UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE FARMÁCIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS PARA SAÚDE

CAROLINA SERRA JOGAIB CABO

EXTRATO DICLOROMETANO DE Eugenia punicifolia: MODULAÇÃO DO

FENÓTIPO COLINÉRGICO NA RETINA DE RATOS NEONATOS IN VITRO

Orientadores: Prof. Dr. Wilson da Costa Santos Profa Dra. Carla Valéria Vieira Guilarducci Ferraz

Niterói 2014

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CAROLINA SERRA JOGAIB CABO

EXTRATO DICLOROMETANO DE Eugenia punicifolia: MODULAÇÃO DO

FENÓTIPO COLINÉRGICO NA RETINA DE RATOS NEONATOS IN VITRO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde, da Faculdade de Farmácia, da Universidade Federal Fluminense, como requisito para obtenção do título de Mestre.

Dissertação desenvolvida no Laboratório de Farmacologia da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal Fluminense

Orientadores: Prof. Dr. Wilson da Costa Santos Profa Dra. Carla Valéria Vieira Guilarducci Ferraz

Niterói 2014

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CAROLINA SERRA JOGAIB CABO

EXTRATO DICLOROMETANO DE Eugenia punicifolia: MODULAÇÃO DO

FENÓTIPO COLINÉRGICO NA RETINA DE RATOS NEONATOS IN VITRO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde, da Faculdade de Farmácia, da Universidade Federal Fluminense, como requisito para obtenção do título de Mestre.

Aprovada em 30 de maio de 2014

BANCA EXAMINADORA

_________________________________________________ Dra. Karinne Cristinne da Silva Cunha

UNIRIO

_________________________________________________ Dra. Aline Araujo dos Santos Rabelo

UFF

_________________________________________________ Dr. Wilson da Costa Santos (Orientador)

UFF

Niterói 2014

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Lâmpada para os meus pés é tua palavra, e luz para o meu caminho.

Salmos 119:105

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Dedico este trabalho aos meus pais, Fátima e Ronald,

ao meu irmão, Ronald e àqueles que de forma direta ou indireta colaboraram para sua

realização.

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AGRADECIMENTOS

À Deus pela oportunidade de concluir mais uma etapa de crescimento pessoal e profissional, e por ser minha fonte de forças, equilíbrio e paz nos momentos de dificuldade.

Aos meus pais, Fátima e Ronald, por proverem meus estudos e me

incentivarem sempre. A minha mãe por estar presente a cada instante em minha vida com seu apoio e amor incondicionais. Ao meu pai por sua ajuda e apoio para que eu me dedique aos estudos. A ambos pelo exemplo de vida e de trabalho. Amo vocês mais que o infinito!

Ao meu irmão, Roninho, por ser um exemplo de esforço e dedicação no

trabalho ao buscar sempre o melhor desempenho. Te admiro e amo demais, Ninho! A minha cunhada, Marta, por suas palavras de incentivo. Sei que vocês estão sempre mandando bons pensamentos para mim. Obrigada!

Aos meus orientadores, Wilson e Carla. Wilson por confiar a mim o trabalho

que possibilitou a realização do meu mestrado. Obrigada pela oportunidade e por seus conselhos! Carla por estar comigo durante o desenvolver do trabalho, me apoiando e passando seus conhecimentos em cada etapa da pesquisa. Obrigada por sua paciência, incentivo e confiança!

A professora Elizabeth Giestal por ter me acolhido em seu laboratório de

forma tão especial. Obrigada por sua ajuda durante o desenvolver do meu projeto e, além disso, obrigada pelo exemplo de profissional, que gosta do que faz, e pelo exemplo de pessoa por toda a sua generosidade! Jamais esquecerei tudo o que você fez por mim! A professora Aline por sua ajuda e atenção sempre que foi precisei!

Aos meus amigos pela compreensão nos momentos de ausência, pelas

risadas nos momentos de distração e por acreditarem em mim! Vocês tornam tudo mais fácil e leve: Rachel, Gabi Veiga, Munick, Ana Renata, Roberta, Fabiana, Raísa, Raquel, Camilly, Júlia Mattos e Júlia Hauaji.

Ao Anderson por seu incentivo e companheirismo nas horas de estudo e desenvolvimento dessa dissertação, e por todos os momentos de descontração.

As amigas que a faculdade me presenteou: Natália, Flaviane e Thais. Sei que

mesmo que cada uma esteja trilhando o seu caminho, uma torce pela outra da mesma forma. A Gabriela Deutsch por sua amizade e ajuda durante o mestrado.

Aos amigos do Laboratório de Cultura de Tecidos Hertha Meyer, que me

receberam de braços abertos, me ajudaram no aprendizado das técnicas desenvolvidas, transmitiram seus conhecimentos quando necessário e proporcionaram muitas risadas. Vocês tornam o ambiente de trabalho mais leve e agradável. Sentirei saudades! Muito obrigada Gérsica, Leandro, Babu, Luis, Patrícia, Marcelo, Thayana, Sheila, Lucienne, Karen, Thalita, Amanda, Érica, Adriano, Eliezer, Gustavo Mataruna e Alex. Aos amigos do Laboratório de Farmacologia, que apesar da pouca convivência também me acolheram de forma especial.

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Aos técnicos do laboratório pela preparação do material do laboratório. Aos responsáveis pelo cuidado com os animais do biotério. Aos envolvidos nos serviços gerais prestados em nosso ambiente de pesquisa.

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RESUMO

Estudos sobre os efeitos do extrato aquoso da Eugenia punicifolia (EP) demonstram sua ação na neurotransmissão da junção neuromuscular. Entretanto, apesar de saber que o aumento da neurotransmissão colinérgica pode apresentar atividade neuroprotetora e atuar na plasticidade neuronal, não existem estudos sobre o efeito do extrato de EP em células do Sistema Nervoso Central. O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito do extrato diclorometano de EP sobre células da retina de ratos neonatos in vitro no que tange à proliferação celular, modulação do fenótipo colinérgico e aos níveis de fator de crescimento do nervo (NGF), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e da interleucina IL-4. Foram realizadas culturas primárias de células da retina de ratos neonatos da linhagem Lister Hooded de ambos os sexos, dia pós-natal 0-2. As culturas foram plaqueadas em placas de Petri pré-tratadas com poli-L-ornitina, na densidade de 1,0x105 cel/cm2, receberam meio 199 ou 1µg/mL do extrato diclorometano de Eugenia punicifolia (EP 1µg/mL) e foram mantidas por 48 horas a 37°C, em atmosfera de 95% de ar e 5% de CO2. O método bioquímico utilizado para análise da proliferação celular foi a incorporação de [3H]-timidina. Os níveis dos receptores muscarínicos, de neurotrofinas e citocinas foram determinados por Western Blot. Todos os dados são apresentados em relação à porcentagem do controle (100%). Os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da UFF (Projeto nº 186/2012). Os resultados mostram que o tratamento das culturas com diferentes concentrações do extrato diclorometano de EP por 48h induziu aumento dependente da concentração na proliferação celular, sendo o aumento mais significativo observado na concentração de 1µg/mL, concentração que foi utilizada em todos os experimentos. Foi observada a redução nos níveis dos receptores muscarínicos M1 e M4, e nos níveis de transportador de acetilcolina associado à vesícula, aumento na expressão do receptor M3 e nenhuma alteração nos níveis do receptor M5. Observou-se, também, que o extrato diclorometano de EP aumenta os níveis de NGF e da interleucina-4, e diminui dos níveis de BDNF. Os resultados sugerem que o extrato diclorometano de EP exerce efeito proliferativo e de diferenciação através da alteração do fenótipo colinérgico da retina e da participação de fatores neurotróficos. Palavras-chave: Eugenia punicifolia, receptores colinérgicos, neurotrofinas, interleucina-4.

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ABSTRACT

Studies on the effects of the Eugenia punicifolia (EP) aqueous extract demonstrate its action on neurotransmission in the neuromuscular junction. However, despite knowing that increased cholinergic neurotransmission may have neuroprotective activity and act in neuronal plasticity, there are no studies on the effect of the extract of EP in cells of the Central Nervous System. The aim of this work was to study the effect of the dichloromethane extract of EP on retinal cells of neonatal rats in vitro with respect to cell proliferation, modulation of the cholinergic phenotype and levels of nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and interleukin IL-4. Primary cell cultures of neonatal rat retina from Hooded Lister strain of both sexes, postnatal day 0-2 were performed. Cultures were plated on pre-treated Petri plates with poly-L- ornithine at a density of 1.0 x105 cel/cm2 received medium 199 or 1μg/mL of dichloromethane extract of E. punicifolia (EP 1μg/mL) and kept for 48 hours at 37°C in an atmosphere of 95% air and 5% CO2. The method used for biochemical analysis of cellular proliferation was the incorporation of [3H]-thymidine. The levels of muscarinic receptors, neurotrophins and cytokines were determined by Western blot. All data are presented in relation to the percentage of control (100%). The experimental procedures were approved by the Ethics Committee on Animal Use of UFF (Project nº 186/2012). The results show that treatment of cultures with different concentrations of the dichloromethane extract of EP for 48h induces an increase in cell proliferation, with the most significant increase observed with the concentration of 1μg/mL, concentration, which was used in all experiments. A reduction in levels of muscarinic receptors M1 and M4, and VAChT was observed, an increase in expression of the M3 receptor and no change in the levels of the M5 receptor were observed. Also was observed that the dichloromethane extract of EP increased NGF levels and interleukin-4, and decreases levels of BDNF. The results suggest that the dichloromethane extract of EP exerts a proliferative effect and differentiation by altering the cholinergic phenotype of the retina and the involvement of neurotrophic factors. Keywords: Eugenia punicifolia, cholinergic receptors, neurotrophins, interleukin-4.

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LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1: Imagens da Eugenia punicifolia (Kunth) DC. A) árvore; B) frutos p.14 Figura 2: Sistema colinérgico (encéfalo humano) p.17 Figura 3: Estrutura química da acetilcolina p.18 Figura 4: Representação esquemática da sinapse colinérgica p.20 Figura 5: Estrutura dos receptores nicotínicos neurais p.23 Figura 6: Estrutura dos receptores muscarínicos p.25 Quadro 1: Subtipos de receptores muscarínicos centrais e periféricos, transdução de sinal, perfil de expressão e doenças relacionadas p.26 Figura 7: Diagrama esquemático das interações dos receptores com neurotrofinas maduras e pró-neurotrofinas p.30 Figura 8: Histogênese da retina p.33 Figura 9: Esquema simplificado da retina de vertebrados recém-nascidos (A) e adultos (B) p.34 Figura 10: Regulação do ciclo celular p.40 Figura 11: Curva concentração-resposta do extrato de E. punicifolia em células da

retina mantidas em cultura por 48h p.51 Figura 12: Fotomicrografia em contraste de fase da morfologia das culturas de

céuluas da retina após 48 horas in vitro p.52 Figura 13. Níveis de receptor M1 em culturas de células da retina tratadas com E.

punicifolia por 48h p.53 Figura 14. Níveis de receptor M3 em culturas de células da retina tratadas com E.

punicifolia por 48h p.54 Figura 15. Níveis de receptor M4 em culturas de células da retina tratadas com E.

punicifolia por 48h p.55 Figura 16. Níveis de receptor M5 em culturas de células da retina tratadas com E.

punicifolia por 48h p.56 Figura 17. Níveis da subunidade α7 do receptor nicotínico (Nα7) em culturas de

células da retina tratadas com E. punicifolia por 48h p.57 Figura 18. Níveis do transportador de acetilcolina associoado à vesícula

VAChT em culturas de células da retina tratadas com E. punicifolia p.58 Figura 19. Níveis do fator de crescimento do nervo (NGF) em culturas de células da

retina tratadas com E. punicifolia p.59 Figura 20. Níveis do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) em culturas de

células da retina tratadas com E. punicifolia p.60 Figura 21. Níveis de interleucina IL-4 em culturas de células da retina tratadas com

E. punicifolia p.61

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LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

[3H] – Trítio 5–HT3 – 5-hidroxitriptamina 3 α-Bgtx – Alfa bungarotoxina Acetil CoA – Acetil coenzima A ACh – Acetilcolina AChE – Acetilcolinesterase AChRs – Receptores de acetilcolina AMPc – Adenosina monofosfato cíclico ATP – Adenosina trifosfato BDNF – Fator neurotrófico derivado do cérebro BSA – Albumina de soro bovino BuChE – Butirilcolinesterase CAK – Ativador da cinase CCG – Camada de células ganglionares CDKs – Cinases dependentes de ciclina CGR – Células ganglionares da retina ChAT – Colina acetiltransferase CHT / CHT1 – Transportador de colina de alta afinidade CKI – Inibidores de CDK Cl- – Íon cloro CMF – Solução salina sem cálcio e sem magnésio CNE – Camada nuclear externa CNI – Camada nuclear interna CNTF – Fator trófico para neurônios do gânglio ciliar CPE – Camada plexiforme externa CPI – Camada plexiforme interna CT – Controle DAG – Diacilglicerol DMD – Distrofia muscular de Duchenne DMSO – Dimetilsulfóxido DA – Doença de Alzheimer DNA – Ácido desoxirribonucleico E – Período embrionário ECL – Solução reagente de Luminol EGFRs – Fator de crescimento epidermal EP – Eugenia punicifolia EPR – Epitélio pigmentar da retina ERK – Cinase regulada por sinal extracelular Fase M – Mitose FGFb / FGF-2 – Fator de crescimento de fibroblasto básico GABA – Ácido gama aminobutírico GRKs – Cinase de receptores acoplados a proteína G HC-3 – Hemicolinium-3 IFN-γ – Interferon gama IL-1β – Interleucina 1β IL-2 – Interleucina 2 IL-4 – Interleucina 4 IL-4R – Receptor de IL-4

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IL-4Rα – Subunidade alfa do receptor de IL-4 IL-13Rα1 – Subunidade alfa 1 do receptor de IL-13 IP3 – Inositol 1,4,5-trifosfato LIF – Fator inibitório de leucemia M1, M2, M3, M4, M5 – Subtipos de receptores muscarínicos mAChRs – Receptores muscarínicos MMP – Metaloproteinases de matriz ms – Septo medial Nα7 – Receptor nicotínico de subunidade alfa 7 Na+ – Íon sódio nAChRs – Receptores nicotínicos nb – Núcleos basais NF-κB – Fator nuclear kappa B NGF – Fator de crescimento do nervo NTs – Neurotrofinas NT-3 – Neurotrofina 3 NT-4/5 – Neurotrofina 4/5 NT-6 – Neurotrofina 6 NT-7 – Neurotrofina 7 P – Período pós-natal p75 NTR – Receptor de neurotrofina p75 p53 – Gene suppressor de tumor p53 pRb/Rb – Proteína de retinoblastoma PKC – Proteína cinase C PMA – 13-acetato de forbol 12-miristato Proteína G – Proteínas ligantes de nucleotídeo de guanina PVDF – Polímero de fluoreto de vinilideno Raf-1 cinase – Cinase que ativa a MEK RNAm – Ácido ribonucleico mensageiro SDS – Dodecil sulfato de sódio SFB – Soro fetal bovino SNC – Sistema Nervoso Central SNP – Sistema Nervoso Periférico Src – Protooncogene proteína cinase tirosina TBS – Solução salina tamponada por Tris TCA – Ácido tricloroacético TEMED – N,N,N’,N’-tetrametiletilenodiamina TGFα – Fator de transformação de crescimento alfa TNF – Fator de necrose tumoral TNFα – Fator de necrose tumoral alfa Trk – Receptor com atividade cinase relacionado à tropomiosina VAChT – Transportador de acetilcolina associoado à vesícula VAT – Transportador associado à vesícula

