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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Engenharia Química
RAQUEL VANNUCCI CAPELLETTI
ANÁLISE DA ASSOCIAÇÃO DE AGENTES ANTIMICROBIANOS A
BIOPOLÍMEROS PARA O CONTROLE DE BIOFILMES EM
AMBIENTES SUSCEPTÍVEIS AO DESENVOLVIMENTO DE
CONTAMINANTES ORIUNDOS DE ÁGUA
Campinas
2015
RAQUEL VANNUCCI CAPELLETTI
ANÁLISE DA ASSOCIAÇÃO DE AGENTES ANTIMICROBIANOS A
BIOPOLÍMEROS PARA O CONTROLE DE BIOFILMES EM
AMBIENTES SUSCEPTÍVEIS AO DESENVOLVIMENTO DE
CONTAMINANTES ORIUNDOS DE ÁGUA
Tese apresentada à Faculdade de
Engenharia Química da Universidade
Estadual de Campinas como parte dos
requisitos exigidos para a obtenção do
título de Doutora em Engenharia
Química.
Orientadora: ÂNGELA MARIA MORAES
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO
FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA
RAQUEL VANNUCCI CAPELLETTI, E
ORIENTADA PELA PROFa. DRa. ÂNGELA
MARIA MORAES.
CAMPINAS
2015
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): Não se aplica.
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Área de Engenharia e Arquitetura
Luciana Pietrosanto Milla - CRB 8/8129
Capelletti, Raquel Vannucci, 1978-
C171a Análise da associação de agentes antimicrobianos a biopolímeros para o
controle de biofilmes em ambientes susceptíveis ao desenvolvimento de
contaminantes oriundos de água / Raquel Vannucci Capelletti. – Campinas, SP
: [s.n.], 2015.
Orientador: Ângela Maria Moraes.
Tese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de
Engenharia Química.
Água. 2. Contaminação. 3. Quitosana. 4. Indústria. 5. Biofilmes. I.
Moraes, Maria Ângela,1966-. II. Universidade Estadual de Campinas.
Faculdade de Engenharia Química. III. Título.
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Engenharia Química
ANÁLISE DA ASSOCIAÇÃO DE AGENTES ANTIMICROBIANOS A
BIOPOLÍMEROS PARA O CONTROLE DE BIOFILMES EM
AMBIENTES SUSCEPTÍVEIS AO DESENVOLVIMENTO DE
CONTAMINANTES ORIUNDOS DE ÁGUA
Autora: Raquel Vannucci Capelletti
Orientadora: Profa. Dra. Ângela Maria Moraes
A Banca Examinadora composta pelos membros abaixo aprovou esta Tese em Campinas, em
18 de dezembro de 2015
Profa. Dr
a. Ângela Maria Moraes
Faculdade de Engenharia Química
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Profa. Dr
a. Cláudia Steckelberg
Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA)
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Prof. Dr. Cláudio Alberto Torres Suazo
Departamento de Engenharia Química
Universidade Federal de São Carlos (UFSCar)
Profa. Dr
a. Elisabeth de Fátima Pires Augusto
Instituto de Ciência e Tecnologia
Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Profa. Dr
a. Rose Marry Araújo Gondim Tomaz
Instituto Agronômico de Campinas (IAC)
A Ata da Defesa, assinada pelos membros da Comissão Examinadora, consta no
processo de vida acadêmica da aluna.
EPÍGRAFE
"Não sabendo que era impossível, foi lá e fez".
Jean Cocteau
AGRADECIMENTOS
A Deus, que me permite dar continuidade aos meus sonhos.
Aos meus familiares, que me motivaram durante todo o período dedicado à realização
deste trabalho.
À orientação, análise crítica e carinho dispensados pela professora Ângela, que foram
muito importantes na superação das dificuldades encontradas no decorrer do estudo, e pela
confiança desde o princípio, me acolhendo como aluna.
À Unicamp, em particular às Faculdades de Engenharia Química e Engenharia de
Alimentos e aos Institutos de Física e de Biologia, que me proporcionaram obter o título de
Doutorado.
Aos meus colegas da empresa em que atuo paralelamente às atividades acadêmicas
(Thor Brasil Ltda.), em especial aos Srs. Ridnei Brenna pelo permanente incentivo e Dave
Alexander pelo precioso suporte técnico. A esta empresa, também agradeço a facilitação de
uso do laboratório de controle de qualidade para a execução dos ensaios, bem como pela
possibilidade de utilizar alguns de seus produtos para este fim.
Também, foi de muita importância contar com Cristiele Pereira Oshiro em sua
carinhosa dedicação, colaboração e apoio. Ao Sr. Antônio José Matteucci, pela imensa
consideração e amizade no decorrer desta trajetória.
Por fim, dedico este trabalho a quem sempre foi meu maior condutor a caminhar em
direção ao aperfeiçoamento e à conclusão de objetivos, em todos os aspectos. Com amor, a
Fernando Zago.
RESUMO
Biofilmes microbianos são frequentemente formados por contaminantes remanescentes ou
resistentes a procedimentos de limpeza e sanitização, estando presentes em variados locais, desde
indústrias a hospitais. A água é o principal estímulo para o desenvolvimento microbiano, e seu
fluxo tem papel importante na disseminação de contaminantes. Biocidas são comumente
utilizados para o controle microbiano, porém podem gerar culturas resistentes e causar corrosão
em tubulações, requerendo frequente reposição para manter sua atividade. Este estudo teve por
objetivo avaliar o uso de biocidas de diferentes categorias associados a membranas de
biopolímeros como estratégia alternativa de prevenção e controle de contaminação em sistemas
envolvendo fluxo de água, visando minimizar o uso de produtos agressivos, especialmente em
ambientes susceptíveis com alta circulação de pessoal. Foram utilizados os polissacarídeos
quitosana e alginato para a constituição das membranas, ambos de origem biológica e de baixa
toxicidade a mamíferos. Culturas microbianas típicas, bem como as isoladas da tubulação, de
torneiras, de chuveiros, e do ar de ambientes industriais, foram expostas, nas formas suspensa em
água, em biofilmes e em cultura pura e mista, aos agentes antimicrobianos selecionados,
associados ou não aos biopolímeros. Observou-se que a eficácia de uso das membranas depende
da sua composição e da diversidade microbiana contaminante. A quitosana com menor grau de
desacetilação (85%) mostrou-se mais efetiva, de modo geral, que a de 98%. Em pH 4,0 a
formulação de quitosana apresentou maior atuação contra bactérias. Em pH 7,0 a atividade foi
mais pronunciada contra fungos. A quitosana com 85% de desacetilação em pH 7,0 apresentou
melhor atividade sobre microrganismos planctônicos, especialmente contra a bactéria Gram-
positiva S. aureus, enquanto o alginato mostrou melhor desempenho na erradicação de biofilmes
de culturas puras. Em biofilmes mistos ambos os polissacarídeos se mostraram promissores. O
aumento da concentração dos biopolímeros de 1 para 2% não proporcionou aumento da eficácia.
As membranas contendo apenas quitosana ou alginato apresentaram-se pouco efetivas contra os
contaminantes testados, sendo a membrana formada por quitosana de melhor desempenho, mas
ainda pouco atuante contra bactérias Gram-negativas e fungos. A incorporação de biocidas nesta
membrana favoreceu a ampliação do seu espectro de atuação para todas as formulações, mesmo
sob lixiviação. Mesmo não tendo sido possível adequar a formulação para a incorporação de todos
os biocidas selecionados (classe dos sanitizantes), obteve-se alternativas promissoras, tais como a
membrana contendo o biocida à base de n-octilisotiazolinona, que se mostrou majoritariamente
efetiva contra fungos, em especial a versão encapsulada para exposição à lixiviação, enquanto que
a formulação contendo nitrato de prata a 1,5% com benzisotiazolinona a 9%, contra bactérias. De
modo global, a minimização apropriada do uso de biocidas pôde ser demonstrada, embora seja
ainda dependente da diversidade na microbiota avaliada. Células em suspensão ou em biofilmes
possuem diferentes mecanismos de desenvolvimento e ambos devem ser avaliados para que se
possa delinear tratamentos mais efetivos, sendo a proposição de um conjunto de recomendações
preventivas e de monitoramento que reflita cuidados com o segmento industrial e que dê diretrizes
a outros ambientes susceptíveis considerada de alta relevância para atingir este propósito.
Palavras-chave: Biofilmes microbianos, contaminação, biocidas, membranas antimicrobianas,
biopolímeros, quitosana, alginato, sistemas de distribuição água.
ABSTRACT
Microbial biofilms are often formed by contaminants remaining or resistant to cleaning and
sanitizing procedures. They may be present in various sites, from industries to hospitals. Water is
the main stimulus for the development of microorganisms, and its flux plays an important role in
the spread of contaminants. Biocides are products frequently used for microbial control, but they
can generate resistant strains, corrosion in pipes and require frequent replenishing to maintain
their activity. This study aimed to evaluate different categories of biocides associated to
biopolymers in the form of membranes as prevention and control strategies of contaminants
present in water systems, as an alternative to minimize the use of aggressive products in areas of
high traffic of people. Chitosan and alginate were used for the production of the membranes,
being both compounds of biological origin not toxic to animals. Typical microbial cultures used in
laboratorial tests as well as microorganism isolated from pipes, faucets, showers, and air from
industrial environments were exposed, both as cell suspension and as biofilms, in pure and mixed
culture, to selected antimicrobial agents, associated or not to the biopolymer membranes. The
results showed that the efficiency of the use of the membranes depends on its composition and
contaminant microbial diversity. The chitosan with lower degree of deacetylation (85%) was more
effective in general than that of 98%. At pH 4.0, the formulation of chitosan showed higher
activity against the group of bacteria. At pH 7.0, the activity was more pronounced against fungi.
The 85% deacetylated chitosan at pH 7 showed better activity on planktonic microorganisms,
especially against the Gram-positive bacteria S. aureus, while alginate performed better in
eradicating biofilms resulting from pure cultures. In mixed biofilms both polysaccharides showed
to be promising for the desired application. Increasing the concentration of both polymers from 1
to 2% did not improve the antimicrobial efficacy of the membranes. The membranes containing
only chitosan and alginate showed not o be very effective against contaminants commonly found
in industrial environment. The chitosan membrane performed better, and the incorporation of
biocides to its formulation improved its activity, specially against Gram-negative bacteria and
fungi, as well as against biofilms. Although it was not possible to have formulations able to
incorporate all selected biocides (class of sanitizants), promising alternatives were attained, such
as the membrane containing the biocide n-octylisothiazolinone, which showed to be mainly
effective against fungi, in particular the encapsulated version, even in leaching conditions,
whereas the formulation containing 1.5% silver nitrate and 9% benzylisothiazolinone was
efficient against bacteria. In general, the safe minimization of the use of biocides could be
demonstrated, although it is still dependent on the diversity in the microbiota evaluated. Cells in
suspension or in biofilms have different development mechanisms and those mechanisms should
be considered for the design of effective treatment strategies. Thus, a set of preventive
recommendations and monitoring that reflects care for specific industrial sectors giving guidelines
to other susceptible environments is fundamental for achieving this purpose.
Keywords: Microbial biofilms, contamination, biocides, antimicrobial membranes, biopolymer,
chitosan, alginate, water distribution systems.
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1: INTRODUÇÃO ........................................................................................................................
1
1.1- EMBASAMENTO E JUSTIFICATIVA....................................................................................................... 2
1.2- OBJETIVOS ................................................................................................................................................. 7
CAPÍTULO 2: REVISÃO DA LITERATURA................................................................................................ 8
2.1- PERSPECTIVA HISTÓRICA: MICRORGANISMOS, ENFERMIDADES E ANTIBIÓTICOS
ASSOCIADOS..............................................................................................................................................
