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D. Fitoquímica 24

D. FITOQUÍMICA

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 25 2. EXPERIMENTAL ............................................................................................................... 32

2.1. Métodos cromatográficos.............................................................................................. 32 2.1.1. Cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC)..................................... 32 2.1.2. Cromatografia em coluna ....................................................................................... 33

2.2. Estudo das folhas de Smallanthus sonchifolius............................................................. 35 2.2.1. Origem do material vegetal .................................................................................... 35 2.2.2. Extrato de lavagem foliar de S. sonchifolius #130 ................................................. 35 2.2.3. Isolamento de LSTs do extrato de lavagem foliar de S. sonchifolius #130 ........... 36 2.2.4. Extratos de folhas com e sem tricomas glandulares de S. sonchifolius #101......... 38 2.2.5. Coleta de tricomas glandulares de folhas............................................................... 39 2.2.6. Análise dos extratos glandulares por meio de CLAE ............................................ 39

2.3. Identificação e elucidação estrutural ............................................................................. 40 2.3.1. Métodos espectroscópicos e espectrométricos....................................................... 40

2.3.1.1. Espectrometria de massas................................................................................ 40 2.3.1.2. Espectroscopia na região do IV....................................................................... 41 2.3.1.3. Espectroscopia de RMN.................................................................................. 41

2.3.2. Elucidação estrutural automatizada via SISTEMAT ............................................. 41 2.3.3. Confôrmeros de baixa energia................................................................................ 42

3. RESULTADOS E DISCUSSÕES ................................................................................... 43 3.1. Extrato de lavagem foliar de S. sonchifolius #130 ........................................................ 43

3.1.1. Isolamento de terpenóides da fase hidrometanólica de S. sonchifolius #130......... 43 3.1.2. Identificação e elucidação estrutural ...................................................................... 46

3.1.2.1. LST 1 (Enidrina) ............................................................................................. 46 3.1.2.2. LST 2 (Uvedalina)........................................................................................... 54 3.1.2.3. LST 3 (Sonchifolina)....................................................................................... 59 3.1.2.4. LST 4 (Fluctuanina) ........................................................................................ 62 3.1.2.5. LST 5............................................................................................................... 68 3.1.2.6. LST 6............................................................................................................... 72 3.1.2.7. LST 7............................................................................................................... 76 3.1.2.8. LST 8 (Polimatina B) ...................................................................................... 82 3.1.2.9. LST 9............................................................................................................... 90 3.1.2.10. LST 10 (Dímero de melampolidos) .............................................................. 97 3.1.2.11. Dados de RMN 1H de todas LSTs............................................................... 111

3.1.3. Características dos metabólitos secundários isolados .......................................... 113 3.1.3.1. LST 1 (Enidrina) ........................................................................................... 113 3.1.3.2. LST 2 (Uvedalina)......................................................................................... 114 3.1.3.3. LST 3 (Sonchifolina)..................................................................................... 115 3.1.3.4. LST 4 (Fluctuanina) ...................................................................................... 116 3.1.3.5. LST 5............................................................................................................. 117 3.1.3.6. LST 6............................................................................................................. 118 3.1.3.7. LST 7............................................................................................................. 119 3.1.3.8. LST 8 (Polimatina B) .................................................................................... 120 3.1.3.9. LST 9............................................................................................................. 121 3.1.3.10. LST 10 (Dímero de melampolidos) ............................................................ 122

3.2. Avaliação espectroscópica de extratos de folhas com e sem tricomas glandulares .... 124 3.3. Extrato glandular de S. sonchifolius e caracterização dos picos ................................. 125

4. BIBLIOGRAFIA................................................................................................................ 127

D. Fitoquímica 25

1. INTRODUÇÃO

Smallanthus sonchifolius (Poepp. & Endl.) H. Robinson, subtribo

Melampodiinae, tribo Heliantheae (Bremer, 1994) foi originalmente

classificada como Polymnia por Linnaeus em 1715. Blake, em 1917 e

1930, fez a primeira revisão do gênero e Wells (Wells, 1965) manteve o

termo Polymnia. Mais recentemente, Robinson (Robinson, 1978) dividiu

o gênero Polymnia em dois: Polymnia e Smallanthus, mantendo ambos

em Melampodiinae. A partir de então, yacón passou a pertencer ao

gênero Smallanthus. Embora a classificação de Robinson seja bem aceita, a antiga ainda é

muito utilizada. A espécie Smallanthus sonchifolius (Poepp. & Endl.) H. Robinson -

sinonímia Polymnia sonchifolia Poepp. & Endl, é uma das 21 espécies deste gênero

americano, o qual é apresentado na tabela D1 (Grau e Rea, 1999).

A espécie possui inúmeros nomes populares em espanhol (yacón, llamón, arboloco,

puhe, jícama e jíquima), em inglês (yacon, jiquima e yacon strawberry), em francês (poir de

terre Cochet), em alemão (Erdbirne) e em italiano (polimnia) (Nieto, 1991). No Brasil, a

espécie é popularmente conhecida como yacón.

Tem origem na região andina, onde foi encontrada em tumbas Incas do Peru e hoje

cresce livremente principalmente na Venezuela, Colômbia, Equador, Bolívia, Peru e noroeste

da Argentina. Desenvolve-se a princípio em regiões de 880 a 3500 m de altitude, embora

esteja se adaptando muito bem ao nível do mar (Valentová e Ulrichová, 2003).

As espécies de Smallanthus parecem ter preferência por locais de distúrbio ecológico,

como por exemplo, em locais de desmatamento, beira de rios e estradas. Assim, em função da

agricultura baseada em desmatamento e queimadas, o yacón foi tornando-se cada vez mais

freqüente como erva daninha, que aos poucos foi chamando a atenção pelas características de

suas raízes tuberosas. Então essa erva passou a ser cultivada, o que deve ter ocorrido nas

regiões norte da Bolívia e central do Peru. O primeiro registro sobre o yacón data de 1615,

quando Felipe Guaman Poma de Ayala cita-o em uma lista de 55 plantas cultivadas pelos

povos andinos. Depois o cronista Padre Barnabé Cobo, em 1653, deixa registrado em um

livro a descrição do yacón, dizendo que é uma fruta que se come cru, que tem sabor muito

bom e ainda melhor se exposta ao sol, também disse que é uma fruta maravilhosa para

transporte em embarcações, pois dura muito, como no original: "Comense crudas por frutas y

tienen muy buen sabor, y mucho mejor si se passan al sol. Es maravillosa fruta para

embarcada, porque dura mucho tiempo" (Valentová e Ulrichová, 2003; Zardini, 1991). Há

muito que o yacón chegou na Europa, na Itália foi bastante cultivado nos idos de 1930, mas o

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cultivo não resistiu à segunda guerra mundial (Grau e Rea, 1999). Atualmente o yacón vem

conquistando o mercado internacional (Zardini, 1991), sendo cultivado na Itália, França,

Alemanha, EUA, República Tcheca, Rússia, Japão e Brasil (Valentová et al., 2001; Valentová

e Ulrichová, 2003). Sua produção aumentou durante um grande período de seca na região

andina nos anos de 1982-1983, quando a produção de batata inglesa foi muito afetada. O

problema da sua marginalização está conectada ao fato de não haver uma técnica de produção

intensiva, talvez por não ser ainda costumeiramente consumida em áreas urbanas, embora

vários estudos tenham sido realizados na área agrícola (Estrella e Lazarte, 1994; Grau e Rea,

1999; Nieto, 1991; Zardini, 1991).

S. sonchifolius (Fig. D1) é uma planta herbácea perene que multiplica-se por rizomas

(Nieto, 1991). Os caules aéreos são cilíndricos, de coloração esverdeada, apresentam

pilosidade em toda a superfície e chegam a medir até 2,5 m de altura. As folhas brotam de

gemas do caule aéreo, são opostas, delgadas, apresentam as bordas lobuladas e formam uma

ala de cada lado do pecíolo. Apresentam várias estruturas secretoras, tais como tricomas,

idioblastos e hidatódios (Dip., 1986). As flores estão agrupadas nas extremidades dos ramos e

são de dois tipos: as liguladas, que se encontram nos bordos, e as tubulares, na parte central da

inflorescência.

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A

B

C Figura D1. Partes aéreas de Smallanthus sonchifolius. A e B mostram fotografias feitas no campo de

cultivo do CERAT, UNESP em Botucatu, SP, e C foi obtida na internet.

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Suas raízes tuberosas, suculentas e translúcidas, são descritas como pêras ou maçãs,

com odor que lembra a melancia (Ohyama et al., 1990; Valentová e Ulrichová, 2003). O

sistema subterrâneo (Fig. D2) é constituído de três partes distintas: os tubérculos − que são

ricos em frutanos e fibras não digeríveis − dos quais originam-se gemas que formarão uma

nova planta, as raízes de absorção e fixação, e as raízes tuberosas ou de reserva, também ricas

em frutanos, que chegam a pesar até 2 kg, sendo as preferidas para o consumo humano.

Figura D2. Raízes tuberosas de Smallanthus sonchifolius.

A maioria das raízes tuberosas em Asteraceae possui a capacidade de armazenar

amido, polímero de glicose. Entretanto, o yacón é um enorme reservatório de inulina, um

polímero de frutose com um resíduo de glicose (Carvalho et al., 2004). Também armazenam

vários carboidratos como frutose, glicose, sacarose, oligossacarídeos de baixa polimerização e

traços de amido. A inulina de alta polimerização é comum em espécies de Asteraceae, como

Helianthus e Dahlia, mas no yacón está em baixa quantidade. Porém os oligofrutanos de

baixa polimerização, de até doze graus, chegam a perfazer 67 % da matéria seca da batata do

yacón, e o tipo de ligação de polimerização mostra que são do tipo existente na inulina (Grau

e Rea, 1999). Os oligofrutanos auxiliam no desenvolvimento de bífido bactérias benéficas no

intestino, na assimilação de cálcio, têm efeito favorável na diminuição do colesterol, de

triglicérides e de microorganismos putrefativos (Carvalho et al., 2004). Assim o yacón pode

prover redução de calorias e as fibras necessárias para o combate ao estresse da vida

sedentária, que geralmente vem associado ao consumo de muito carboidrato e gordura.

A síntese e degradação destes carboidratos ocorrem por meio de um sistema

multienzimático. A enzima sacarose-sacarose-frutosiltransferase transfere um resíduo de

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frutose de uma molécula de sacarose, açúcar comum, para outra, resultando em um tri-

sacarídeo, chamado de cetose, e mais um resíduo de glicose livre. A seguir, a enzima frutano-

frutano-frutosiltransferase transfere outros resíduos de frutose para a cetose, promovendo a

polimerização da cadeia (Carvalho et al., 2004).

A afirmação do Padre Barnabé quanto à melhora do sabor das raízes quando expostas

ao sol foi confirmada por meio de estudos bromatológicos (Carvalho et al., 2004; Nieto,

1991). As investigações demonstram que com a exposição das raízes ao sol por 15 dias, o

conteúdo de açúcar aumenta nove vezes (Nieto, 1991). Neste caso ocorre a despolimerização

da molécula de inulina por meio da enzima frutano-hexohidrolase, o que acarreta o acúmulo

de frutose e de glicose. O processo de despolimerização da inulina gera energia para o

processo de respiração e transpiração celular.

A batata do yacón é também rica em minerais como potássio, fósforo, ferro, zinco,

magnésio, sódio, cálcio e cobre, além de caroteno, retinol, vitamina C, niacina e riboflavina

(Grau e Rea, 1999).

S. sonchifolius tem um alto potencial para tornar-se um importante alimento dietético,

uma vez que a inulina não é hidrolisada por complexos enzimáticos de humanos (Alfaro e

Melgarejo, 2005). A batata do yacón é comercializada na Europa, em feiras livres, como

alimento funcional e suplemento alimentar, especialmente para idosos, diabéticos e mulheres

no climatério. Nos mercados locais da região andina o yacón é vendido como fruta,

juntamente com maçã, abacaxi, abacate, etc (Valentová e Ulrichová, 2003). A sua aparência

pode parecer um pouco estranha, pois é vendida quando a pele da batata está enrugada. Tal

fato ocorre porque a batata é exposta ao sol, processo para aumentar o seu sabor doce. O

yacón é consumido cru, em saladas de frutas, cozido, frito em fatias finas, grelhado e até

como suco. As folhas são utilizadas para alimentação bovina, mas a presença de LSTs na

superfície das mesmas altera a sua palatabilidade (Grau e Rea, 1999).

As folhagens de S. sonchifolius são utilizadas na medicina popular na forma de infusão

para tratamento de diabetes (Valentová et al., 2001). Estudos realizados com animais normais,

diabéticos e com diabetes induzida demonstram que além de normalizar os níveis de glicose

no sangue, um infuso de folhas de yacón parece aumentar a concentração plasmática da

insulina (Aybar et al., 2001). O extrato aquoso e o chá de folhas de yacón reduzem a produção

de glicose por meio da diminuição da gliconeogênese e da glicogenólise em hepatócitos, além

de atuar de forma similar à insulina e proteger contra danos oxidativos (Valentová et al.,

2003; Valentová et al., 2004). A enidrina (1), a LST de maior concentração nos extratos de

folhas de S. sonchifolius, foi administrada oralmente a ratos a 100 mg/kg com 1,5 mg/kg de

D. Fitoquímica 30

glicose. Os resultados mostram que esta substância possui atividade antidiabética, pois os

valores de glicose no sangue foram de 140,8 mg/dL para os ratos tratados e de 216,8 mg/dL

para os controles (Kawashima et al., 2001). Além disso, a enidrina apresenta as atividades

antiinflamatória (Hwang et al., 1996), antifúngica e antimicrobiana (Inoue et al., 1995).

De S. sonchifolius foram isolados quatro diterpenóides do tipo caurano (Kakuta et al.,

1992), flavonóides, vários derivados do ácido cinâmico como os ácidos caféico, cumárico,

ferúlico e clorogênico (Simonovska et al., 2003), além de várias LSTs do tipo melampolido,

dentre outros metabólitos secundários. O número de LSTs isoladas do gênero Smallanthus é

apresentado na tabela D1.

Tabela D1. Espécies do gênero Smallanthus, sua localização e número de LSTs (melampolidos) isoladas.