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO p. 13 2 REVISÃO DE LITERATURA p. 14 2.1 Eugenia punicifolia p.14 2.2 Sistema colinérgico p. 17 2.2.1 Acetilcolina p. 18 2.2.2 Receptores colinérgicos p. 21 2.3 Sistema Nervoso Central p. 27 2.3.1 Neurotrofinas e citocinas p.28 2.3.2 Retina p.32 2.3.2.1 Atividade colinérgica na retina p.35 2.3.2.2 Ações das neurotrofinas na retina p.37 2.4 Ciclo celular p.39 3. OBJETIVOS p. 42 3.1 Objetivo geral p. 42 3.2 Objetivos específicos p. 42 4 MATERIAL E MÉTODOS p. 43 4.1 Material p. 43 4.2 Extrato diclorometano da Eugenia punicifolia p. 44 4.3 Animais experimentais p. 44 4.4 Cultura de células da retina p. 45 4.5 Incorporação de timidina p. 45 4.6 Western blot p. 46 4.6.1 Extração de proteínas p. 47 4.6.2 Dosagem de proteínas p. 47 4.6.3 Preparação do gel de poliacrilamida p. 47 4.6.4 Transferência das proteínas do gel para a membrana de PVDF p. 48 4.6.5 Bloqueio e imunodetecção p. 48 4.6.6 Revelação p. 48 4.7 Fotomicrografia em contraste de fase p. 49 4.8 Análise estatística dos resultados p.49 4.9 Questões éticas p. 50 5 RESULTADOS p. 51 6 DISCUSSÃO p. 62 7 CONCLUSÕES p. 74 8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS p. 75 9 ANEXOS 9.1 Anexo 1 - Folha de aprovação do projeto pelo Comitê de Ética no Uso de Animais p. 95

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1 INTRODUÇÃO

Historicamente, há uma longa tradição de pesquisas sobre o perfil

farmacológico de extratos de plantas, e consequente busca por novos compostos

bioativos com interesse terapêutico. Esta estratégia tem conduzido à descoberta de

diversos compostos que deram origem a várias moléculas para tratamento de uma

série de doenças (MARCAURELLE & JOHANNES, 2008). Neste aspecto, nosso

grupo de pesquisas tem interesse na determinação de extratos de produtos naturais

com atividade farmacológica. Nos últimos anos, interessamo-nos por estudar os

efeitos colinérgicos de Eugenia punicifolia, uma planta pertencente à família

Myrtaceae, de larga ocorrência na região amazônica do Brasil bem como no

Nordeste do Brasil. A planta é amplamente empregada, embora de forma empírica,

no tratamento de distúrbios estomacais (JORGE et al., 2000) e na diabetes mellitus

(BRITO et al., 2007). Recentemente foi demonstrada a importância de extratos da E.

punicifolia sobre a transmissão colinérgica periférica (GRANGEIRO et al., 2006;

LEITE et al., 2010).

Sabendo que o aumento da neurotransmissão colinérgica pode apresentar

atividade neuroprotetora e atuar na plasticidade neuronal (RAFII & AISEN, 2009), é

racional realizar experimentos com extratos de E. punicifolia em células do Sistema

Nervoso Central (SNC). Esta investigação é relevante uma vez que não há nenhum

estudo utilizando este extrato neste tecido, o qual apresenta grande dependência da

atividade colinérgica, tanto durante o desenvolvimento quanto na manutenção da

homeostasia em adultos (DESCARRIES et al., 1997; PERRY et al., 1999). Para o

desenvolvimento do estudo foi utilizado, como modelo experimental, retina de ratos

neonatos, pertencente ao SNC e de fácil obtenção, livre de outras populações

celulares.

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2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Eugenia punicifolia

Eugenia punicifolia (Humb., Bonpl. & Kunt) DC é uma planta arbustiva

pertencente à família Myrtaceae, constituída por mais de 3.000 espécies dos

gêneros Syzigium e Eugenia, largamente distribuída em toda a Amazônia (Figura 1).

A família Myrtaceae é uma das mais características da flora brasileira e entre suas

espécies são encontrados vegetais de uso medicinal, ornamentais, produtores de

madeiras e de frutos comestíveis. As folhas das mirtáceas são simples e

hipoestomáticas, com estômatos do tipo ranunculáceo (JORGE et al., 2000). Além

das caracteríscas gerais, a Eugenia punicifolia apresenta folhas com contorno

predominantemente oboval. Quanto às características microscópicas a espécie

apresenta células epidérmicas de contorno onduloso, recobertas por cutícula

estriada, em secção paradérmica; nervuras medianas plano-convexas com feixes

bicolaterais envoltos por bainha esclerenquimática; esporadicamente há presença de

cristais dos tipos drusas e prismáticos, e o parênquima paliçádico em duas camadas

(JORGE et al., 2000, OLIVEIRA et al., 2005).

A B Figura 1 – Imagens da Eugenia punicifolia (Kunth) DC. A) árvore; B) frutos. Fonte: A)

http://www.kew.org/science/tropamerica/imagedatabase/large1/cat_single1-1636.html B) http://www.kew.org/science/tropamerica/imagedatabase/index.html

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A composição química do óleo essencial das folhas secas de E. punicifolia

varia conforme a região de coleta da planta, devido a diferenças nos parâmetros

climáticos e geográficos. Considerando plantas colhidas na região de Matas

Serranas próximas à Pernambuco, a composição química consiste principalmente

de monoterpenos oxigenados como o 1,8-cineol, o linalol e o α-terpineol;

sesquiterpenos oxigenados como o β-cariofileno, elemol e α-cadinol (OLIVEIRA et

al., 2005). Por outro lado, nas plantas colhidas próximas a Manaus, a composição

química é constituída majoritariamente de benzenóides e β-cariofileno (MAIA et al.,

1997).

Popularmente denominada “pedra-ume caá”, as folhas frescas são utilizadas

na forma de infusão ou decocção no tratamento de distúrbios estomacais (JORGE et

al., 2000) e da diabetes mellitus (BRITO et al., 2007; BOPP et al., 2009). Outras

espécies do gênero Eugenia são utilizadas na terapêutica popular e, estudos

comprovaram a eficácia da E. uniflora como agente anti-hipertensivo (CONSOLINI et

al., 1999), antidiarréico, diurético e antirreumático (PIO CORREA, 1984;

SCHAPOVAL et al., 1994). As propriedades farmacológicas descritas para os

membros do gênero Eugenia são atribuídas à ação de terpenóides, taninos,

antraquinonas e flavonóides (mircitina, quercitina) (CONSOLINI & SARUBBIO,

2002).

O uso da E. punicifolia na medicina tradicional foi comprovado em ratos com

diabetes induzida por estreptozotocina. Nesses animais, a administração crônica do

extrato metanólico de folhas de E. punicifolia apresentou efeito benéfico com a

redução dos sintomas da diabetes, melhorando o metabolismo de carboidratos e de

proteína. Por outro lado, o extrato aquoso induziu um efeito anoréxico, uma vez que

houve significativa redução da ingestão de alimentos em todos os animais do grupo

tratado. Cabe ressaltar que ambos os extratos não induziram nenhum tipo de lesão

hepatocelular, muscular, pancreática ou microvascular (BRUNETTI et al., 2006).

Em preparações de diafragma de ratos, as contrações induzidas por

estímulos elétricos são bloqueadas pelos antagonistas nicotínicos galamina e

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pancurônio. A utilização de extrato aquoso de E. punicifolia nessa preparação

induziu reversão completa dos efeitos observados com os antagonistas nicotínicos,

galamina e pancurônio, diferente daquela observada quando foi utilizado a

neostigmina (inibidor reversível da enzima acetilcolinesterase). Também foi proposta

atividade inibitória do extrato aquoso na acetilcolinesterase (GRANGEIRO et al.,

2006). Estes resultados sugerem uma participação importante dos receptores

nicotínicos nas respostas induzidas pela E. punicifolia.

O tratamento de camundongos com distrofia muscular de Duchenne (DMD),

com a fração de diclorometano de E. punicifolia, exerce efeito antiinflamatório no

músculo gastrocnêmico, através da redução da produção de mediadores da

inflamação e redução de apoptose (LEITE et al., 2010). Outro efeito observado com

o extrato diclorometano de E. punicifolia foi a capacidade de aumentar a liberação

exocitótica de catecolaminas desencadeada pela acetilcolina ou com soluções

enriquecidas de potássio em células cromafins da glândula adrenal de bovinos

(PASCUAL et al., 2011). Outra atividade importante descrita para as folhas de

Eugenia punicifolia é a ação antioxidante e inibidora de enzimas como α-amilase, α-

glicosidase e xantina oxidase. Essa última pode levar à redução da taxa de absorção

de carboidratos e diminuir fatores de risco relacionados a doenças cardiovasculares,

proporcionando assim uma nova alternativa dietética para a prevenção da síndrome

metabólica (GALENO et al., 2013).

A partir dos resultados descritos, pode ser sugerido que a E. punicifolia é uma

importante ferramenta para estudos da neurotransmissão colinérgica. Em distúrbios

como doença de Alzheimer, Síndrome de Tourette, dentre outras, sabe-se que há

uma alteração importante da atividade do sistema colinérgico, porém as alterações

fisiopatológicas não estão totalmente elucidadas. A interferência no sistema

colinérgico é uma das bases clínicas para o tratamento de algumas destas doenças.

Sendo assim, torna-se importante ponderar a utilização de extratos da E. punicifolia

como importante ferramenta experimental para o desenvolvimento de novas

estratégias terapêuticas para tais doenças.

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2.2 Sistema Colinérgico

O sistema colinérgico tem papel fundamental em várias funções vitais, tanto

centrais quanto periféricas, o que faz deste sistema, atualmente, alvo de inúmeras

pesquisas (MESULAM et al., 2002). Seu bloqueio agudo é geralmente letal;

enquanto sua perda gradual, como observada na Doença de Alzheimer (DA), é

associada com a deterioração progressiva de funções neurais (HOFFMAN &

TAYLOR, 2001). Sua importância é observada na manutenção e modulação da

homeostasia do Sistema Nervoso Central (SNC), além de desempenhar funções

importantes durante o desenvolvimento. No SNC regula a proliferação e

diferenciação de células progenitoras (ANGELIS et al., 2012), o desenvolvimento de

células gliais, a maturação e a plasticidade neuronal (BROIDE & LESLIE, 1999), o

crescimento axonal, a expressão gênica e a sobrevivência celular (PEZET &

MCMAHON, 2006), influenciando em processos cognitivos como atenção, memória,

aprendizado e vigília (PEPEU & GIOVANINNI, 2004). As diferentes regiões cerebrais

envolvidas nas transmissões colinérgicas estão descritas na Figura 2.

Figura 2: Sistema colinérgico (encéfalo humano). A localização dos principais grupos de corpos celulares e tratos de fibras colinérgicas, núcleos septo medial (ms) e núcleo basal (nb) (vermelho). O núcleo pedúnculo pontino (azul) e os interneurônios estriatais (laranja). (Adaptado de PERRYet al. (1999), modificado por MAZZANTI, 2007).

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Os neurônios colinérgicos e suas projeções se encontram amplamente

distribuídos através do prosencéfalo, região na qual estão os hemisférios cerebrais,

núcleos da base, diencéfalo e porção frontal do mesencéfalo (BAGLEY, 2005). O

mais significante grupo de neurônios colinérgicos se encontra nos núcleos do septo

medial (ms) e nos núcleos basais (nb), e suas projeções vão para a região do

hipocampo, amígdala e córtex cerebral. Os neurônios colinérgicos que se encontram

no núcleo pedúnculo pontino se projetam para o tálamo e os interneurônios estriatais

apresentam um circuito colinérgico intrínseco (MESULAM, 1995; PERRY et al, 1999)

As funções do sistema colinérgico estão associadas à ação de seus diferentes

componentes como: acetilcolina (ACh), colina acetiltransferase (ChAT),

transportador associado à vesícula (VAT), transportadores de colina de alta

afinidade (CHT), acetilcolinesterase (AChE), receptores nicotínicos (nAChR) e

muscarínicos (mAChR) (ABREU-VILLAÇA et al., 2011 para revisão).

2.2.1 Acetilcolina

Em 1921, a acetilcolina foi a primeira molécula descrita como

neurotransmissor (BENNETT, 2000), e passou a ser amplamente estudada nas

sinapses centrais e periféricas (DESCARRIES et al., 1997; FERREIRA et al., 2008).

Figura 3: Estrutura química da acetilcolina. (FERREIRA et al., 2008)

Quimicamente, a acetilcolina, é um éster de ácido acético e colina (Figura 3),

cuja simplicidade estrutural subestima a complexidade das ações que exerce. É

sintetizada a partir da colina e acetil coenzima A (Acetil CoA) nos neurônios pré-

sinápticos, pela ação da colina acetiltransferase (ChAT) (ABREU-VILLAÇA et al.,

2011) (Figura 4). Os níveis de acetil-CoA são mantidos através do metabolismo da

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glicose, sob ação da enzima ATP-citrato-liase, que apresenta sua expressão

aumentada em neurônios colinérgicos (TOMASZEWICZ et al., 2003; BEIGNEUX et

al., 2004). O suprimento de colina é provido principalmente da dieta, devido à

incapacidade de neurônios em sintetizar colina (FERNSTROM, 1981; ZEISEL,

1981). A ACh é armazenada em vesículas por meio do transportador associado à

vesícula (VAChT), sendo liberada de forma quântica, após influxo de cálcio no

terminal pré-sináptico que vai induzir alterações de diversas proteínas, favorecendo

a fusão da vesícula com o terminal pré-sináptico. Uma vez liberada na fenda

sináptica, a ACh interage com receptores nicotínicos (nAChRs), causando

despolarização e propagação do potencial de ação na célula pós-sináptica, e com

receptores muscarínicos (mAChRs) (ODA, 1999). O término da ação da ACh ocorre

por hidrólise pela enzima acetilcolinesterase (AChE) gerando colina e acetato

(FERREIRA et al., 2008). Grande parte da colina resultante é captada pelo terminal

colinérgico pré-sináptico pelo transportador de colina de alta afinidade (CHT1) e

reutilizada na síntese de nova ACh (ABREU-VILLAÇA et al., 2011 para revisão;

FERREIRA et al., 2008; MESULAM et al., 2002).

20

Figura 4: Representação esquemática da sinapse colinérgica. VAChT: transportador vesicular de acetilcolina; CHT: transportador de colina; AChE: acetilcolinesterase; ChAT: colina acetil transferase; Acetyl CoA: acetilcoenzima A; ACh: acetilcolina; nAChR: receptor nicotínico de acetilcolina; mAChR: receptor muscarínico de acetilcolina. Fonte: Abreu-Villaça et al., 2011.

O término da transmissão sináptica pela hidrólise do neurotransmissor é uma

característica substancial das sinapses colinérgicas. Este mecanismo único faz da

acetilcolinesterase (AChE), uma serina hidrolase encontrada predominantemente no

cérebro, junção neuromuscular e eritrócitos, encarregada de executar a hidrólise da

ACh, peça chave da sinalização colinérgica (ZIMMERMAN & SOREQ, 2006). A

hidrólise da ACh também pode ser feita por uma enzima menos específica chamada

butirilcolinesterase (BuChE) (ou pseudocolinesterase), que se encontra no plasma,

rins, fígado, intestino, coração, pulmão e tem distribuição neuronal mais restrita em

relação a AChE (MESULAM et al., 2002)

Como mencionado anteriormente, a colina resultante da hidrólise da

acetilcolina é recaptada pelo terminal pré-sináptico, e isso se dá através do

transporte ativo realizado pelo transportador de colina de alta afinidade, CHT1, que

depende dos íons Na+ e Cl- (YAMAMURA & SNYDER,1973; COLLIER & ILSON,

21

1977). Este transporte é específico de neurônios colinérgicos e pode ser inibido por

baixas concentrações de hemicolinium-3 (HC-3). Em outras células há outro tipo de

transporte de colina, que é inibido por doses maiores de HC-3 (YAMAMURA &

SNYDER,1973)

A respeito da caracterização do transporte de colina de alta afinidade,

trabalhos mostraram que o aumento da atividade de neurônios colinérgicos gera

aumento no transporte de colina e síntese de ACh (COLLIER & KATZ, 1974; SIMON

& KUHAR, 1975; SIMON et al., 1976; O’REGAN & COLLIER 1981; SALTARELLIi et

al., 1987). Segundo Fergunson e colaboradores, 2003 o aumento da atividade

neuronal acarreta em aumento da fusão de vesículas sinápticas e maior fluxo de

CHT1 em direção à membrana plasmática. Maior captação de colina ocorre com o

aumento da concentração do CHT1 na membrana pré-sináptica, e com isso a

síntese de ACh é favorecida. (RIBEIRO et al., 2003; FERGUNSON et al., 2003).