9
2.2- FONTES DE CONTAMINAÇÃO E DISPERSÃO MICROBIANA........................................................... 12
2.3- CONTAMINAÇÕES EM AMBIENTES CRÍTICOS E AQUISIÇÃO DE
INFECÇÕES.......................................................................................................................... .......................
16
2.4- CONTROLE DE BIOFILMES EM SISTEMAS DE DISTRIBUIÇÃO DE ÁGUA E IMPACTOS DA
CONTAMINAÇÃO PARA A INDÚSTRIA................................................................................................
24
2.5- VIAS COMPLEMENTARES À DISPERSÃO DE CONTAMINAÇÕES PELA ÁGUA E IMPACTO
NA SAÚDE OCUPACIONAL.....................................................................................................................
30
2.6- POLISSACARÍDEOS E APLICAÇÕES ANTIMICROBIANAS.............................................................. 35
2.7- CONSIDERAÇÕES FINAIS SOBRE A LITERATURA CONSULTADA................................. ............... 43
CAPÍTULO 3: METODOLOGIA EXPERIMENTAL E ANÁLISE DOS DADOS..................................... 46
3.1- ESTRUTURA GERAL DOS ENSAIOS EXPERIMENTAIS...................................................................... 47
3.2- MATERIAL................................................................................................................... ................................ 48
3.2.1- Biopolímeros............................................................................................................................................... 48
3.2.2- Agentes antimicrobianos complementares.................................................................................................. 48
3.2.3- Diluentes e reagentes.................................................................................................................................. 50
3.2.4- Meios de cultura........................................................................................ .................................................. 50
3.2.5- Microrganismos........................................................................................ .................................................. 51
3.3- MÉTODOS.................................................................................................................................................... 51
3.3.1- Avaliação microbiológica do sistema estudado.......................................................................................... 51
3.3.1.1.- Estratégias para a conduta de amostragem, diagnóstico microbiológico e proposição de
recomendações........................................................................................................................................ 51
3.3.1.2- Coleta, isolamento e caracterização de contaminantes críticos identificados de sistemas de
distribuição de água identificados........................................................................................................... 53
3.3.1.3- Preparo dos inóculos microbianos individuais ou mistos....................................................................... 54
3.3.1.4- Seleção dos biocidas para os ensaios de incorporação nas membranas................................................ 55
3.3.2- Ensaios preliminares: análise da atividade antimicrobiana dos biopolímeros........................................... 56
3.3.2.1- Avaliação da qualidade microbiológica inicial dos biopolímeros utilizados......................................... 56
3.3.2.2- Avaliação da atividade antimicrobiana da quitosana sólida e em solução............................................ 57
3.3.3- Preparação das membranas: seleção do biopolímero e incorporação dos biocidas.................................... 58
3.3.3.1- Preparação das membranas......................................................................................... ........................... 58
3.3.3.2- Atividade das membranas contra microrganismos planctônicos em cultivo de superfície..................... 59
3.3.3.3- Atividade das membranas na prevenção do desenvolvimento de biofilmes............................................... 60
3.3.3.4- Caracterização da membrana antimicrobiana selecionada................................................................... 61
3.3.4- Ensaio de triagem das membranas com biocidas em condições basais..................................................... 62
3.3.4.1- Atividade preliminar das membranas contendo biocidas na avaliação contra microrganismos
padronizados........................................................................................ .......................................................
62
3.3.4.2- Atividade da membrana contra microrganismos amostrados de sistema de água contaminado........... 62
3.3.5- Condições de exposição críticas para a avaliação da ampliação de atuação das membranas..................... 63
3.3.5.1- Ensaio de lixiviação das membranas...................................................................................................... 63
3.3.5.2- Atuação antimicrobiana por exposição a microrganismos patogênicos................................................ 64
3.3.5.3- Análise da variação do desempenho da membrana biopolimérica ao longo do tempo de utilização... 64
CAPÍTULO 4: RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................................................. 67
4.1- AVALIAÇÃO DO CENÁRIO, AMOSTRAGEM DE CONTAMINANTES INDUSTRIAIS DE
SISTEMAS DE DISTRIBUIÇÃO DE ÁGUA VISANDO À SELEÇÃO DE BIOCIDAS.........................
68
4.1.1- Levantamento do panorama geral e do perfil de contaminantes em sistemas envolvendo água no
segmento industrial........................................................................................................................................ 68
4.1.2- Análise da microbiota coletada de sistema de água visando seu uso nos ensaios de efetividade.............. 71
4.2- ANÁLISE PRELIMINAR DOS BIOPOLÍMEROS..................................................................................... 74
4.2.1- Avaliação microbiológica dos biopolímeros e interferência do ácido acético usado na solubilização da
quitosana........................................................................................................................................................
74
4.3- PREPARAÇÃO DAS MEMBRANAS POLIMÉRICAS, SELEÇÃO DO BIOPOLÍMERO E
INCORPORAÇÃO DOS BIOCIDAS...........................................................................................................
78
4.3.1- Avaliação do desempenho de membranas competentes após formulação e seleção do biopolímero
antimicrobiano mais promissor............................................................................ .........................................
78
4.3.2- Desempenho das membranas contra culturas padronizadas isoladas e mistas........................................... 78
4.3.3- Desempenho das membranas contra biofilmes........................................................................................... 85
4.3.4- Caracterização da membrana selecionada................................................................... ................................ 90
4.3.5- Incorporação de agentes antimicrobianos na composição da membrana................................................... 93
4.4- ATUAÇÃO ANTIMICROBIANA DAS MEMBRANAS COM BIOCIDAS EM CONDIÇÕES BASAIS... 96
4.4.1- Avaliação antimicrobiana preliminar das membranas compostas de quitosana com biocidas..................... 96
4.5- APLICAÇÃO DAS MEMBRANAS SOBRE CONTAMINANTES DE SISTEMA DE ÁGUA
ENVOLVENDO CONDIÇÕES MAIS RIGOROSAS.................................................................................
99
4.5.1- Submissão das membranas à lixiviação...................................................................................................... 99
4.5.2- Atuação contra microrganismos reconhecidamente patogênicos............................................................... 102
4.5.3- Resistência das membranas à exposição microbiana continuada............................................................... 104
4.6- DISCUSSÃO GLOBAL SOBRE A APLICABILIDADE DAS MEMBRANAS COM OU SEM
BIOCIDAS EM SISTEMAS COM CONTAMINAÇÃO DE ÁGUA..........................................................
105
CAPÍTULO 5: CONCLUSÕES E SUGESTÕES PARA FUTUROS TRABALHOS................................... 107
5.1- CONCLUSÕES ACERCA DA APLICABILIDADE DAS MEMBRANAS COM A FINALIDADE
PROPOSTA..................................................................................................................................................
108
5.2- SUGESTÕES PARA FUTUROS TRABALHOS............................................................................ ............. 109
CAPÍTULO 6: REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................................... 111
1
CAPÍTULO 1:
INTRODUÇÃO
2
1.1- EMBASAMENTO E JUSTIFICATIVA
O desenvolvimento de métodos para a produção de meios nutrientes sólidos e a
estratégia para isolar culturas de microrganismos proposta por Robert Koch nas últimas
décadas do século XIX possibilitou o treinamento de gerações de microbiologistas na
investigação e elucidação das propriedades de culturas puras de microrganismos. Seus
postulados foram de suma importância para provar que uma bactéria seria o agente causal de
uma determinada doença e requeriam o isolamento em cultura pura da bactéria supostamente
patogênica (Nascimento e Taveira, 2001).
Posteriormente, o advento de técnicas de análise por microscopia mais sofisticadas e
efetivas contribuiu para a constatação de que, em ambientes naturais, os microrganismos se
apresentam majoritariamente em associação mista e fixos a suportes (Costerton et al., 1978).
Aos microrganismos aderidos, chamados sésseis, é atribuído o nome de biofilme quando há
formação de um material extracelular protetor, secretado por células microbianas de fisiologia
diferenciada. Os microrganismos precursores da formação de biofilmes, denominados
planctônicos, são encontrados dispersos em meios aquosos, o que os torna mais susceptíveis a
agressões ambientais que em sua forma aderida. Geralmente, a forma séssil apresenta
alterações genéticas que possibilitam a inibição ou síntese de novas substâncias, além de uma
estrutura protetora do grupo microbiano contra fatores ambientais agressivos. Assim, tais
características proporcionam a estas células condições favoráveis de sobrevivência, o que as
tornam menos susceptíveis à erradicação quando comparadas aos mesmos microrganismos
sob a forma planctônica (Morck et al., 2001). A partir de então, a importância do tema se
tornou mais abrangente e pesquisas vêm sendo realizadas em muitas áreas relacionadas com a
ecologia microbiana.
A deposição de biofilmes pode ocorrer em uma ampla variedade de locais, incluindo
desde a colonização em superfícies de materiais como dispositivos médicos ou em locais
contendo produtos com alto nível de controle, como reservatórios e linha de produção de água
ultrapura (Flemming e Ridgway, 2008). Outra implicação com impacto direto na saúde
humana é quando se tem uma higienização ineficiente das superfícies de equipamentos, tais
como em trocadores de calor, tendo como consequência o acúmulo de biofilmes microbianos,
uma preocupação importante e constante na indústria laticinista (Miguel et al., 2014).
3
Vinculados aos seus diversos ambientes de possível instalação, frequentemente, os
biofilmes estão envolvidos com diversos problemas, tais como o processo de corrosão
microbiologicamente induzido em tubulações, equipamentos e peças metálicas (Walker et al.,
1998), contaminação em linhas de processamento de indústrias de alimentos (Flint et al.,
1997), doenças periodontais (Hobson e Bolsen, 2001), infecções hospitalares relacionadas à
ineficácia de limpeza de superfícies, a implantes de biomateriais e a sistemas envolvendo
distribuição de ar e água (Dankert et al., 1986), sendo este último veiculador de
contaminantes mencionado de maior interesse no presente estudo.
No ambiente hospitalar, contaminações por biofilme têm grande impacto na segurança
dos pacientes e dos profissionais envolvidos. A transmissão de microrganismos responsáveis
por infecções hospitalares, também denominada de nosocomiais, é um grave e recorrente
problema de saúde pública, que acomete tanto os países em desenvolvimento quanto os
desenvolvidos. De acordo com o Ministério da Saúde (Portaria nº 930, Anexo II - 1992),
“Infecção Hospitalar é qualquer infecção adquirida após a internação do paciente e que se
manifesta durante a internação ou mesmo após a alta, quando puder ser relacionada com a
internação ou procedimentos hospitalares”. A infecção pode ser caracterizada como um
desequilíbrio no sistema parasita-hospedeiro-ambiente, por consequência do aumento da
patogenicidade do parasita em relação aos mecanismos de defesa do hospedeiro, ou pela
diminuição da capacidade normal de defesa anti-infecciosa do hospedeiro em relação à
patogenicidade normal do parasita.
Os biofilmes são responsáveis por mais de 65% das infecções bacterianas nos Estados
Unidos, e contribuem para a ocorrência de aproximadamente 90.000 mortes, gerando cinco
bilhões de dólares em despesas por ano, de acordo com o Centro de Controle de Doenças e
Prevenção daquele país (CDC, 2003). No Brasil, estima-se que entre 13 e 15% dos pacientes
adquirem algum tipo de infecção durante a hospitalização, resultando em significativa
morbidade, mortalidade e elevados custos (Associação Paulista de Medicina, 2006).
Normalmente estas infecções caracterizam-se pela sua cronicidade, o que torna o diagnóstico
microbiológico difícil, e pela elevada resistência ao tratamento com antibióticos.