Espécies Melampolidos isolados Localização geográfica S. apus (Blake) - S. connatus (Spreng.) - Brasil, Paraguai, Uruguai, Argentina S. fruticosus (Benth.) 5 (Bohlmann et al., 1980) Colômbia, Equador, Peru S. glabratus (DC.) 1 (Bohlmann et al., 1985) Chile, Equador, Peru S. jelksii (Hieron.) - Peru S. latisquamus (Blake) - Costa Rica S. lundellii - Guatemala S. macroscyphus (Baker ex. Martius) A. Grau

8 (DePedro et al., 2003) Bolívia, Argentina

S. maculatus (Cav.) - México, Guatemala, Honduras, Salvador, Costa Rica, Nicarágua

S. macvaughii (Wells) 4 (Castro et al., 1989) México S. meridensis (Steyerm.) - Venezuela, Colômbia S. microcephalus - Equador S. oaxacanus (Sch. Bip. ex Klatt) - México, Guatemala, Honduras S. parviceps (Blake) - Peru, Bolívia S. pyramidalis (Triana) - Venezuela, Colômbia, Equador S. quichensis (Coult.) - Costa Rica, Guatemala S. riparius (H.B.K.) - México, Bolívia S. siegesbeckius (DC.) - Peru, Bolívia, Brasil, Paraguai S. sonchifolius (Poepp. & Endl.) 7 (Inoue et al., 1995; Lin

et al., 2003; Valentová et al., 2003)

Venezuela, Colômbia, Equador, Peru, Bolívia

S. suffruticosus (Baker) - Venezuela S. uvedalius (L.) (Mackenzie) 7 (Bohlmann et al., 1985) Estados Unidos

O yacón ainda possui uma característica interessante de manchar as mãos de quem

manuseia suas folhas, o que é causado por peroxidases.

A espécie é conhecida por sua alta resistência a pragas (Hashidoko et al., 1993; Inoue

et al., 1995; Kakuta et al., 1992; Takasugi e Masuda, 1996), o que foi relacionado à presença

de tricomas glandulares (Hashidoko et al., 1993; Inoue et al., 1995), especialmente porque

estas são estruturas que armazenam LSTs, substâncias alergênicas e amargas.

A localização de LSTs em tricomas glandulares de espécies de Heliantheae

possibilitou a otimização de estudos fitoquímicos, reduzindo custos, tempo de análise e

D. Fitoquímica 31

consumo de material (Spring, 1991; Spring e Buschmann, 1994). Isso foi possível através do

emprego da técnica denominada microamostragem de tricomas glandulares. A metodologia

analítica consiste em coleta manual de tricomas glandulares, preparo do extrato glandular e

análise por meio da CLAE (Da Costa et al., 2001; Spring, 1991). Geralmente os metabólitos

presentes nos tricomas podem ser indiretamente identificados por meio da comparação de

seus dados cromatográficos com os de substâncias previamente conhecidas, cujos dados são

compilados na forma de um banco de dados. A metodologia preparativa é uma adaptação da

anterior. Ela compreende a obtenção de extrato glandular com grande número de tricomas,

sendo, portanto necessária a lavagem das superfícies íntegras das folhas ou das flores do

vegetal. O extrato é também analisado em CLAE e seus metabólitos são isolados em escala

preparativa. Estes metabólitos são posteriormente submetidos à análise espectroscópica para

sua elucidação estrutural.

Neste trabalho, o intuito foi isolar quantidades suficientes de LSTs para que fossem

utilizadas em ensaios biológicos.

D. Fitoquímica 32

2. EXPERIMENTAL

2.1. Métodos cromatográficos 2.1.1. Cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC)

As CCDCs foram realizadas em placas de vidro com 10 ou 20 x 20 cm. Estas eram

recobertas com sílica gel 60 GF254, Merck (0,25 mm) com auxílio de um espalhador do tipo

Desaga. Também foram empregadas placas de alumínio pré-fabricadas Merck, recobertas

com o mesmo tipo de sílica. As amostras foram solubilizadas em solvente apropriado e

aplicadas nas placas com auxílio de capilares de vidro ou por meio de câmara de aplicação de

amostras. As placas foram eluídas em diferentes sistemas de fases móveis, contendo

geralmente hexano, acetona, AcOEt, CHCl3 e HAc. As manchas referentes às substâncias

foram detectadas por meio de luz UV a 254 e 366 nm, assim como por meio de reveladores

químicos. Estes, como o anisaldeído sulfúrico, eram borrifados nas placas e estas eram então

aquecidas até 100 °C, a fim de que houvesse a revelação, ou seja, o desenvolvimento de

coloração através de reações químicas promovidas pelo calor.

O aplicador de amostras consiste em aparelho Camag Automatic TLC Sampler 4

acoplado a um computador com software winCATS, detetor Camag Reprostar 3 e Camag

TLC Scanner 3. As amostras eram solubilizadas em pequeno volume de solvente em frascos

apropriados. Alguns microlitros de amostra eram aplicados sobre a placa, na forma de bandas

muito finas e pré-determinadas.

Vale ressaltar que os reveladores empregados corriqueiramente não estavam sendo

efetivos para as amostras analisadas. Foi realizada então uma pesquisa sobre reveladores

específicos para LST, conforme a tabela D2. Observa-se na CCDC (Fig. D3) que a amostra

(fração 130.6, ver item D2.2.3) possui basicamente duas substâncias predominantes, sendo

uma delas a enidrina (1), a de rf maior (0,70). O revelador à base de vanilina sulfúrica, mais

concentrada do que a normalmente utilizada (Tab. D2), foi escolhido para utilização posterior,

em função da facilidade de obtenção da vanilina em relação ao p-dimetilaminobenzaldeído. O

revelador com sulfato cérico amoniacal não revelou as LSTs.

D. Fitoquímica 33

A B

Enidrina (rf = 0,70)

Figura D3. Amostra (10 µg da fração 130.6) com enidrina em CCDCs eluídas em CHCl3/acetona 6:1. A: revelado com p-dimetilaminobenzaldeído; B: revelado com vanilina sulfúrica.

Tabela D2. Reveladores para LSTs. Revelador vanilina sulfúrica

(Picman et al., 1980) p-dimetilaminobenzaldeído(Picman et al., 1980)

sulfato cérico amoniacal (Zamyatina e Shvets, 1995)

Quantidade 0,5 g 0,5 g 0,5 g 9 mL EtOH (95 %) 9 mL EtOH (95 %) 45 mL H2O 0,5 mL H2SO4 0,5 mL H2SO4 5 mL H2SO4 Preparo 3 gotas HAc 3 gotas HAc -

Fase móvel CHCl3/acetona 6:1 CHCl3/acetona 6:1 hexano/AcOEt/ CHCl3 3:4:3 com 2 % HAcCor da mancha (10 µg amostra)

Azul forte, fundo amarelo marrom não revelou

2.1.2. Cromatografia em coluna Foram empregados os seguintes materiais e fases móveis:

a) cromatografia líquida a vácuo (CLV)

A técnica é apropriada para extratos brutos com massa menor que 1 g (Coll e Bowden,

1986), possibilitando análises em tempo reduzido, de minutos até poucas horas. O

equipamento consiste de um funil de vidro com placa sinterizada e um balão coletor.

A fase estacionária, sílica gel 60 H, Merck (0,040-0,063 mm), é empacotada no funil

e, para forçar a passagem do eluente, utiliza-se pressão reduzida, gerada por uma

bomba de vácuo acoplada abaixo da coluna (Pelletier et al., 1986). A amostra é

solubilizada em pequeno volume de solvente apropriado, adicionada de sílica gel 60 e

misturada até total adsorção da amostra na sílica, que é então depositada no topo da

coluna seca. A fase móvel utilizada foi em esquema de gradiente crescente de

polaridade, iniciando-se com 100 % de hexano até 100 % de AcOEt, e finalmente com

100 % de MeOH para a limpeza da coluna.

D. Fitoquímica 34

b) cromatografia flash

A técnica constitui-se basicamente de cromatografia de adsorção em coluna, sendo que

a aparelhagem necessária consiste de uma coluna de vidro e uma válvula controladora

de fluxo, onde a pressão é geralmente produzida com gás nitrogênio, o qual é

introduzido acima da coluna. A coluna possui aproximadamente 46 cm de altura, de

base achatada, com torneira de teflon e junta de vidro esmerilhado 24/40 na parte

superior. A seleção da fase móvel é feita por meio de CCDC, sendo escolhida a fase

móvel que move o componente desejável para um rf = 0,35, e a eluição é sempre

isocrática. Ao contrário da CLV, nesta técnica deve-se ter o cuidado de sempre manter

a fase estacionária coberta com solvente, pois a ausência do mesmo no interior da

coluna danifica o empacotamento e, por conseguinte, a separação. A fase estacionária

geralmente utilizada é a sílica gel 60, Merck (0,040 – 0,063 mm). A maior vantagem

da cromatografia flash, além de promover uma melhor eficiência na separação, quando

comparada com a cromatografia clássica em coluna de vidro, é o tempo reduzido de

análise, por vezes de apenas 15 minutos (Still et al., 1978). A fase móvel empregada

era composta de hexano, AcOEt, CHCl3 com HAc e fluxo de aproximadamente 5

cm/min. A amostra foi solubilizada em pequeno volume de fase móvel e

cuidadosamente depositada no topo da coluna.

c) cromatografia líquida a média pressão (CLMP)

O sistema consiste em coluna de vidro de 550 mm de altura e 10 mm de diâmetro,

empacotada com fase estacionária LiChroprep RP8 Merck (fase reversa, 25-40 µm),

uma bomba Latek (modelo S 1990), cânulas de silicone, fases móveis pré-misturadas

em sistema gradiente, detetor Labomatic de UV regulável, registrador Goerz

Metrawatt (modelo SE 120) com papel milimetrado a 12 cm/h e coletor automático. A

amostra é solubilizada em pequeno volume da fase móvel e aplicada no injetor. A

análise pode durar de minutos até horas e estas dimensões de coluna são próprias para

amostras de até 200 mg. O fluxo é regulável, por exemplo, 1,6 mL/min ocasionam

pressão de 0,07 MPa.

d) cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)

As análises em CLAE foram realizadas em cromatógrafo Shimadzu, modelo SCL 10

AVP, equipado com três bombas Shimadzu, modelo LC-10AD, detetor de arranjo de

diodos UV-Vis-DAD Shimadzu, modelo SPD-M10A, injetores manual e automático e

D. Fitoquímica 35

sistema de integração computadorizado com software CLASS-VP versão 5.02. Foi

utilizada coluna analítica C18 (4,6 x 250 mm; 5 µm, 100 Å) e coluna semipreparativa

C18 (20 x 250 mm; 15µm, 100 Å), Shimadzu. O padrão externo para as análises

cromatográficas em CLAE foi o 2,5-dimetilfenol (DMP), Aldrich, injetado sempre

imediatamente antes da injeção da amostra.

2.2. Estudo das folhas de Smallanthus sonchifolius 2.2.1. Origem do material vegetal

Folhas de S. sonchifolius foram coletadas por K. Schorr. A estabilização e secagem

foram realizadas em estufa de ar circulante a 50 °C por 10 dias. Suas exsicatas foram

depositadas no herbário da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da

Universidade de São Paulo sob códigos SPFR conforme segue:

- código de coleta #101 (SPFR 07646): 12/1999 Departamento de Horticultura do Centro de

Raízes Tropicais (CERAT) da Universidade Estadual Paulista (UNESP), campus Lajeado,

em Botucatu, SP;

- código de coleta #130 (SPFR 07645): 01/2002 Departamento de Horticultura do CERAT

da UNESP, campus Lajeado em Botucatu, SP.

2.2.2. Extrato de lavagem foliar de S. sonchifolius #130 Em cuba metálica contendo CH2Cl2 foram lavadas individualmente, durante 20

segundos, 248 g ou 146 folhas (média de 1,76 g/folha) secas e inteiras de S. sonchifolius

#130. Optou-se por lavagem individual em função do tamanho de cada folha, com mais de 20

cm de comprimento, visto que se as mesmas fossem despedaçadas, causaria extravasamento

de metabólitos presentes em outras organelas, ocasionando a extração de substâncias de pouco

interesse para este estudo. Esta lavagem foi efetuada com auxílio de pinça e com a face

inferior das folhas voltada para baixo, uma vez que os tricomas glandulares localizam-se

justamente nesta face. O extrato obtido foi filtrado em papel de filtro e evaporado, resultando

em 2,6 g de extrato diclorometânico seco (1,05 % de peso seco da droga). O extrato seco foi

solubilizado em MeOH e o material graxo foi precipitado com um terço do volume de água,

resultando em 2,2 g de fase hidrometanólica seca (0,89 % de peso seco da droga). Os extratos

foram submetidos à espectroscopia na região do IV.

D. Fitoquímica 36

2.2.3. Isolamento de LSTs do extrato de lavagem foliar de S. sonchifolius

#130 Por meio de CLV foram obtidas dez frações da fase hidrometanólica do extrato de

lavagem foliar de S. sonchifolius #130. A CLV foi feita com 110 g de sílica gel 60 H em

coluna de 4,5 cm de diâmetro e 10 cm de altura. A eluição foi feita em esquema de gradiente

crescente de polaridade de hexano a AcOEt e a coluna foi limpa com MeOH (Tab. D3). Todas

as amostras foram submetidas à análise espectroscópica na região do IV. Por meio de CCDC

(hexano/AcOEt/CHCl3 3:4:3 com 2 % HAc) e de CLAE (MeOH/H2O, 55:45, 1 mL/min, C-

18) as frações foram selecionadas para obtenção dos espectros de RMN ou para um novo

fracionamento.

Tabela D3. CLV da fase hidrometanólica do extrato de lavagem foliar de S. sonchifolius #130.

Solvente Proporção Volume (mL)

Fração Massa (mg)

hexano - 250 130.1 9 hexano/AcOEt 80:20 250 130.2 6 hexano /AcOEt 70:30 250 130.3 62 hexano /AcOEt 65:35 250 130.4 148 hexano /AcOEt 30:20 250 130.5 321 hexano /AcOEt 55:45 250 130.6 942 hexano /AcOEt 50:50 500 130.7 594 hexano /AcOEt 30:70 250 130.8 167

AcOEt - 500 130.9 263 MeOH - 500 130.10 323

Conforme dados do espectro de RMN 1H, a fração 130.2 compreende um

diterpenóide, porém em função do alto grau de impurezas presentes não foi possível

identificá-lo. Já a fração 130.3 consiste na LST sonchifolina (3).

A fração 130.4 foi submetida a novo fracionamento em escala preparativa em CLAE

com MeOH/H2O 55:45, 9,5 mL/min em coluna semipreparativa C18, resultando em sete

subfrações, sendo seis LSTs puras (Tab. D4).

Tabela D4. Subfrações de 130.4 (CLAE escala semipreparativa em MeOH/H2O). Subfração Massa (mg) LST

130.4.1 4,0 2 130.4.2 3,0 4 130.4.3 2,5 - 130.4.4 2,5 5 130.4.5 4,0 6 130.4.6 2,5 7 130.4.7 3,0 8

A fração 130.5 corresponde à LST uvedalina (2).

D. Fitoquímica 37

A fração 130.6 foi selecionada para refracionamento por meio de cromatografia flash

com 30 cm de altura de sílica gel 60 para flash seca em coluna de 4 cm de diâmetro. A eluição

foi realizada com fase móvel hexano/AcOEt/CHCl3 5:2:3 com 2 % HAc e a coluna foi limpa

com acetona e MeOH. Foram obtidas 40 subfrações e avaliadas por meio de CCDC com fase

móvel hexano/AcOEt/CHCl3 3:4:3 com 2 % HAc, sendo reunidas em oito subfrações, de

130.6.1 a 130.6.8, sendo a subfração 130.6.4 (200 mg) correspondente à enidrina (1).