O VAChT é outro transportador colinérgico responsável por transportar a ACh

sintetizada no citoplasma para o interior das vesículas sinápticas através de

transporte ativo, que utiliza gradiente de prótons gerado pela ATPase do tipo V. Esse

transporte realizado pelo VAChT possui relação de dois prótons por molécula de

acetilcolina (PARSONS et al., 1993).

O isômero levógiro do vesamicol é capaz de inibir o transporte de ACh

impedindo o preenchimento de vesículas colinérgicas, caracterizando assim uma

inibição alostérica e não competitiva. (PARSONS et al., 1993).

2.2.2 Receptores colinérgicos

A ACh exerce suas diversas ações fisiológicas através da interação com duas

classes distintas de receptores: os nicotínicos (nAChRs) e os muscarínicos

(mAChRs). Tais receptores foram divididos nessas classes através da

22

caracterização da atividade farmacológica de alcaloides como a nicotina e a

muscarina (VENTURA et al., 2010).

Receptores nicotínicos

Os receptores nicotínicos fazem parte da superfamília de canais iônicos

ativados por ligante, que também inclui receptores de ácido gama aminobutírico

(GABAA e GABAB), glicina e receptores de serotonina (5–HT3) (FERREIRA et al.,

2008, CHANGEUX, 2003). Os receptores nicotínicos compreendem combinações

pentaméricas de subunidades individuais (NAI et al., 2003). Por sua distribuição

anatômica e propriedades farmacológicas, esses receptores podem ser divididos em

três grupos: receptores musculares, encontrados na junção neuromuscular

esquelética; receptores ganglionares, nos terminais pós-sinápticos dos gânglios

autônomos; e receptores neuronais, amplamente distribuídos no sistema nervoso

central (HOGG et al., 2003).

No SNC, a inervação colinérgica regula diferentes processos tais como

liberação de neurotransmissores, excitabilidade celular e integração neuronal. Tais

ações envolvem os receptores nicotínicos em funções e estados fisiológicos como

sono, alerta, fadiga, ansiedade, processamento central da dor e uma série de

funções cognitivas (GOTTI & CLEMENTI, 2004). Tem sido demonstrado que a

perturbação da neurotransmissão colinérgica nicotínica pode levar a doenças

envolvendo disfunção do sistema colinérgico durante o desenvolvimento, como o

vício, epilepsia, esquizofrenia, mal de Alzheimer, miastenia, entre outras

(CHANGEUX & EDELSTEIN, 2001; GOTTI et al, 1997; HOGG et al, 2003;

LINDSTROM, 1997).

23

Figura 5: Estrutura dos receptores nicotínicos neurais. A) Topologia das subunidades nAChR dos receptores neuronais. B) Formação do poro do canal. C) Receptores homoméricos. D) receptores heteroméricos. Os triângulos vermelhos em C e D indicam os locais de interação da acetilcolina nos receptores. Fonte: HENDRICKSON et al., 2013.

Os subtipos de nAChR neuronais são localizados nas membranas pré- e pós-

sinápticas dos neurônios e em locais extra-sinápticos no SNC (AMENTA &

TAYEBATI, 2008). Múltiplos subtipos de nAChRs podem ser formados a partir das

várias combinações de subunidades, e esses subtipos podem ser classificados

como heteropentaméricos ou homopentaméricos (ABREU-VILLAÇA et al., 2011 para

revisão; FERREIRA et al., 2008). Para os receptores nicotínicos (nAChR) neuronais

as subunidades contém 4 domínios transmembrana (M1-M4) carboxiterminal, uma

região extracelular aminoterminal e uma proeminente alça intracelular (M3-M4) de

tamanhos variados (Figura 5A). Cinco subunidades iguais (receptores

homopentaméricos) ou distintas (receptores heteropentaméricos) se organizam para

formar o poro do canal (Figura 5B), o qual é permeável aos íons Na+ e Ca+2. Os

receptores homopentaméricos consistem de subunidades α somente e apresentam

baixa afinidade pelo agonista (Figura 5C). Enquanto que a maioria dos receptores de

alta afinidade são heteropentaméricos, formados pela combinação de subunidades α

e β que se organizam entre si, formando, por exemplo, os receptores α4α6β2β3,

α4β2 e α3β4 (Figura 5D) (HENDRICKSON et al., 2013).

A família de subunidades de AChRs é agrupada em duas classes principais:

Sensíveis à toxina de serpente (α-bungarotoxina-AChRs), formando AChRs

homopentaméricos (α7-α9), com cinco subunidades idênticas formando um canal

24

iônico; e heteropentaméricos (α7, α8 ou α9 e α10) (ZHANG et al., 1994;

LINDSTROM, 2000; HENDRICKSON et al., 2013). O receptor homomérico é ativado

pela acetilcolina e bloqueado por concentrações nanomolares de α-bungarotoxina

com alta permeabilidade ao Ca2+ e rápida taxa de dessensibilização. A classe não-

sensível à α-bungarotoxina (nAChRs) possui ligação à nicotina com alta afinidade,

formando sempre AChRs heteropentaméricos: contém um par de subunidades α

idênticas (α2-α6) como ligantes e requer associação com três subunidades β

idênticas (β2-β4) para serem um AChR funcional (LINDSTROM, 2000;

HENDRICKSON et al., 2013).

A maior seletividade dos receptores nicotínicos (α7)5 do sistema nervoso

central ao cálcio permite que sejam desencadeadas, por esse íon, respostas a longo

e médio prazo, como regulação da liberação de neurotransmissores, mecanismos de

plasticidade neuronal e memória, dependência a drogas, neuroproteção e morte

celular (ROLE & BERG, 1996; HENDRICKSON et al., 2013).

Receptores muscarínicos

As ações muscarínicas da acetilcolina são mediadas por cinco subtipos

distintos de receptores (FERREIRA et al., 2008; NEUBIG & SIDEROVSKI, 2002;

CAULFIELD & BIRDSALL, 1998) (Figura 6). Baseado na sua habilidade em ativar

diferentes classes de proteína G heterotriméricas, os cinco subtipos podem ser

agrupados em duas principais classes funcionais. Os receptores M2 e M4 mostram

seletividade para proteína Gi, inibem a atividade da adenilil ciclase, enquanto os

receptores M1, M3 e M5 estão seletivamente acoplados à proteína Gq, que ativa

fosfolipase C, levando à formação de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) e diacilglicerol

(DAG) (NEUBIG & SIDEROVSKI, 2002; ABREU-VILLAÇA et al., 2011 para revisão).

25

Figura 6: Estrutura dos receptores muscarinicos. Adaptado de: Neubig & Siderovski, 2002.

Os receptores muscarínicos estão presentes em diferentes órgãos, tecidos ou

tipos celulares (WOLFE & YASUDA, 1995; LEVEY, 1983). Receptores muscarínicos

periféricos estão envolvidos nas ações clássicas da ACh em tecidos ou órgãos que

recebem inervação parassimpática (CAULFIELD, 1993), enquanto os mAChRs

centrais participam da regulação de um grande número de funções cognitivas,

comportamentais, sensoriais, motoras e autonômicas (FELDER et al. 2003).

Na periferia, os receptores do tipo M3 são responsáveis por respostas

funcionais como a contração dos músculos lisos e estimulação da secreção

glandular, enquanto que os receptores do tipo M2 medeiam a inibição de canais de

cálcio voltagem-dependentes no miocárdio, sendo este resultado da inibição da

adenilato ciclase (MATSUI el at, 2004) modulando a resposta crono e inotrópica dos

músculos cardíacos.

De modo geral, no Sistema Nervoso Central, os receptores do tipo M1 são

mais abundantes, enquanto os receptores M2 e M4 são expressos de forma

moderada e os receptores M3 e M5 apresentam baixos níveis de expressão. No

hipocampo os receptores M1 e M3 são mais expressos em neurônios, os receptores

M2 e M4 são localizados em interneurônios, e os receptores M5 são pouco

expressos. A diversidade dos efeitos muscarínicos somada à presença destes

subtipos moleculares no hipocampo sugere que estes receptores possuam

importante papel na memória e no processo de aprendizado (DREVER et al., 2011).

No Quadro 1 são descritos os subtipos de receptores muscarínicos, suas

respectivas transduções de sinal, regiões onde são expressos e doenças a eles

relacionadas.

26

Quadro 1: Subtipos de receptores muscarínicos centrais e periféricos, transdução de sinal, perfil de expressão e doenças relacionadas.

M1 M2 M3 M4 M5 Transdução

de sinal Gq/11

PLC,IP3/DAG; Ca+2/PKC

Gi/0 AC (inibição)

Gq/11 PLC,IP3/DAG;

Ca+2/PKC

Gi/0 AC (inibição)

Gq/11 PLC,IP3/DAG;

Ca+2/PKC Perfil de

expressão Córtex

cerebral, Hipocampo,

Tálamo, Tecido

glandular

Córtex cerebral,

Hipocampo, Tálamo, Estriado,

Músculo liso, Coração, Pulmão

Córtex cerebral,

Hipocampo, Músculo liso,

Tecido glandular.

Estriado, Córtex

cerebral, Hipocampo.

Substância nigra

Doenças relacionadas

Doença de Alzheimer, Distúrbio cognitivo,

Esquizofrenia

Doença de Alzheimer, Distúrbio cognitivo

Doença pulmonar obstrutiva crônica,

Incontinência urinária

Doença de Parkinson,

Esquizofrenia, Dor

neuropática

Doença de Parkinson,

Esquizofrenia, Dependência

de drogas

PLC, fosfolipase-C; IP3, inositol 1,4,5-trisfosfato; DAG, diacilglicerol; PKC, proteina kinase C; AC, adenilato ciclase

Adaptado de: LANGMEAD et al., 2008.

A exposição prolongada ao agonista ativa mecanismos capazes de regular a

atividade do receptor acoplado a proteína G e isso se dá por um mecanismo

formado por três etapas principais: dessensibilização, internalização e

“downregulation”. A dessensibilização do receptor homólogo é dada pela fosforilação

do receptor acoplado a proteína G pela quinase de receptores acoplados a proteína

G (GRKs) que faz o recrutamento de β-arrestina e uma subsequente redução na

sinalização do segundo mensageiro desacoplando o receptor da proteína G

associada (SHENOY & LEFKOWITZ, 2003). A ligação à β-arrestina também leva à

internalização do receptor através de vesículas revestidas de clatrina (GOODMAN et

al., 1996). Uma vez internalizados, os receptores acoplados a proteína G podem ser

reciclados de volta para a membrana plasmática ou degradados por lisossomas em

um processo denominado “downregulation” (THANGARAJU & SAWYER, 2011).

27

2.3 Sistema Nervoso Central

A formação das estruturas do Sistema Nervoso Central (SNC) depende do

balanço controlado entre a neurogênese e a morte celular durante o

desenvolvimento. No SNC de mamíferos, a interação de vários tipos neuronais e

suas terminações sinápticas, bem como a plasticidade e a rede de sinalização que

envolve diferentes citocinas e neurotransmissores, são responsáveis pelos

processos de desenvolvimento e funcionamento deste complexo sistema (REUSS &

HALBACH, 2003).

Durante o desenvolvimento do SNC, ocorrem fenômenos progressivos de

proliferação celular e neuritogênese, de forma que as células geradas buscam

contato com as populações alvo, na formação da árvore dendrítica. O crescimento

dos prolongamentos até o alvo depende de moléculas tróficas liberadas no meio

pelo próprio neurônio, por neurônios vizinhos e por células gliais. Esta sinalização

autócrina e parácrina é necessária para a manutenção da sobrevida dos neurônios

ao longo da vida (OPPENHEIM, 1999).

Durante esse período de chegada ao alvo, acontece a morte celular natural

que é um processo morfológico e bioquímico inerente ao desenvolvimento, a qual

pode ser classificada em três tipos: necrose, apoptose (LO et al., 1995) e autofagia

(MAIURI et al., 2007). Neste período ocorre um fenômeno regressivo, onde

aproximadamente 50% dos neurônios inicialmente gerados morrem, uma vez que as

células alvo liberam quantidades limitadas de fatores tróficos, levando os neurônios

que não conseguem captar estes fatores a ativar o programa de morte celular.

(OPPENHEIM, 1991; HENDERSON, 1996).

Os três tipos de morte celular apresentam características distintas entre si. Na

necrose celular observa-se tumefação do citoplasma e das organelas, sem

mudanças nucleares facilmente detectáveis. Tal tumefação leva à destruição das

organelas e ruptura da membrana plasmática com o extravasamento do conteúdo

citoplasmático, levando a resposta inflamatória importante e acometendo todas as

28

células vizinhas (SCHWARTZMAN & CIDLOWSKI, 1993). A autofagia é

caracterizada pela eliminação de organelas danificadas ou em excesso, podendo

evoluir para a destruição completa da célula (LINDEN & GUIMARÃES, 2004;

MAIURI et al., 2007). Observa-se a formação de vacúolos que se fundem aos

lisossomas levando à degradação de seus conteúdos (MAIURI et al., 2007). A

apoptose é caracterizada por perda de volume celular, condensação da cromatina,

fragmentação organizada do DNA em oligonucleossomos provocada pela ativação

das endonucleases, manutenção da estrutura das organelas e da membrana

plasmática até seu rompimento. Por último ocorre fagocitose dos corpúsculos

apoptóticos por macrófagos e por células vizinhas (KERR, 2002), sem a ocorrência

de resposta inflamatória expressiva no tecido, bem como sem dano ao micro-

ambiente (AMARANTE-MENDES & GREEN, 1999). O programa apoptótico ocorre

através da ativação das caspases (AMARANTE-MENDES & GREEN, 1999; MAIURI

et al., 2007), que podem ser classificadas como iniciadoras da cascata de

sinalização e efetoras da resposta que agem nos substratos nucleares (SALVESEN,

1999).

Com o avanço dos estudos sobre mecanismos envolvidos no processo de

morte celular observou-se que algumas moléculas, denominadas moléculas tróficas,

são capazes de controlar essa degeneração. As neurotrofinas são moléculas com

funções importantes tanto durante o desenvolvimento do sistema nervoso quanto na

homeostasia deste tecido, desempenhando funções de controle de proliferação,

diferenciação, sobrevida, crescimento axonal e plasticidade sináptica, dentre outras

(ARÉVALO & WU, 2006).

2.3.1 Neurotrofinas e citocinas

Na década de 1950, Rita Levi-Montalcini e Victor Hamburger descreveram o

fator de crescimento do nervo (NGF), o primeiro membro de uma grande família,

denominada família de neurotrofinas (OPPENHEIM, 1999). Além do NGF, o fator

neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) (BARDE et al., 1982), a neurotrofina 3 (NT-

3) (HOHN et al., 1990), a neurotrofina 4/5 (NT-4/5) (HALLBÖÖK et al., 1991;

29

BERKEMEIER et al., 1991; EBENDAL; 1992), a neurotrofina 6 (NT-6) (GÖTZ et al.,

1994) e a neurotrofina 7 NT-7 (NILSSON et al., 1998) também foram descritos em

mamíferos.