Entretanto, os biofilmes podem ser investigados para a prevenção de sua formação,
controle ou erradicação. A utilização de produtos químicos com atividade antimicrobiana é
frequentemente empregada, porém, o uso destes requer a determinação quanto à concentração
apropriada para aplicação. Dosagens abaixo do nível necessário causam falsa segurança,
4
seleção de microrganismos resistentes e, consequentemente, a ocorrência de surtos de
contaminação, enquanto que acima do necessário, além dos aspectos econômicos, podem
ocorrer problemas de toxicidade entre os envolvidos.
O controle das infecções hospitalares no Brasil está regulamentado desde 1982 pelo
Ministério da Saúde, porém, para delinear o panorama do problema, somente em 1997 foi
estabelecida a Lei 9431, que dispõe sobre a obrigatoriedade de os hospitais manterem um
programa de controle de infecções hospitalares responsável pelas ações preventivas e
corretivas relacionadas à disseminação de patógenos. Em decorrência de infecções adquiridas
em hospitais brasileiros são registrados 45 mil óbitos por ano dentre 12 milhões de
internações, consistindo na principal causa de mortes ocorridas em Unidades de Terapia
Intensiva (UTI) hospitalares. Também em decorrência de infecções hospitalares o tempo de
internação pode ser prolongado de 10 a 14 dias em média, o que gera um custo de 10 bilhões
anuais para o tratamento complementar (Associação Paulista de Medicina, 2006).
Além da inata susceptibilidade dos enfermos, um dos principais fatores que podem
contribuir sensivelmente para a transmissão de patógenos e a aquisição de infecção pelos
pacientes são materiais que possam acumular sujidades e contaminantes e que estejam em
contato direto ou indireto com os pacientes no ambiente durante o qual os mesmos estejam
sob tratamento. Dentre as superfícies mais propícias ao desenvolvimento microbiano em
hospitais podem-se citar aquelas em que há o condicionamento resultante de respingos de
água contaminada, facilitando o depósito de outras moléculas e de patógenos.
Microrganismos podem facilmente aderir no interior de tubulações e aparatos do sistema que
geralmente acumulam água estagnada, principalmente onde o escoamento é dificultado,
formando biofilmes. Estes contaminantes são carreados pelo próprio fluido ou pelo
bioaerossol expelido pela água contaminada de torneiras e chuveiros, sendo então veiculados
no ar, facilitando a dissipação no ambiente. São a causa de muitas infecções adquiridas em
hospitais, que podem resultar em piora da doença e, muitas vezes morte, principalmente em
pacientes cujo sistema imunológico esteja debilitado.
Diante do exposto, os biofilmes e a diversidade microbiana são áreas que merecem
intensa investigação científica, face ao crescente desenvolvimento da resistência de cepas a
tratamentos antimicrobianos. A implantação de medidas para prevenir a progressão da
colonização à infecção por microrganismos é uma necessidade para a adequação das boas
práticas ocupacionais no âmbito hospitalar e nas demais áreas cujo controle microbiológico
5
necessite ser rigoroso, em particular nas indústrias dos setores de alimentos, fármacos,
cosméticos e produtos de higiene pessoal. Nestes últimos setores, o problema pode também
adquirir caráter muito grave e ter severas implicações no que tange à saúde dos envolvidos
diretamente no processamento de materiais, em função de etapas pouco seguras com relação à
exposição a contaminantes, e mesmo àqueles envolvidos de forma indireta, como usuários dos
produtos porventura contaminados.
Comumente, na rotina de limpeza e sanitização de ambientes utiliza-se de produtos
chamados biocidas para a contenção dos níveis de contaminação críticos. Biocida pode ser
definido como qualquer substância que contém um ou mais agentes ativos, capaz de prevenir,
inibir, diminuir ou eliminar a ação de organismos vivos patogênicos e não patogênicos
(definição adaptada da European Commission, 1998). A escolha de um agente antimicrobiano
com ampla atividade se faz necessária onde o foco de contaminação é constituído por
distintos tipos de microrganismos. Por vezes, princípios ativos em associação apresentam
sinergismo na erradicação de comunidades de microrganismos e/ou quando estes são
resistentes a tratamentos convencionais. Porém, a cada nova condição de exposição a agentes
químicos, os microrganismos tendem a se adaptar, persistindo e requerendo maiores doses de
produto para que sejam eliminados.
Desta forma, no presente trabalho teve-se por meta o estudo de membranas obtidas a
partir de biopolímeros naturais contra a instalação microbiana, seu crescimento e
disseminação, de modo a agregarem valor no combate a contaminantes persistentes. Como
opção promissora para a manufatura das membranas tem-se a quitosana que, dependendo do
pH do meio, pode apresentar cargas positivas. Por apresentar cargas negativas também de
forma dependente do pH foi analisado o uso de outro polissacarídeo, o alginato. Ambos são
de origem biológica e com reconhecida aplicação na área biomédica, o que confere a estes
biopolímeros pré-requisitos essenciais para uso como material não-tóxico a mamíferos de
forma geral. O alginato é amplamente utilizado como revestimento de fármacos para liberação
controlada no organismo e como agente para imobilização de células em estudos na área
biotecnológica (Dornish e Dessen, 2004). Recentemente, a quitosana foi utilizada com êxito
no recobrimento de implantes médicos para impedir sua colonização por bactérias e leveduras
de importância clínica (Carlson et al., 2008). Destaca-se ainda que ambos os biopolímeros
poderiam ser potencialmente obtidos a partir da biota marinha brasileira e que seu custo de
processamento não é muito elevado, sendo ambos de fácil manipulação. Com base nestas
observações, estes biopolímeros foram então testados na forma isolada ou combinada com
6
agentes antimicrobianos complementares que tenham aprovação para esta aplicação, visando
ampla atuação contra os microrganismos comumente presentes em sistemas de distribuição de
água.
Assim, diante dos problemas associados ao controle de biofilmes em sistemas de água
considerando-se as técnicas e os produtos comumente utilizados, a presente proposta de
estudo foi definida levando-se em conta a necessidade do uso de agentes antimicrobianos
mais sustentáveis que pudessem substituir ou atuar como agentes de minimização do uso de
produtos agressivos. Foram enfocadas no estudo especialmente áreas microbiologicamente
controladas, a análise da disseminação microbiana através da água (insumo mais utilizado em
vários campos de aplicação) e o controle da formação de biofilmes microbianos em locais de
difícil acesso à remoção, que induzem à resistência microbiana e a disseminações ambientais.
Ainda, considerou-se neste estudo o uso de materiais biodegradáveis (biopolímeros), total ou
parcialmente, para a constituição dos dispositivos para o controle e/ou eliminação dos
contaminantes, pois boa parte das matrizes comumente usadas para a incorporação de agentes
antimicrobianos tem elevada persistência no ambiente após o seu descarte, o que não é o caso
da quitosana e do alginato.
Visto que a realização dos ensaios em ambiente hospitalar poderia levar ao
agravamento do problema na localidade enfocada, optou-se por conduzir o estudo em áreas
sujeitas à mesma problemática de alto potencial de formação de biofilmes, com elevada
disseminação microbiana por via aérea e por meio de circulação de água, e com grande
trânsito de pessoas, mas sem o inconveniente e o risco da presença de pessoas com alta
susceptibilidade de infecção que poderiam ser prejudicadas pela realização do estudo. Desta
forma, realizou-se os ensaios em um vestiário com 40 m2 de extensão, 20 chuveiros e
aproximadamente 50 usuários por dia, localizado em ambiente industrial com foco de atuação
no processamento de produtos químicos para linha escolar.
Com isto, tem-se que a problemática apresentada abrange várias vertentes que se
complementam para o estudo de alternativas mais sustentáveis ao uso de agentes
antimicrobianos comumente empregados, tendo como fundamento a preocupação de atender
os aspectos ambiental e ocupacional envolvidos nesta prática, áreas estas ainda com registro
de dados restrito na literatura.
7
1.2- OBJETIVOS
Sendo assim, o presente estudo teve como principal objetivo a análise de estratégias
alternativas para o controle microbiológico de sistemas envolvendo distribuição de água,
especialmente em ambientes com grande probabilidade de disseminar contaminantes para o
ambiente externo. A proposta baseou-se no uso de agentes antimicrobianos e de biopolímeros
bioativos por serem estes materiais compatíveis com o organismo humano e por apresentarem
outras potenciais vantagens no uso a longo prazo em relação aos produtos atualmente
utilizados para este propósito.
As etapas envolvidas na busca do objetivo global estabelecido foram:
a) Analisar a factibilidade de uso de membranas poliméricas contendo quitosana de
diferentes tipos ou alginato, isoladas ou contendo agentes coadjuvantes antimicrobianos
(biocidas), sob condições adversas, como material complementar ou substituto a agentes
químicos agressivos e que possam evitar o desenvolvimento de microrganismos, sua
instalação na forma de biofilmes e dispersão ambiental;
b) Avaliar a capacidade antimicrobiana das membranas contra microrganismos
padronizados para uso em ensaios laboratoriais e avaliar comparativamente sua atuação contra
culturas resistentes oriundas de sistema de água de ambientes industriais com microrganismos
planctônicos (suspensos no fluido) e sésseis (fixos a superfícies e envoltos por uma matriz
extracelular, na forma de biofilmes), com exposição também à lixiviação (fluxo intenso e
contínuo de água);
c) Determinar a forma de atuação da membrana selecionada como a mais promissora e
eventuais limitações de sua eficácia antimicrobiana na aplicação final, considerando variações
na microbiota que possam influenciar o controle microbiológico do sistema envolvendo
culturas individuais e mistas, células em suspensão e em biofilmes;
d) Propor um conjunto de recomendações que reflita cuidados com o segmento
industrial e que remeta ou dê diretrizes também a outros ambientes susceptíveis, como o
segmento de processamento de alimentos, de artigos para uso humano e de amparo à saúde.
8
CAPÍTULO 2:
REVISÃO DA LITERATURA
9
Os assuntos abordados nesta seção foram compilados visando apresentar os marcos
referenciais relacionados à temática do presente trabalho. Fundamentos sobre as condições
que desencadeiam os diferentes modos de sobrevivência dos microrganismos, o uso de
antimicrobianos e sua relação com o desenvolvimento da resistência de microbiotas
envolvendo ambientes críticos são fornecidos e discutidos. Tais informações são importantes
para a compreensão global da problemática apresentada, bem como para o direcionamento de
medidas para intervenções. O levantamento de dados sobre a eficácia antimicrobiana de
produtos variados e suas limitações visam colaborar na avaliação de novos potenciais
tratamentos, como o estudado neste trabalho.
2.1- PERSPECTIVA HISTÓRICA: MICRORGANISMOS, ENFERMIDADES E
ANTIBIÓTICOS ASSOCIADOS
A humanidade registra, desde períodos muito antigos, a ocorrência de epidemias que
devastaram civilizações, cujos primeiros relatos datam de mais de três mil anos. Moléstias
consideradas atualmente de simples tratamento frequentemente resultavam em morte ou
sequelas, devido às corriqueiras complicações em decorrência de doenças infecciosas. De
acordo com dados da Organização Mundial da Saúde (OMS, World Health Organization, em
inglês, WHO), até meados do século XIX a expectativa de vida na Europa e América do
Norte era, em média, de 50 anos (WHO, 2000-b).
Diante de variadas situações de risco, o Homem deu início a um processo de
desenvolvimento de estratégias de enfrentamento e práticas de controle em resposta aos surtos
infecciosos que, até então, tinham sua origem desconhecida. Apesar da crença na origem
divina dos males, os povos da Antiguidade já expressavam em sua cultura cuidados com a
higiene e o saneamento para a manutenção da saúde. Nesse período, ao longo da costa do
Mediterrâneo, era muito comum a incidência de malária, pois o mosquito transmissor se
proliferava nos pântanos. Após a drenagem ou aterro, eliminavam-se os reservatórios de água
parada, os insetos perdiam seu local de reprodução e as febres desapareciam. A extinção dos
insetos, entretanto, não era relacionada ao aterro ou à drenagem, mas sim ao fim do odor
desagradável, que se acreditava na época ser o causador das febres. Essa crença de que
alguma alteração no ar, vinda principalmente de lugares pantanosos e fétidos, águas e valas
estagnadas e cemitérios era a responsável pelas doenças, deu origem à teoria dos miasmas
10
(odores presentes no ar como responsáveis pelas doenças e epidemias), que predominaria até
o século XIX (CRF-SP, 2011).