A fração 130.7 trata-se também da LST enidrina (1).

A fração 130.8 foi refracionada por meio de diferenças de solubilidade. A amostra

seca foi adicionada de AcOEt, solubilizando-se apenas uma porção da mesma. A parte

insolúvel em AcOEt (subfração 130.8.1, 36 mg) foi refracionada por meio de CLMP. A parte

solúvel (subfração 130.8.2, 130 mg) corresponde à LST 9.

A subfração 130.8.1 foi purificada por meio de CLMP com coluna de vidro (550 x 10

mm), fase estacionária LiChroprep RP8 Merck e as fases móveis foram inicialmente misturas

de MeOH/H2O 1:1 até MeOH apenas, com fluxo de 1,6 mL/min, durante quatro horas. Todas

as frações (Tab. D5) foram analisadas por meio de CCDC com fase móvel

hexano/AcOEt/CHCl3 2,5:4,5:3 com 2 % de HAc. Foram isolados dois picos (10 mg) largos

parcialmente sobrepostos, porém ambos são referentes à mesma substância 10.

Tabela D5. CLMP da subfração 130.8.1. MeOH/H2O Subfração LST

50:50 130.8.1.1 55:45 130.8.1.2 60:40 130.8.1.3 65:35 130.8.1.4 70:30 130.8.1.5 75:25 130.8.1.6 80:20 130.8.1.7 85:15 130.8.1.8 10 90:10 130.8.1.9 100 % 130.8.1.10

A fração 130.9 foi purificada em escala semipreparativa em CLAE com MeOH/H2O

55:45, 9,5 mL/min em coluna C18, resultando em 15 mg da LST 9.

A fração 130.10 foi também fracionada por meio de CLV. A CLV foi realizada com 5

cm de sílica gel 60 H em coluna de 4,5 cm de diâmetro e 12 cm de altura. A eluição foi feita

em esquema de gradiente crescente de polaridade de hexano a AcOEt e a coluna foi limpa

com MeOH, resultando em 15 subfrações, porém nenhum metabólito secundário foi

identificado.

D. Fitoquímica 38

mistura com diterpeno

130.2

3(62 mg)

130.3

2(4 mg)

130.4.1

4(3 mg)

130.4.2

5(2,5 mg)

130.4.4

6(4 mg)

130.4.5

7(2,5 mg)

130.4.6

8(3 mg)

130.4.7

CLAEC18 (20 x 250 mm)MeOH/H2O 55:45

9,5 mL/min

130.4

2(321 mg)

130.5

1(200 mg)

130.6.4

flashhexano/AcOEt/CHCl3

5:2:3+2 % HAcsilica gel 60

130.6

1(594 mg)

130.7

10(10 mg)

CLMPRP-8 (550 x 1 mm)grad. MeOH/H2O

130.8.1

9(130 mg)

130.8.2

AcOEtMeOH

130.8

9(15 mg)

130.9

CLVgrad. hexano - AcOEt

siligal gel 60H

S. sonchifolius #130fase hidrometanólica

A figura D4 apresenta um esquema resumido do fracionamento.

Figura D4. Fracionamento da fase hidrometanólica do extrato glandular de lavagem foliar de S. sonchifolius #130.

2.2.4. Extratos de folhas com e sem tricomas glandulares de S. sonchifolius

#101 O extrato de lavagem foliar de S. sonchifolius #101 foi obtido como mostra o item

E2.1.2 (Schorr, 2001).

Cerca de 180 g de folhas lavadas secas (Schorr, 2001), ou seja, sem tricomas

glandulares, de S. sonchifolius #101, foram trituradas em liquidificador metálico. Cerca de

152 g do pó foram colocados em Erlenmeyer de 3 L, sendo posteriormente adicionados 2 L de

água fervente. A suspensão foi mantida por 20 min em chapa de aquecimento e sob agitação,

sendo então colocada em uma coluna de vidro para percolação. O infuso foi escoado

inicialmente na velocidade de 84 gotas/min. Depois a velocidade caiu bem e o escoamento

total se deu após dois dias. Obteve-se assim o extrato aquoso. O resíduo de pó foi então

macerado com 2 L de EtOH por seis dias e então escoado e evaporado em evaporador

rotativo, resultando em 6,9 g de extrato etanólico. Por meio de maceração do pó residual com

2 L de CH2Cl2, seu escoamento e evaporação, obteve-se 2,2 g de extrato diclorometânico. O

resíduo foi então submetido à maceração por seis dias com 1 L de hexano, escoado e

evaporado resultando em 12,4 mg de extrato hexânico. Todos os extratos foram submetidos à

análise espectroscópica na região do IV.

D. Fitoquímica 39

A 1 g de pó foram adicionados 10 mL de água e a mistura foi fervida por 10 min,

produzindo um decoto. Um infuso foi preparado com 1 g de pó, 50 mL de água fervente e 20

min de repouso (Aybar et al., 2001).

Também foram preparados infuso e decoto com pedaços de folhas com tricomas

glandulares. As folhas foram controladas sob estereomicroscópio antes e após o preparo dos

chás.

2.2.5. Coleta de tricomas glandulares de folhas Para a coleta manual dos tricomas glandulares utilizou-se estereomicroscópio

Olympus, modelo SZ 6045-CHI. Os extratos glandulares foram preparados em tubos tipo

Eppendorf com capacidade para 1,5 mL. A centrifugação foi realizada em microcentrífuga

Sanyo, modelo Microcentaur.

Da face inferior das folhas de S. sonchifolius, com uma agulha de dissecação os tricomas

glandulares foram coletados e carregados para Eppendorf contendo 40 µL de solvente para

dissolução. Aproximadamente 60 glândulas foram sonicadas em MeOH por alguns segundos e,

após adição de 40 µL de água, foram centrifugadas por 20 segundos em microcentrífuga. O

sobrenadante límpido do extrato glandular foi analisado em CLAE.

2.2.6. Análise dos extratos glandulares por meio de CLAE As condições de trabalho incluem coluna analítica C18 fases MeOH/H2O (55:45; 1,0

mL/min) e CH3CN/H2O (35:65; 1,3 mL/min) e detecção simultânea a 225 e 265 nm à

temperatura ambiente (22 a 25 °C). Tais condições foram monitoradas adequadamente, o que

se reflete na estabilidade e reprodutibilidade do tempo de retenção do padrão 2,5-dimetilfenol

(DMP, 20 µL a 10-8M). Sendo dois sistemas de fase móvel, cada amostra corresponde ao

conteúdo glandular de aproximadamente 30 tricomas provenientes de um mesmo extrato, o

que proporcionou maior uniformidade dos resultados. As análises dos extratos glandulares

ocorreram em seqüência para cada sistema de fase móvel, evitando assim eventuais alterações

a que o sistema pudesse estar sujeito. Uma vez obtidos os cromatogramas dos extratos glandulares a 225 e 265 nm, em 60

min de eluição, foram calculados, para cada pico, os seguintes dados:

- tempo de retenção relativo ao padrão interno no sistema 1 (MeOH/H2O) - trr1;

- tempo de retenção relativo ao padrão interno sistema 2 (CH3CN/H2O 3:7) - trr2;

D. Fitoquímica 40

- comprimento de onda máximo no UV - λmáx (obtidos através do detetor de arranjo

de diodos).

Inicialmente expandiu-se a escala do eixo das ordenadas (mAU) do cromatograma

para visualizar a presença de picos com baixa intensidade de absorção. O tempo de retenção

obtido de cada pico foi dividido pelo tempo de retenção do padrão DMP, injetado

imediatamente antes. A relação entre os dois tempos de retenção é sempre constante para uma

mesma substância (trr). O espectro na região do UV de cada pico também pode ser

confrontado com os espectros das substâncias presentes no banco de dados sobre LSTs

conhecidas e a porcentagem de similaridade pode ser considerada. O comprimento de onda de

absorção máxima na região do UV, λmáx, pode ser utilizado como um dos critérios para

caracterização de uma substância.

2.3. Identificação e elucidação estrutural 2.3.1. Métodos espectroscópicos e espectrométricos 2.3.1.1. Espectrometria de massas

Os espectros de massas foram obtidos por meio dos métodos EI, CI, APCI e ESI.

- Electron impact (EI) - substâncias 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10:

Aparelho: Finnigan MAT 8200

Energia de ionização: 70 eV

Fonte de íons: 230 °C, 1 mA, 3kV

- Chemical ionization (CI) - substâncias 2, 4, 5, 6, 7, 8 e 9:

Aparelho: Finnigan TSQ 7000


Fonte de íons: 200 °C, 500 µA

Gás reagente: isobutano (1205 mT)

- Atmosphere pressure chemical ionization (APCI) - substância 10:


- Electrospray ionization (ESI) - substâncias 9 e 10:



D. Fitoquímica 41

- Electrospray ionization (ESI)- substância 10:

Aparelho: Finnigan LTQ-FT


Fonte de íons: 250 °C, 4-4,5 kV

2.3.1.2. Espectroscopia na região do IV

Os espectros na região do IV foram obtidos em espectrômetro Perkin-Elmer 1600.

Nesse espectrômetro utilizam-se pastilhas de KBr em micropastilhador para substâncias

sólidas e cela de NaCl onde se depositam as amostras (geralmente goma) solúveis em CHCl3

ou EtOH, em forma de filme.

2.3.1.3. Espectroscopia de RMN

Os espectros de RMN foram registrados nos seguintes aparelhos:

- Bruker DPX 300, operando em 300 MHz para 1H e em 75 MHz para 13C

- Bruker DRX 400, operando em 400 MHz para 1H e em 100 MHz para 13C

- Variant Unity 300, operando em 300 MHz para 1H e em 75 MHz para 13C

As amostras foram solubilizadas em solvente deuterado Aldrich, sendo que o sinal de

CDCl3 e de TMS serviram como referência interna. As constantes de acoplamento (J) são

fornecidas em Hz e o deslocamento químico (δ) em ppm.

2.3.2. Elucidação estrutural automatizada via SISTEMAT Os dados de RMN 13C propostos foram analisados por meio do sistema especialista

SISTEMAT (Emerenciano et al., 1994). Este é um sistema especialista que foi desenvolvido

para estudos das áreas de quimiotaxonomia e elucidação estrutural automatizada de produtos

naturais. As estruturas propostas foram analisadas por meio dos programas SISCONST e

C13MATCH, sendo cada subestrutura analisada individualmente. No caso das LSTs, são

considerados subestruturas os ésteres, o anel lactônico, anéis restantes e outras cadeias

laterais. Esta abordagem permite ao SISTEMAT propor substâncias desconhecidas ao

sistema.

Os dados de RMN 13C de cada LST foram fornecidos ao programa que procurou

estruturas com os deslocamentos químicos fornecidos, com uma faixa tolerável de erro em

gradiente de 0,1 a 1,5 ppm.

D. Fitoquímica 42

2.3.3. Confôrmeros de baixa energia As fórmulas estruturais foram desenhadas com o programa ChemDraw® Ultra,

Chemical Structure Drawing Standard (CambridgeSoft Corporation).

Para todas as estruturas foi realizado um estudo para determinar seus confôrmeros de

menor energia. Todas as minimizações de energia foram realizadas com o programa

Molecular Modelling-System HyperChemTM Version 7.0 Professional (Hypercube, Inc.) em

um computador com sistema operacional Microsoft Windows XP, Home Edition, Version

2002, processador Intel Pentium, 1500 MHz.

A minimização de energia foi efetuada com o HyperChemTM implementado com

campo de força MM+ e com a utilização do alogarítmo Polak-Ribière. MM+ é uma

modificação do campo de força MM2 de N. L. Allinger (Allinger, 1977). A minimização de

energia foi realizada por meio do método semi-empírico AM1, Austin Model 1 (Dewar et al.,

1985; Dewar e Dieter, 1986).

Os cálculos foram efetuados por meio da opção conformational search do

HyperChemTM. As geometrias iniciais foram fornecidas pelo HyperChemTM em campo de

força MM+ sob um gradiente RMS < 0,01 kcal mol-1 Å-1. O próximo passo foi realizado com

a utilização da opção usage directed search method, o que significa que cada confôrmero de

baixa energia encontrado passou a ser utilizado como ponto de partida para a próxima

minimização. Todas as ligações passíveis de rotação nos anéis foram consideradas variáveis.

Os testes de duplicata foram efetuados a partir das geometrias iniciais. Os ésteres não foram

inicialmente considerados na busca pelos confôrmeros de menor energia porque o tempo de

cálculo e o número de confôrmeros aumentariam drasticamente. A minimização de energia foi

calculada para 2500 geometrias para cada estrutura e 20 confôrmeros foram selecionados. Os

ésteres foram adicionados aos confôrmeros selecionados e a sua energia foi novamente

minimizada sob o campo de força MM+ e pelo método semi-empírico AM1.

D. Fitoquímica 43

3. RESULTADOS E DISCUSSÕES

3.1. Extrato de lavagem foliar de S. sonchifolius #130 O extrato diclorometânico de lavagem foliar da população #130 foi avaliado quanto à

absorção na região do IV (Fig. D5). O espectro apresenta como principal característica bandas

de absorção de estiramento de grupamento carbonila de γ-lactonas em torno de 1760 cm-1.

Esta característica sugere a presença de LSTs. Já no espectro da fase hidrometanólica, estas

bandas são mais intensas, sugerindo uma maior concentração de LSTs.

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

0

20

40

60

80

100

120

1760

A

% tr

ansm

itânc

ia

comprimento de onda (cm-1)

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

0

20

40

60

80

100

120

1760

B

% tr

ansm

itânc

ia


Figura D5. Espectros na região do IV (filme em CHCl3) dos extratos de lavagem foliar de S. sonchifolius

#130; A: extrato diclorometânico; B: fase hidrometanólica.

3.1.1. Isolamento de terpenóides da fase hidrometanólica de S. sonchifolius

#130 A fase hidrometanólica foi fracionada por meio de CLV. Posteriormente, as frações

130.4, 130.6 e 130.8 foram refracionadas, levando ao isolamento de dez LSTs. Destas oito já

haviam sido isoladas anteriormente, sendo seis (1-4, 7-8, item D3.1.2.11 e Fig. D68) de S.

sonchifolius, tribo Heliantheae, (Inoue et al., 1995; Lin et al., 2003), uma (5) de Enydra

anagallis, tribo Heliantheae, (Bardón et al., 2001) e uma (6) de Grazielia intermedia, tribo

Eupatorieae, (Bohlmann et al., 1981b).