As neurotrofinas (NTs) constituem um grupo de pequenos polipeptídeos

solúveis relacionados a fenômenos de sobrevivência, diferenciação e sobrevida

neuronal, apoptose, crescimento axonal, plasticidade sináptica e regeneração axonal

de neurônios do sistema nervoso, podendo agir de forma parácrina ou autócrina

(MENDELL, 2001; TERENGHI, 1999; RICHARDSON et al., 1991). São sintetizadas

como precursores, as pró-neurotrofinas, que podem ser clivadas intracelularmente

pela furina e outras pró-convertases ou, alternativamente, podem ser secretadas na

sua forma não clivada como pró-neurotrofinas (FRIEDMAN, 2010).

As NTs exercem seus efeitos através da ligação com dois receptores

diferentes - receptor com atividade cinase relacionado à tropomiosina (Trk) e o

receptor de neurotrofina p75 (p75NTR) da superfamília de receptores para fator de

necrose tumoral (TNF) (ARÉVALO & WU, 2006) (Figura 7). Todas as neurotrofinas

descritas ligam-se ao receptor p75, porém, com diferentes cinéticas de ligação

(TERENGHI, 1999). A família dos receptores Trk compreende três membros, o TrkA

o TrkB e o TrkC, e as neurotrofinas ligam-se a eles com seletividades diferentes.

NGF liga-se com maior seletividade ao TrkA ;o BDNF e a NT-4/5 ao TrkB e o NT-3

ao TrkC (BOYD & GORDON, 2003; CHAO, 2003). A pró-neurotrofina desempenha

um papel de ligante para o receptor p75NTR (RATTENHOLL et al., 2001), sendo

capaz de desencadear ações celulares como apoptose (NYKJAER et al., 2005),

crescimento e sobrevida neuronal (YAMASHITA et al., 1999). As formas “maduras”

clivadas de neurotrofinas se ligam com alta afinidade aos receptores Trk, que podem

estar complexados com p75NTR, enquanto as pró-neurotrofinas se ligam

preferencialmente à p75NTR em complexo com o co-receptor sortilina (FRIEDMAN,

2010).

A sinalização mediada pelo receptor p75, em determinadas situações

experimentais, leva à morte neuronal, através da ação do pró-NGF (IBÃNÉZ, 2002)

(Figura 7). Enquanto que a sinalização mediada pelos receptores Trk desencadeia

30

uma cascata de sinalização com ativação de múltiplas vias intracelulares

responsáveis por efeitos protetores nos neurônios como regulação dos fenômenos

de neuritogênese e sobrevida (KAPLAN & MILLER, 2000). Alguns alvos das

neurotrofinas foram melhor caracterizados no Sistema Nervoso Periférico, onde elas

são secretadas por tecidos inervados com neurônios simpáticos e sensoriais, como

as glândulas salivares, músculos, órgãos viscerais e pele (ASCANO et al, 2012)

Figura 7: Diagrama esquemático das interações dos receptores com neurotrofinas maduras e

pró-neurotrofinas. Fonte: FRIEDMAN, 2010.

O NGF é capaz de regular funções importantes, incluindo liberação de

neurotransmissores, ativação de receptores e abertura de canais iônicos voltagem

dependentes (PEZET & MCMAHON, 2006). Esses efeitos são observados em

neurônios sensoriais primários, assim como em neurônios simpáticos e colinérgicos

do gânglio basal e protegem contra a neurodegeneração (SHOVAL & WEIZMAN,

2005). Efeitos pró-apoptóticos são gerados pelo NGF em células gliais, como

oligodendrócitos e células de Schwann quando procedentes da ligação com p75,

mas depende da intensidade de ligação e interação com os receptores Trk (BOYD &

GORDON, 2003). O NGF também exerce papel comunicador entre o sistema imune

31

e nervoso, onde se observa aumento em seus níveis teciduais e séricos em

respostas inflamatórias, doenças auto-imunes e reações alérgicas podendo, dessa

maneira, agir como modulador (ALOE, 2004; BONINI et al., 1999).

O BDNF é importante para a formação, maturação e sobrevida neuronal na

fase inicial do desenvolvimento fetal e, na fase adulta, tem papel bastante conhecido

nos fenômenos cognitivos como no processo de consolidação da memória e

aprendizado (POST, 2007). Estudos mostram que há diminuição na sua expressão e

de seu receptor, TrkB, na Doença de Alzheimer (SCHINDOWSKI et al., 2008), além

de alteração nos níveis séricos do BDNF em pacientes com esquizofrenia (REIS et

al., 2008). A ativação de receptores TrkB e p75 promove ou suprime o crescimento

dendrítico e gera potenciação ou depressão sináptica. Sendo o balanço entre as

ligações da forma madura no receptor TrkB e a sua forma pró-BDNF no receptor p75

importante para as alterações das estruturas sinápticas (LU et al., 2005).

Assim como as interleucinas, as citocinas são pequenas proteínas liberadas

por diferentes tipos celulares e responsáveis por diferentes respostas como

sobrevivência, crescimento e diferenciação assim como respostas imunes

inflamatórias. São cruciais para a homeostasia, mas também desempenham papel

importante em condições patológicas (LUHESHI & ROTHWELL, 1996).

A interleucina 4 (IL-4) foi descoberta em 1982 sendo inicialmente chamada de

fator de crescimento da célula B. Com o conhecimento de seus efeitos pleiotrópicos

foi definitivamente denominada de IL-4 (PAUL, 1991). Essa citocina é uma proteína

glicosilada formada por 129 aminoácidos com peso molecular de aproximadamente

15 kDa (CHOI & REISER, 1998). A presença de receptores IL-4 (IL-4R) foi

observada em células hematopoiéticas, endoteliais, hepáticas e neuronais. Foram

identificados dois tipos de receptores de IL-4, I e II, sendo o tipo I formado pela

heterodimerização da subunidade alfa (IL-4Rα) com a subunidade γc (NELMS et al,

1999). O tipo II é um complexo envolvendo a subunidade alfa do receptor IL-4 e a

subunidade alfa I do receptor IL-13 (IL-13Rα1) (KEEGAN & PIERCE, 1994).

32

A IL-4 possui papel chave na resposta imune (PAUL, 1991), além de exercer

influência sobre o ciclo celular, induzindo as células a saírem da fase G1 (NELMS et

al., 1999). Além disso, ela atua como fator de crescimento autócrino e de

diferenciação, sendo promotora para proliferação de células T imaturas e

diferenciação destas mesmas células em efetoras (CHOI & REISER, 1998). Essa

interleucina tem capacidade tanto de suprimir a inflamação no sistema imune

(PONOMAREY et al., 2007) como de exercer função anti-inflamatória no cérebro.

Neste contexto a IL-4 age inibindo a produção de citocinas pró-inflamatórias como a

IL-1β e o TNF-α (LEE et al., 1995; MORI et al., 1995) e antagoniza os efeitos do IFN-

γ no sistema nervoso (FIORENTINO et al., 1991).

2.3.2 Retina

A retina pertence ao Sistema Nervoso Central e desenvolve-se a partir do

ectoderma neural. O tecido retiniano é translúcido e sua localização periférica

privilegiada permite fácil obtenção, livre do tecido conjuntivo adjacente e de outras

populações neuronais, o que facilita em muito sua obtenção para a realização de

diferentes tipos de experiências. A retina possui uma rica circuitaria de

neurotransmissores e de citocinas que a coloca na posição de um excelente modelo

experimental para o estudo do desenvolvimento, da diferenciação e da fisiologia de

células do sistema nervoso central, tanto in vivo quanto in vitro. Além disso, sua

organização morfo-funcional em camadas sinápticas e nucleares é muito semelhante

ao observado em outras estruturas do sistema nervoso (DOWLING, 1991). Dentre

todas as complexas estruturas do sistema nervoso central, nenhuma oferece tantas

vantagens a estudos do desenvolvimento como a retina (CEPKO, 1993).

A neurogênese das células da retina de ratos (Figura 8) se dá da seguinte

maneira: inicialmente são formadas as células ganglionares no período embrionário

(E) entre E14 e E20; em seguida as células amácrinas (REESE & COLELLO, 1992)

e horizontais entre E14 e E22; os cones são gerados entre E14 a P0 (dia do

33

desenvolvimento pós-natal 0) e, por fim as células bipolares, bastonetes e as células

de Müller no período entre E20 a P13 (CEPKO, 1993).

Figura 8: Histogênese da retina. Desenvolvimento das células progenitoras originam os sete tipos principais de células da retina em diferentes espécies. Período embrionário (E); Período pós-natal (P). Retirado de MARTINS & PEARSON, 2008.

No período pós-natal (P0 a P2) a retina é imatura, formada por uma

população de neuroblastos e apenas a camada de células ganglionares está

formada (Figura 9A). O processo de diferenciação retiniana depende de um

programa genético pré-determinado e de pistas, sinais ambientais intraretinianos,

como a expressão de moléculas de adesão e da matriz extracelular, bem como da

liberação de diversas citocinas (FARAH, 2006; DOWLING, 1991).

Após o desenvolvimento (Figura 9B), a retina de vertebrados organiza-se em

camadas: na camada nuclear externa (CNE) encontram-se os corpos celulares dos

fotorreceptores (os cones, que possuem baixa sensibilidade à luz e permitem a visão

cromática, e os bastonetes, responsáveis pela adaptação da visão ao claro-escuro);

na camada plexiforme externa (CPE) observam-se os prolongamentos de

fotorreceptores, células bipolares e horizontais, que se comunicam através de

conexões sinápticas; a camada nuclear interna (CNI) é composta por corpos

celulares das células horizontais, das células bipolares e das amácrinas; os corpos

celulares das células ganglionares e de células amácrinas deslocadas formam a

34

camada mais interna da retina, a camada de células ganglionares (CCG). As células

ganglionares da retina (CGR), cujos axônios formam o nervo óptico, fazem sinapses

com outras regiões centrais do sistema visual; na camada plexiforme interna (CPI),

os prolongamentos de células bipolares, amácrinas e ganglionares fazem sinapses

entre si (DOWLING, 1991; FARAH, 2006).

As células de Müller são o principal tipo de célula glial encontrado na retina de

todas as espécies de vertebrados (WON et al., 2000). O corpo celular da célula de

Müller está localizado na CNI e seus prolongamentos se estendem por todas as

camadas da retina, formando a membrana limitante interna, adjacente ao humor

vítreo, e a membrana limitante externa, adjacente à camada nuclear externa

(NEWMAN & REICHENBACH, 1996).

A B

Figura 9: Esquema simplificado da retina de vertebrados recém-nascidos (A) e adultos (B). Representação dos diferentes tipos celulares, bem como as camadas celulares e sinápticas. Modificados de: (A) Dowling, 1991 e (B) Yang, 2004.

Posterior à retina, no fundo do olho, encontra-se a camada de células

epiteliais pigmentadas, conhecida como epitélio pigmentar da retina (EPR), rico em

melanina e responsável, dentre outras funções, por absorver a luz não capturada

pelos fotorreceptores. Desta forma, a degradação e a distorção da imagem pela

retina neural são evitadas, uma vez que não permite a reflexão da luz não absorvida

por cones e bastonetes (DOWLING, 1991).

35

2.3.2.1 Atividade colinérgica na retina

A acetilcolina (ACh) é um importante neurotransmissor na retina dos

mamíferos, estando presente principalmente nas células amácrinas (VANEY, 1990).

O envolvimento dessa molécula na neurotransmissão na retina de vertebrados está

bem estabelecido, em particular com a participação dos receptores nicotínicos

(nAChRs) na sinalização nos estágios iniciais do desenvolvimento, bem como na

etapa de crescimento e maturação neuronal (FELLER, 2002).

Os nAChRs na retina de vertebrados desempenham papel na sinalização

durante os estágios iniciais do desenvolvimento e mais tarde durante o crescimento

neuronal e sinaptogênese (FELLER, 2002; ZHOU, 2001). Na retina de vertebrados

adultos, ACh liberada por células amácrinas ativa grande variedade de nAChRs.

Estudos de hibridização in situ e imunolocalização em conjunto com análises de

Northern blot mostraram que a retina expressa quase todas as subunidades

nicotínicas presentes em receptores homoméricos e heteroméricos (FELLER, 2002).

Estudos bioquímicos e farmacológicos usando ligantes nicotínicos e

anticorpos policlonais específicos para cada subunidade mostraram a presença de

três subtipos que se ligam à α-Bgtx na retina de galinha: os homoméricos α7 e α8 e

os heteroméricos com os subtipos α7 e α8 (KEYSER et al., 1993). Utilizando a retina

adulta de coelho, Keyser e colaboradores (2000) mostraram que muitos dos

receptores heteroméricos contém a subunidade β2, que é parcialmente associada à

subunidade α3. Em conjunto, estes resultados indicam que nAChRs contendo a

subunidade β2 são essenciais para o desenvolvimento anatômico e funcional do

sistema visual de roedores (MORETTI et al., 2004).

Os receptores muscarínicos (mAChRs) são expressos por células amácrinas,

ganglionares, bipolares em retinas de animais adultos. Marcadores de neurônios

colinérgicos (colina acetil transferase e colinesterase) são expressos na camada

neuroblástica da retina de embrião (E3) de pinto. Marcadores colinérgicos também

são expressos na retina de mamíferos mesmo antes do período de sinaptogênese,

36

sugerindo que células da retina neural imatura podem também liberar acetilcolina

(MARTINS et al., 2008).

Strang e colaboradores (2010) verificaram a presença de todos os sub-tipos

de receptores muscarínicos em células amácrinas em análise imunocitoquímica na

retina de coelhos. As células amácrinas, bipolares e ganglionares apresentaram

marcação para M1, enquanto que as células ganglionares, horizontais e algumas

bipolares, apresentaram marcação para M3, além das células amácrinas.

Imunorreatividade para receptores M2 e M4 foram observadas na retina de tritões

adultos. Sendo o M2 encontrado na somata em ambos os lados da camada

plexiforme interna (CPI), principalmente em células ganglionares, e também

distribuídas em duas bandas dentro da CPI. O M4 foi localizado próximo à somata

oposta aos lados da CPI, provavelmente somata de células amácrinas, e nenhuma

imunorreatividade foi detectada na CPI (CHEON et al., 2001)

Pereira e colaboradores (2001) avaliaram o papel do sistema colinérgico no

aumento da sobrevida das CGR. Eles demonstraram que a estimulação por

agonistas colinérgicos aumenta a sobrevida das CGR em cultura e que o bloqueio

dos receptores M1 é capaz de abolir totalmente esse efeito. O efeito da estimulação

colinérgica é abolido pela inibição dos receptores Trk e pela inibição da secreção

vesicular de polipeptídeos. Esses resultados sugerem que a estimulação colinérgica

pode mediar a liberação de fatores tróficos capazes de regular a sobrevida das

CGR. Esses dados estão de acordo com outros dados da literatura que demonstram

o envolvimento de neurotransmissores na liberação de fatores tróficos de células do

tecido neuronal (BERZAGHI et al., 1993; ELLIOT et al., 1994).

A via da proteína cinase C (PKC) também está envolvida no controle da

sobrevida das CGR. SANTOS e ARAUJO (2000) descreveram que a ativação da

PKC por PMA (13-acetato de forbol 12-miristato), tem papel importante na sobrevida

das CGR mantidas em culturas mistas por 48 horas. Por outro lado, a ativação da

PKC por PMA reduz a proliferação celular de células da retina, mediada por ativação

de receptor muscarínico (M1). O tratamento das culturas com carbamilcolina e BDNF

também reduz a proliferação dessas células de forma semelhante ao PMA,

37

sugerindo que a ativação da PKC induz redução da proliferação celular através da

liberação de acetilcolina e de BDNF na cultura, bem como ativação de receptores

Trk (SANTOS et al., 2000). Em 2009, Santos e colaboradores demonstraram que o

PMA induz redução na expressão de receptor M1 e de BDNF em culturas de células

da retina. Porém, observou-se que em culturas tratadas por 45min com PMA, houve

aumento transiente na expressão de BDNF e redução na expressão de receptores

M1 (SANTOS et al., 2009).