Mesmo desconhecendo as bactérias, os romanos construíram uma rede de
abastecimento de água potável e um sistema de esgotos responsável pela profilaxia de
diarreias. No entanto, as cidades medievais não dispunham de sistemas de esgotos e os dejetos
se acumulavam próximos aos muros, fluindo para os rios, de onde a população muitas vezes
retirava a água que ingeria (CRF-SP, 2011). A peste bubônica, denominada popularmente
como peste negra, talvez a mais conhecida das grandes epidemias, ganhou este nome devido
ao seu pior episódio, que atingiu a Europa no século XlV. Em apenas dois anos, a doença
matou cerca de um terço da população europeia, estimada em 75 milhões de pessoas.
Por volta de 1670, após o advento do microscópio, as bactérias foram identificadas
pela primeira vez pelo pesquisador holandês Van Leeuwenhoek. Somente no século XIX foi
considerada a possibilidade de que estes microrganismos poderiam ser causadores de
processos infecciosos. Esta hipótese surgiu após os experimentos de Louis Pasteur, que
comprovaram que as bactérias se distribuíam amplamente no meio ambiente. Após a segunda
metade do século XIX, Robert Koch identificaria o microrganismo responsável pela
tuberculose (Guimarães et al., 2010).
Baseado nas descobertas de Pasteur, em 1860, Joseph Lister demonstrou uma técnica
para manter as incisões cirúrgicas livres de contaminação pelos microrganismos. Lister
passou a pulverizar o ar da sala cirúrgica com ácido fênico e, posteriormente, passou a utilizar
ácido carbólico para desinfecção do instrumental. Alguns anos mais tarde, em 1883, Pasteur e
Charles Chamberland, criador da autoclave, demonstraram que a esterilização pelo calor era
de eficácia superior.
Até meados do século XIX, as estratégias sanitárias de combate às infecções eram
limitadas. Somente a partir da segunda metade deste século, após a constatação dos
microrganismos como agentes infecciosos, houve uma reorientação das práticas de tratamento
e prevenção das infecções, reduzindo sensivelmente o número de mortes. Mas foram os
estragos causados pelas epidemias que assolaram a Europa durante a Revolução Industrial que
desencadearam o desenvolvimento da saúde pública. A série de transformações sociais
promovidas pela proliferação de fábricas levou à ocorrência de várias doenças infecciosas. A
população urbana aumentou exponencialmente, o que contribuiu para o alastramento de
11
doenças infecciosas e para o aumento das taxas de mortalidade. Nesta época, havia grandes
aglomerações populacionais e surtos de sarampo e varíola se disseminavam com facilidade
entre os moradores, condições insalubres suficientes para que a tuberculose surgisse como
uma grande epidemia (Freitas, 2003).
No século XX, foram conduzidas diversas pesquisas na busca de agentes químicos
com atividade antibiótica. O pesquisador Paul Ehrlich foi responsável pelos conceitos
primários de que uma substância química poderia interferir na proliferação de microrganismos
em concentrações toleráveis pelo hospedeiro e ficou conhecido como o "pai da quimioterapia"
(Guimarães et al., 2010). Em 1910, este pesquisador desenvolveu o primeiro antibiótico de
origem sintética, denominado Salvarsan, que fora utilizado no tratamento da sífilis.
Entretanto, o grande marco no tratamento das infecções bacterianas ocorreu com a descoberta
da penicilina, por Alexander Fleming, no final da década de 20 e que levaria mais de dez anos
para que fosse introduzida como agente terapêutico. Neste período, Gerhard Domagk
verificou que o corante vermelho prontosil apresentava atividade in vivo contra infecções
causadas por espécies de Streptococcus. O prontosil (pró-fármaco) originou uma nova classe
de antibióticos sintéticos: as sulfas ou sulfonamidas, que constituem a primeira classe de
agentes efetivos contra infecções sistêmicas, sendo introduzida no início dos anos 40
(Guimarães et al., 2010).
Ainda na década de 1940, a penicilina G (benzilpenicilina) foi introduzida como
agente terapêutico. Após o seu processo de industrialização, especialmente em consequência
da Segunda Guerra Mundial, foi observado um rápido crescimento no desenvolvimento de
novos antibióticos e o consumo generalizado dessas substâncias (Guimarães et al., 2010).
Entre 1940 e 1960, vários antibióticos foram descobertos, pela triagem de produtos naturais
microbianos, sendo a maioria deles eficazes para o tratamento de bactérias Gram-positivas:
betalactâmicos (cefalosporina), aminoglicosídeos (estreptomicina), tetraciclinas
(clortetraciclina), macrolídeos (eritromicina), peptídeos (vancomicina) e outros (cloranfenicol,
rifamicina, clindamicina e polimixina). Neste período, apenas três derivados sintéticos foram
introduzidos no mercado: isoniazida, trimetoprima e metronidazol. Entre 1960 e 1980, foram
introduzidos no mercado antibióticos semi-sintéticos eficazes para o tratamento de patógenos
Gram-positivos e Gram-negativos, análogos aos antibióticos naturais já existentes. Entre 1980
e 2000, a genômica foi uma das principais ferramentas utilizadas para a busca de novos
antibióticos. Houve, porém, uma redução dramática na identificação de novos protótipos
antibióticos, ao mesmo tempo em que ocorreu um aumento na incidência de resistência
12
bacteriana. Este período é marcado pela modificação do mercado de antibióticos e pela
introdução da classe das fluoroquinolonas sintéticas na metade dos anos 80, desenvolvidas a
partir do ácido nalidíxico. Alguns antibióticos baseados em protótipos naturais, como o
imipenem e análogos da eritromicina também foram introduzidos neste período (Guimarães et
al., 2010).
A partir de 2000, poucos antibióticos foram introduzidos na terapêutica
antimicrobiana. Em 2001, apenas um antibiótico de origem sintética da classe das
oxazolidinonas foi introduzido no mercado farmacêutico, a linezolida (Guimarães et al.,
2010). Atualmente, os programas direcionados ao estudo de novos antibióticos oriundos de
fontes naturais têm sido retomados em algumas indústrias farmacêuticas como alternativa aos
produtos sintéticos amplamente utilizados. Com o grande advento de pesquisas centradas no
modo de ação pelo qual as culturas desenvolvem resistência, foi constatado que tal evento é
altamente estimulado quando as culturas se desenvolvem em um modo diferenciado de
colonização, denominado biofilme.
2.2- FONTES DE CONTAMINAÇÃO E DISPERSÃO MICROBIANA
Quando fixos a um suporte, os microrganismos se agregam e formam biofilmes, o que
lhes confere a capacidade para estabelecer-se em variados locais e em inóspitas condições
nutricionais, além de facilitar a comunicação intercelular através de moléculas sinalizadoras
de níveis populacionais e de nutrientes, que lhes garante maior chance de viabilidade. A
estrutura unificadora e protetora dos biofilmes é denominada matriz extracelular (EPS,
Extracellular Polymeric Substances), de composição heterogênea e complexa. Ainda que, de
uma maneira geral, sejam os polissacarídeos a prevalecer, a EPS pode também ser constituída
por proteínas, ácidos nucléicos, glicoproteínas e fosfolipídios (Vieira, 1995). Estudos
mostraram que a EPS promove a adesão, proliferação e diferenciação celular, além de poder
conter regiões hidrofílicas e hidrofóbicas em sua estrutura química, permitindo o depósito
microbiano em diversas superfícies (Tsuneda et al., 2003). A penetração de substâncias
através destas estruturas se dá através de canais preenchidos pelo meio líquido circundante,
que facilitam a transferência de massa (Xavier, 2002).
Os biofilmes são formados a partir de uma sequência de eventos, de acordo com as
etapas de adesão e de adaptação dos microrganismos ao suporte (Figura 1). A primeira etapa
13
envolvida na formação de um biofilme, a adesão dos colonizadores primários, é
fundamentalmente controlada por interações iônicas negativas e/ou positivas entre a parede
celular dos microrganismos e as macromoléculas do filme condicionador que se forma a partir
de resíduos do próprio ambiente. Apêndices celulares externos, como flagelos, fímbrias e pílis
também desempenham papel importante na adesão celular inicial, além de formarem pontes
entre as células e a superfície (Christensen e Characklis, 1990). A adesão irreversível é quase
sempre mediada pelos polímeros extracelulares. Após o contato com a superfície e a
instalação microbiana, ocorre a fase de crescimento e divisão celular. Assim, ocorre a
consolidação do material extracelular (biofilme propriamente dito), fazendo com que as
ligações entre as células e a superfície se fortaleçam (Figura 2). A partir de então, dentro de
dias a meses, a adesão de outros microrganismos é facilitada, e ocorre a liberação de novos
colonizadores que se desprendem do biofilme maduro. Os microrganismos liberados formarão
novos biofilmes, caracterizando um ciclo de contaminações (Christensen e Characklis, 1990).
Estima-se que mais de 90% dos microrganismos existentes esteja sob a forma de
biofilmes (Costerton et al., 1987) e que praticamente não há nenhuma superfície que não
possa ser colonizada por microrganismos. Machado (2005) avaliou o efeito de um produto
antimicrobiano com ação surfactante (cloreto de benzalcônio) em biofilmes de Pseudomonas
fluorescens formados sobre aço inoxidável e silicone. Em ambos os materiais houve a
formação de um consistente biofilme, mas na superfície do aço a inativação microbiana foi
mais difícil que sobre o silicone.
Figura 1: Estrutura típica de um biofilme e principais etapas de formação.
Microrganismos em suspensão
(células planctônicas)
Adesão celular em superfície
(células sésseis)
Superfície
Fluxo de água
Formação de EPS: desenvolvimento de biofilme
Dispersão de biomassa
contaminante
14
(a) (b)
Figura 2: Fotomicrografia ilustrativa das diferenças morfológicas entre uma mesma cultura
da bactéria Staphylococcus sp. (a) sob a forma planctônica, em condições ambientais
favoráveis; (b) em condições inóspitas de crescimento, favorecendo a formação de biofilme
(fonte: Center for Biofilm Engineering, 2003).
A maioria dos biofilmes comumente encontrados em ambientes diversos é composta
por associações de diferentes grupos e espécies microbianas (Figura 3). Muitos estudos têm
demonstrado que não há relação direta entre o efeito do agente químico para erradicar as
células livres e para erradicar o biofilme formado, já que além das diferenças fisiológicas e
estruturais entre ambas as formas de vida dos microrganismos, as células aderidas em um
dado local podem não ser as mesmas encontradas na forma dispersa (Capelletti, 2006). Desta
forma, em sistemas industriais, por exemplo, a troca periódica de produtos antimicrobianos se
faz necessária para cada situação específica, onerando e dificultando a manutenção do
controle microbiológico dos processos. Tal situação se complica quando a ocorrência envolve
a área da saúde, com implicações na vida humana. A concentração de microbicida empregada
para eliminar as células planctônicas em relação às mesmas na forma de biofilmes pode
chegar a até 1.000 vezes a empregada usualmente, ou até mesmo ser necessária a substituição
do agente antimicrobiano para que o biofilme seja efetivamente erradicado (Costerton et al.,
1987; Lucchesi et al., 2006; Capelletti, 2006).