O primeiro grupo de frações (130.1 a 130.10) foi submetido à análise por meio de

espectroscopia na região do IV e os espectros são apresentados a seguir:

D. Fitoquímica 44

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

0

20

40

60

80

100

130.117

20

% tr

ansm

itânc

ia

comprimento de onda (cm-1)4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

0

20

40

60

80

100

130.2

1720

% tr

ansm

itânc

ia


4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

0

20

40

60

80

100

130.3

1720

1770

% tr

ansm

itânc

ia

comprimento de onda (cm-1)4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

0

20

40

60

80

100

130.4

172017

70

% tr

ansm

itânc

ia


4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

0

20

40

60

80

100

130.5

174017

70% tr

ansm

itânc

ia


4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

0

20

40

60

80

100

120

130.6

1740

1770

% tr

ansm

itânc

ia


Figura D6. Espectros na região do IV (filme em CHCl3) das frações 130.1 a 130.6 provenientes da CLV com a fase

hidrometanólica do extrato glandular de lavagem foliar de S. sonchifolius #130.

D. Fitoquímica 45

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

0

20

40

60

80

100

120

130.7

1760

% tr

ansm

itânc

ia


4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

0

20

40

60

80

100

120

130.8

1710

1760

% tr

ansm

itânc

ia


4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

0

20

40

60

80

100

120

130.9

17201760

% tr

ansm

itânc

ia


4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

0

20

40

60

80

100

130.10

172017

60

% tr

ansm

itânc

ia


Figura D7. Espectros na região do IV (filme em CHCl3) das frações 130.7 a 130.10 provenientes da CLV

com a fase hidrometanólica do extrato glandular de lavagem foliar de S. sonchifolius #130.

Os espectros das frações 130.1 e 130.2 apresentam basicamente bandas de absorção de

estiramento C-H entre 2.850 e 2.960 cm-1 e bandas de estiramento de carbonila em torno de

1.720 cm-1 (baixa intensidade). Este fato justifica o não isolamento de LSTs destas frações,

uma vez que não foram observadas as já mencionadas bandas de estiramento de carbonila de

γ-lactonas.

Nos espectros das frações 130.3 a 130.10 aparecem bandas de absorção de estiramento

de C-H entre 2.850 e 2.960 cm-1, de estiramento de carbonila de ésteres entre 1.720 e 1.740

cm-1, de grupos -OH de álcoois e fenóis entre 3.600 e 3.200 cm-1 e bandas de absorção

características de estiramento de carbonila de γ-lactonas em 1.760 e 1.770 cm-1. Na fração

130.10, a banda de carbonila de lactonas é de intensidade relativamente menor do que nos

espectros das outras frações que a contém. Sendo assim, LSTs foram isoladas apenas destas

sete frações.

A fração 130.1, as subfrações de 130.10 e de 130.6 (com exceção da 130.6.4) foram

submetidas à análise por meio de RMN, mas não foram detectadas substâncias de interesse

para este estudo.

D. Fitoquímica 46

nm

200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420

mAU

0

100

200

300 10.09 min

O

O

O O

OO

O

O

O

O

12

34

56

7

8910

11

12

13

14

15

1' 2'3'

4'

5'1''

2''

1'''

3.1.2. Identificação e elucidação estrutural Os confôrmeros de baixa energia calculados pelo HyperChemTM são apresentados no

início da discussão sobre a identificação ou elucidação estrutural de cada susbtância. Os

átomos de hidrogênio não são mostrados. A cor cinza representa átomos de carbono e a cor

branca representa átomos de oxigênio. A apresentação das moléculas tridimensionais teve

como intuito fornecer mais uma possibilidade de se avaliar a estereoquímica, conformação ou

até algumas interações atômicas, podendo desta forma facilitar a interpretação de alguns

dados dos espectros de RMN.

3.1.2.1. LST 1 (Enidrina)

4α,5β-epóxi-8β-(2’S,3’S-epóxi-angeloilóxi)-9α-acetoilóxi-germacra-1(10)Z,11(13)-dien-

6α,12-olido-14-oato de metila

A substância foi submetida a análises através dos seguintes métodos espectroscópicos:

UV, RMN 1H, 13C e 1H−1H COSY 45°. A figura D8 apresenta o espectro na região do UV,

onde o máximo de absorção ocorre em 212 nm. Vale ressaltar que para todas as outras LSTs

isoladas, os espectros na região do UV são muito semelhantes a este.

Figura D8. Espectro na região do UV para LST 1.

D. Fitoquímica 47

O espectro de RMN 1H apresenta em δ 6,33 e 5,84 sinais característicos de

hidrogênios de dupla exocíclica de anel γ-lactônico α,β-insaturado. Esses sinais são dubletos

referentes aos H13a/b que acoplam com o sinal em δ 3,01, referente ao H7, com constantes de

acoplamento iguais ou maiores do que 3,0 Hz. A magnitude deste acoplamento indica que o

anel lactônico é transóide, uma vez que em cis-lactonas esta magnitude é menor do que 3,0

Hz. No espectro de 1H−1H COSY é possível observar que o sinal de H7 ainda acopla

fracamente com um sinal em δ 6,71, um duplo dubleto característico para H8 ligado a um

carbono substituído por um átomo de oxigênio. Em função da pequena magnitude da

constante de acoplamento entre H7 e H8, conclui-se que os mesmos formam um ângulo

diedro pouco menor que 90°, o que indica que os mesmos estão em relação cisóide. Assim, se

H7 está orientado em α, característico de trans-lactonas, então H8 também deve possuir a

mesma orientação em α. Observa-se a sobreposição de outros dois sinais sobre o de H7.

Portanto, a orientação do éster epóxi-angelato deve ser β, de acordo com o esperado para a

tribo Heliantheae (Bohlmann, 1990). A presença deste éster foi confirmada devido à

observação de um multipleto para H3’ em δ 3,01, um dubleto para H4’ em δ 1,17 e um

singleto para H5’ em δ 1,45.

Um dubleto em δ 5,87 que acopla com o sinal de H8, o duplo dubleto em δ 6,71, foi

atribuído ao H9. Com base no valor deste deslocamento, conclui-se que C9 está também

substituído por alguma função oxigenada, além de ser alílico. A magnitude deste acoplamento

(8,5 Hz), observado também no espectro de 1H−1H COSY, indica que H8/H9 devem estar em

relação transóide. Logo, se o H8 está orientado em α, o H9 deve estar em β.

O deslocamento paramagnético de H8 (δ 6,71) é causado pela orientação de um grupo

carbonílico do substituinte que o deixa no mesmo plano da ligação, causando sua

desblindagem, o que é comum em outros melampolidos que possuem o mesmo padrão de

substituição. Assim, entende-se que o substituinte no C9 é também um éster, o qual está

orientado em α, fato confirmado pela presença do sinal característico dos hidrogênios da

metila de um acetato em δ 2,05.

Um sinal de uma metoxila em δ 3,83, a ausência de sinais que indicam a presença de

uma metila em C14 e a presença de um sinal para um carbono carbonílico no espectro RMN 13C em δ 165,5, indica a presença de um éster metílico (COOCH3) no C10. Os outros três

sinais de carbonos carbonílicos observados no espectro fazem parte do éster epóxi-angelato

no C8 (δ 170,3), do grupo acetato no C9 (δ 168,0) e do C12 (δ 168,3) no anel lactônico.

D. Fitoquímica 48

A ausência de sinal para o H10, o deslocamento paramagnético de H1 (δ 7,15, dd) e a

presença de quatro sinais para carbonos sp2, sendo dois deles correspondentes ao C11 e C13,

indicam que há uma insaturação na ligação C1(10). Os deslocamentos químicos dos carbonos

1 e 10 são, respectivamente, δ 149,5 e 130,0.

Um singleto largo integrado para 3H em δ 1,71 é característico de hidrogênios de

grupo metila sobre carbono substituído por alguma função oxigenada ou insaturado. Em

função do valor do deslocamento químico do sinal de H5 (δ 2,68, d), que está acoplado

apenas com H6 (9,6 Hz), entende-se que o mesmo não é olefínico. Sinais para quatro

carbonos oxigenados aparecem entre δ 59 e 63 no espectro de RMN 13C. Como dois destes

carbonos são conhecidos por fazerem parte do grupamento epóxido do éster epóxi-angelato,

os outros dois sinais correspondem a um outro grupamento epóxido entre C4 e C5. A

magnitude da constante de acoplamento entre H5 e H6 (9,6 Hz) indica que estes estão em

relação transóide, portanto H5 está em posição α axial, uma vez que se trata de trans-lactona,

estando H6 em posição β axial. Este fato leva à concluir que a ligação entre o átomo de

oxigênio do epóxido e C5 está em β equatorial. Então a orientação mais esperada para a

ligação do oxigênio com o C4 é também equatorial, portanto α. A estereoquímica do

grupamento epóxido entre C4 e C5 foi comprovada por cristalografia (Tak et al., 1994).

Os multipletos em δ 2,47 e 2,39 são atribuídos a H2a e H2b. Já os sinais de H3a e H3b

apresentam-se em δ 3,00 e 1,20, em função do primeiro estar dentro do cone de desblindagem

da ligação C4−O.

Os dados dos espectros de RMN 1H e RMN 13C foram comparados com aqueles da

literatura (Inoue et al., 1995), comprovando tratar-se da enidrina, uma LST do tipo

melampolido anteriormente isolada de S. sonchifolius. Os seus dados de RMN estão na tabela

D6 e os espectros nas figuras D10-12.

D. Fitoquímica 49

BA

O confôrmero de menor energia (Fig. D9) encontrado por meio do HyperChemTM para

a enidrina (1) condiz com a estrutura molecular determinada via cristalografia (Tak et al.,

1994).

Figura D9. A: Confôrmero de menor energia e B: estrutura molecular determinada por

cristalografia (Tak et al., 1994) para LST 1 (Enidrina).

D. Fitoquímica 50

Tabela D6. Dados experimentais e da literatura de espectros de RMN 1H e 13C - LST 1, δ (ppm), J (Hz).

*: observado

Posição

Enidrina

O

O

O O

OO

O

O

O

O

12

34

56

7

8910

11

12

13

14

15

1' 2'3'

4'

5'1''

2''

1'''

1H (* 400 MHz) 1H (Inoue et al., 1995) 13C (* 100MHz) 13C (Inoue et al., 1995)

1 7,15 dd (10,6; 7,6) 7,15 dd (10,8; 7,5) 149,5 147,4 2a 2,47 m (13,8) 2,46 m 2b 2,39 m (13,8) 2,35 m 24,7 24,7

3α 3,00 m (11,8) 3β 1,20 m (11,8) 35,3 39,4

4 59,3 58,9 5 2,68 d (9,6) 2,67 d (10) 62,7 62,7 6 4,28 t (9,6) 4,28 dd (10) 75,9 75,8 7 3,01 m 3,00 m 45,4 45,5 8 6,71 dd (8,5; 1,2) 6,71 dd (9,1; 1,3) 71,1 71,3 9 5,87 d (8,5) 5,87 d (9,1) 70,4 70,7 10 130,0 130,3 11 133,2 134,4 12 168,3 168,5 13a 5,84 d (3,2) 5,81 d (3,3) 13b 6,33 d (3,5) 6,34 d (3,0) 122,9 121,7

14 165,5 165,5 15 1,71 sl 1,71 s 52,5 51,8 1’ 168,0 167,9 2’ 59,4 59,1 3’ 3,01 m (5,4) 3,00 m 59,8 59,5 4’ 1,17 d (5,4) 1,17 d (5,0) 13,5 13,6 5’ 1,45 s 1,45 s 19,0 19,1 1’’ 170,3 170,2 2’’ 2,05 s 2,05 s 20,8 20,2 1’’’ 3,83 s 3,83 s 17,45 17,4

D. Fitoquímica 51

10

D. Fitoquímica 52

11

D. Fitoquímica 53

12

D. Fitoquímica 54

3.1.2.2. LST 2 (Uvedalina)

8β-(2’S,3’S-epóxi-angeloilóxi)-9α-acetoilóxi-germacra-1(10)Z,4E,11(13)-trien-6α,12-olido-14-oato de metila

A LST 2 foi analisada através de espectroscopia de RMN 1H, de 13C e de

espectrometria de massas. O espectro de massas EI (Fig. D14) apresenta o fragmento do íon

molecular m/z 448 [M]+, além de um fragmento m/z 43 característico para o grupo acetato

[C2H3O]+. Já o espectro de massas CI (Fig. D15) apresenta um fragmento m/z 449

representando o íon quasimolecular [M + H]+. Além deste, há ainda um outro fragmento m/z

405 que indica o íon molecular sem o grupo acetato [M - C2H3O]+, além de um outro m/z 389

[M - C2H3O2]+. Esses dados (Fig. D13) mostram que a LST 2 tem a fórmula molecular de

C23H28O9 e massa molecular de 448, portanto com apenas um átomo de oxigênio a menos do

que a LST 1.

Figura D13. Fragmentações da LST 2 (Uvedalina).

O

O

O

O

O O

12

34

56

7

98

10

11

12

13

14

15

1' 2'3'

5'

4'

O

O

1''

2''

1'''

O

O

O

O

O

O O

OO

[C2H3O]m/z 43

[C21H25O8]m/z 405

O

D. Fitoquímica 55

Base M/z=449. 100%

Low Resolution M/z100 150 200 250 300 350 400 450 500

Inte

nsity

(%ag

e)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100

79

85

105 117

145 185 213 229241

257

273

289

291

313

333

349 361

371

389

405

449

465

491

[M+H]+

Base M/z=43. 100%

Low Resolution M/z50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

Inte

nsity

(%ag

e)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100 43

71 83

105 115 128 154 175 185

213

229

240259

272

291348 356 448

[M]+

Figura D14. Espectro de massas EI da LST 2 (Uvedalina).

Figura D15. Espectro de massas CI da LST 2 (Uvedalina).

Os espectros de RMN da LST 2 são muito semelhantes aos da LST 1. Porém, alguns

sinais tiveram um deslocamento paramagnético considerável, como ocorreu com os sinais de

H5, H6 e dos hidrogênios da metila ligada ao C4. Um singleto largo integrado para 6H em δ

1,94 é característico de hidrogênios de grupo metila sobre carbono quaternário substituído por

função oxigenada ou insaturado. Entretanto, neste caso 3H são referentes à metila do grupo

acetato, C2’’. Em função do deslocamento químico de um único sinal para H5 (δ 4,89, d) que

está acoplado apenas com H6 (δ 5,04, dd), conclui-se que os outros 3H do sinal em δ 1,94 são

relativos à uma metila ligada a um carbono insaturado, o C4.

D. Fitoquímica 56

Dois multipletos em δ 2,60 e 2,34 devem-se à presença de H2α e H2β,

respectivamente. H3α/β aparecem em δ 2,40 e 1,98, uma vez que, nesta molécula, eles não

sofrem o efeito do cone de desblindagem do oxigênio do epóxido, como na LST 1.

Os demais sinais apresentam deslocamentos químicos semelhantes àqueles da LST 1.

Os dados de RMN desta LST são apresentados na tabela D7 e os espectros nas figuras D16 e

D17.