2.3.2.2 Ações de neurotrofinas e citocinas na retina

No sistema visual, dentre as neurotrofinas citadas, o BDNF tem papel de

destaque, coordenando eventos de sobrevivência e diferenciação em todas as

áreas, desde a retina até o córtex visual (von BARTHELD, 1998). Seus efeitos foram

caracterizados em estudos in vitro e in vivo, e podem ser observados durante o

desenvolvimento até a vida adulta (ISENMANN et al., 2003).

O desenvolvimento das CGR depende de diferentes fatores tróficos,

produzidos por diferentes populações celulares, na sobrevida das células

ganglionares. De fato, as células de Müller são capazes de liberar fatores tróficos

que aumentam a sobrevivência das células ganglionares de ratos neonatos em

cultura (RAJU & BENNETT, 1986; ARMSON et al., 1987). Esses fatores atuam

durante o desenvolvimento e a maturação da retina, bem como podem se constituir

em importantes agentes terapêuticos em doenças degenerativas da retina como

após lesão de nervo óptico (von BARTHELD, 1998).

Estudos mostram que o NGF, o BDNF e a NT-4/5 exercem efeito de

sobrevida nesses neurônios in vivo. O NGF e o BDNF têm efeito após lesão

isquêmica e o BDNF e a NT-4/5 promovem crescimento de neuritos dos neurônios

em regeneração. Em experimentos in vitro, o BDNF mantém a sobrevida desses

neurônios de diferentes espécies animais, enquanto a NT-4/5 tem esse efeito

somente em células ganglionares de ratos. A NT-3 parece não ter papel importante

38

na sobrevida, ramificação de neuritos ou crescimento axonal de células ganglionares

de mamíferos (von BARTHELD, 1998). Ugolini e colaboradores (1995) detectaram a

expressão de RNA mensageiro (RNAm) para os receptores (Trk e p75) para as

neurotrofinas na camada de células ganglionares da retina de ratos P0.

O BDNF e as Neurotrofinas 4/5 são capazes de proteger as células

ganglionares, impedindo sua degeneração (von BARTHELD, 1998). Essa

degeneração ocorre após lesão do nervo óptico (axotomia das células ganglionares)

de ratos recém-nascidos, quando aproximadamente 80% dessas células morrem

nas primeiras 24 horas (RABACCHI et al., 1994).

Em cultura de células ganglionares purificadas foi observado que os níveis de

3´5´-adenosina monofosfato cíclico (AMPc) regulam o efeito trófico de inúmeras

citocinas: BDNF, NT-4/5, FGFb (fator de crescimento de fibroblasto básico, também

chamado de FGF-2), CNTF (fator trófico para neurônios do gânglio ciliar), LIF (fator

inibidor de leucemia) e TGFα (fator de transformação de crescimento alfa) (MEYER-

FRANKE et al., 1995). Santos e Araujo (2000) demonstraram que o tratamento de

culturas mistas de células da retina com forscolina, agente que eleva os níveis de

AMPc, induz aumento na sobrevida das células ganglionares, sem a necessidade de

adicionar fatores tróficos às culturas.

Em relação às ações das citocinas em células da retina, Sholl-Franco e

colaboradores (2001) demonstraram que o tratamento de culturas mistas de células

da retina com IL-2 ou com IL-4 por 48h induz aumento da sobrevida das CGR de

maneira dependente da concentração. O efeito da IL-2 não depende da atividade

colinérgica e também não foi afetado pela inibição da proliferação celular, enquanto

o efeito da IL-4 depende tanto da atividade colinérgica quanto da proliferação celular

(SHOLL-FRANCO et al., 2001). Posteriormente foi observado também em células

da retina, que essa citocina é capaz de modular o fenótipo GABAérgico, sugerindo

importante papel desta citocina durante o desenvolvimento normal da circuitaria

retiniana ou durante a neuroproteção após lesões (SHOLL-FRANCO et al., 2002).

39

2.4 CICLO CELULAR

Nos eucariontes o ciclo celular é dividido em duas fases distintas: a intérfase e

a mitose. A mitose, ou fase M, é quando ocorre a divisão celular. A interfase é o

período em que a célula se prepara para a divisão, aumentando a sua massa e

duplicando seu material genético. A mitose estende-se desde o início da prófase até

o final da telófase e é o período no qual não há síntese de DNA, a síntese de

proteínas está reduzida ao mínimo e a de RNA está limitada. A interfase é o período

mais longo do ciclo celular, representando o intervalo entre duas mitoses, sendo

subdividido em três fases (G1, S, G2) (GALLI-MUHTASIB, 2002).

• G1: fase pós-mitótica durante a qual as células sintetizam ácido ribonucleico

(RNA) e proteínas;

• S: fase na qual o DNA é duplicado enquanto a síntese de proteínas e RNA

continua Nesta fase as células podem ser marcadas com [3H]-timidina, um

nucleotídeo derivado da timina, utilizado exclusivamente para a síntese de DNA;

• G2: fase pós-sintética, período entre o fim da fase S e o início da mitose,

caracterizado por não apresentar síntese de DNA e a síntese de RNA e proteínas

continua assim como na fase pós-mitótica.

As células em fase G1 podem começar o processo de divisão celular ou

mudar para G0 (fase de repouso), onde podem permanecer por dias, semanas ou

anos. O ciclo celular é estreitamente controlado por vários mecanismos que podem

tanto permitir ou restringir a sua progressão (GALLI-MUHTASIB, 2002).

40

Figura 10: Regulação do ciclo celular. A progressão pela fase G1 do ciclo celular ocorre pela e fosforilação de ciclinas e cinases dependentes de ciclina (CDKs). Os inibidores de CDK agem parando as ciclinas e o ciclo. (Retirado de BOEHM & NABEL, 2001).

O ciclo celular é altamente controlado contendo vários pontos de checagem,

sendo o ponto de restrição encontrado na etapa de transição entre as fases G1 e S,

e é nesse período que os progenitores saem do ciclo celular e se diferenciam. Esta

decisão é determinada por fatores extrínsecos e intrínsecos e suas interações

(Figura 10). As principais famílias de proteínas reguladoras da progressão do ciclo

celular são as ciclinas, cinases dependentes de ciclina (CDKs), os inibidores de CDK

(CKI) e o produto dos genes supressores de tumor, p53 e pRb (GALLI-MUHTASIB,

2002). Sinais provenientes do meio extracelular podem regular a expressão destas

proteínas fazendo com que as células entrem ou saiam do ciclo mitótico (GOLIAS et

al., 2004).

Primeiramente identificadas em invertebrados marinhos, as ciclinas

receberam este nome por oscilarem durante o ciclo celular (HUNT, 1989). As CDKs

são cinases serina-treonina, e sua atividade cinase acontece quando estão

complexadas com as ciclinas. A formação deste complexo induz a passagem da

fase G1 para S pela fosforilação das proteínas retinoblastoma (Rb), p107 e p130

41

(Figura 10). A hiperfosforilação dessas proteínas libera o fator de transcrição E2F

permitindo a transcrição de genes pró-mitóticos (DYER & CEPKO, 2001).

Algumas CDKs, tais como as CDK1-CDK4, CDK6 e talvez CDK11, estão

envolvidas na progressão do ciclo celular, ao passo que a CDK7 possui papel duplo

como ativador de cinase CDK (CAK) e regulador da maquinaria transcricional. CDK8

e CDK9 parecem ter papel fundamental no controle da transcrição pela RNA

polimerase II. Outras CDKs e proteínas que agem como as CDK atuam em

processos mais específicos em tipos particulares de células. A atividade da CDK

está aumentada em doenças proliferativas tais como câncer, devido à frequente

superexpressão de reguladores positivos (ciclinas) e a frequente inativação de

inibidores de CDK (MALUMBRES et al., 2007).

A proliferação celular que é induzida por fatores de crescimento ou citocinas

pode ocorrer apenas na presença de diferentes sinais de sobrevida. As células que

recebem o sinal proliferativo na ausência de sinal de sobrevida não proliferam, ao

contrário, morrem por apoptose. Assim, a apoptose age como importante

mecanismo para eliminação de células que sofreram mutações durante o ciclo

celular e que podem resultar em proliferação celular descontrolada (VERMEULEN et

al., 2003).

42

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

Analisar o efeito do extrato diclorometano de Eugenia punicifolia em células

da retina de ratos neonatos.

3.2 Objetivos específicos

• Pesquisar o efeito do extrato na proliferação celular;

• Analisar o perfil de expressão de receptores colinérgicos muscarínicos (M1, M3,

M4 e M5);

• Investigar o perfil de expressão da subunidade α7 do receptor colinérgico

nicotínico;

• Analisar a expressão do transportador vesicular de acetilcolina (VAChT);

• Investigar os níveis de NGF;

• Averiguar nos níveis de BDNF;

• Analisar os níveis de IL-4.

43

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Material

Materiais utilizados nos procedimentos experimentais desta dissertação com a

respectiva origem.

PRODUTO EMPRESA LOCALIZAÇAO SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) Tris(hidroximetil)aminometano

USB USB

NJ, USA NJ, USA

Penicilina G Sigma MO, USA Sulfato de estreptomicina Sigma MO, USA L-Glutamina Sigma MO, USA poli-L-Ornitina Sigma MO, USA Meio 199 Gibco MD, USA Soro Fetal Bovino Gibco MD, USA Tripsina Worthington NJ, USA Placas de Petri TPP Switzerland Hiperfilme Amersham Bucknghamshre, UK Kit ECL Amersham Bucknghamshre, UK 2-Mercaptoetanol Amersham Bucknghamshre, UK Anticorpo Secundário Anti-rabbit ligado a HRP

Amersham Bucknghamshre, UK

Glicina Queel SP, Brazil Tween 20 Ácido tricloroacético (TCA)

Vetec Vetec

RJ, Brazil RJ, Brazil

Azul de Cromassie Vetec RJ, Brazil Glicerol Vetec RJ, Brazil Anti-Actina Sta. Cruz Biotecnology Santa Cruz, USA Anti-M1 Sta. Cruz Biotecnology Santa Cruz, USA Anti-M3 Anti-M4

Sta. Cruz Biotecnology Sta. Cruz Biotecnology

Santa Cruz, USA Santa Cruz, USA

Anti-M5 Anti-α7

Sta. Cruz Biotecnology Sta. Cruz Biotecnology

Santa Cruz, USA Santa Cruz, USA

Anti-VAChT Albumina sérica bovina (BSA) Anti-NGF Anti-BDNF Anti-IL-4

Sta. Cruz Biotecnology Sta. Cruz Biotecnology Peprotech Peprotech Peprotech

Santa Cruz, USA Santa Cruz, USA NJ, USA NJ, USA NJ, USA

Temed Invitrogem Carlsbad, USA Padrão de Peso Molecular Invitrogem Carlsbad, USA Luminata Millipore MA, USA Metanol [3H-metil]-timidina Filtros de fibra de vidro DMSO

J.T.Baker GE Sigma Sigma

NJ, USA NJ, USA MO, USA MO, USA

44

Estudos sobre a atividade colinérgica induzida por EP (GRANGEIRO et al.,

2006, PASCUAL et al., 2011) e sobre a importância da transmissão colinérgica na

retina de mamíferos (VANEY, 1990; FELLER, 2002; SANTOS et al., 2009) indicam a

necessidade de se estudar o efeito do extrato diclorometano de Eugenia punicifolia

na modulação do fenótipo colinérgico de células da retina de ratos neonatos,

mantidas em cultura. Foram realizadas culturas de células da retina para se avaliar

as possíveis alterações na expressão de receptores muscarínicos (M1, M3, M4, M5)

e da subunidade α7 do receptor nicotínico (Nα7), além da expressão do

transportador vesicular de acetilcolina (VAChT), induzidas pelo extrato.

4.2 Extrato diclorometano de Eugenia punicifolia

O extrato diclorometano de Eugenia punicifolia (EP) foi obtido na Faculdade

de Farmácia, segundo metodologia descrita (YOO et al., 2005) e foi estocado em

quantidade suficiente para a realização do presente trabalho. O extrato foi diluído em

10% de dimetilsulfóxido (DMSO). A solução obtida foi filtrada em filtro 0,22µm e

armazenada em alíquotas de 1mg/mL (50µL), a uma temperatura de -20oC.

4.3 Animais experimentais

Foram utilizados ratos neonatos pigmentados da linhagem Lister Hooded nas

primeiras 72 horas após o nascimento (P0-P2), provenientes do Biotério da

Faculdade de Farmácia da UFF ou do Biotério do Departamento de Neurobiologia

(Instituto e Biologia – UFF), os quais receberam ração e água ad libidum e foram

mantidos a um ciclo claro/escuro de 12h. Os procedimentos experimentais foram

aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da UFF (Projeto nº 186/2012).

45

4.4 Cultura de células da retina

Em capela de fluxo laminar, ratos neonatos (dia pós-natal 0-2) foram

sacrificados por decapitação, seus olhos removidos por enucleação. As retinas

foram dissecadas e colocadas em um tubo contendo solução salina sem cálcio e

sem magnésio (CMF: NaCl 131mM, KCl 4,09mM, Na2HPO4.7H2O 0,92mM,

KH2PO4 0,45mM, glicose.H2O 12,2mM, NaHCO3 9,4mM, vermelho de fenol

10mg/mL.) acrescida de penicilina 100U/mL e estreptomicina 100μg/mL, e a

dissociação química foi realizada por ação da tripsina 0,1% por aproximadamente

20min a 37°C. Posteriormente, para inativação da tripsina, as células foram lavadas

duas vezes com meio de cultura 199 acrescido de 5% de soro fetal bovino (SFB),

glutamina 2,0mM, estreptomicina 100µM e penicilina 100U/mL (M199 completo). As

células foram dissociadas mecanicamente utilizando pipeta Pasteur e plaqueadas,

na densidade de 1,25x106 células/placa, em placas de Petri de 35 mm, previamente

tratadas com poli-L-ornitina, em um volume inicial de 1 mL de M199 completo. A

seguir, as placas receberam mais 1 mL de M199 completo (culturas controle) ou

mais 1 mL de M199 completo contendo extrato diclorometano de E. punicifolia (EP).

Todas as culturas foram mantidas a 37°C, em atmosfera de 95% de ar e 5% de CO2.

As células eram mantidas in vitro por 48h quando então eram processadas para

incorporação de [3H]-timidina ou para Western blot.

4.5 Incorporação de [3H]-timidina

Para a determinação da concentração do extrato que seria utilizado nos

experimentos, optou-se pelo estudo da proliferação celular através da utilização do

método de incorporação de [3H]-timidina ao DNA das células. Esta é uma técnica

útil, uma vez que a [3H]-timidina é capaz de marcar todas as células que se

encontram na fase S do ciclo celular, indiscriminadamente. Uma vez que a célula

tem o marcador incorporado ao DNA, suas células filhas terão a metade desse

marcador em seu DNA após sofrerem mitose, e assim a divisão vai acontecendo, o

marcador vai se diluindo e as células geradas serão igualmente marcadas (FARAH,

2006). A utilização dessa técnica permite a quantificação da timidina marcada

46

radioativamente incorporada ao DNA, porém não é possível identificar as células em

divisão em um dado momento.

A incorporação de [3H]-timidina nas culturas mantidas por 48 horas in vitro foi

realizada segundo o seguinte protocolo:

Após o período de incubação, as culturas foram lavadas duas vezes com 2

mL de M199 sem SFB, a temperatura ambiente, e foram incubadas com 0,5µCi/mL

de [3H]-timidina em 1mL de M199 sem SFB por 60 minutos a 37°C em atmosfera de

5% de CO2 e 95% de ar. Neste período as células que estavam se dividindo tiveram

a [3H]-timidina incorporada ao seu DNA. As culturas foram então lavadas quatro

vezes com M199 sem SFB, a fim de remover a [3H]-timidina que não foi incorporada

ao DNA. O M199 foi removido e 200µL de NaOH 0,4N foram adicionados às culturas

e mantido por quinze minutos para lisar as células. Posteriormente, foi feita a

raspagem das células aderidas a essas placas e o conteúdo de cada placa foi

transferido para tubos de vidro contendo 3mL de água MilliQ gelada, aos quais

foram adicionados 600µL de ácido tricloroacético (TCA) 50%. Após 30 minutos, cada

amostra foi filtrada sob pressão negativa em membrana de filtro de vidro (Whatman

GF/B). Os filtros foram colocados para secar overnight e a radioatividade foi

determinada em cintilador de fase líquida (Packard, USA) em vials contendo 3mL de

tolueno + 2,4-difeniloxazol (PPO). As culturas controle apresentaram contagens por

minuto (CPM) em torno de 1100. Os resultados foram expressos em porcentagem

do controle.