Portanto, a prevenção do desenvolvimento de biofilmes é especialmente importante,
pois a resistência intrínseca dos biofilmes a sanitizantes é claramente demonstrada em
diversos estudos, como os efetuados com células não aderidas de Listeria monocytogenes, em
que as mesmas foram eliminadas após 30 segundos de contato com o sanitizante cloreto de
benzalcônio, enquanto as células aderidas resistiram ao mesmo tratamento por 20 minutos
15
(Frank e Kofi, 1990). Outros microrganismos, como Pseudomonas fluorescens e Yersinia
enterocolitica, quando na presença de hipoclorito de sódio, sofreram redução celular de 5 log
quando em suspensão, mas as células aderidas foram atingidas no máximo em 3 log
(Mosteller e Bishop, 1993).
Figura 3: Microscopia eletrônica de varredura de parte de uma placa bacteriana dentária
típica, mostrando a associação entre Fusobacterium sp e Streptococcus sp (Bos et al., 1999).
Vários são os mecanismos pelos quais os microrganismos desenvolvem resistência a
tratamentos antimicrobianos. Pode, por exemplo, ocorrer a inativação ou modificação da
substância. Como exemplo desta situação, tem-se a desativação enzimática da penicilina por
certas bactérias resistentes, pela produção de β-lactamases. Também, pode haver alteração
física do sítio de interação com antimicrobianos, como em Staphylococcus sp resistente à
meticilina (MRSA) e em outras bactérias resistentes à penicilina. Em alguns casos observam-
se modificações da via metabólica celular em que, por exemplo, bactérias resistentes a
tratamento com sulfonamida deixam de necessitar de ácido para-aminobenzóico (PABA) para
a síntese de ácido fólico. Finalmente, pode ocorrer redução do acúmulo intracelular de agente
ativo por diminuição da permeabilidade e/ou aumento do efluxo na superfície celular. Os
genes que codificam estes mecanismos de defesa podem ser transmitidos para a próxima
geração e entre microrganismos de diferentes estirpes, principalmente quando a densidade
microbiana é elevada, como nos biofilmes (Davison, 1999).
Um dos principais fatores envolvidos na persistência de patógenos é o uso
inapropriado de sanitizantes (tipo e concentração ineficazes), que pode gerar cepas tolerantes
16
a este tratamento no sistema de água, no qual os contaminantes voltam a se proliferar,
causando uma falsa segurança de desinfecção. O mesmo princípio se aplica quando do uso
indiscriminado de antibióticos, favorecendo a posterior resistência microbiana a diversos
tratamentos. Um agravante a este fato é que, na forma de biofilmes os microrganismos
interagem através de substâncias que são secretadas e que possibilitam às células a
informação sensitiva necessária para a modulação da expressão gênica e de metabólitos para a
adaptação perante diversos fatores, tais como o controle do nível populacional para garantia
de nutrientes e permanência da comunidade microbiana (Camilli e Bassler, 2006). Bactérias
Gram-positivas geralmente secretam peptídios, enquanto a maioria das Gram-negativas tem
como metabólito principal moléculas chamadas acil-homosserino lactonas.
Assim, muitas
bactérias patogênicas são capazes de transitar entre a vida no meio ambiente e no organismo
humano, tendo habilidade para se adaptar a alterações súbitas na disponibilidade de nutrientes
e nas respostas do sistema imune do hospedeiro, e a formação de biofilme é um exemplo
relevante de adaptação microbiana (Jefferson, 2004).
2.3- CONTAMINAÇÕES EM AMBIENTES CRÍTICOS E AQUISIÇÃO DE INFECÇÕES
Durante séculos, as pessoas que adoeciam eram isoladas em locais úmidos, sem luz
natural, e sem cuidados higiênicos e dietéticos. Não raro, um paciente admitido por uma
enfermidade degenerativa, ou lesão externa, acabava falecendo por outra, infecciosa, como a
cólera, febre tifóide ou por supurações. Porém, a aquisição de novas doenças e o óbito eram
associados a crenças e superstições. No decorrer do tempo, mesmo que ainda não se
dispusesse dos conhecimentos de microbiologia, foi-se percebendo a associação entre
hospitalização e infecção. As transformações ocorridas, sobretudo no século XVIII,
possibilitaram que os hospitais exercessem uma ação terapêutica mais efetiva, com o
questionamento sobre todas as condições que favoreciam o contágio e com a mudança da
concepção de hospital como um local onde as pessoas eram internadas para serem excluídas
do convívio social, para um local de cura e medicação (Angerami e Andrade, 1999).
Ignaz Philipp Semmelweis, médico obstetra de origem húngara, é considerado o
precursor no controle de infecções hospitalares. Em meados de 1840, observou uma diferença
no número de casos de infecções adquiridas pós-parto (puerperal) em duas clínicas de um
hospital em Viena. Na primeira clínica, as gestantes eram examinadas por médicos que
17
também estavam presentes constantemente na sala de necropsias, enquanto na segunda
clínica, os atendimentos eram realizados por parteiras e o número de infecções era
substancialmente menor. Certa vez, um dos médicos foi acidentalmente ferido por um bisturi,
durante a realização de uma necropsia e adquiriu uma infecção similar à das puérperas,
levando Semmelweis a concluir que ele havia sido contaminado pela mesma “matéria”, já que
nesta época o conceito sobre a existência de microrganismos ainda não era bem estabelecido.
Tal como o bisturi da dissecação introduziu o agente infeccioso na corrente sanguínea do
patologista, as mãos contaminadas dos médicos o carregavam da sala de necropsia para as
mulheres durante os exames e o parto. Então, em maio de 1847 Semmelweis tornou
compulsório para todos os profissionais do hospital a lavagem das mãos com uma solução
clorada, o que reduziu drasticamente a mortalidade por este tipo de infecção, de 12% para
1,9% (Veiga e Padoveze, 2003).
A utilização de medicamentos antimicrobianos sistêmicos em larga escala, iniciada na
década de 1940, possibilitou o tratamento das doenças infecciosas e a redução das infecções
em pacientes hospitalizados. Hospitais militares se depararam com Streptoccoccus pyogenes
resistentes à sulfonamida, medicamento muito utilizado em feridas. Da mesma forma, a
resistência da Mycobacterium tuberculosis à estreptomicina se deu pouco depois da
introdução deste medicamento no mercado. Aturdida pelas infecções por Staphylococcus
aureus nos hospitais, a comunidade médica recebeu com grande entusiasmo os novos agentes
antimicrobianos (Santos, 2006). Logo após o início do uso da penicilina, os hospitais se
confrontaram com a emergência da resistência dos Staphylococcus aureus a este
medicamento. Em meados de 1950, surtos de infecções por estafilococos resistentes foram
identificados em praticamente todo o mundo, caracterizando assim o fenômeno da resistência
como uma pandemia. Mais tarde, na década de 1960, novos microrganismos, especialmente
as bactérias Gram-negativas e os fungos, surgem como agentes das infecções nos hospitais
(Santos, 2006).
Paradoxalmente, a resistência microbiana foi um dos principais estímulos para que os
profissionais de saúde e administradores hospitalares reconhecessem a necessidade de
medidas de controle e prevenção das infecções adquiridas durante a hospitalização. Em
ambientes cuja contaminação tem impacto direto na saúde humana, a criticidade de controle
deve ser ainda maior. Infecções nosocomiais oriundas da água podem ser transmitidas por
contato, ingestão ou aspiração. Há casos em que intervenções severas são necessárias,
restando apenas a restrição do uso da água como medida para prevenir ou interromper o
18
processo de infecção em pacientes de alto risco (Squier et al., 2000). Por exemplo, o guia de
diretrizes da área de saúde na União Européia recomenda que a água de torneira para uso em
clínicas odontológicas apresente contagem microbiana abaixo de 100 unidades formadoras de
colônia por mililitro (<102 UFC/mL) a 22°C (Karpay et al., 1999). O mesmo índice é
aplicável para água de diálise, segundo o Centers for Disease Control and Prevention, nos
Estados Unidos (Sehulster e Chinn, 2003).
Em um levantamento realizado por Rogues et al. (2007) em uma unidade de terapia
intensiva de um hospital na França, detectou-se a bactéria P. aeruginosa em
aproximadamente 10% das águas de torneira amostradas (dentre 657 coletas). A porcentagem
de transmissão deste contaminante às mãos dos profissionais de saúde foi de 14% e a mesma
cepa foi detectada em 38 pacientes.
A água está presente em praticamente todas as partes da instituição hospitalar. Dentre
as áreas de maior consumo destacam-se os geradores de vapor, equipamentos de hemodiálise,
os setores de análises laboratoriais, de processamento de materiais cirúrgicos, o sistema de
condicionamento de ar e as lavanderias (Anaissie et al., 2002). Os principais reservatórios de
patógenos em ambientes clínicos relatados em literatura são a água potável, a água para
diálise, a água usada para lavagem de aparatos médicos, a utilizada em torneiras e chuveiros,
as linhas de água em clínicas odontológicas e em lavadores de olhos (Sehulster e Chinn,
2003).
Portanto, se o planejamento do sistema de distribuição de água não contemplar certas
precauções, como a minimização de cantos para evitar acúmulo de água estagnada, este pode
transformar-se em importante veiculador de patógenos. A água disponibilizada através de
torneiras tem sido correlacionada com incidência de bacteremias, infecções em pacientes
queimados e em áreas cirúrgicas (Pegues et al., 1994). A habilidade de bactérias Gram-
negativas de sobreviver sob elevada umidade por longos períodos explica sua comum
ocorrência nestes ambientes (Rutala e Weber; 1997). A contaminação é, então, transferida
quando as mãos se tornam contaminadas durante a lavagem (Pegues et al., 1994).
Um estudo envolvendo a desinfecção em um hospital italiano contaminado com
Legionella pneumophila foi realizado aplicando-se ácido peracético em circulação nas
tubulações do sistema de água (Ditommaso et al., 2005). Testes in vitro mostraram que a
concentração efetiva para a eliminação do contaminante presente no sistema foi de 50 ppm
19
após 5 minutos de contato. Com base neste resultado, foi realizado um processo de
desinfecção em quatro etapas. Na primeira etapa fez-se a desinfecção com 50 ppm de ácido
peracético por 30 minutos. Na segunda, o tratamento foi repetido semanalmente ao longo de
três semanas; na terceira, a desinfecção foi realizada nas mesmas condições de tempo de
contato e concentração de ácido peracético, com repetição mensal do procedimento por cinco
meses. Finalmente, na fase 4, foram adicionadas 1.000 ppm de ácido peracético, com tempo
de contato de também 30 minutos. Apesar das múltiplas etapas de tratamento efetuadas, foi
detectado retorno do desenvolvimento da bactéria 30 dias após a desinfecção, em
concentração microbiana superior à inicial ao tratamento, devido à permanência de biofilmes
no interior das tubulações de água, que protegeram os microrganismos contra o agente
desinfetante.
A transferência de patógenos da água a instrumentais médicos é uma rota de difícil
constatação e que pode levar a um incorreto diagnóstico da infecção. Dados fornecidos por
um estudo sobre infecções nosocomiais relacionadas à água (Pall Corporation, 2006)
mostraram que dentre os aparatos comumente envolvidos na transmissão destacaram-se os
nebulizadores e as torneiras, debilitando pacientes com problemas respiratórios, queimados,
neonatos, os sob recuperação de cirurgia cardíaca e neurocirurgia, bem como idosos, que são
muito vulneráveis. Segundo o CDC dos Estados Unidos, recomenda-se que para a lavagem de
materiais médicos, tais como endoscópios e broncoscópios, deve-se utilizar água de elevado
grau de qualidade, a fim de se evitar a proliferação microbiana e a formação de biofilmes no
interior destes aparatos Sehulster e Chinn (2003).
