se necessrio. Concentrar at 0,5mL em BM e adicionar 2,5mL da sol. de pdimetilaminobenzaldedo. Aquecer em BM durante 5min. Aps esfriar, em um funil de


decantao, agitar com 10mL de ter de Petrleo. Quando as duas fases estiverem distintas, observe a fase aquosa. Resultado: Quando h presena de proazulenos, a fase aquosa adquire colorao azul, porm, quando estes esto em pequena quantidade, a colorao observada esverdeada. Outra tcnica: Durante o desenvolvimento do perfil cromatogrfico, borrifar a amostra eluida com a soluo de p-dimetilaminobenzaldedo, abandonar sob a luz durante 5 min, em seguida, observe. Resultado: O surgimento de uma mancha azul-claro, indica reao positiva. CAROTENIDES Tcnica 1: dissolva alguns miligramas do extrato seco em 3mL de clorofrmio. Filtrar se necessrio. Juntar 2mL de Clorofrmio saturado com Tricloreto de Antimnio. Resultado: o aparecimento de colorao azul, indica reao positiva. Tcnica 2: substitua o clorofrmio saturado, por gotas de cido Trifluoractico. Resultado: a observao de colorao azul, indica reao positiva. Obs.: este tratamento serve para dissolver os pigmentos amarelos que mascaram a cor azul. DEPSDIOS E DEPSIDONAS Dissolver alguns miligramas do extrato seco em 5mL de ter Etlico. Filtrar se necessrio. Evaporar todo o ter em BM, juntar ao resduo 3mL de Metanol. Agitar e adicionar III gotas de soluo de FeCl3 a 1%. Resultado: o aparecimento de colorao verde, azul ou cinza, indica reao positiva. DERIVADOS DA CUMARINA Dissolver alguns miligramas do extrato seco em 5mL de ter etlico, concentrar em BM at 0,5mL. Em papel filtro, aplique gotas da soluo etrea, de modo a formar duas manchas de aproximadamente 1cm de dimetro cada. A uma destas, juntar 1 gota de soluo de NaOH a 1N. Cubra a metade da mancha com papel escuro, e exponha a outra metade a luz ultravioleta. Descubra e compare. Resultado: fluorescncia azul na parte exposta da mancha, indica reao positiva. ANTRAQUINONAS a) Tcnica 1: dissolver alguns miligramas do extrato seco em 5mL de Tolueno. Filtrar se necessrio. Adicionar 2mL de soluo de NH4OH 10%, agitar suavemente. Resultado: o aparecimento de colorao rsea, vermelha ou violeta na fase aquosa, indica reao positiva. b) Tcnica 2: ferver durante 15min alguns miligramas do resduo, em 10mL de soluo aquosa de H2SO4 a 10%. Filtrar o lquido ainda quente. Transferir o filtrado para um funil de decantao, adicionar mais 10mL de gua destilada, e extrair duas vezes com 10mL de Tolueno. Reunir os extratos tolunicos, e concentrar at 3mL, adicionar a este 3mL de soluo de NH4OH a 10%. Resultado: o aparecimento de colorao rsea, vermelha ou violeta na fase aquosa, indica reao positiva. 4. PERFIL CROMATOGRFICO Dissolver uma pequena quantidade do extrato seco, em solvente apropriado (metanol p. ex.). Aplicar a amostra dissolvida com o auxlio de um tubo capilar, na base da placa cromatogrfica e em dois locais como mostra a figura 1.


Figura 1

Eluir a amostra com eluentes de polaridades crescente (p/ ex.: Hexano/Acetona (80:20), Clorofrmio/ Metanol (90:10) ou Clorofrmio/Metanol/ gua (75:20:05). Desenhar a placa em seu tamanho natural e com todos os detalhes perceptveis em luz visvel. Desenhar novamente a placa desta vez anotando as observaes feita em cmara de luz ultravioleta, e finalmente, revelar as substncias da placa com um reativo geral (Anisaldeido ou sol. de Vanilina) e um especfico. A placa deve ser novamente desenhada com detalhes.

Amostra

A revelao com os reativos deve ser feita da seguinte forma: cobrir a placa cromatogrfica, deixando apenas metade dela exposta, borrifar primeiramente um reativo observar e desenhar, para depois borrifar o outro. Calcular os Rf quando possvel, como mostra a figura 2. Figura 2 Geral Especfico Clculo do fator de Reteno (Rf) Aaaa = H h Rf = fator de Reteno h= distncia percorrida pela substncia H= distncia percorrida pelo eluente H Rf = h H


apostila fitoquimica

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