4.6 Western blot

A técnica foi utilizada para a detecção dos níveis dos receptores colinérgicos

(M1, M3, M4, M5, Nα7), VAChT, das neurotofinas (NGF e BDNF), da interleucina-4 e

actina.

47

4.6.1 Extração de proteínas

As culturas foram lavadas com solução Hank’s e as proteínas totais extraídas

com 100 µL de tampão de amostra (glicerol; 2-mercaptoetanol; SDS; Tris 0,5M pH

6,8 e água destilada). As amostras foram fervidas a 100°C por 10 min, para

desnaturar as proteínas.

4.6.2 Dosagem de proteínas

A dosagem de proteínas foi realizada pelo método de Bradford (BRADFORD,

1976), no qual a curva padrão é feita com 0, 5, 10, 15 e 20µg de uma solução de

albumina (BSA) na concentração de 1mg/mL. A leitura das amostras foi feita em

espectrofotômetro em 595nm.

4.6.3 Gel de poliacrilamida

O gel de corrida foi preparado com Tris base 1,5M (pH 8,8), acrilamida 30% +

0,9% de metileno bisacrilamida, SDS 10%, TEMED, persulfato de amônia 10%. O

gel foi aplicado e, após polimerização por 30 min de polimerização, adicionou-se o

gel de compactação (Tris base 0,5M pH 6,8; acrilamida 30% + 0,9% de metileno

bisacrilamida, SDS 10%, TEMED, persulfato de amônia 10%). Após aplicar o gel, o

pente foi colocado e, mantido 30 min para que ocorresse a polimerização. O pente

foi retirado e o suporte colocado na cuba contendo tampão de corrida (glicina, tris

base e SDS). As amostras foram aplicadas nos poços em volumes variados das

amostras das experiências representando 60 µg de proteínas por poço. Foi utilizado

10µl do padrão de peso molecular no primeiro poço. A corrida foi realizada com

corrente constante de 10mA por aproximadamente 15min seguido por 15mA por

60min. Após a corrida o gel foi removido e transferido para uma cuba contendo

tampão de transferência onde foi mantido por 30 minutos.

48

4.6.4 Transferência das proteínas do gel para a membrana de polímero de fluoreto

de vinilideno (PVDF)

A membrana de PVDF foi incubada por 30 segundos em metanol e transferida

para uma cuba contendo tampão de transferência (glicina, Tris base, SDS 10% e

20% de metanol), onde ficou equilibrando por aproximadamente 30 min. O

“sandwich” com o gel e a membrana foi montado e a transferência realizada em

sistema Semi-Dry utilizando voltagem constante de 10V por 30 min.

4.6.5 Bloqueio e imunodetecção

O bloqueio foi realizado com 5% de leite desnatado em solução salina

tamponada de Tris (TBS) pH 7,6 com 0,1% tween 20, por 2h, em temperatura

ambiente. Após este período, a solução para o bloqueio era retirada e a membrana

lavada três vezes em TBS com 1% de leite e 0,1% de tween. A membrana era,

então, incubada com o anticorpo primário específico em TBS (1% de leite e 0,1%

tween), overnight. Foram utilizados vários anticorpos primários separadamente (anti-

M1; anti-M3, anti-M4, anti-M5, anti-α7N, anti-NGF, anti-BDNF, anti-IL4, anti-actina) e,

após a incubação com o primário, a membrana era lavada três vezes em TBS (1%

de leite e 0,1% tween) por 10 min cada lavagem e posteriormente incubada com o

anticorpo secundário específico, ligado a peroxidase por 1 hora. As membranas

eram lavadas duas vezes, por 10 min cada, em TBS + 0,1% tween, e a última

lavagem era realizada com TBS por 10 min.

4.6.6 Revelação

A revelação foi realizada com exposição da membrana à solução reagente de

Luminol (ECL) por 5 minutos. Esta reação é baseada na quimioluminescência que

resulta da oxidação do luminol, catalisada pela peroxidase presente no anticorpo

secundário. Posteriormente a membrana ficou exposta ao filme (Hiperfilme) por 5

49

minutos, pois esta luz resultante foi detectada pelo filme em segundos ou minutos. O

filme foi retirado e a revelação realizada com revelador GBX Kodak 1:10 por 15

segundos, seguido de fixação (Fixador Kodak 1:5) por 1 minuto. A quantificação das

bandas obtidas foi feita através do ImageJ.

4.7 Fotomicrografia em contraste de fase

Após 48h, as culturas controle e tratadas com EP foram fixadas em Karnovski

(paraformaldeído 1% e glutaraldeído 2%) por um período de 5 a 10 minutos. Em

seguida, as células foram lavadas três vezes em tampão fosfato 0,1M pH 7,2-7,4.

Cada placa foi armazenada por um período de aproximadamente uma semana em

geladeira, com 1mL de tampão fosfato. As culturas foram observadas em

microscópio óptico (LEICA DFC 310FX) em contraste de fase.

4.8 Análise estatística dos resultados

Os resultados foram expressos na forma de histogramas e, cada experimento

foi repetido no mínimo 3 vezes, sendo utilizadas no mínimo 3 amostras por ponto

experimental. O resultado da [3H]-timidina foi apresentado em porcentagem do

controle, como média ± erro padrão da média e a análise estatística foi feita através

da análise de variância (ANOVA) seguida do pós-teste, Newman-Keuls, que faz a

comparação entre as diferentes condições experimentais. Os testes e gráficos foram

feitos através do programa GraphPad Prism®.

Os resultados do Western blot representam os níveis de expressão das

proteínas estudadas em unidades arbitrárias (em porcentagem do controle) como

média ± erro padrão da média. A análise estatística foi feita através da comparação

50

entre dois grupos através do teste t-student. Os testes e gráficos foram feitos através

do programa GraphPad Prism®.

4.9 Questões éticas

O projeto foi submetido à apreciação do Comitê de Ética no Uso de Animais

da UFF sob o número 186, tendo sido aprovado em 17/05/2012 (Anexo 1). Todos os

experimentos foram realizados reduzindo ao máximo qualquer sofrimento e tendo

sido utilizado apenas o número suficiente de animais.

51

5 RESULTADOS

Para iniciar os estudos relacionados aos efeitos do extrato diclorometano de

E. punicifolia (EP) sobre células da retina de ratos neonatos mantidas em cultura, foi

realizada a curva de concentração-resposta para analisar o efeito do extrato sobre a

proliferação celular. As culturas foram mantidas por 48h na presença de diferentes

concentrações do extrato (EP 100ng/mL; EP 500ng/mL e EP 1µg/mL) (Figura 11).

Figura 11. Curva concentração-resposta do extrato diclorometano de E. punicifolia em células da retina mantidas em cultura por 48h. Controle (CT); Extrato diclorometano de E. punicifolia (EP). O valor da radioatividade (cpm/placa) da cultura controle foi considerado 100%, e os valores foram expressos em média ± erro padrão da média. (n = 6-10). (* p< 0,05).

Os resultados demonstram que o extrato de EP é capaz de induzir um

aumento na proliferação celular, sendo essa resposta dependente da concentração.

O tratamento com EP 500ng/mL induz um aumento significativo, e na concentração

mais alta, EP 1µg/mL, observa-se aumento de 50% na proliferação, quando

comparado ao controle. Baseado nesses resultados definiu-se a utilização da

concentração de EP 1µg/mL para a realização dos demais experimentos. Além

disso, todos os experimentos foram realizados com a densidade de 1,25x106

células/placa, mantidas in vitro por 48h.

52

Com o objetivo de analisar a morfologia das culturas, estas foram tratadas

com EP 1µg/mL, mantidas por 48h e posteriormente fixadas e observadas em

microscopia de contraste de fase (Figura 12).

Figura 12: Fotomicrografia em contraste de fase mostrando a morfologia das culturas após 48 horas in vitro. A: Cultura controle; B: Cultura tratada com Ep1µg/mL. Barra de calibração: 20μm. Setas: Processos neuronais; cabeça de seta: células gliais.

Analisando as fotomicrografias das culturas de células pode-se constatar na

cultura controle (Figura 12A) a presença de poucos grumos com a formação de

pequenos processos neuronais. Por outro lado, a cultura tratada com EP1µg/mL

(Figura 12B) apresentou em sua morfologia a presença de grumos espraiados

(cabeça de seta), maior número de células, além da presença de muitos processos

(seta). Nota-se presença de células gliais (cabeça de seta) sobre as quais as células

neuronais se localizam e podem ser individualizadas, sendo este padrão morfológico

observado em toda a extensão da placa.

A partir deste resultado, pode-se sugerir que o extrato de EP 1µg/mL é capaz

de aumentar o número e tamanho de processos e, possivelmente, a sobrevida das

células da retina de ratos neonatos in vitro.

53

MODULAÇÃO DO FENÓTIPO COLINÉRGICO

Os níveis de receptor M1 reduzem ao longo dos primeiros 14 dias de

desenvolvimento pós-natal em células da retina de ratos neonatos mantidas em

cultura (SANTOS et al., 2009). Para avaliar se o extrato diclorometano é capaz de

induzir alterações na expressão desse receptor, culturas foram tratadas com extrato

EP 1µg/mL por 48h (Figura 13).

CT

EP 1µg/m

L0

50

100

*

Nív

eis

de r

ecep

tor

M1

Uni

dade

s A

rbitr

ária

s(%

do

cont

role

)

50 kDa M1

49 kDa actina Figura 13. Níveis de receptor M1 em culturas tratadas com extrato diclorometano de E. punicifolia por 48h. Controle (CT); Extrato diclorometano de E. punicifolia (EP) 1µg/mL. A: Níveis da expressão de receptores M1, representados em unidades arbitrárias (% do controle), como média ± erro padrão da média (n = 4). B: Imagem do filme radiográfico representativo da imunodetecção obtidos nessas experiências. (*p< 0,001)

Os resultados demonstram que culturas tratadas com o extrato apresentam

redução significativa (32%) nos níveis dos receptores M1, quando comparadas com

cultura controle.

A

B

54

Guizzetti e colaboradores (2011) demonstraram uma relação entre receptores

M3 e fenômenos de diferenciação celular como a neuritogênese. Recentemente,

Braga e colaboradores (2013) demonstraram que a expressão de receptores M3

aumenta ao longo do desenvolvimento da retina (P0-P30). Baseado nesses dados

procedeu-se à investigação do efeito do extrato de EP na expressão de receptores

M3 em células mantidas em cultura por 48h (Figura 14).

CT

EP 1µg/m

L0

100

200

Nív

eis

de r

ecep

tor

M3

Uni

dade

s A

rbitr

ária

s(%

do

cont

role

)

*

66 kDa M3

49 kDa actina Figura 14. Níveis de receptor M3 em culturas tratadas com extrato diclorometano de E. punicifolia por 48h. Controle (CT); Extrato diclorometano de E. punicifolia (EP) 1µg/mL. A: Níveis da expressão de receptores M3, representados em unidades arbitrárias (% do controle), como média ± erro padrão da média (n = 5). B: Imagem representativa dos resultados da imunodetecção obtidos nessas experiências. (*p< 0,0005)

Os resultados demonstram o extrato induz um significativo aumento (74%), nos

níveis de receptores M3 em células da retina mantidas em cultura.

Sabendo que a ativação de receptores M4 é importante para o

processamento da informação visual (WEBER & SCHLICKER, 2001), foram

realizadas culturas de células da retina, as quais foram tratadas com EP 1µg/mL por

48h, para investigar o efeito deste extrato sobre a expressão de receptor M4 (Figura

15).

A

B

55

CT

EP 1µg/m

L0

50

100

Nív

eis

de R

ecep

tor

M4

Uni

dade

s Ar

bitr

ária

s(%

do

cont

role

)

*

74 kDa M4

49 kDa actina

Figura 15. Níveis de receptor M4 em culturas tratadas com extrato diclorometano de E. punicifolia por 48h. Controle (CT); Extrato diclorometano de E. punicifolia (EP) 1µg/mL. A: Níveis da expressão de receptores M4, representados em unidades arbitrárias (% do controle), como média ± erro padrão da média (n = 3). B: Imagem representativa dos resultados da imunodetecção obtidos nessas experiências. (*p< 0,001)

Pode-se observar que o tratamento das culturas com o extrato diclorometano

de EP1µg/mL foi capaz de induzir uma redução dos níveis de receptores M4 na

retina, em torno de 11%.

Resende e colaboradores (2008) demonstraram que o subtipo de receptor

muscarínico M5 aumenta a taxa de proliferação de células precursoras neuronais

em culturas de células de carcinoma embrionário. Uma vez que houve um aumento

da proliferação celular com o tratamento com EP1µg/mL por 48h, culturas foram

realizadas para a averiguação de alteração nos níveis dos receptores M5 (Figura

16).

A

B

56

CT

EP 1µg/m

L0

50

100

150

Nív

eis

de R

ecep

tor

M5

Uni

dade

s Ar

bitr

ária

s(%

do

cont

role

)

60 kDa M5

49 kDa actina Figura 16. Níveis de receptor M5 em culturas tratadas com extrato diclorometano de E. punicifolia por 48h. Controle (CT); extrato diclorometano de E. punicifolia (EP) 1µg/mL. A: Níveis da expressão de receptores M5, representados em unidades arbitrárias (% do controle), como média ± erro padrão da média (n = 3). B: Imagem representativa dos resultados da imunodetecção obtidos nessas experiências.

Observa-se que o tratamento com extrato diclorometano de Eugenia

punicifolia 1µg/mL não causa alteração nos níveis de receptores M5 nas culturas de

células da retina.

A subunidade α7 do receptor nicotínico (Nα7) é expressa nas células

bipolares, amácrinas e células ganglionares da retina, sugerindo que sua ativação

pode influenciar o processamento da informação visual (DMITRIEVA, 2007). Para

analisar a alteração da expressão de receptores colinérgicos nicotínicos (subunidade

α7) na retina, culturas foram mantidas por 48h com EP 1µg/mL (Figura 17).

A

B

57

55 kD Nα7

49 kDa actina

Figura 17. Níveis da subunidade α7 do receptor nicotínico (Nα7) em culturas tratadas com extrato diclorometano de E. punicifolia por 48h. Controle (CT); extrato diclorometano de E. punicifolia (EP) 1µg/mL. A: Níveis da expressão de Nα7, representados em unidades arbitrárias (% do controle), como média ± erro padrão da média (n = 2). B: Imagem representativa dos resultados da imunodetecção obtidos nessas experiências. (*p< 0,02). Os resultados sugerem que o tratamento das culturas com extrato

diclorometano de EP foi capaz de induzir aumento na expressão da subunidade α7

dos receptores nicotínicos de forma expressiva (Figura 17).

O transportador vesicular de acetilcolina (VAChT) assim como a colina

acetiltransferase (ChAT) são proteínas características de neurônios colinérgicos, que

podem ser identificadas por técnicas de biologia molecular ou imunomarcação,

sendo úteis para definir a população de neurônios colinérgicos no cérebro de ratos

(SCHÄFER et al., 1998). Para estudar a possível alteração dos níveis de expressão

do transportador vesicular de acetilcolina (VAChT) em retinas de ratos, culturas

dessas células foram tratadas com extrato diclorometano de EP 1µg/mL por 48h

(Figura 18).