De acordo com informações disponibilizadas pelo Ministério da Saúde (1995), a
provisão ideal de reservatórios de água deve considerar os tanques para água potável de modo
a permitir o uso de unidades alternativas, enquanto um tanque estiver interditado para reparos
ou limpeza, e outros dois, totalmente segregados dos de água potável, destinados a suprir água
para descarga de bacias sanitárias e similares, abastecidas geralmente com água de poço,
proveniente de mina ou mesmo de chuva. A segregação destas caixas desempenha papel
importante na prevenção de contaminação da rede de água. É sabido que, no sistema de
válvula flexível, a água, quando descarregada em bacia sanitária cheia (por entupimento ou
problemas mecânicos) acaba por criar uma variação de pressão negativa no duto de
alimentação da bacia, acarretando e, consequentemente, aspiração e ascensão de água poluída,
com possibilidade de transmitir contaminantes à caixa de água. Esta transmissão pode atingir
aparelhos como lavatórios, chuveiros e torneiras de lavagem, quando alimentados pelo mesmo
20
duto de descida que supre a bacia sanitária. Todavia, a efetiva contaminação por esta rota
carece ser melhor estudada. Neste caso, a aplicação de medidas, como as propostas no
presente estudo, utilizando membranas como barreira nas saídas de água, pode impedir a
disseminação e contaminação cruzada de patógenos, principalmente em locais susceptíveis ao
desenvolvimento microbiano, tais como chuveiros e torneiras, que podem ser uma fonte
significativa de microrganismos causadores de infecções, prejudicando principalmente a
saúde de indivíduos com o sistema imunológico debilitado.
Ao contrário do que se supõe na crença popular, obviamente a água de chuveiro não é
suficientemente quente para debelar a transmissão de microrganismos. A maioria da
microbiota encontrada nestes aparatos é composta por grupos comumente encontrados em
água e solo, e que encontram condições favoráveis para a formação de biofilmes (Feazel et
al., 2009). Um chuveiro pode constituir-se em um reservatório de bactérias, como é o caso da
Legionella, que integra o grupo das chamadas “water bacteria”. Com o aquecimento da água
do chuveiro, esta bactéria se beneficia do vapor d´água que se forma para se disseminar,
podendo facilmente atingir o aparelho respiratório do paciente. Além disto, drenos e ralos
costumam ocasionar problemas aos hospitais. O seu transbordamento pode levar agentes
patogênicos a aflorar e a contaminar os pisos (Ministério da Saúde, 1995).
Em 2001, de forma pioneira, foi realizado um estudo sobre a rota de transmissão de
Aspergillus abrangendo chuveiros e torneiras hospitalares (Warris et al., 2001). Foram
analisadas 100 amostras deste fungo, isoladas do ar, da água e de pacientes de um hospital na
Noruega. Dentre as amostras analisadas, 55 foram coletadas do sistema de água (51%
presente em torneiras, 44% na tubulação principal e 5% em chuveiros), 25 foram obtidas do ar
e 20 oriundas de treze pacientes imunodeprimidos. As amostras do fungo originadas da água
foram geneticamente distintas das amostras coletadas no ar. Em nove dos treze pacientes
avaliados, foram detectadas cepas de Aspergillus geneticamente similares àquelas encontradas
no sistema de água.
Um relevante fato foi associado com o desenvolvimento de cianobactérias (algas
azuis) em reservatórios de água potável, que culminou em uma síndrome conhecida como
pneumonia tóxica, em uma cidade na Escandinávia. A manifestação de sintomas como febre e
sinais de falência relacionados ao trato respiratório ocorreram de 1,5 a 6 horas após pessoas
banharem-se habitualmente. Endotoxinas dispersas nos aerossóis gerados durante o banho
foram relatadas como provável agente (Annadotter et al., 2005). Em muitos casos, reações
21
pirogênicas foram também reportadas como decorrentes de lipopolissacarídeos microbianos
(EPS) formados por biofilmes (Sehulster e Chinn, 2003). No Brasil, em 1996, um importante
surto de infecção hospitalar transmitido pela água ocorreu na cidade de Caruaru, em
Pernambuco, afetando 131 pacientes renais crônicos submetidos à hemodiálise. Destes, 46
faleceram por intoxicação pela toxina microcistina produzida por algas ali presentes (Agência
Fapesp, 1996).
Assim, nestes e em diversos outros casos em que haja potencial de disseminação de
contaminantes, é de extrema relevância a diminuição da carga microbiana à qual os
indivíduos possam se expor, podendo se fazer necessária a intervenção direta na rede de
distribuição ou até mesmo a restrição do uso da água oriunda desta fonte.
Com o uso de modernos métodos moleculares hoje utilizados para a detecção de
bactérias em água, nota-se que o significativo nível e tipo de contaminação microbiana
residente denota que a água havia sido por muito tempo subestimada na qualidade de ser fonte
de infecções no âmbito hospitalar.
Segundo a Anvisa (Agência Nacional de Vigilância Sanitária), os fungos são
responsáveis por aproximadamente 8% das infecções hospitalares totais, sendo o gênero
Aspergillus o principal causador de infecções em pacientes imunocomprometidos, em especial
as espécies fumigatus e flavus, levando à morte aproximadamente metade dos acometidos
(Anvisa, 2004). Porém, são muitos os patógenos que podem acometer pacientes debilitados,
tais como: Escherichia coli, Klebsiella sp, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae,
Nocardia sp, Mycobacterium, Haemophylus influenzae, Neisseria meningitidis, dentre outros
(Nucci e Maiolino, 2000). Alguns microrganismos merecem destaque, como a bactéria
Pseudomonas aeruginosa, que está frequentemente envolvida em enfermidades humanas,
tanto em número quanto em tipos de infecção, e é encontrada em diferentes regiões do corpo e
ambiente por ser facilmente adaptável a diferentes condições adversas. Esta bactéria está
onipresente na água e tem sido responsável por taxas de mortalidade em torno de 30% entre
pacientes com pneumonia e septicemia e de 60% em queimados (Angelbeck, 2004). Já a
bactéria Legionella pneumophila, pode causar pneumonia tanto durante a internação
hospitalar (por contaminação da água e transmissão pelo ar) quanto no ambiente extra-
hospitalar, e a Serratia marcescens é geralmente associada à pneumonia e septicemia em
pacientes que recebem quimioterapia. Este último microrganismo tem crescimento lento, com
propriedades invasoras e tendência a resistir a muitos dos antibióticos utilizados na atualidade
22
(Koneman et al., 2001). Adicionalmente, as metilobactérias, caracterizadas por apresentarem
crescimento lento e resistência a tratamento à base de cloro, são descritas como importantes
patógenos transmitidos pela água (Hiraishi et al., 1995). Destacam-se também as
micobactérias, que possuem capacidade de sobrevivência em temperaturas extremas, como
em máquinas de gelo e em água aquecida, e a espécie intracellulare que pode persistir por
mais de um ano em água destilada. Outras bactérias comumente encontradas em água potável
e de grande relevância quanto à incidência de infecções, incluem: Stenotrophomonas
maltophilia, Aeromonas hydrophila, Acinetobacter spp., Enterobacter spp., Flavobacterium
spp. e Burkholderia cepacia (Angelbeck et al., 2006).
Levando-se em conta a elevada prevalência de contaminantes presentes na água,
variadas alternativas complementares ao uso de agentes químicos estão sendo consideradas
em muitos hospitais no exterior, particularmente os europeus. Na Alemanha, um crescente
número de filtros descartáveis são instalados em torneiras e chuveiros para a proteção de
pacientes, de modo a evitar a proliferação de biofilmes, pois acima de 40% das infecções por
Pseudomonas sp em unidades de terapia intensiva foram associadas à água. A adoção da
instalação destes filtros também foi motivada por ter sido considerada uma alternativa
bastante econômica, levando-se em conta a compensação pelos gastos minimizados com a
reabilitação dos pacientes acometidos e de medidas para tratamento do foco de contaminação.
Foi constatado que a instalação de sete filtros em um hospital reduziram os casos de infecção,
poupando aproximadamente 82% dos dispêndios normalmente gastos (Reiter, 2004).
Também, é bastante comum a ocorrência da transmissão de contaminantes por via
aérea, em que microrganismos geralmente inócuos podem ser causadores de infecções.
Microrganismos carreados por este meio podem se dispersar amplamente por correntes de ar e
ser inalados por um hospedeiro susceptível. A viabilidade de patógenos presentes no ar é
proporcionada por gotículas de água ou por partículas de sujeira, que ficam suspensas no ar
por longo período. Supondo-se que no ar de um dado ambiente a concentração microbiana
seja de 1.000 unidades formadoras de colônia por metro cúbico, e que um indivíduo
normalmente respira 30 litros deste ar por minuto, a carga de microrganismos inalados seria
de 1.800 unidades formadoras de colônia a cada hora, enquanto que um sistema filtrante
convencional com tamanho de poro médio de 0,5 m processa em torno de 90 unidades
formadoras de colônia por hora (Lee et al., 2004).
Uma análise sobre a magnitude das infecções hospitalares no Brasil foi conduzida pela
23
coordenação de controle de infecção hospitalar do Ministério da Saúde, em que foram
envolvidos 99 hospitais situados nas capitais brasileiras, totalizando 8.624 pacientes
(Ministério de Saúde, 1995). O tempo médio de internação dos pacientes acometidos por
infecção hospitalar foi de 21,7 dias e a taxa de infecção foi de 13%, sendo prevalentes as do
trato respiratório (28%), as cirúrgicas (15%), as de pele (15%), urinárias (11%) e outras
(31%). A partir dos dados obtidos, destaca-se a importância do controle de contaminantes
dispersos no ar, pois infecções que acometem a via respiratória podem contemplar, mesmo
que indiretamente, patógenos gerados por aerossóis oriundos de água com a qualidade
microbiológica comprometida.
Em 2004 foi realizada uma pesquisa nacional para um melhor posicionamento sobre a
existência de comissões para controle de infecção hospitalar, bem como de laboratórios
microbiológicos em hospitais brasileiros (Anvisa, 2004). De acordo com os dados divulgados,
apenas 4,3% das instituições avaliadas na esfera nacional contam com o respaldo de uma
comissão municipal de controle de infecção hospitalar. Além disso, pode-se inferir que a
indisponibilidade de laboratórios de microbiologia, verificada em aproximadamente 40% dos
hospitais brasileiros inqueridos, compromete a adoção de políticas para o uso racional de
antimicrobianos e pacientes com doenças infecciosas tendem a ficar sob maior risco de
insucesso terapêutico. Foi constatado que medidas efetivas de vigilância com
acompanhamento, avaliação e divulgação de indicadores necessitam ser aprimoradas. Neste
mesmo estudo, a lavagem das mãos foi apontada como um dos itens de maior relevância
vinculados ao controle de infecções, mas, no entanto, a água não foi reconhecida como
potencial fonte de contaminantes. A lavagem das mãos é uma medida simples, pouco
dispendiosa e uma das mais importantes para a prevenção de disseminação de patógenos no
ambiente hospitalar (El-Far e Richtmann, 2001), com já mencionado e bem colocado por
Semmelweis em meados do século XIX, porém a água deve ser de boa qualidade
microbiológica de modo a evitar o efeito contrário ao desejado, com a dispersão de patógenos.
Atualmente, as diversas classes de antibióticos disponíveis possibilitam tratar o
mesmo agente infeccioso com vários esquemas terapêuticos. Porém, estes medicamentos
escondem silenciosamente a possibilidade de induzir a resistência bacteriana. Tal ocorrência
começou a ser reportada em 1942 com o uso da penicilina, que foi o primeiro antibiótico de
uso clínico. No início da década de 50, cerca de 80% das cepas da bactéria Staphylococcus
aureus já apresentavam resistência a este medicamento. No entanto, na década de 60, a
meticilina surgiu como uma alternativa ao tratamento de infecções por S. aureus resistentes e,
24
no mesmo ano do início de seu uso já foram reportados casos de cepas também resistentes
(Multi Resistant S. aureus - MRSA) (El-Far e Richtmann, 2001).