Tabela D7. Dados experimentais e da literatura de espectros de RMN 1H e 13C - LST 2, δ (ppm), J (Hz). Posição

Uvedalina

O

O

O

O

O O

12

34

56

7

98

10

11

12

13

14

15

1' 2'3'

5'

4'

O

O

1''

2''

1'''

O

1H (* 400 MHz) 1H (Inoue et al., 1995) 13C (* 100MHz) 13C (Inoue et al., 1995)

1 6,94 dd (10,3; 7,8) 7,05 dd (10,3; 7,5) 148,8 148,1 2α 2,60 m (12,6; 10,3; 2,2) 2,43 2β 2,34 m (12,6; 2,0) 26,5 26,1

3α 2,40 m (10,0 2,0) 3β 1,98 m (10,0) 37,3 36,8

4 131,0 131,1 5 4,89 d (10,3) 4,95 d (10,8) 126,5 126,9 6 5,04 dd (10,3; 9,8) 5,11 t (10) 75,6 74,9 7 2,72 m (9,8; 1,5) 2,79 m 51,3 51,1 8 6,59 dd (8,3; 1,5) 6,66 dd (8,5; 1,3) 71,4 71,3 9 5,34 d (8,3) 5,41 d (8,5) 71,5 71,1 10 134,8 135,5 11 139,1 137,9 12 169,5 168,6 13a 5,66 d (3,0) 5,73 d (3,3) 13b 6,19 d (3,5) 6,26 d (3,3) 122,0 120,6

14 166,3 165,7 15 1,94 s 2,01 s 17,4 17,0 1’ 168,9 168,7 2’ 59,8 59,2 3’ 2,96 q (5,3) 3,02 ddd (5,3) 60,3 59,6 4’ 1,12 d (5,3) 1,19 d (5,3) 14,0 13,7 5’ 1,40 s 1,47 s 19,6 19,3 1’’ 170,7 170,0 2’’ 1,94 s 2,01 s 21,4 20,3 1’’’ 3,73 s 3,81 s 52,8 51,8

*: observado

D. Fitoquímica 57

16

D. Fitoquímica 58

17

D. Fitoquímica 59

O

O

O

O

O O

12

34

56

7

98

10

11

12

13

14

15

1' 2'3'

5'

4'

1''

3.1.2.3. LST 3 (Sonchifolina)

8β-angeloilóxi-germacra-1(10)Z,4E,11(13)-trien-6α,12-olido-14-oato de metila

A LST 3 foi submetida à espectroscopia de RMN 1H. O espectro de RMN 1H

apresenta em δ 6,16 e 5,50 sinais característicos de hidrogênios de dupla exocíclica de anel

lactônico α,β-insaturado. Esses sinais são dubletos referentes aos H13a/b (3,0 e 3,5 Hz) que

acoplam com o sinal em δ 2,54, referente ao H7. Este, por sua vez, acopla fracamente com um

sinal em δ 6,22, um duplo dubleto característico para H8 ligado a um carbono substituído. Em

função da pequena magnitude de acoplamento entre H7 e H8, conclui-se que os mesmos estão

em relação cisóide. Um éster do tipo angelato, com sinais característicos de um quádruplo

quadrupleto em δ 6,03 (1,5 e 7,3 Hz) para H3’, duplo quadrupleto para H4’ em δ 1,90 (1,5 e

7,3 Hz) e quintupleto para H5’ em δ 1,78 (1,5 Hz), está ligado ao carbono 8 em posição β.

Dois sinais de multipleto em δ 1,97 e 2,78, que acoplam entre si como hidrogênios

geminais, caracterizam-se como H9α/β. O sinal em δ 1,97 acopla com o sinal de H8 em δ 6,22

com constante de acoplamento de 10,6 Hz. Já com o sinal em δ 2,78 o acoplamento é menor

(7,8 Hz), indicando que o H8 e o sinal em δ 1,97 estão em relação transóide, ou seja, o sinal

em δ 1,97 está em β e o sinal em δ 2,78 em α.

Um singleto largo integrado para 3H em δ 1,83 é característico de hidrogênios de

grupo metila sobre carbono substituído por função oxigenada ou insaturado. Em função do

deslocamento químico de um único sinal integrado para 2H em δ 5,03, que representam H5 e

H6, entende-se que H5 está ligado a carbono sp2. A ausência de sinal para o H10 e o

deslocamento paramagnético de H1 (δ 6,76 dd) indicam que há uma insaturação na ligação

C1(10), como na maioria dos melampolidos isolados da subtribo Melampodiinae.

D. Fitoquímica 60

Dois multipletos em δ 2,26 e 2,07 devem-se à presença de H2a/b. Já os sinais de H3a/

apresentam-se em δ 2,27 e 2,07.

Os dados dos espectros de RMN 1H foram comparados com aqueles da literatura,

comprovando sua identidade. Os dados de RMN desta LST são apresentados na tabela D8 e o

espectro na figura D18.

Tabela D8. Dados experimentais e da literatura de espectros de RMN 1H e 13C - LST 3, δ (ppm), J (Hz) .

*: observado

Posição

Sonchifolina

O

O

O

O

O O

12

34

56

7

98

10

11

12

13

14

15

1' 2'3'

5'

4'

1''

1H (* 400 MHz) 1H (Inoue et al., 1995) 13C (Inoue et al., 1995)

1 6,76 dd (9,8; 7,3) 6,83 dddl (10,0; 7,5; 1,6) 142,0 2a 2,07 m 2,12 tl (12,0) 2b 2,26 m 2,36 m 25,4

3a 2,07 m 2,06 tl (10,0) 3b 2,27 m 2,31 m 37,0

4 137,8 5 5,03 m 5,09 m 125,5 6 5,03 m 5,11 m 75,8 7 2,54 m 2,61 m 49,5 8 6,22 ddd (10,6; 7,8; 1,8) 6,31 dddl (9,8; 7,5; 1,0) 66,4 9α 2,78 m (12,6; 7,8) 2,86 m 9β 1,97 m (10,6) 2,03 tl (10,4) 30,0

10 131,2 11 135,2 12 169,5 13a 5,50 d (3,0) 5,56 dl (3,5) 13b 6,16 d (3,5) 6,23 dl (3,5) 120,0

14 167,0 15 1,83 sl 1,89 s 17,0 1’ 166,2 2’ 127,0 3’ 6,03 qq (7,3; 1,5) 6,10 ql (7,5) 139,0 4’ 1,90 dq (7,3; 1,5) 1,98 dl (7,5) 15,5 5’ 1,78 quin (1,5) 1,85 s 20,5 1’’’ 3,71 s 3,78 s 52,0

D. Fitoquímica 61

18

D. Fitoquímica 62

3.1.2.4. LST 4 (Fluctuanina)

4α,5β-epóxi-8β-angeloilóxi-9α-acetoilóxi-germacra-1(10)Z,11(13)-dien-6α,12-olido-14-oato de metila

Da LST 4 foram obtidos espectros de RMN 1H, 13C, 1H-1H COSY 90-45° e espectros

de massas. O espectro de massas EI (Fig. D20) apresenta o fragmento do íon molecular m/z

448 [M]+, um fragmento m/z 388 [M - C2H4O2]+ e um fragmento m/z 83 característico para o

grupo angelato [C5H7O]+. Já o espectro de massas CI (Fig. D21) apresenta um fragmento m/z

449, representando o íon quasimolecular [M + H]+. Além deste, há ainda um fragmento m/z

389 [M - C2H3O2]+ e um fragmento m/z 83 para o éster angelato [C5H7O]+. Esses dados (Fig.

D19) indicam que a LST 4 tem a fórmula molecular de C23H28O9 e massa molecular de 448.

Figura D19. Fragmentações da LST 4 (Fluctuanina).

O

O

O

O

O O

12

34

56

7

98

10

11

12

13

14

15

1' 2'3'

5'

4'

O

O

1''

2''

1'''

O

[C21H25O7]m/z 389

[C5H7O]m/z 83

O

O

O

O

O

O O

O

D. Fitoquímica 63

Base M/z=389. 100%


Inte

nsity

(%ag

e)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100

83

149 227 229

245

257275

289

313316

331

349

359

375

389

429 431

449

487

[M+H]+

Base M/z=83. 100%


Inte

nsity

(%ag

e)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100

55

69

83

105 115129 149 167 179 201 229 245 256 279 289

348

356

388

417 448

(*5)

[M]+

Figura D20. Espectro de massas EI da LST 4 (Fluctuanina).

Figura D21. Espectro de massas CI da LST 4 (Fluctuanina).

Os espectros de RMN da LST 4 são praticamente idênticos aos da LST 1, com

exceção apenas dos deslocamentos químicos referentes aos sinais para os hidrogênios e

carbonos do éster ligado ao C8. Na LST 1, este éster é o epóxi-angelato, mas na LST 4 é o

angelato. Os deslocamentos químicos dos sinais de angelato são bem mais desblindados em

função da dupla ligação entre C2’ (δ 126,5) e C3’ (δ 140,2 e 6,02, qq). Os sinais para as duas

metilas também aparecem mais desblindadas no espectro de RMN 1H (δ 1,71 e 1,88). O

espectro de 1H-1H COSY foi importante para a confirmação das correlações entre os

D. Fitoquímica 64

hidrogênios, especialmente do éster. Os dados de RMN desta LST são apresentados na tabela

D9 e figuras D22-24.

O sistema especialista SISTEMAT foi capaz de propor uma estrutura para a LST 4, a

partir dos deslocamentos químicos dos seus carbonos, o que confirma a estrutura proposta.


*: observado

Posição

Fluctuanina

O

O

O

O

O O

12

34

56

7

98

10

11

12

13

14

15

1' 2'3'

5'

4'

O

O

1''

2''

1'''

O

1H (* 400 MHz) 1H (Lin et al., 2003) 13C (* 75 MHz) 13C (Lin et al., 2003)

1 7,08 dd (10,5; 7,4) 7,15 dd (9,0; 7,5) 149,3 149,3 2a 2,91 m (11,3) 2,98 m 2b 2,39 m 2,34 m 22,7 24,7

3a 2,28 m 2,44 m 3b 2,28 m 1,24 m 31,9 35,4

4 59,4 59,4 5 2,61 d (9,8) 2,68 m 62,9 62,9 6 4,21 t (9,8) 4,29 dd (10,0; 9,5) 76,0 76,2 7 2,91 m 2,98 m 45,7 45,6 8 6,66 dd (8,8; 1,2) 6,74 dl (9,0) 70,7 70,7 9 5,79 d (8,8) 5,86 d (8,5) 69,3 69,3 10 130,2 130,0 11 133,4 133,3 12 168,3 168,4 13a 5,85 d (3,2) 5,92 d (3,5) 13b 6,28 d (3,5) 6,35 d (3,5) 123,0 123,1

14 165,5 165,5 15 1,65 s 1,70 s 17,6 17,6 1’ 165,9 165,9 2’ 126,5 126,5 3’ 6,02 qq (7,3; 1,5) 6,09 dq (7,0; 1,5) 140,2 140,2 4’ 1,88 dq (7,3; 1,5) 1,94 m 15,8 15,8 5’ 1,71 quin (1,5) 1,79 m 20,4 20,7 1’’ 170,3 170,3 2’’ 1,94 s 2,01 s 20,7 20,4 1’’’ 3,76 s 3,84 s 52,5 52,5

D. Fitoquímica 65

22

D. Fitoquímica 66

23

D. Fitoquímica 67

24

D. Fitoquímica 68

3.1.2.5. LST 5

8β-metacriloilóxi-9α-acetoilóxi-germacra-1(10)Z,4E,11(13)-trien-6α,12-olido-14-oato de metila

Da LST 5 foram obtidos espectros de RMN 1H e de massas. O espectro de massas EI

(Fig. D26) apresenta o fragmento do íon molecular m/z 418 [M]+, um fragmento m/z 358 [M -

C2H4O2]+, um fragmento m/z 69 característico para o grupo metacrilato [C4H5O]+ e um

fragmento m/z 43 característico para o grupo acetato [C2H3O]+. Já o espectro de massas CI

(Fig. D27) apresenta um fragmento m/z 419 representando o íon quasimolecular [M + H]+.

Além deste, há ainda um fragmento m/z 359 [M - C2H3O2]+. Estas informações (Fig. D25)

indicam que a LST 5 tem a fórmula molecular de C22H26O8 e massa molecular de 418.

Figura D25. Fragmentações da LST 5.

O

O

O

O

O O

12

34

56

7

98

10

11

12

13

14

15

1' 2'3'

4'O

O

1''

2''

1'''

O

O

O

O

O O[C4H5O]m/z 69

[C20H23O6]m/z 359

O

[C2H3O]m/z 43

O

D. Fitoquímica 69

[M+H]+

Base M/z=285. 100%

Low Resolution M/z150 200 250 300 350 400 450 500

Inte

nsity

(%ag

e)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100

215 229

239 245

257

275

285

293

313

327

331

342

359

369 383 391 405

419

465

[M]+

Base M/z=69. 100%


Inte

nsity

(%ag

e)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100

43

69

73 93 112

129 142

149 167 185 206

213

240 256

272

284

358 418

Figura 26. Espectro de massas EI da LST 5.

Figura D27. Espectro de massas CI da LST 5.

O espectro de RMN 1H da LST 5 é praticamente idêntico ao da LST 2, com exceção

apenas para os deslocamentos químicos dos sinais para os hidrogênios do éster ligado ao C8.

Na LST 2, este éster é o epóxi-angelato, mas na LST 5 é o metacrilato. O éster metacrilato

não possui a metila 5’, portanto o espectro apresenta dois sinais para os 2H da dupla ligação

H3’a/b (δ 5,96 e 5,51, sl). O sinal para a metila 4’ aparece em δ 1,98. Os dados de RMN desta

LST são apresentados na tabela D10 e figura D28.

D. Fitoquímica 70


*: observado

Posição

O

O

O

O

O O

12

34

56

7

98

10

11

12

13

14

15

1' 2'3'

4'O

O

1''

2''

1'''

1H (* 400 MHz) 1H (Bardón et al., 2001) 13C (Bardón et al., 2001)

1 6,94 dd (10,1; 7,3) 7,00 dd (10,0; 7,2) 148,3 2a 2,59 m 2,65 dddd (12,4; 12,4; 10,4; 2,0) 2b 2,44 m 2,44 dddd (12,0; 8,0; 6,0; 2,0) 26,1

3a 2,39 m 2,39 ddd (12,0; 6,0; 2,0) 3b 2,28 m 2,03 tl (11,6) 36,9

4 130,6 5 4,89 dl (10,3) 4,96 dl (10,4) 126,3 6 5,05 dd (10,3) 5,11 t (10,0) 75,3

7 2,70 dddd (10,3; 3,5; 3,0; 1,5) 2,76 dddd (10,0; 3,2; 2,8; 1,2) 50,9

8 6,56 dd (8,5; 1,7) 6,62 dd (8,8; 1,4) 70,2 9 5,37 d (8,5) 5,43 d (8,4) 71,1 10 134,3 11 138,5 12 170,2 13a 5,75 d (3,0) 6,26 d (3,2) 13b 6,20 d (3,2) 5,81 d (3,2) 121,8

14 170,2 15 1,83 s 1,89 s 16,9 1’ 165,9 2’ 135,4 3’a 5,96 sl 6,02 sl 3’b 5,51 sl 5,57 t (1,6) 126,6

4’ 1,98 sl 1,93 s 18,3 1’’ 165,9 2’’ 2,03 s 2,03 s 20,8 1’’’ 3,76 s 3,79 s 52,3

D. Fitoquímica 71

28

D. Fitoquímica 72

O

O

O

O

H O

12

34

56

7

98

10

11

12

13

14

15

1' 2'3'

4'

5'

3.1.2.6. LST 6

8β-angeloilóxi-14-oxo-germacra-1(10)Z,4E,11(13)-trien-6α,12-olido

A LST 6 foi submetida à espectroscopia de RMN 1H e à espectrometria de massas. O

espectro de massas CI (Fig. D30) apresenta um fragmento m/z 345 representando o íon

quasimolecular [M + H]+. Além deste há ainda um fragmento m/z 245 [M - C5H7O2]+ e um

fragmento m/z 83 característico para o grupo angelato [C5H7O]+. O espectro de massas EI

(Fig. D31) apresenta o fragmento m/z 244 [M – C5H8O2]+ e um fragmento m/z 83 [C5H7O]+.