A

B

58

55 kDa VAChT

49 kDa actina Figura 18. Níveis de VAChT em culturas tratadas com extrato diclorometano de E. punicifolia. Controle (CT); Extrato diclorometano E. punicifolia (EP). A: Níveis de VAChT, representados em unidades arbitrárias (% do contr'ole), como média ± erro padrão da média (n = 4). B: Imagem representativa dos resultados da imunodetecção obtidos nessas experiências. (* < 0,001).

Os resultados demonstram que o tratamento com extrato diclorometano de

EP induziu uma diminuição de 11% nos níveis do transportador vesicular de

acetilcolina (VAChT) em culturas de células da retina.

NÍVEIS DA EXPRESSÃO DE NEUROTROFINAS

Durante o desenvolvimento retiniano, os níveis de NGF aumentam

gradualmente, atingindo um máximo em 14 dias pós-natal (aumento de 100% em

relação ao dia do nascimento – P0), e reduzindo para os níveis do controle em 30

dias. Esses resultados sugerem o envolvimento do NGF na maturação do tecido

retiniano (BRAGA, 2013). Para avaliar o possível envolvimento do extrato na

A

B

59

expressão do NGF, foi realizada cultura a qual foi tratada com extrato diclorometano

de EP 1µg/mL durante 48h (Figura 19).

17 kDa NGF

49 kDa actina

Figura 19. Níveis de NGF em culturas tratadas com extrato diclorometano de E. punicifolia. Controle (CT); Extrato diclorometano de E. punicifolia (EP). (A) Níveis de NGF, representados em unidades arbitrárias (% do controle), como média ± erro padrão da média (n = 3). B: Imagem representativa dos resultados da imunodetecção obtidos nessas experiências. (*p< 0,007)

Observa-se que o tratamento das culturas com extrato de EP induz aumento

expressivo (44%) nos níveis de NGF em culturas de células da retina.

O BDNF tem importante papel no desenvolvimento e homeostasia do sistema

visual, desde a retina até o córtex visual (VON BARTHELD, 1998). Foi descrita tanto

a expressão da molécula quanto de seu receptor de alta afinidade (TrkB) na retina

(VECINO et al.,1998). Sabe-se, também, que essa neurotrofina tem sua expressão

reduzida ao longo dos primeiros 14 dias pós-natal (SANTOS et al., 2009).

Conhecendo essas informações, torna-se necessário avaliar o efeito do extrato

A

B

60

diclorometano de EP 1µg/mL em cultura de células da retina sobre os níveis de

BDNF (Figura 20).

CT

EP 1µg/m

L0

50

100

*

Nív

eis

de B

DN

FU

nida

des

Arb

itrár

ias

(% d

o co

ntro

le)

28 kDa BDNF

49 kDa actina Figura 20. Níveis de BDNF em culturas tratadas com extrato diclorometano de E. punicifolia. Controle (CT); Extrato diclorometano de E. punicifolia (EP). A: Níveis de BDNF representados em unidades arbitrárias (% do controle), como média ± erro padrão da média (n = 3). B: Imagem representativa dos resultados da imunodetecção obtidos nessas experiências. (*p< 0,005)

Os resultados demonstram que o tratamento de culturas de células da retina

com extrato diclorometano de EP induz redução significativa (44%) do nível de

expressão do BDNF.

NÍVEIS DA EXPRESSÃO DE CITOCINAS

Araujo-Martins e colaboradores (2013) mostraram que ao longo do

desenvolvimento da retina, os níveis de IL-4 aumentam, sendo mantidos altos na

idade adulta. Ainda em 2013, foi demonstrado por Braga e colaboradores que ao

longo do desenvolvimento da retina, os níveis do receptor M3 aumentam. Vale

A

B

61

ressaltar que o curso temporal tanto do aumento dos níveis de IL-4 como do receptor

M3 tem um perfil semelhante. Uma vez que o tratamento de culturas com EP1µg/mL

foi capaz de aumentar os níveis de receptor M3, é importante analisar o efeito deste

extrato nos níveis da interleucina 4 (IL-4) (Figura 21).

CT

EP 1µg/m

L0

100

200

Nív

eis

de IL

-4U

nida

des

Arb

itrár

ias

(% d

o co

ntro

le)

*

14,9 kDa IL-4

49 kDa actina Figura 21. Níveis de IL-4 em culturas tratadas com extrato diclorometano de E. punicifolia. Controle (CT); Extrato diclorometano de E. punicifolia (EP). A: Níveis de IL-4 representados em

unidades arbitrárias (% do controle), como média ± erro padrão da média (n = 3). B: Imagem

representativa dos resultados da imunodetecção obtidos nessas experiências. (*p< 0,002)

Os resultados demonstram que o tratamento com o extrato aumenta em 71%

os níveis de IL-4, aumento esse que foi semelhante ao observado nos níveis de M3

em culturas tratadas com o extrato diclorometano de EP 1µg/mL por 48h.

A

B

62

6. DISCUSSÃO

Neste trabalho foi demonstrado que o tratamento de culturas de células da

retina com o extrato diclorometano de EP interfere na modulação do fenótipo

colinérgico e na expressão de fatores tróficos como neurotrofinas e a citocina IL-4.

O Extrato da Eugenia punicifolia induz efeitos pronunciados sobre a

transmissão colinérgica periférica (GRANGEIRO et al., 2006; LEITE et al., 2010) e,

sabe-se que compostos que aumentam a neurotransmissão colinérgica central

podem apresentar atividade neuroprotetora e atuar na plasticidade neuronal (RAFII

& AISEN, 2009). No presente trabalho foram realizados experimentos a fim de

observar o efeito do tratamento com extrato diclorometano de Eugenia punicifolia em

células do Sistema Nervoso Central, utilizando como modelo experimental células da

retina de ratos neonatos. Essas células apresentam grande dependência da

atividade colinérgica, tanto durante o desenvolvimento quanto na manutenção da

homeostasia em adultos (ZHOU, 2001; FELLER, 2002).

Dados da literatura mostram que receptores de acetilcolina muscarínicos

(mAChRs) são expressos, em retina de animais adultos, por células amácrinas,

ganglionares, bipolares (STRANG et al., 2010), e que durante o desenvolvimento

tecidual há uma alteração na expressão dos subtipos de receptores (SANTOS et al.,

2009; BRAGA et al., 2013). Inicialmente foi analisado se o tratamento com o extrato

diclorometano de E. punicifolia seria capaz de interferir nos níveis de expressão

desses receptores.

Inicialmente fez-se uma avaliação da proliferação celular induzida pelo

tratamento de culturas com diferentes concentrações do extrato diclorometano de E.

punicifolia. Observou-se aumento da proliferação dessas células de forma

dependente da concentração, sendo o melhor efeito (50% de aumento em relação

ao controle) obtido com o tratamento com EP 1µg/mL. Posteriormente foi

investigado o efeito do extrato na expressão dos marcadores colinérgicos. Os

resultados demonstraram que o tratamento induz redução dos níveis de receptores

M1 e M4; aumento expressivo nos níveis de receptores M3, sem induzir alterações

63

significativas nos níveis de receptores M5. Também foi demonstrada redução dos

níveis do transportador vesicular de acetilcolina, o VAChT, além de aumento nos

níveis dos receptores Nα7. Por fim, foi observado aumento nos níveis do fator de

crescimento do nervo (NGF) e da interleucina (IL-4), e diminuição da expressão do

fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF).

A utilização da técnica de incorporação de [3H]-timidina nesse trabalho

permitiu que fosse determinada a concentração do extrato que seria utilizada na

análise da atividade colinérgica, na expressão de neurotrofinas e de citocinas

induzida pelo extrato diclorometano de E. punicifolia.

Os resultados mostraram aumento da proliferação celular com a utilização de

100ng/mL-1µg/mL, sendo o melhor efeito observado com a utilização de EP 1µg/mL.

Essa concentração foi compatível com a utilizada por Pascual e colaboradores

(2011) que utilizaram o extrato diclorometano de E. punicifolia para estudar a

influência na secreção de catecolaminas por células cromafins da adrenal bovina e

trataram essa células com concentrações que variavam de 0,1ng/mL a 10µg/mL.

Um dos mediadores mais importantes da organização do sistema nervoso e

da plasticidade são as células gliais, cujo tipo principal da retina é representado

pelas células de Müller, que desempenham papéis dos astrócitos, oligodendrócitos e

células ependimais em outras regiões do SNC. As células de Müller derivam do

neuroectoderma da retina e pertencem à linhagem astrocítica e são geradas do

período E20 a P13 (CEPKO, 1993). Cabe lembrar que neste período (E20-P13)

também são gerados os fotorreceptores. As células de Müller respondem ao

tratamento com diferentes fatores de crescimento e tem grande importância na

manutenção e suporte de vários tipos celulares da retina, através da regulação da

atividade metabólica, concentração iônica, dentre outros (WAHLIN et al, 2000).

Ao analisar a morfologia das culturas, observa-se um padrão morfológico

semelhante em toda a placa, com a presença de um grande tapete glial sobre o qual

se encontram neurônios capazes de emitir processos longos. Ao contrário, as

culturas controle, mantidas também por este período, evidenciam uma morfologia

64

menos exuberante, com presença de poucos processos. Considerando o período do

desenvolvimento em que a retina é estudada (P0-P2), pode-se sugerir que as

células que estão proliferando nessas culturas sejam as células gliais ou

fotorreceptores, porém, o estudo da proliferação celular não foi o foco deste

trabalho.

Estudos demonstraram que o extrato aquoso da E. punicifolia tem efeito

pronunciado sobre a atividade colinérgica de diafragma de ratos (GRANGEIRO et

al., 2006) e que o extrato diclorometano da EP aumenta a secreção de

catecolaminas induzida pela acetilcolina ou por K+ sem causar bloqueio da

acetilcolinesterase ou butirilcolinesterase, além de não ativar diretamente o sistema

colinérgico em células cromafins da adrenal de bovinos em nenhuma concentração

utilizada (PASCUAL et al., 2011).

Na retina de mamíferos, a neurotransmissão colinérgica é importante tanto no

desenvolvimento quanto na manutenção da homeostasia (VANEY, 1990)

envolvendo diretamente a participação dos nAChRs (FELLER, 2002) e mAChR

(SANTOS et al., 2009). Todos os subtipos de mAChR são expressos em

subpopulações de células amácrinas, bipolares e ganglionares de retina de coelho,

incluindo células dos circuitos glicinérgico e colinérgico (SHANG et al., 2010). Além

disso, foi observado que o receptor muscarínico do subtipo M2 foi localizado na

camada nuclear interna (CNI) e na camada plexiforme interna (CPI) em retinas de

rato, mais especificamente, nas células amácrinas glicinérgicas (STRANG et al.,

2010). Os subtipos de receptores muscarínicos M2, M3, M4 foram localizados em

células amácrinas de retina (GLEASON, 2012). Também foi demonstrada a

presença da subunidade α7 do receptor nicotínico em células bipolares, amácrinas e

ganglionares na retina de coelhos (DMITRIEVA, 2007). Sabendo da importância da

atividade colinérgica na retina, foram realizadas culturas de células da retina de

ratos neonatos a fim de analisar a ação do extrato diclorometano de E. punicifolia na

atividade colinérgica dessas células.

O tratamento de culturas de células da retina de ratos neonatos com forbol

12-miristato 13-acetato (PMA), um agente mitogênico, promotor de tumor (GRINER

65

& KAZANIETZ, 2007) induz redução da proliferação celular e este efeito que é

mediado pela ativação da PKC, depende da atividade colinérgica (receptores M1) e

da ativação de receptores Trk (SANTOS et al., 2003). Em 2009, Santos e

colaboradores, analisando o nível de expressão de receptores M1, demonstraram

que há redução dos níveis ao longo do desenvolvimento, desde o nascimento até o

dia pós-natal P30 (P0 a P30). No presente trabalho foi demonstrado que o

tratamento das culturas de células da retina com o extrato diclorometano de E.

punicifolia 1µg/mL por 48h, induz diminuição na expressão de receptores M1,

semelhante ao que foi observado por Santos e colaboradores (2009). Apesar desta

semelhança, estes autores observaram redução da proliferação celular pelo

tratamento das células da retina com PMA, enquanto o tratamento dessas células

com extrato de E. punicifolia induziu aumento da proliferação.

A ativação de receptores colinérgicos M1 e M3 está diretamente envolvida no

aumento da proliferação em vários tipos de tumor como, por exemplo, tumor de

próstata (RAYFORD et al., 1997), de cólon (CHENG e RAUFMAN, 2005), de mama

(ESPANOL et al., 2007). Em linhagem de células de astrocitoma, a ativação de

receptor M3 por agonista colinérgico é capaz de aumentar a proliferação celular

(GUIZZETTI et al, 1996), sinalizando via ERK e NF-kB (GUIZZETTI et al., 2003). Em

experimentos usando células humanas de câncer de cólon, Peng e colaboradores

(2013) mostraram aumento da proliferação celular e altos níveis de expressão de

receptor M3, induzido pelo agonista muscarínico betanecol. Esse efeito é mediado

ativação de receptores M3 e de receptores do fator de crescimento epidermal

(EGFRs), sinalizando via proteína cinase ativada por mitógenos p44/42. Além disso,

os receptores M3 estimulam uma robusta expressão de genes de metaloproteinases

de matriz (MMP), que desempenham papéis chave na mediação da proliferação

celular, migração celular e invasão in vitro (PENG et al, 2013). O tratamento de

células da retina com o extrato diclorometano de E. punicifolia induz aumento da

proliferação celular com respectivo aumento dos níveis dos receptores M3. E apesar

de não se tratar de células tumorais, sugerimos que esse aumento do receptor M3

em células da retina, esteja envolvido no efeito de proliferação através de

mecanismos semelhantes.

66

A ativação de receptores M3 está envolvida com a diferenciação celular de

astrócitos de ratos tratados com carbacol, um análogo da acetilcolina (GUIZZETTI et

al., 2011), e a acetilcolina liberada pelas células amácrinas induz liberação de cálcio,

estabilizando o desenvolvimento dos neuritos de células ganglionares da retina

(LOHMANN et al., 2002). Ao analisar as culturas tratadas com extrato diclorometano

de EP, observa-se aumento no número de processos celulares, o que pode sugerir

que o aumento nos níveis de M3 nessas culturas também possa estar relacionado

com as alterações morfológicas observadas nas culturas tratadas em comparação

com as culturas controle.

A ativação dos receptores M4 é capaz de induzir a diferenciação de células

progenitoras neurais em culturas de células de carcinoma embrionário (P19) em

ratos (RESENDE, et al., 2008). ANGELIS e colaboradores (2012) mostraram que em

células progenitoras de oligodendrócitos, o receptor M4 medeia o aumento da

proliferação celular na presença de muscarina. Na retina de pintos, os receptores

M4 foram identificados nas células da camada nuclear interna e camada de células

ganglionares, havendo uma co-localização com células amácrinas quando utilizado

marcadores específicos tais como somatostatina, tirosina hidroxilase (FISCHER, et

al, 1998). Braga e colaboradores (2013) demonstraram que o tratamento de células

da retina de ratos neonatos com PMA, não foi capaz de induzir alterações nos níveis

dos receptores M4. Ao contrário do tratamento com PMA, o tratamento dessas

células com extrato diclorometano da EP foi capaz de induzir pequena redução nos

níveis dos receptores M4, sugerindo envolvimento deste receptor no efeito

proliferativo observado.

Ashkenazi e colaboradores (1989) descreveram que a ativação de receptores

muscarínicos como M1, M3 e M5 aumenta a proliferação em astrócitos corticais de

ratos. Os subtipos de receptores muscarínicos M1, M3 e M5, acoplados a proteína

Gαq/11, aumentam a taxa proliferação de diversos tipos celulares como, por exemplo,

células precursoras neurais (RESENDE et al., 2008). Apesar de ser verificada

redução da expressão de M1 e aumento da expressão de M3, não foram

observadas alterações dos níveis dos receptores M5 com o tratamento com extrato

67

diclorometano de E. punicifolia em células da retina de ratos neonatos, sugerindo

que não há participação deste subtipo de receptor nos efeitos observados.