Um estudo realizado pela Rede Nacional de Monitoramento da Resistência
Microbiana em Serviços de Saúde, vinculada à Agência Nacional de Vigilância Sanitária
(Anvisa, 2007) apresentou notificações com o perfil de sensibilidade dos principais
microrganismos isolados por 64 hospitais, dentre as quais foi evidenciado que, em média,
apenas 58% apresentaram susceptibilidade a ao menos um dos nove principais
antimicrobianos utilizados em terapia convencional (amicacina, gentamicina, levofloxacina,
ciprofloxacina, meropenem, imipenem, cefepime, ceftazidima e tazobactam).
Segundo informações da Organização Mundial da Saúde, divulgadas pelo Conselho
Regional de Farmácia (CRF-SP, 2011), em 2010 foram registrados aproximadamente 440 mil
casos de tuberculose resistente a diferentes tipos de medicamentos, além de 150 mil óbitos.
Uma medida nacional importante para a minimização de eventos relacionados à resistência
microbiana foi implementada pela Anvisa em 2010 pela Resolução RDC 44, na qual se
implementou o controle obrigatório de receita médica para a dispensação de medicamentos à
base de substâncias classificadas como antimicrobianos (CRF-SP, 2011).
Da mesma forma, vê-se a necessidade de maior estudo, controle e regulamentação
para o uso seguro de biocidas em vários outros ambientes, incluindo-se os relacionados ao
segmento industrial, que também tem potencial favorável à geração de contaminantes
resistentes, capazes de afetar a saúde ocupacional de trabalhadores.
2.4- CONTROLE DE BIOFILMES EM SISTEMAS DE DISTRIBUIÇÃO DE ÁGUA
E IMPACTOS DA CONTAMINAÇÃO PARA A INDÚSTRIA
Como mencionado previamente, os biofilmes podem ser encontrados nos mais
diversos sistemas, orgânicos ou inorgânicos, em ambientes naturais ou artificiais, em locais
mais inspecionados, como hospitais, e com grande incidência também em indústrias.
De maneira desejada e controlada, os biofilmes também podem ser úteis em alguns
processos industriais, como no tratamento de efluentes, produção de biocombustíveis,
biorremediação e produção de ativos e aditivos para aplicações químicas e alimentícias.
Entretanto, quando se trata de contaminação microbiana por biofilmes, principalmente em
ambientes de processamento de alimentos e de cosméticos, esta pode representar um sério
25
risco à saúde humana, enquanto na indústria química em geral pode resultar em biocorrosão,
contaminação de produtos, impedimento de funcionamento mecânico e de transferência de
calor (Coetser & Cloete, 2005).
Os principais usos da água na indústria são para geração de vapor (água de caldeiras),
água de resfriamento, água de processo (matéria-prima) e para uso sanitário. As
consequências de um tratamento ineficaz da água utilizada têm impacto tanto na água que
circula na empresa quanto nos efluentes gerados.
Um sistema de distribuição de água ineficientemente tratado atua como um potencial
reservatório de patógenos e apresenta características particulares de acordo com seu local de
instalação (Feazel et al., 2009). Em condições ótimas de desenvolvimento, uma célula
bacteriana se divide em duas células-filhas, em média, a cada 20 minutos aproximadamente,
ou seja, uma única bactéria pode gerar mais de 2 milhões de células em oito horas. Além
disso, mesmo pequenas quantidades de substrato podem suprir a necessidade nutricional dos
contaminantes, que conseguem manter sua viabilidade nestes sistemas. Ainda que somente
uma parte por bilhão de matéria orgânica esteja presente em 1 mL de água, esta pequena
quantidade possibilita o crescimento de aproximadamente 9.500 bactérias (Dreeszen, 2003).
Por exemplo, segmentos de tubulações em que a água tende a estagnar, propiciam ótimas
condições de crescimento para patógenos (Figura 4).
Um estudo sobre adesão microbiana realizado por Rosenberg e Gutnick (1980)
demonstrou que bactérias apresentam a capacidade de alterar o grau de hidrofilicidade ou
hidrofobicidade de sua superfície celular. O aumento da hidrofobicidade favorece a adesão de
células a superfícies e a formação de biofilmes, a fim de garantir a colonização de
contaminantes em ambientes com cisalhamento erosivo, como em sistemas de distribuição de
água (Leff et al., 1994).
No campo industrial, estratégias para prevenir e controlar a formação de biofilme
têm uso frequente em sistemas de osmose reversa, por exemplo, pelo projeto otimizado dos
sistemas, como pela introdução de modificações no processo de polimerização e mesmo na
seleção da estrutura química do polímero, seja pela modificação dos monômeros constituintes
ou pela inserção de moléculas ou componentes com propriedades de interesse, como íons e
nanopartículas, dentre outros (Ben-Sasson et al, 2014; Kang & Cao, 2012). A incrustação
biológica na forma de biofilmes ainda é o principal desafio na tecnologia de dessalinização
26
por membranas. As dificuldades se encontram principalmente na capacidade das bactérias de
formarem biofilme mesmo sob condições extremas e à sensibilidade das membranas aos
biocidas menos onerosos, como os biocidas à base de cloro (Ben-Sasson et al., 2014). A
funcionalização das membranas de osmose reversa para o aumento de sua vida útil é um dos
mecanismos em voga atualmente, sendo mais mencionado o uso de nanopartículas de prata.
Entretanto, devido ao seu alto custo, muitas vezes estão sendo substituídas por partículas de
cobre, o que reduz o custo total em 99%. As nanopartículas de cobre podem facilmente ser
acopladas ao policátion polietilenamina, o qual irá interagir com as cargas negativas presentes
na superfície da membrana. Os resultados encontrados em alguns estudos demonstraram uma
redução variando de 66 a 99% no número de bactérias viáveis aderidas, tanto para Gram-
positivas quanto para Gram-negativas (Ben-Sasson et al., 2014).
Figura 4: Exemplos de pontos críticos e eventos favoráveis ao acúmulo de biofilme
microbiano em sistemas de distribuição de água (adaptada de Thor Brasil Ltda., 2008).
Como já explicitado, muitos são os fatores que podem favorecer a contaminação
microbiológica da água e culminar na formação de biofilmes. Atualmente, os métodos mais
utilizados para prevenir e controlar a contaminação microbiológica em superfícies podem ser
divididos basicamente em três categorias: procedimentos de limpeza mecânica, uso de agentes
sanitizantes e aplicação de revestimentos ou filmes antimicrobianos em materiais diversos. A
má utilização dos métodos de desinfecção estão entre os fatores mais problemáticos, pois
desta forma a eliminação do foco contaminante pode não ser obtida. Determinados produtos
disponíveis e suas técnicas de aplicação apresentam limitações de uso (Tabela 1), que devem
Fluxo água de entrada
Focos de acúmulo
de biofilme
Fluxo água de entrada
Ponto crítico 2:
Zona de estagnação
de água
Ponto crítico 4: Falta de procedimentos
de limpeza e sanitização
Ponto crítico 3: Falta de monitoramento periódico
da qualidade da água
Ponto crítico 1:
Contaminação
microbiana:
Água de entrada
Ponto crítico 5:
Contaminação microbiana
da água em circulação
Focos de acúmulo de
biofilme em tubulação e
aparatos
27
ser consideradas quando de sua seleção para cada tratamento específico. A maioria dos
agentes químicos, até mesmo em dosagem acima do usual, é incapaz de erradicar completa e
permanentemente os biofilmes instalados, que voltam a se desenvolver, inclusive com
potencial de adquirir resistência (Angelbeck et al., 2006).
Os problemas mais frequentes do mal uso de biocidas são a corrosão e suas
consequências, como os danos físicos e estruturais em equipamentos, aumento nos custos de
manutenção, entupimentos, perda de eficiência e ainda gerando o aumento na oferta de
nutrientes aos microrganismos. Os depósitos químicos e microbiológicos em um sistema de
resfriamento podem resultar na redução da eficiência de trocadores de calor, em função do
aumento da espessura média do equipamento. Estima-se que o aumento da espessura em
1 mm corresponda aproximadamente a 9% de perda. Estes depósitos costumam ser
controlados por meio de filtração, pelo controle do ciclo de concentração (purga), com o uso
de dispersantes e de biocidas (CRQ, 2009), o que, de certa forma, pode terminar por
contribuir com o agravamento do problema se estes ou seus resíduos se depositarem nos
equipamentos ou servirem de compostos nutritivos para os contaminantes remanescentes.
A adição de biocidas é, entretanto, a abordagem mais frequente no que tange ao uso de
produtos utilizados no tratamento antimicrobiano preventivo e corretivo. Para exercerem sua
função, os biocidas agem nos componentes celulares funcionais, principalmente na parede
celular, nos componentes da membrana citoplasmática e no citoplasma. O acesso a estes alvos
é determinado pela composição química e propriedades físico-químicas que cada biocida
apresenta, bem como pelas interações com o material extracelular, pela composição química e
morfologia das células presentes (Denyer e Stewart, 1998).
De acordo com seu caráter químico, os biocidas podem ser classificados em dois
grandes grupos (Ludensky, 2004): oxidantes (tais como ozônio, peróxido de hidrogênio,
compostos de cloro) e não-oxidantes (compostos sulfurados, estanho, isotiazolinonas, sais de
cobre, aldeídos, sais quaternários de amônio, dentre outros).
Embora apresentem diferenças químicas importantes, o modo primário de ação dos
biocidas oxidantes consiste em oxidar compostos constituintes das células microbianas,
enquanto os biocidas não-oxidantes, que englobam uma enorme variedade de compostos
orgânicos, exercem atividade antimicrobiana atuando sobre os microrganismos por
interferência em seu metabolismo e/ou pela desintegração da parede celular.
28
Tabela 1: Comparação entre as principais estratégias de desinfecção de água (adaptada de
Schindler, 2001).
Técnica de
desinfecção Vantagens Desvantagens
Fluxo de
água quente
- Não requer equipamento
especializado
- Desnecessário o uso de agentes
químicos
- Risco de queimaduras
- Danos às tubulações
- Dificuldade em atingir toda a área em
sistemas de distribuição complexos
Cloração
- Boa eficácia a curto prazo
- Atuação desinfetante bem
estabelecida e compreendida
- Verificação periódica do nível de cloro
presente
- Micobactérias e Legionella potencialmente
resistentes
- Ineficaz contra Cryptosporidium
- Odor, reações alérgicas e subprodutos
carcinogênicos (trihalometanos)
- Corrosivo
- Não permeia efetivamente em biofilmes
Ionização
(Cobre-Prata)
- Boa eficácia a curto e longo prazo
- Fácil instalação e manutenção
- Acumulação de íons dentro do
biofilme é considerada um benéfico
efeito prolongado
- Água deve conter baixa concentração de
sólidos dissolvidos
- Necessária rotina de manutenção
(semanalmente para o cobre e a cada dois
meses para a prata)
- pH elevado e baixa concentração de íons
afeta a eficácia
- Somente efetiva com fluxo de água quente
- Corrosivo (aço e tubulação galvanizada)
Luz Ultravioleta
- Fácil instalação
- Ação pronunciada em células
planctônicas
- Desnecessário o uso de agentes
químicos
- Formação de subprodutos não
significativa
- Muito efetivo contra protozoários,
bactérias, a maioria das vírus e
particularmente Cryptosporidium
- Fraco poder de penetração em biofilmes
- Frequente recolonização microbiana
- A água deve ser límpida para a efetividade
do tratamento
- Área de alcance e atuação limitada
- Efetividade é reduzida por alto fluxo de
água, presença de materiais orgânicos e
elevada carga microbiana
- Custo elevado
Ozonização
- Boa eficácia a curto prazo
- Destruição de micropoluentes
(pesticidas, componentes com odor
e sabor)
- Oxidante mais potente que o cloro
- Requer equipamento especializado, de
difícil instalação e manutenção
- Custo elevado
- Atuação somente no ponto de injeção
- Decomposição rápida do ozônio
- Questionável impacto sobre biofilmes
Cloraminação
- Formação de subprodutos não
significativa
- Gera menos sabor e odor que o
cloro
- Residual permeia biofilmes
- Atua em maior faixa de pH que o
cloro e Ionização (Cobre-Prata)
- Menos efetivo que o cloro
- Monocloramina pode causar anemia em
pacientes de hemodiálise
-Favorece o aumento de algumas espécies
microbianas (Micobactérias)
- Subprodutos do nitrogênio
- Uso geralmente limitado a estações de
tratamento
29
Apesar dos altos custos associados ao registro de novos biocidas, a busca por
componentes alternativos que demonstrem capacidade biocida ou biostática é uma
necessidade emergente do ponto de vista ecológico, de saúde ocupacional e econômica.