Esses dados (Fig. D29) mostram que a LST 6 tem a fórmula molecular de C20H24O5 e massa

molecular de 344.


O

O

H O [C15H17O3]m/z 245

[C5H7O]m/z 83

O

D. Fitoquímica 73

Base M/z=345. 100%


Inte

nsity

(%ag

e)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100

83

84 149 199 227

245

273 291 313 333

345

359

391 421 449

450

[M+H]+

Base M/z=83. 100%

Low Resolution M/z50 100 150 200 250 300 350

Inte

nsity

(%ag

e)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100

43

55

69

83

91 105 118 134 147 215244

256 272


Figura D31. Espectro de massas EI da LST 6.

O espectro de RMN 1H da LST 6 é praticamente idêntico ao da LST 3. Porém,

constata-se a ausência do sinal para a metoxila em δ 3,70. Entretanto, o espectro apresenta um

sinal integrado para 1 H em δ 9,3, indicando a presença de um grupo aldeído. Isto mostra que

nesta molécula existe um grupamento aldeído em C14 ao invés do éster metílico. Os

deslocamentos químicos foram comparados com dados da literatura (Bohlmann et al., 1981a).

Os dados de RMN desta LST são apresentados na tabela D11 e figura D32.

D. Fitoquímica 74


** derivado isovalerato da LST 6. *: observado

Posição

O

O

O

O

H O

12

34

56

7

98

10

11

12

13

14

15

1' 2'3'

4'

5'

1H (* 400 MHz) 1H (Bohlmann et al., 1981a) 13C (Kijoa et al., 1993)*

1 6,55 ddd (9,8; 7,0; 1,7) 6,62 ddd (10,0; 7,0; 2,0) 153,9 2a 2,27 m 2,29 ddl (13,0; 2,0) 2b 2,27 m 2,50 m 26,1

3a 2,27 m 2,12 ddl (13,0; 2,0) 3b 2,27 m 2,40 ddd (13,0; 6,0; 2,0) 37,1

4 42,9 5 5,00 m 5,08 m 126,3 6 5,00 m 5,08 m 75,3 7 2,43 m 2,50 m 49,3 8 6,41 ddd (10,1; 7,5; 2,0) 6,49 ddd (10,0; 7,0; 2,0) 65,5 9α 2,76 m 2,84 dd (14,0; 10) 28,8 9β 2,08 m 1,98 m (1,5) 10 135,1 11 137,7 12 169,4 13a 5,53 d (3,0) 5,60 d (3,0) 13b 6,17 d (3,5) 6,25 d (3,5) 120,9

14 9,30 s 9,49 d (1,5) 195,3 15 1,85 sl 1,93 s 16,9 1’ 171,6* 2’ 43,3* 3’ 6,03 qq (7,0; 1,5) 6,10 qq 25,7* 4’ 1,98 dq (7,0; 1,5) 1,98 dq 22,3* 5’ 1,77 quin (1,5) 1,85 dq 22,3*

D. Fitoquímica 75

32

D. Fitoquímica 76

3.1.2.7. LST 7

8β-metacriloilóxi-germacra-1(10)Z,4E,11(13)-trien-6α,12-olido-14-oato de metila

Da LST 7 foram obtidos espectros de RMN 1H, 13C, 1H-1H COSY 90-45° e de massas.

O espectro de massas EI (Fig. D34) apresenta o fragmento do íon molecular m/z 360 [M]+, um

fragmento m/z 291, que indica o íon molecular sem o éster metacrilato [M - C4H5O]+ e um

fragmento m/z 69 característico para o grupo metacrilato [C4H5O]+. Já o espectro de massas

CI (Fig. D35) apresenta um fragmento m/z 361 representando o íon quasimolecular [M + H]+.

As informações (Fig. D33) mostram que a LST 7 tem a fórmula molecular de C20H24O6 e

massa molecular de 360.


O

O

O

O

O O

12

34

56

7

98

10

11

12

13

14

15

1' 2'3'

4'

1''

O

O

O

O O[C16H19O5]

m/z 291

[C4H5O]m/z 69

O

D. Fitoquímica 77

Entries=888. Base M/z=69. 100%


Inte

nsity

(%ag

e)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100

43

55

69

83

105 118 134 147 152 169 186 197

214

224

242

256 272

274

291

300

329 360

(*5)

[M]+

Base M/z=361. 100%


Inte

nsity

(%ag

e)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100

79 85 179 215 229

243 257

275

288300 316 329 343

361

373

433

[M+H]+



O espectro de RMN 1H da LST 7 é praticamente idêntico ao da LST 3, com exceção

apenas para os deslocamentos químicos dos sinais dos hidrogênios do éster ligado ao C8. Na

LST 3, este éster é o angelato, mas na LST 7 é o metacrilato. O éster metacrilato não possui a

metila 5’, portanto o espectro apresenta dois sinais para os 2H da dupla ligação H3’a/b (δ 5,98

e 5,51, sl). O deslocamento do sinal para a metila 4’ é de δ 1,84. Os dados experimentais de

RMN, assim como os dados da literatura desta LST são apresentados na tabela D12 e figuras

D36-38.

D. Fitoquímica 78

O sistema especialista SISTEMAT foi capaz de propor uma estrutura para a LST 7 em

função dos deslocamentos químicos dos carbonos fornecidos, confirmando a estrutura

proposta.


*: observado

Posição

O

O

O

O

O O

12

34

56

7

98

10

11

12

13

14

15

1' 2'3'

4'

1''

1H (* 400 MHz) 1H (Lin et al., 2003) 13C (* 75 MHz) 13C (Lin et al., 2003)

1 6,76 ddd (9,6; 7,2; 2,3) 6,83 ddd (9,6; 7,5; 2,2) 142,4 142,4 2a 2,06 m 2,36 m 2b 2,06 m 2,12 tl (12,0) 25,7 25,7

3a 2,27 m 2,06 tl (10,0) 3b 2,27 m 2,31 m 37,1 37,1

4 137,7 137,9 5 5,03 m 5,11m 126,0 6 5,03 m 5,12 m 75,8 75,8 7 2,53 m 2,60 m 49,7 49,7 8 6,21 ddd (7,6; 5,5; 1,7) 6,28 ddd (9,6; 7,7; 1,8) 67,3 67,3 9α 1,95 m 2,03 tl (10,4) 9β 2,77 ddd (7,6; 5,3; 2,3) 2,84 ddd (13,9; 7,5; 2,1) 30,9 30,2

10 131,2 131,1 11 134,4 135,6 12 169,5 169,5 13a 5,49 d (3,2) 5,56 d (3,4) 13b 6,16 d (3,4) 6,23 d (3,4) 120,5 120,5

14 167,4 167,4 15 1,85 sl 1,91 s 17,0 17,0 1’ 166,0 166,4 2’ 135,4 135,8 3’a 5,98 sl 6,06 sl 3’b 5,51 sl 5,58 quin (1,5) 126,1 126,1

4’ 1,84 sl 1,93 m 18,3 18,3 1’’ 3,70 s 3,78 s 52,0 52,0

D. Fitoquímica 79

36

D. Fitoquímica 80

37

D. Fitoquímica 81

38

D. Fitoquímica 82

3.1.2.8. LST 8 (Polimatina B)

8β-angeloilóxi-9α-acetoilóxi-germacra-1(10)Z,4E,11(13)-trien-6α,12-olido-14-oato de metila

A LST 8 foi submetida à espectroscopia de RMN 1H, 13C, gHSQCR, gHMBCR e à

espectrometria de massas. O espectro de massas CI (Fig. D40) apresenta o fragmento do íon

molecular m/z 433 representando o íon quasimolecular [M + H]+, um fragmento m/z 83

característico para o grupo angelato [C5H7O]+, além de um fragmento m/z 373 [M - C2H3O2]+.

O espectro de massas EI (Fig. D41) apresenta também um fragmento m/z 83 [C5H7O]+ e um

fragmento m/z 43 referente a um éster acetato [C2H3O]+. Os dados (Fig. D39) dos espectros

indicam que a LST 8 tem a fórmula molecular de C23H28O8 e massa molecular de 432.

Figura D39. Fragmentações da LST 8 (Polimatina B).

O

O

O

O

O O

12

34

56

7

98

10

11

12

13

14

15

1' 2'3'

5'

4'

O

O

1''

2''

1'''

O

O

O

O

O O

[C5H7O]m/z 83

O

[C21H25O6]m/z 373

D. Fitoquímica 83

Base M/z=83. 100%


Inte

nsity

(%ag

e)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100

43

55

69

83

105 119 131 169185

213219 240

272

273

[M+H]+ Base M/z=433. 100%


Inte

nsity

(%ag

e)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100

83

91 241

273

291 333

373

375

433

475

Figura D40. Espectro de massas CI da LST 8 (Polimatina B).

Figura D41. Espectro de massas EI da LST 8 (Polimatina B). O espectro de RMN 1H da LST 8 é praticamente idêntico ao da LST 2, com exceção

apenas para os deslocamentos químicos dos sinais para os hidrogênios do éster ligado ao C8,

que na LST 8 é o angelato. Os deslocamentos químicos dos sinais referentes aos átomos do

éster angelato sofrem um efeito paramagnético em relação aos do éster epóxi-angelato. Os

espectros de gHSQCR e gHMQCR serviram para confirmar as conexões e correlações entre

os hidrogênios e os carbonos da molécula, concordando inclusive com a estereoquímica

obtida para o confôrmero de menor energia calculado por meio do HyperChemTM. No

D. Fitoquímica 84

espectro de gHSQCR foram observados quatro sinais de conexão de hidrogênios com

carbonos tipo –CH3, sete do tipo –CH e mais sete do tipo –CH2. No espectro gHMQCR foram

observadas as correlações dos hidrogênios com os carbonos distantes duas ou mais ligações

(Fig. D42). Os dados experimentais de RMN, assim como os dados da literatura desta LST

(Inoue et al., 1995), são apresentados na tabela D13 e figuras D43-46.

Figura D42. Correlações entre C e H observadas via gHMQCR (300 e 75 MHz), LST 8. As setas apontam sempre a correlação entre C e H no sentido C H.

O

O

O

O

O O

O

O

C H

D. Fitoquímica 85


** Derivado metacrilato da LST 8.*: observado

Posição

Polimatina B

O

O

O

O

O O

12

34

56

7

98

10

11

12

13

14

15

1' 2'3'

5'

4'

O

O

1''

2''

1'''

1H (* 400 MHz) 1H (Inoue et al., 1995) 13C (* 75 MHz) 13C (Bardón et al., 2001)**

1 6,94 dd (10,3; 7,5) 7,01 dd (10,3; 8,3) 148,2 148,3 2a 2,57 m 2,41 m 2b 2,39 m 2,41 m 26,1 26,1

3a 2,31 m 3b 1,96 m 36,9 36,9

4 138,6 130,6 5 4,87 dd (10,1; 1,1) 4,96 d (10,8) 126,2 126,3 6 5,04 dd (10,1; 9,8) 5,11 t (10,0) 75,5 75,3

7 2,71 dddd (9,8; 3,2; 3,0; 1,5) 2,78 m 51,0 50,9

8 6,61 dd (8,5; 1,5) 6,68 dd (8,6; 1,3) 69,1 70,2 9 5,34 d (8,5) 5,41 d (8,6) 71,2 71,1 10 130,7 134,3 11 134,5 138,5 12 169,4 170,2 13a 5,74 d (3,2) 5,81 d (3,0) 13b 6,21 d (3,2) 6,28 d (3,0) 121,7 121,8

14 170,1 170,2 15 1,92 s 1,96 s 16,9 16,9 1’ 166,2 165,9* 2’ 126,9 135,4* 3’ 6,01 qq (7,3; 1,5) 6,08 ddd (7,1; 1,5) 138,5 126,6* 4’ 1,87 dq (7,3; 1,5) 1,95 dd (7,1; 1,3) 15,7 18,3* 5’ 1,76 quin (1,5) 1,96 s 20,4 1’’ 166,0 165,9 2’’ 1,89 s 20,8 20,8 1’’’ 3,74 s 3,81 s 52,2 52,3

D. Fitoquímica 86

43

D. Fitoquímica 87

44

D. Fitoquímica 88

45

D. Fitoquímica 89

46

D. Fitoquímica 90

O

O

O

O

HO O

12

34

56

7

98

10

11

12

13

14

15

1' 2'3'

4'

5'

3.1.2.9. LST 9

Ácido 8β-angeloilóxi-germacra-1(10)Z,4E,11(13)-trien-6α,12-olido-14-óico

A LST ácida 9, ainda não descrita na literatura, é semelhante à LST 6, que possui

função aldeído no C14. A LST 9, por sua vez, apresenta na mesma posição a função ácido. A

estrutura referente a esta substância foi elucidada mediante análise de espectros de RMN 1H, 13C, 1H-1H gCOSY e espectros de massa. O espectro de RMN 1H não apresenta sinal para o

C14, nem para metoxila e nem para hidrogênio de aldeído. Porém, todos os outros sinais

condizem com a descrição para a LST 6 (Inoue et al., 1995). O sinal para o C14 (éster

metílico) aparece geralmente em δ 165,0 no espectro de RMN 13C, mas no espectro de 9 o

sinal para C14 aparece em δ 171,1. Os dados dos espectros de RMN são apresentados na

tabela D14 e figuras 47-49.

Mais uma vez o confôrmero de menor energia calculado pelo HyperChemTM

praticamente é idêntico às outras LSTs isoladas, o que mostra a reprodutibilidade das análises.

Além disso, o sistema especialista SISTEMAT foi capaz de propor uma estrutura para a LST

9, o que confirma a estrutura proposta a partir dos deslocamentos químicos dos carbonos.