As respostas celulares verificadas frente à ativação de receptores

muscarínicos dependem do fenótipo celular em questão (van KOPPEN & KAISER,

2003). Muitos destes tipos celulares bem como as respostas frente à ativação de

receptores colinérgicos foram citados. O tratamento dessas células com o extrato

diclorometano de E. punicifolia induz aumento nos níveis dos receptores M3 e

redução dos níveis de M1 mimetizando, tanto o que acontece durante o

desenvolvimento do tecido quanto o que é observado com o tratamento com PMA

(SANTOS et al., 2009; BRAGA et al., 2013). Porém, apesar da semelhança

observada frente às alterações morfológicas de ambos os tratamentos, sugerindo

indução da diferenciação celular, houve um efeito distinto sobre a proliferação

celular: o EP aumenta enquanto o PMA reduz a proliferação. É possível especular

que os constituintes do extrato da EP utilizem vias de sinalização distintas daquelas

observadas pelo tratamento com PMA e que isso seja capaz de induzir aumento da

proliferação celular, enquanto o PMA reduz. Outro fator a ser considerado é que o

PMA é uma droga purificada, enquanto o extrato de EP utilizado é composto por

grande número de constituintes ainda não identificados (somente o ácido

barbinérvico e o daucosterol foram isolados). Pode ser sugerido que os constituintes

do extrato estejam atuando de forma coordenada, ativando e/ou inibindo vias de

sinalização distintas sendo elas responsáveis pelo aumento da proliferação celular.

Receptores acoplados a proteína G, quando expostos a estímulos

prolongados de agonistas podem passar por um processo composto por etapas tais

como a dessensibilização, “down-regulation” e degradação (MOLINA-HOLGADO et

al., 2003). Santos e colaboradores (2009) observaram diminuição na expressão de

receptores M1 após 45 minutos de tratamento com PMA, um período considerado

suficiente para induzir a degradação desses receptores. Estudos anteriores haviam

descrito que a internalização e/ou degradação de receptores muscarínicos ocorre a

partir dos 30 minutos após a adição do agonista (LILES et al., 1986). Nota-se então

que esse “down-regulation” ocorre até que seja atingida estabilidade, que em alguns

estudos ocorre após 30 minutos de tratamento (FEIGENBAUM & EL-FAKAHANY,

68

1984; FEIGENBAUM & EL-FAKAHANY, 1985), mostrando que esse tempo é

suficiente para induzir a internalização e “down-regulation” do receptor (SANTOS et

al., 2009). No presente estudo foram observadas redução do nível de expressão de

receptores M1 e M4, o que pode sugerir que haja dessensibilização dos mesmos

após tratamento por 48h com extrato de EP. Porém, não foram realizados

tratamentos de curta duração com o extrato diclorometano da EP, não sendo

possível inferir se o mesmo é capaz de causar dessensibilização dos receptores por

tratamento de curtos períodos.

Receptores nicotínicos neuronais são expressos nos gânglios do Sistema

Nervoso Autônomo e no Sistema Nervoso Central, em localização pós-, pré- e extra

sinápticas. Dados da literatura mostram que a nicotina é capaz de estimular a

proliferação em células HT-29 de adenocarcinoma de cólon, e que a metil-

licaconitina, um antagonista de nAChRα7 é capaz de reverter este efeito (WONG et

al., 2007). A indução da proliferação se dá através do aumento na síntese de

catecolaminas, via ativação da subunidade α7 do receptor nicotínico (WONG et al.,

2007). Pascual e colaboradores (2011) mostraram que o aumento da secreção de

catecolaminas evocada pela acetilcolina em células cromafins de bovino pode ser

devido ao efeito direto do extrato diclorometano de EP em receptores nicotínicos,

comportando como um modulador alostérico da subunidade α7 do receptor

nicotínico.

O subtipo de receptor nicotínico, especialmente aquele contendo a

subunidade α7, é amplamente expresso em regiões do cérebro responsáveis pelo

aprendizado e memória, como o hipocampo e o neocórtex (SEGUELA et al., 1993).

Esse subtipo possui alta permeabilidade aos íons Ca+2 e Na+, aumenta a

neurotransmissão glutamatérgica e modula a plasticidade neuronal influenciando o

crescimento de axônios (BROIDE & LESLIE, 1999). Resende e colaboradores

(2008) ainda relacionam a expressão genes da subunidade α7 em células P19

indiferenciadas, sugerindo o envolvimento desse subtipo de receptor em processos

iniciais da proliferação e da diferenciação neuronal. Na retina, a subunidade α7 do

receptor nicotínico (Nα7) é expressa nas células bipolares, amácrinas e células

69

ganglionares, sugerindo que sua ativação pode influenciar o processamento da

informação visual (DMITRIEVA, 2007).

O tratamento de células da retina de ratos neonatos com o extrato

diclorometano de E. punicifolia é capaz de induzir aumento da expressão da

subunidade α7 do receptor nicotínico de forma significativa, sugerindo uma possível

ação desse receptor no processo de proliferação celular observado e possivelmente

na diferenciação. Como os nAChRs não possuem atividade tirosina cinase intrínseca

(GOTTI & CLEMENTI, 2004), os mecanismos moleculares envolvidos em seus

efeitos na proliferação ainda não estão muito claros. Foi demonstrado que a indução

da proliferação celular mediada por nicotina envolve recrutamento de β-arrestina,

que facilita a ativação de Src. Isto por sua vez leva à ligação da Raf-1 cinase ao Rb,

levando à entrada no ciclo celular (DASGUPTA et al., 2006).

Estudos em neurônios do hipocampo mostraram uma relação entre a

presença do VAChT e a liberação de acetilcolina, na qual o aumento do VAChT está

acompanhado do aumento na liberação do neurotransmissor (NAGY & AUBERT,

2012), o que é importante na consolidação da memória e do aprendizado (JAEGER

et al., 2013). O tratamento das culturas de células da retina de ratos neonatos com o

extrato diclorometano de E. punicifolia por 48h, induz redução nos níveis de VAChT,

o que pode indicar que o efeito da acetilcolina independe da liberação da acetilcolina

mediada por VAChT nessas células e que estes efeitos podem ser diretos via

ativação de receptores muscarínicos e/ou nicotínicos. Também pode ser sugerido

que a redução da expressão de VAChT pode estar diminuindo a liberação de

acetilcolina, corroborando a ideia de que o efeito seja direto em receptores

colinérgicos.

As atividades da ChAT e do VAChT podem ser reguladas por vários fatores

extracelulares que são capazes de influenciar o fenótipo colinérgico e exercer efeitos

tróficos sobre o desenvolvimento de neurônios colinérgicos. Um dos fatores que

influencia a sobrevida e diferenciação de neurônios colinérgicos é o fator de

crescimento do nervo (NGF) (TIAN et al., 1996). O aumento nos níveis de NGF no

desenvolvimento cerebral de ratos precede o aumento da atividade de ChAT por

70

aumentar a expressão dos genes da ChAT e VAChT em neurônios colinérgicos

(TIAN et al., 1996). Além do NGF, o fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)

também modula o fenótipo colinérgico do cérebro de ratos (LI et al., 1995). Outros

fatores tróficos como a NT-3 e o CNTF podem agir modulando os receptores de

acetilcolina e promovendo a diferenciação colinérgica de neurônios derivados de

células tronco embrionário humano (NILBRATT et al., 2009). Diversos fatores

neurotróficos e receptores incluindo as neurotrofinas e receptores Trk (LEWIN &

BARDE, 1996) são expressos em padrões temporais e celulares específicos na

retina de aves durante o período de desenvolvimento (HALLBÖÖKet al., 1996; von

BARTHELD, 1998). O NGF, receptores TrkA e p75 são expressos por células

horizontais e amácrinas na retina em desenvolvimento (KARLSSON et al., 1998),

enquanto p75 tem sua expressão em diferentes tipos celulares na retina de recém-

nascidos e adultos (LARGE et al., 1989; HALLBÖÖK et al., 1990; von BARTHELD et

al., 1991; KARLSSON et al., 1998).

Dentre as ações de regulação de proliferação, diferenciação e manutenção da

função de diferentes populações neuronais descritas para o NGF, sabe-se que ele é

capaz de regular o tamanho do corpo celular, sua arborização dendrítica e sua

conectividade (MENDELL, 2001). Além disso, esta neurotrofina induz diferenciação

de neurônios colinérgicos no SNC (SHOVAL & WEIZMAN, 2005) e é importante nos

processos de plasticidade e sobrevivência neuronal (PEZET & MCMAHON, 2006).

Braga e colaboradores (2013) demonstraram que os níveis do NGF, ao longo do

desenvolvimento, tem aumento gradual a partir de P0, sendo o máximo em P14,

sugerindo envolvimento do NGF na maturação do tecido retiniano. Neste trabalho foi

observado aumento nos níveis de NGF em culturas de células tratadas com extrato

diclorometano de E. punicifolia, sugerindo envolvimento do NGF na indução da

diferenciação celular. Porém, diferente do que foi observado por TIAN e

colaboradores (1996) com relação à expressão de VAChT, em cérebro de ratos

durante o desenvolvimento, o extrato induz aumento na expressão de NGF sem que

haja aumento subsequente da expressão de VAChT, sugerindo uma sinalização

distinta nas células da retina.

71

O fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) é importante para a

formação, maturação e sobrevida neuronal na fase inicial do desenvolvimento fetal

e, na fase adulta, tem papel bastante conhecido nos fenômenos cognitivos como na

consolidação da memória e aprendizado (POST, 2007). No sistema visual, dentre as

neurotrofinas citadas, o BDNF tem papel de destaque, coordenando eventos de

sobrevivência e diferenciação em todas as áreas, desde a retina até o córtex visual

(von BARTHELD, 1998). Seus efeitos foram caracterizados em estudos in vivo e in

vitro, e podem ser observados durante o desenvolvimento até a vida adulta

(ISENMANN et al., 2003).

Estudos in vitro demonstraram que o BDNF é uma neurotrofina presente nas

células ganglionares da retina de várias espécies incluindo ratos (VON BARTHELD,

1998). Em culturas de células da retina de ratos neonatos o tratamento com BDNF

reduz a proliferação celular após 48h, sendo o mesmo efeito observado no

tratamento com PMA, (SANTOS et al., 2003). O tratamento de células da retina de

ratos com extrato diclorometano da E. punicifolia foi capaz de induzir redução nos

níveis de BDNF, semelhante ao que ocorre durante o desenvolvimento. Porém, o

BDNF induz redução da proliferação celular (SANTOS et al., 2003), enquanto o

extrato diclorometano da EP induziu aumento da proliferação celular. Esses efeitos

contraditórios em relação à proliferação celular podem ser explicados pela

diversidade de constituintes do extrato que poderia estar modulando vias de

sinalização distintas na geração desses efeitos, ao contrário do que acontece com o

BDNF que é uma molécula purificada e com ativação de receptor e vias de

sinalização bem caracterizadas. Pode-se sugerir que essa redução da expressão de

BDNF induzida por extrato diclorometano de EP possa estar envolvida na indução

da diferenciação celular observada com tratamento das culturas com o extrato.

No Sistema Nervoso Central, a IL-4 tem ação importante sobre as células

gliais, inibindo a liberação de moléculas neurotóxicas como o TNF alfa por microglia

ativada (DE ARAUJO et al., 2009) além de aumentar a expressão de BDNF em

células do hipocampo (HALL et al., 2000). Também foi observado que a IL-4 reduz a

deposição de proteína AB bem como a formação de oligômeros (KIYOTA et al.,

2010), importante para o desenvolvimento e progressão da Doença de Alzheimer.

72

O interesse nos efeitos da IL-4 no desenvolvimento do sistema nervoso vem

aumentando e a literatura mostra a ação desta interleucina em eventos como a

proliferação celular (ESTES et al., 1993; BARNA et al., 1995; BRODIE et al., 1998),

diferenciação celular (BRODIE & GOLDREICH, 1994), controle da sobrevida

neuronal de diferentes tipos celulares (ARAUJO & COTMAN, 1993; SHOLL-

FRANCO et al., 2001), arranjo do citoesqueleto e fenótipo das células gliais

(WIRJATIJASA, 2002). Esta citocina induz diferenciação de bastonetes em roedores

através da ativação de tirosina cinase, PKC e MAP cinase, independente da

liberação de fatores tróficos (DA SILVA et al., 2008). Em relação à proliferação de

células da retina de ratos neonatos, não foi observado aumento considerável neste

parâmetro quando do tratamento com IL-4 (SILVA, 2011). Porém, a IL-4 aumenta a

sobrevida das células ganglionares da retina, desempenhando importante papel

neuroprotetor nessas células após axotomia, e sua expressão na retina aumenta

durante o período pós-natal (ARAUJO-MARTINS et al., 2013).

A IL-4 é capaz de controlar a síntese e secreção de NGF in vitro bem como

regular a proliferação de células gliais (DE ARAUJO et al., 2009), e induzir a

secreção de NGF em células astrogliais de ratos (AWATSUJI et al., 1993). Araujo-

Martins e colaboradores (2013) mostraram que a IL-4 pode estar induzindo a

liberação de neurotrofinas e/ou aumentando a expressão de receptores Trk nas

membranas das células da retina de ratos neonatos, uma vez que a utilização do

anticorpo anti-BDNF inibiu o efeito da IL-4 de resgate da morte de células

ganglionares da retina induzida por axotomia. O mesmo estudo ainda observou

aumento na expressão de BDNF em culturas tratadas com IL-4, bem como um

aumento da expressão de IL-4 ao longo do desenvolvimento pós-natal (P0 até 1ano)

O tratamento de células da retina de ratos neonatos com extrato diclorometano da

EP induz um aumento expressivo dos níveis da IL-4, sugerindo que a IL-4 esteja

induzindo a síntese e secreção de NGF e que ambos estão atuando em conjunto

para a indução da proliferação e diferenciação celular observadas.

É possível sugerir que a diferenciação esteja sendo induzida através da ação

direta do extrato em receptores muscarínicos do tipo M1 e M3, além da liberação de

73

fatores tróficos como o NGF, BDNF e a IL-4. E por outro lado, a proliferação seja

mediada por uma ação do extrato na subunidade α7 do receptor nicotínico. No

entanto, por não haver nenhum outro tipo de trabalho utilizando o extrato

diclorometano de EP em células do Sistema Nervoso Central, esses resultados são

referentes a etapa inicial. É necessário que seja realizada uma investigação das vias

de sinalização que estão sendo ativadas ou inibidas pelo extrato e ainda um estudo

com os compostos isolados. Conhecendo mais detalhadamente as ações do extrato

ou seus componentes no desenvolvimento retiniano, pode-se sugerir o

desenvolvimento de estratégias terapêuticas para o tratamento de diferentes

doenças que acometem esse tecido.

74

7. CONCLUSÕES Baseados nos resultados do tratamento de culturas mistas de células da

retina de ratos neonatos com o extrato diclorometano de E. punicifolia, pode-se

concluir que este é capaz de aumentar a proliferação de células da retina de ratos

neonatos de forma dependente da concentração.

No que diz respeito ao perfil fenotípico colinérgico o extrato induz aumento a

expressão de receptores colinérgicos muscarínicos M3, reduz a expressão de

receptores colinérgicos muscarínicos M1 e M4, não altera a expressão de receptor

colinérgico M5 e aumenta a expressão da subunidade α7 do receptor nicotínico.

O tratamento com o extrato ainda induz aumento na expressão de NGF,

reduz a expressão de BDNF e aumenta a expressão de interleucina-4.

Por se tratar de um extrato, cuja composição ainda não se encontra

totalmente caracterizada, pode-se sugerir que o extrato diclorometano de EP esteja

atuando de modo a induzir uma diferenciação e proliferação das células da retina, e

tais processos estão sendo desencadeados por vias de sinalização distintas.

75

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9 ANEXOS

9.1 Anexo 1 – Folha de aprovação do projeto pelo Comitê de Ética no Uso de

Animais