D. Fitoquímica 91


*: observado

Posição

O

O

O

O

HO O

12

34

56

7

98

10

11

12

13

14

15

1' 2'3'

4'

5'

1H (* 400 MHz) 13C (* 75 MHz)

1 6,92 tl (7,3) 144,8 2a 2,26 m 2b 2,02 m 25,9

3a 2,33 m 3b 2,02 m 37,0

4 137,8 5 5,04 m 126,0 6 5,04 m 76,0 7 2,59 m 49,8 8 6,27 dd (8,7; 7,9) 66,5 9α 2,02 m 9β 2,80 m (7,9) 31,9

10 130,6 11 135,5 12 169,5 13a 5,54 d (2,7) 13b 6,18 d (3,2) 120,7

14 171,1 15 1,84 s 17,1 1’ 166,5 2’ 127,1 3’ 6,04 qq (7,3; 1,5) 139,5 4’ 1,92 dq (7,3; 1,5) 15,9 5’ 1,78 quin (1,5) 20,6

D. Fitoquímica 92

47

D. Fitoquímica 93

48

D. Fitoquímica 94

49

D. Fitoquímica 95

Base M/z=361. 100%


Inte

nsity

(%ag

e)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100

79

83

101

143 165 215

243

244

261

279

285301

313 343

361

399

[M+H]+

O espectro de massas CI (Fig. D51) apresenta fragmento m/z 361 relativo ao íon

quasimolecular [M + H]+, m/z 261 [M - C5H7O2]+, m/z 101 relativo ao éster angelato e uma

molécula de água [C5H7O + H2O]+e m/z 83, característico do éster angelato [C5H7O]+. O

espectro EI (Fig. D52) apresenta o fragmento m/z 83 [C5H7O]+. As fragmentações são

apresentadas na figura D50. O espectro de massas de alta resolução ES (Fig. D53) revela a

fórmula molecular de C20H24O6 com fragmento m/z 361,164565 [M + H]+. Desta forma, a

estrutura proposta pôde ser confirmada.



O

O

HO O[C15H17O4]

m/z 261

[C5H7O]m/z 83

O

D. Fitoquímica 96

Base M/z=83. 100%


Inte

nsity

(%ag

e)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100

43

55

81

83

105 134 214 232 242 260 384


Figura D53. Espectro de massas de alta resolução ES da LST 9.

[M+H]+

D. Fitoquímica 97

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

OH

O O

A

B1

2

34

5

67

8910

11

12

13

14

15 12

34

5

67

8910

11

12

13

14

15

1' 2'3'

4'

5'

1''

2''

1'''

2'''' 3''''4''''

5''''

1''''

3.1.2.10. LST 10 (Dímero de melampolidos)

4α,5β-epóxi-8β-[2S-hidróxi-3R-óxi-(8β-angeloilóxi-germacra-1(10)Z,4E,11(13)-trien-6α,12-olido)]-9α-acetoilóxi-germacra-1(10)Z,11(13)-dien-6α,12-olido-14-oato de metila

A LST 10, também ainda não descrita na literatura, é um dímero de melampolidos. A

estrutura foi elucidada por meio da análise de espectros de massas, de RMN 1H e de 13C (Tab.

D15, Fig. D55 e D56). A conectividade entre os sinais de 1H e 13C foi determinada por

gHSQCR (Fig. D57) e as demais correlações de 13C e 1H foram confirmadas pela inspeção de 1H-1H gCOSY (Fig. D60) e gHMQCR (Fig. D58 e D59). Os espectros de RMN 13C e de

gHSQCR apresentam sinais para 43 carbonos, sendo 21 -CH ou -CH3, sete -CH2 e 15

quaternários. O espectro de RMN 1H apresenta quatro dubletos, integrados para 1H cada, em

δ 6,26, 5,69, 6,14 e 5,83 que foram atribuídos, respectivamente, a dois grupos (anéis A e B)

de hidrogênios de dupla exocíclica H13a e H13b, característicos de γ-lactonas α,β-insaturadas.

Um multipleto em δ 2,42, acoplado aos sinais da dupla exocíclica do anel A caracteriza H7,

que também está acoplado com o duplo duplo dubleto em δ 6,25, que foi atribuído ao H8. O

sinal de H7 ainda acopla com um sinal em δ 5,05, integrado para 2H, sendo característico para

H6 e H5 de melampolidos, quando o C5 é insaturado. O sinal de H8 (δ 6,25) acopla com dois

sinais típicos de H9α e β em δ 2,78 e 1,94, respectivamente. Através do espectro 1H-1H

COSY, observa-se o acoplamento entre um dos H9 e o H1, o qual está ligado a um carbono

insaturado, cujo sinal aparece em δ 6,63. Este último sinal está conectado ao sinal para

carbono em δ 143,8, conforme pode ser observado no espectro gHSQCR. O sinal para o

D. Fitoquímica 98

A

B

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

OH

O O

C H

H1(C1, δ 143,8) do anel A correlaciona-se também com o sinal da carbonila ou C14 em δ

165,3, que por sua vez está correlacionado com um quadrupleto em δ 5,17. Este quadrupleto

está correlacionado com dois outros carbonos em δ 13,9 (C4’’’’) e 22,5 (C5’’’’), sinais

referentes a dois grupamentos metila. Os sinais da primeira metila está correlacionada com

um sinal de carbono quaternário em δ 75,7, o qual está ligado a um átomo de oxigênio. O

sinal dos hidrogênios da segunda metila, em δ 22,5, está correlacionado com um carbono

carbonílico de éster em δ 174,2. Este último sinal correlaciona-se, por sua vez, com um duplo

dubleto em δ 6,56. No espectro de 1H-1H COSY observa-se que o sinal em δ 6,56 acopla com

o duplo duplo dubleto em δ 2,91, e este acopla com os sinais típicos de dupla exocíclica, H13a

e H13b do anel B. Assim conclui-se que o sinal em δ 6,56 corresponde ao H8 e o sinal em δ

2,91 ao H7, ambos do anel B. H8 acopla por conseguinte com um sinal em δ 5,82, que por sua

vez correlaciona-se com o sinal para carbono carbonílico de grupo acetato, além de dois sinais

para carbonos insaturados, um em δ 149,6 e outro 127,1. Logo, o H9 está ligado a um átomo

de carbono que possui também um grupamento acetato. O sinal em δ 149,6 está conectado ao

sinal em δ 7,13, que por sua vez correlaciona-se ao sinal de carbono carbonílico em δ 165,5,

que também correlaciona-se ao sinal de metoxila em δ 3,81. Portanto, os sinais em δ 149,6 e

7,13 caracterizam a posição 1 do anel B e o sinal em δ 165,5 refere-se ao C14.

As correlações entre C e H observadas via gHMQCR são apresentadas na figura D54.

Figura D54. Correlações entre C e H observadas via gHMQCR de 5 e 8 Hz (300 e 75 MHZ), LST 10. As setas apontam sempre a correlação entre C e H no sentido C H.

D. Fitoquímica 99


O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

OH

O O

A

B1

2

34

5

67

8910

11

12

13

14

15 12

34

5

67

8910

11

12

13

14

15

1' 2'3'

4'

5'

1''

2''

1'''

2'''' 3''''4''''

5''''

1''''

Anel B Anel A

Posição 1H 13C Posição 1H 13C 1 7,13 dd (10,3; 7,3) 149,6 1 6,63 tl (7,3) 143,8 2a 3,05 ddm (13,1; 11,9) 2a 2,31 m 2b 2,42 m (13,1) 25,9 2b 2,11 m 24,7

3a 2,31 m 3a 2,42 m (13,7) 3b 2,11 m 35,4 3b 1,21 tl (13,7) 36,9

4 59,0 4 138,3 5 2,59 d (9,7) 63,2 5 5,05 d (7,6) 125,8 6 4,30 t (9,7) 76,0 6 5,05 dd (10,3; 7,6) 76,1 7 2,91 ddd (9,7; 3,3; 1,2) 44,7 7 2,42 m 49,9 8 6,56 dd (8,5; 1,2) 73,0 8 6,25 ddd (7,0; 1,8; 1,2) 66,2

9α 2,78 ddd (14,3; 7,0; 1,8) 9 5,82 d (8,5) 70,8 9β 1,94 m 30,1

10 130,0 10 127,1 11 133,3 11 135,2 12 167,8 12 169,7 13a 5,83 d (3,3) 13a 5,69 d (3,0) 13b 6,14 d (3,3) 122,1 13b 6,26 d (3,3) 121,2

14 165,5 14 165,3 15 1,72 s 17,4 15 1,89 sl 17,0 1’’ 170,2 1’ 166,4 2’’ 2,04 s 20,9 2’ 131,0 1’’’ 3,81 s 52,5 3’ 6,09 qq (7,3; 1,5) 139,2 1’’’’ 174,2 4’ 1,97 dq (7,3; 1,5) 15,9 2’’’’ 75,7 5’ 1,85 quin (1,5) 20,5 3’’’’ 5,17 q (6,4) 73,3 4’’’’ 1,25 d (6,4) 13,9 5’’’’ 1,27 s 22,5

D. Fitoquímica 100

55

D. Fitoquímica 101

56

D. Fitoquímica 102

57

D. Fitoquímica 103

58

D. Fitoquímica 104

59

D. Fitoquímica 105

60

D. Fitoquímica 106

O espectro de massas APCI (Fig. D62) apresenta um fragmento m/z 842 relativo ao íon

molecular e uma molécula de água [M + H2O]+. No espectro ESI (Fig. D63) aparecem

fragmentos como m/z 847, para o íon molecular e um átomo de sódio [M + Na]+. No espectro

expandido (Fig. D64), aparecem os picos m/z 765 [M - C2H3O2]+ e m/z 747 [M + Na -

C5H8O2]+. O espectro EI (Fig. D65) apresenta um fragmento m/z 724 [M - C5H8O2]+, m/z 83,

característico para o grupo angelato [C5H7O]+ e m/z 43, relativo ao grupo acetato [C2H3O]+. O

espectro de massas de alta resolução ES (Fig. D66) revela a fórmula molecular de C43H52O16,

com fragmentos m/z 825,33281 [M + H]+ e m/z 847,31476 [M + Na]+. Algumas

fragmentações são apresentadas na figura abaixo.


O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

OH

O O

[C38H45O14]m/z 725

[C5H7O]m/z 83

O

[C2H3O]m/z 43

O

A

B

D. Fitoquímica 107

Base M/z=842. 100%

Low Resolution M/z400 500 600 700 800 900 1000

Inte

nsity

(%ag

e)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100

725 796

842

858900

926 965 983

[M + H2O]+

Base M/z=847. 100%

Low Resolution M/z200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200

Intensity (%age)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100

289 349 707

725

801

847

863 905926 9621005 1113

[M + Na]+

Figura D62. Espectro de massas APCI da LST 10.

Figura D63. Espectro de massas ESI da LST 10.

D. Fitoquímica 108

Base M/z=747. 100%


Intensity (%age)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100

255 272 314 329 355

383 399

417 431474487

500

585

597

650 679

703

747

765

787 803

Base M/z=83. 100%


Inte

nsity

(%ag

e)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100

55

83

115 128 187

215 242

257 289331

349

547

585

623

646

678

724

725

(*20) (*1)

43

Figura D64. Espectro de massas expandido ESI da LST 10.


D. Fitoquímica 109

Figura D66. Espectro de massas de alta resolução ES da LST 10.

S. sonchifolius biossintetiza LSTs de um subgrupo típico no gênero, os melampolidos,

mas é a primeira vez que um dímero é isolado do gênero Smallanthus. Além disso, os dímeros

são raros na tribo Heliantheae, assim como na subtribo Melampodiinae. A figura D67

apresenta uma proposta para a biossíntese deste dímero. Para formar a estrutura do dímero 10,

é possível que o éster de uma LST como a 4 sofra uma oxidação, mais precisamente uma

epoxidação, formando a LST 1. Essa reação seria catalisada por uma monoxigenase na

presença de NADPH e oxigênio. A partir disto o grupo epóxido do éster de cadeia lateral da

LST 1 poderia ser aberto de forma antiperiplanar por catálise ácida originando o diol

correspondente. Uma vez que o epóxido é trans, a abertura do mesmo gera um produto com

dois centros quirais, S e R. O carbono carbonílico do grupo carboxílico de um melampolido

como 9 poderia sofrer um ataque nucleofílico pela hidroxila estericamente menos impedida

do grupo diol, levando assim à formação do dímero 10 por esterificação.

[M+H]+

D. Fitoquímica 110

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

A

B

O

O

O

O

O

O

O

O

O

B

a) NADP-H, O2 Monoxigenase

O

O

O

O

O

O

O

O

O

B

O

CoAS

O

O

O

O

O

A

O

O

O

O

O

O

O

O

O

BO

H2O

OH

S R

OH

O O

S R

OH -H

H+

b) H3O+

LST 4

LST 1

LST 9

LST 10

Figura D67. Proposta de biossíntese para o dímero de melampolidos 10.

D. Fitoquímica 111

O

O

O O

OO

O

O

O

O

12

34

56

7

8910

11

12

13

14

15

1' 2'3'

4'

5'1''

2''

1'''

1

O

O

O

O

O O

O

OO

2 O

O

O

O

O O

3

O

O

O

O

O O

O

O

O

4 O

O

O

O

O O

O

O

5

O

O

O

O

H O

6

O

O

O

O

O O

7 O

O

O

O

O O

O

O

8

O

O

O

O

HO O

9

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

OH

O O

A

B1

2

34

5

67

8910

11

12

13

14

15 12

34

5

67

8910

11

12

13

14

15

1' 2'3'

4'

5'

1''

2''

1'''

2'''' 3''''4''''

5''''

1''''

10

3.1.2.11. Dados de RMN 1H de todas LSTs

Para facilitar a comparação, os dados de RMN 1H de todas as LSTs foram compilados

em uma única tabela D16. Abaixo são apresentadas as estruturas das LSTs isoladas neste

trabalho.

Figura 68. Estruturas das LSTs isoladas.

D. Fitoquímica 112

Tab

D. Fitoquímica 113

3.1.3. Características dos metabólitos secundários isolados As estruturas foram numeradas conforme nomenclatura usual e em negrito de acordo

com sistema IUPAC.

3.1.3.1. LST 1 (Enidrina)

O

O

O O

OO

O

O

O

O

12

34

56

7

8910

11

12

13

14

15

1' 2'3'

4'

5'1''

2''

1'''

1a2

34 5 6

7

8

9

10a

11

10b 7a

4α,5β-epóxi-8β-(2’S,3’S-epóxi-angeloilóxi)-9α-acetoilóxi-germacra-1(10)Z,11(13)-dien-

6α,12-olido-14-oato de metila

Massa isolada 794 mg

Nome IUPAC

(em inglês)

(1aR,6S,7S,7aR,10aS,10bS,E)-methyl 6-acetoxy-7-[(2S,3S)-2,3-

dimethyloxirane-2-carbonyloxy]-1a-methyl-8-methylene-9-oxo-

1a,2,3,6,7,7a,8,9,10a,10b-decahydro-11-oxa-bicyclo[8.1.0]undeca-

1(10),4-dieno[9,8-b]furan-5-carboxylate

Fórmula molecular C23H28O10

Massa molecular 464

Forma macroscópica Sólido branco

Ponto de fusão 144 – 148 °C

trr1 (CLAE) 0,67

trr2 (CLAE) 1,75

UV λmáx 212 nm

RMN 1H Tab. D6, Fig. D10 – pág. 51

RMN 13C Tab. D6, Fig. D11 – pág. 52 1H-1H COSY Fig. D12 – pág. 53

D. Fitoquímica 114

3.1.3.2. LST 2 (Uvedalina)

O

O

O

O

O O

12

34

56

7

98

10

11

12

13

14

15

1' 2'3'

5'

4'

O

O

1''

2''

1'''

O

12

3

456

78

910

1111a

3a

8β-(2’S,3’S-epóxi-angeloilóxi)-9α-acetoilóxi-germacra-1(10)Z,4E,11(13)-trien-6α,12-olido-

14-oato de metila


Nome IUPAC

(em inglês)

(3aS,4S,5S,6E,10E,11aR)-methyl 5-acetoxy-4-[(2S,3S)-2,3-

dimethyloxirane-2-carbonyloxy]-10-methyl-3-methylene-2-oxo-

2,3,3a,4,5,8,9,11a-octahydrocyclodeca[b]furan-6-carboxylate


Massa molecular 448


trr1 (CLAE) 1,32

trr2 (CLAE) 3,12

UV λmáx 210 nm


RMN 13C Tab. D7, Fig. D17 – pág. 58

EM - CI (Iso) m/z (intensidade): 449 [M + H]+ (100), 405 [M - C2H3O]+ (23), 389

[M - C2H3O2]+ (47)

EM - EI m/z (intensidade): 448 [M]+ (3), 43 [C2H3O]+ (100)

D. Fitoquímica 115

3.1.3.3. LST 3 (Sonchifolina)

O

O

O

O

O O

12

34

56

7

98

10

11

12

13

14

15

1' 2'3'

5'

4'

1''

12

3

456

78

910

1111a

3a

8β-angeloilóxi-germacra-1(10)Z,4E,11(13)-trien-6α,12-olido-14-oato de metila

Massa isolada 62 mg

Nome IUPAC

(em inglês)

(3aR,4R,6E,10E,11aR)-methyl 10-methyl-4-[(Z)-2-methylbut-2-

enoyloxy]-3-methylene-2-oxo-2,3,3a,4,5,8,9,11a-

octahydrocyclodeca[b]furan-6-carboxylate


Massa molecular 374


trr1 (CLAE) 1,40

trr2 (CLAE) 1,84

UV λmáx 210 nm


D. Fitoquímica 116

3.1.3.4. LST 4 (Fluctuanina)

O

O

O

O

O O

12

34

56

7

98

10

11

12

13

14

15

1' 2'3'

5'

4'

O

O

1''

2''

1'''

O1a

2

3

4 5 67

8

9

10a

11

7a10b

4α,5β-epóxi-8β-angeloilóxi-9α-acetoilóxi-germacra-1(10)Z,11(13)-dien-6α,12-olido-14-oato

de metila

Massa isolada 3 mg

Nome IUPAC

(em inglês)

(1aR,6S,7S,7aR,10aS,10bS,E)-methyl 6-acetoxy-1a-methyl-7-[(Z)-

2-methylbut-2-enoyloxy]-8-methylene-9-oxo-

1a,2,3,6,7,7a,8,9,10a,10b-decahydro-11-oxa-bicyclo[8.1.0]undeca-

1(10),4-dieno[9,8-b]furan-5-carboxylate


Massa molecular 448


trr1 (CLAE) 1,54

UV λmáx 210 nm


RMN 13C Tab. D9, Fig. D23 – pág. 67 1H-1H gCOSY Fig. D24 – pág. 68

EM - CI (Iso) m/z (intensidade): 449 [M + H]+ (64), 389 [M - C2H3O2]+ (100), 83

[C5H7O]+ (23)

EM - EI m/z (intensidade): 448 [M]+ (1), 388 [M - C2H4O2]+ (5), 83

[C5H7O]+ (100)

D. Fitoquímica 117

3.1.3.5. LST 5

O

O

O

O

O O

12

34

56

7

98

10

11

12

13

14

15

1' 2'3'

4'O

O

1''

2''

1'''

12

3

456

78

910

1111a

3a

8β-metacriloilóxi-9α-acetoilóxi-germacra-1(10)Z,4E,11(13)-trien-6α,12-olido-14-oato de

metila

Massa isolada 2,5 mg

Nome IUPAC

(em inglês)

(3aS,4S,5S,6E,10E,11aR)-methyl 5-acetoxy-4-(methacryloyloxy)-

10-methyl-3-methylene-2-oxo-2,3,3a,4,5,8,9,11a-



Massa molecular 418


trr1 (CLAE) 2,03

UV λmáx 210 nm



(100)

EM - EI m/z (intensidade): 418 [M]+ (3), 358 [M - C2H4O2]+ (2), 69

[C4H5O]+ (100), 43 [C2H3O]+ (61)

D. Fitoquímica 118

3.1.3.6. LST 6

O

O

O

O

H O

12

34

56

7

98

10

11

12

13

14

15

1' 2'3'

4'

5'

12

3

456

78

910

1111a

3a

8β-angeloilóxi-14-oxo-germacra-1(10)Z,4E,11(13)-trien-6α,12-olido

Massa isolada 4 mg

Nome IUPAC

(em inglês)

(Z)-[(3aR,4R,6E,10E,11aR)-6-formyl-10-methyl-3-methylene-2-

oxo-2,3,3a,4,5,8,9,11a-octahydrocyclodeca[b]furan-4-yl] 2-

methylbut-2-enoate


Massa molecular 344


trr1 (CLAE) 2,26

UV λmáx 210 nm



[C5H7O]+ (43)

EM - EI m/z (intensidade): 244 [M - C5H8O2]+ (8), 83 [C5H7O]+ (100)

D. Fitoquímica 119

3.1.3.7. LST 7

O

O

O

O

O O

12

34

56

7

98

10

11

12

13

14

15

1' 2'3'

4'

1''

12

3

456

78

910

1111a

3a

8β-metacriloilóxi-germacra-1(10)Z,4E,11(13)-trien-6α,12-olido-14-oato de metila

Massa isolada 2,5 mg

Nome IUPAC

(em inglês)

(3aR,4R,6E,10E,11aR)-methyl 4-(methacryloyloxy)-10-methyl-3-

methylene-2-oxo-2,3,3a,4,5,8,9,11a-octahydrocyclodeca[b]furan-6-

carboxylate


Massa molecular 360


trr1 (CLAE) 3,46

UV λmáx 210 nm



EM - CI (Iso) m/z (intensidade): 361 [M + H]+ (100)

EM - EI m/z (intensidade): 360 [M]+ (1), 291 [M - C4H5O]+ (1), 69 [C4H5O]+

(100)

D. Fitoquímica 120

3.1.3.8. LST 8 (Polimatina B)

O

O

O

O

O O

12

34

56

7

98

10

11

12

13

14

15

1' 2'3'

5'

4'

O

O

1''

2''

1'''

12

3

456

78

910

1111a

3a

8β-angeloilóxi-9α-acetoilóxi-germacra-1(10)Z,4E,11(13)-trien-6α,12-olido-14-oato de metila

Massa isolada 3 mg

Nome IUPAC

(em inglês)

(3aS,4S,5S,6E,10E,11aR)-methyl 5-acetoxy-10-methyl-4-[(Z)-2-

methylbut-2-enoyloxy]-3-methylene-2-oxo-2,3,3a,4,5,8,9,11a-



Massa molecular 432


trr1 (CLAE) 3,48

UV λmáx 210 nm



gHSQCR Fig. D45 – pág. 89

gHMQCR Fig. D46 – pág. 90


[C5H7O]+ (21)

EM - EI m/z (intensidade): 83 [C5H7O]+ (100), 43 [C2H3O]+ (11)

D. Fitoquímica 121

3.1.3.9. LST 9

O

O

O

O

HO O

12

34

56

7

98

10

11

12

13

14

15

1' 2'3'

4'

5'

12

3

456

78

910

1111a

3a

Ácido 8β-angeloilóxi-germacra-1(10)Z,4E,11(13)-trien-6α,12-olido-14-óico


Nome IUPAC

(em inglês)

(3aR,4R,6E,10E,11aR)-10-methyl-4-[(Z)-2-methylbut-2-enoyloxy]-

3-methylene-2-oxo-2,3,3a,4,5,8,9,11a-octahydrocyclodeca[b]furan-

6-carboxylic acid


Massa molecular 360


trr1 (CLAE) 4,12

UV λmáx 210 nm



EM - CI (Iso) m/z (intensidade): 361 [M + H]+ (100), 261 [M - C5H7O2]+ (70),

101 [H2O + C5H7O]+ (10), 83 [C5H7O]+ (28)

EM - EI m/z (intensidade): 83 [C5H7O]+ (100)

EM alta resolução - ES m/z (intensidade): 361.164565 [M + H]+

D. Fitoquímica 122

3.1.3.10. LST 10 (Dímero de melampolidos)

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

OH

O O

A

B1

2

34

5

67

8910

11

12

13

14

15 12

34

5

67

8910

11

12

13

14

15

1' 2'3'

4'

5'

1''

2''

1'''

2'''' 3''''4''''

5''''

1''''

12

3

456

78

910

1111a

3a

12

3

4 5 67

8

9

10a

11

7a10b

4α,5β-epóxi-8β-[2S-hidróxi-3R-óxi-(8β-angeloilóxi-germacra-1(10)Z,4E,11(13)-trien-6α,12-

olido)]-9α-acetoilóxi-germacra-1(10)Z,11(13)-dien-6α,12-olido-14-oato de metila

Massa isolada 10 mg

Nome IUPAC

(em inglês)

(1aR,6S,7S,7aR,10aS,10bS,E)-methyl 6-acetoxy-7-{(3R)-2-

hydroxy-2-methyl-3-[(3aR,4R,6E,10E,11aR)-10-methyl-4-((Z)-2-

methylbut-2-enoyloxy)-3-methylene-2-oxo-2,3,3a,4,5,8,9,11a-

octahydrocyclodeca[b]furan-6-carbonyloxy]-butanoyloxy}-1a-

methyl-8-methylene-9-oxo-1a,2,3,6,7,7a,8,9,10a,10b-decahydro-11-

oxa-bicyclo[8.1.0]undeca-1(10),4-dieno[9,8-b]furan-5-carboxylate


Massa molecular 824


trr1 (CLAE) 2,66

UV λmáx 225 nm



gHSQCR Fig. D57 – pág. 103

gHMQCR Fig. D58 e D59 – pág. 104 e 105

D. Fitoquímica 123

1H-1H gCOSY Fig. D60 – pág. 106

EM - APCI m/z (intensidade): 842 [M + H20]+ (100)

EM - EI m/z (intensidade): 724 [M - C5H8O2]+ (3), 83 [C5H7O]+ (100), 43

[C2H3O]+ (47)

EM - ESI m/z (intensidade): 847 [M + Na]+ (100), 765 [M - C2H3O2]+ (66),

747 [M + Na - C5H8O2]+ (100)

EM alta resolução - ES m/z (intensidade): 825.33281 [M + H]+ (100), 847.31476 [M + Na]+

D. Fitoquímica 124

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

0

20

40

60

80

100

120

1730

% tr

ansm

itânc

ia


4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

0

20

40

60

80

100

120

1730

% tr

ansm

itânc

ia


4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

0

20

40

60

80

100

1730

% tr

ansm

itânc

ia


A

B

C

Figura D69. Espectros na região do IV (filme em CHCl3) de extratos de folhas de S. sonchifolius sem tricomas

pulverizadas. A: extrato etanólico; B: extrato diclorometânico; C: extrato hexânico.

3.2. Avaliação espectroscópica de extratos de folhas com e sem

tricomas glandulares Os extratos de folhas sem tricomas

glandulares pulverizadas foram submetidos à

análise espectroscópica na região do IV (Fig.

D69). Nos três extratos, etanólico,

diclorometânico e hexânico, observa-se

bandas de absorção características de

estiramento de carbonila de ésteres e bandas

de estiramento C-H entre 2.850 e 2.960 cm-1.

No espectro do extrato etanólico aparece uma

banda de estiramento do grupo -OH de álcoois

e fenóis entre 3.600 e 3.200 cm-1.

Bandas de absorção de estiramento de

carbonila de lactonas não foram observadas,

uma vez que essas são compartimentalizadas

nos tricomas glandulares. Essa comprovação

pode ser mais um indicativo de que as LSTs

participam positivamente das atividades

biológicas do chá das folhas. O infuso ou

decoto preparados com as folhas íntegras são

processos que promovem a extração do

conteúdo glandular. Isso se comprovou

observando as folhas sob estereomicroscópio

antes e após serem submetidas a estes

processos. Os tricomas glandulares foram

totalmente solubilizados na água quente em

ambos os casos. A análise do infuso e decoto

por meio de CLAE também comprovou este

fato, uma vez que os cromatogramas

apresentaram perfis semelhantes aos daqueles

dos extratos glandulares, ou seja, apesar da

compartimentalização os chás possuem LSTs.

D. Fitoquímica 125

Minutos 0 10 20 30 40 50 60

0

5

10

15

20

25

0

5

10

15

20

25

Minutos 0 10 20 30 40 50 60

0

5

10

15

0

5

10

15

1

2

2

1

3

3

4 5 6 7 8

9 1 0

mA

U

mA

U

A

B

3.3. Extrato glandular de S. sonchifolius e caracterização dos picos Tricomas glandulares de folha de S. sonchifolius #101 foram manualmente coletados

sob estereomicroscópio, solubilizados em MeOH/H2O e perfis cromatográficos analíticos

foram obtidos por meio de CLAE em coluna de fase reversa (Fig. D70). No perfil

cromatográfico é possível identificar as LSTs isoladas do extrato de lavagem foliar da

população #130. Alguns dados cromatográficos foram calculados e apresentados na tabela

D17.

Cromatograma D70. Cromatogramas dos tricomas glandulares de folhas de S. sonchifolius A, sistema 1- MeOH/H2O 55:45; 1 mL/min; 225 nm; coluna C-18; DMP = 14,421 min; B, sistema 2 – CH3CN/H2O

35:65; 1,3 mL/min; 225 nm; coluna C-18; DMP = 15,306 min.

D. Fitoquímica 126

Tabela D17. Dados cromatográficos e espectroscópicos das LSTs do extrato glandular de S. sonchifolius #101.

LST trr1/trr2 UV λmáx 1 0,67/1,75 210 2 1,32/3,12 210 3 1,40/1,84 210 4 1,54 210 5 2,03 210 6 2,26 210 7 3,46 210 8 3,48 210 9 4,12 210

10 2,66 225

Os resultados confirmam mais uma vez que as LSTs são compartimentalizadas, porém

isso não impede a sua extração mesmo por formas simples de preparo como decoto e infuso.

D. Fitoquímica 127

4. BIBLIOGRAFIA

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