Pesquisadores da área tem como desafio desenvolver formulações que possam ser
implementadas em uma ampla diversidade de aplicações e que não apresentem demasiadas
restrições regulatórias globalmente.
Produtos do tipo oxidante ainda são muito utilizados em tratamento de água para uso
industrial e para consumo humano, a saber que: “água para consumo humano: água potável
destinada à ingestão, preparação e produção de alimentos e à higiene pessoal,
independentemente da sua origem” (Ministério da Saúde, 2011). Porém, sabe-se que em
condições variadas estes biocidas podem gerar subprodutos assimiláveis como nutrientes
pelos microrganismos, favorecendo ainda mais a persistência no sistema. Apesar de se
conhecer ainda muitos outros fatores desfavoráveis ao uso dos biocidas oxidantes, apenas
muito recentemente foi liberada a utilização de outros agentes desinfetantes, além do cloro,
para esta aplicação, pela Portaria 2914: “Art. 35. No caso do uso de ozônio ou radiação
ultravioleta como desinfetante, deverá ser adicionado cloro ou dióxido de cloro, de forma a
manter residual mínimo no sistema de distribuição (reservatório e rede), de acordo com as
disposições do art. 34 desta Portaria. Art. 36. Para a utilização de outro agente desinfetante,
além dos citados nesta Portaria, deve-se consultar o Ministério da Saúde, por intermédio da
SVS/MS” (Ministério da Saúde, 2011). Desta forma, abrem-se novos horizontes de pesquisa e
desenvolvimento para produtos alternativos que venham oferecer efetividade e maior
segurança ocupacional.
De modo geral, a concentração de cloro necessária para erradicar a maior parte dos
microrganismos presentes na água é de aproximadamente 0,3 mg/L. Porém, mesmo com a
adição de grandes quantidades de cloro livre em tubulações de água (4,3 mg/L), foi
constatado que alguns coliformes conseguem subsistir (LeChevallier et al., 1984). Tal fato
pode ser atribuído a alguns fatores de comum ocorrência: o cloro adicionado provavelmente
não atingiu todos os pontos da rede de distribuição em quantidade suficiente para sua atuação
ou houve carência de cloro resultante de sua reação com resquícios de matéria orgânica e/ou
produtos de corrosão pré-existentes, dentre outras possibilidades. Também, o desprendimento
de porções de biofilme para a água corrente como consequência da atuação de desinfetantes
pode servir como fonte de carbono orgânico facilmente assimilável para a manutenção de
microrganismos no sistema (LeChevallier et al., 1984).
30
Visto que os biofilmes formados sob condições naturais são de mais fácil controle que
os formados onde há presença de produtos antimicrobianos, em particular quando são
utilizados produtos à base de cloro (Baker e Dudley, 1998), o uso de biocidas deve ser
racionalizado e reconhecido como um importante mediador entre a manutenção da saúde e o
risco. Tendo-se como exemplo um sistema de tratamento de água industrial por osmose
reversa no qual se cessou a cloração, a frequência de procedimentos de limpeza e sanitização
pôde ser estendida de quinzenal para anual (Hamida e Moch, 1996).
Além dos aspectos supramencionados vinculados à efetividade, os biocidas também
podem desagregar biofilmes, permitindo a recolonização dos microrganismos em novas
superfícies (Parsek e Fuqua, 2004). Assim, materiais que evitem a formação de biofilmes se
mostram vantajosos. Para tanto, a prática mais adequada é a intervenção no processo de
adesão inicial entre as células e o material que constitui o suporte.
2.5- VIAS COMPLEMENTARES À DISPERSÃO DE CONTAMINAÇÕES PELA ÁGUA E
IMPACTO NA SAÚDE OCUPACIONAL
Conforme já discutido, os microrganismos representam a maior parcela de organismos
vivos na biota terrestre e habitam ambientes muito diversificados, mantendo-se em contato
direto e constante com os seres humanos. Embora uma fração significativa destes organismos
não seja maléfica a humanos, doenças oriundas de vírus, bactérias e fungos presentes no ar,
no solo ou na água, como já mencionado, são frequentemente observadas.
Ultimamente, maior atenção tem sido dada a contaminantes biológicos como fontes de
poluentes (Kalogerakis, 2005). Os microrganismos ou agentes biológicos que podem ser
dispersos através do ar e que têm potencial para afetar a saúde humana são definidos pela
Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos como bioaerossóis. As bactérias e fungos
transportados pelo ar são fontes bem conhecidas de alergias e podem ser toxigênicos e/ou
infecciosos. Enquanto somente organismos completos podem ser infecciosos, reações
alérgicas e tóxicas podem ser causadas por seus fragmentos e subprodutos, como endotoxinas
que são compostos de lipopolissacarídeos encontrados nas paredes das células de bactérias
Gram-negativas e que apresentam fortes propriedades inflamatórias. Existem ainda compostos
orgânicos voláteis microbianos e micotoxinas que provocam efeitos adversos na saúde
(Fabian, 2005). Surtos de infecção podem estar associados à contaminação de filtros de ar
condicionado por estes bioaerossóis. Os sistemas de ar condicionado podem albergar
31
bactérias, vírus e fungos que são capazes de sobreviver em ambientes secos por longos
períodos. De acordo com os padrões da OMS, mais da metade dos locais fechados como
empresas, escolas, cinemas, residências e até hospitais têm ar de má qualidade. Esse baixo
padrão de qualidade é causado principalmente, pela má higienização dos aparelhos de ar
condicionado e pela falta de controle sobre as possíveis fontes de contaminação.
Em ambientes fechados, o ar tipicamente apresenta em torno de 106 bactérias/m
3 e a
água de torneira, 107 bactérias/L, sendo verificado que 55% das bactérias e 80% dos fungos
presentes em domicílios nos Estados Unidos são passíveis de inalação (DeKoster e Thome,
1995). Um estudo demonstrou que a concentração de microrganismos no ar é aumentada em
áreas onde o uso da água é maior, o que reforça o conceito de transmissão dos patógenos da
água contaminada para o ar e para superfícies, que se tornam micronichos de liberação
constante no ambiente (Anaissie et al., 2002). A umidade presente em superfícies próximas a
locais onde se faz uso de água pode ser um indicador importante para auxiliar na prevenção
da instalação de contaminantes. Níveis de umidade acima de 20% após 72 horas de exposição
podem facilitar o desenvolvimento de microrganismos e sua disseminação (Sehulster e Chinn,
2003).
As doenças causadas pelo ar interno insalubre estão entre as principais causas de
afastamento do trabalho, tanto nos Estados Unidos quanto na Europa. A Organização Mundial
da Saúde contabilizou a contribuição de uma variedade de fatores de risco a doenças e
determinou que a poluição do ar interno é o oitavo colocado mais importante, sendo
responsável por 2,7% do conjunto de casos de doenças no mundo. Indivíduos de terceira
idade passam até 90% do seu tempo em ambientes fechados e os poluentes e microrganismos
contidos no ar desses ambientes podem ser tóxicos, principalmente para estes e demais
indivíduos sensivelmente suscetíveis (Quadros et al., 2009).
O desenvolvimento de técnicas para a redução de bioaerossóis teve início com a
purificação do ar de ambientes interiores a partir da década de 70. Desde então, o interesse
por este assunto tem crescido, uma vez que as pessoas normalmente passam cerca de 90% do
seu tempo em ambientes fechados, incluindo residências, escolas, escritórios, hospitais, ou
seja, todo tipo de ambiente não industrial (Jones, 1999). Doenças relacionadas com a
qualidade do ar de interiores são referidas pela OMS como Síndrome dos Edifícios Doentes,
tal sua importância e prevalência, decorrentes da urbanização e verticalização dos ambientes
internos. Em 1982, o Comitê Técnico da OMS relacionou este cenário com o conjunto dos
32
seguintes sintomas, com análise focada em trabalhadores de escritórios: dor de cabeça; fadiga;
letargia; prurido e ardor nos olhos, irritação de nariz e garganta; anormalidades na pele e falta
de concentração (WHO, 1982). No entanto, foi a partir dos anos 90 que esta síndrome tornou-
se um conceito comum na literatura científica, usado para descrever situações nas quais os
ocupantes de um determinado edifício experimentam efeitos adversos à saúde e ao conforto
(Brickus e Neto, 1999).
A qualidade do ar em escolas também tem causado interesse no mundo científico
devido ao longo tempo de permanência de crianças e jovens nesse tipo de ambiente. Baixa
ventilação, com pequena taxa de troca de ar, além da falta de manutenção e limpeza
insatisfatória das salas de aula, têm resultado em concentrações altas de dióxido de carbono e
poeira causando sintomas da Síndrome dos Edifícios Doentes. Hospitais e outros centros de
saúde são exemplos de ambiente complexos que requerem ventilação adequada para conforto
e controle das emissões que possam ser prejudiciais a pacientes, funcionários e visitante. A
qualidade do ar nesse tipo de ambiente é mais crítica do que em outros locais fechados,
devido ao aumento da susceptibilidade dos pacientes. Têm sido diagnosticados sintomas
semelhantes em funcionários de hospitais e centros de saúde em virtude da exposição a vários
agentes químicos e microbiológicos. Por causa destes fatores, a poluição de interiores é hoje
reconhecida como uma das maiores ameaças à saúde pública (WHO, 2000a). Para o
monitoramento ambiental e avaliação de interiores, a Anvisa regulamenta os seguintes
parâmetros: concentração do CO2 como indicador taxa de renovação do ar, temperatura e
umidade como indicadores de conforto térmico, concentração de partículas respiráveis em
suspensão como indicador de pureza do ar e número de colônias de fungos como indicadores
de contaminação microbiológica (Anvisa, 2003).
As doenças infecciosas ocupacionais podem ser atribuídas à exposição a uma atividade
laboral específica, tal como os trabalhadores da saúde ou a um grande aglomerado de pessoas
em um local de trabalho, tal como em escritórios. As doenças respiratórias podem ser
alérgicas ou não alérgicas, sendo a diminuição da capacidade pulmonar o efeito na saúde mais
associado com bioaerossóis. Com relação ao câncer, as micotoxinas são os carcinogênicos
biológicos ocupacionais não virais que estão mais claramente estabelecidos (Douwes et al.,
2003).
Em virtude da crescente preocupação com a qualidade do ar de ambientes fechados
climatizados artificialmente, o Ministério da Saúde aprovou a Portaria nº 3.523, em 28 de
33
agosto de 1998 que tem como objetivo minimizar o risco potencial à saúde dos usuários, em
face da permanência prolongada em ambientes climatizados. Essa portaria regulamenta a
definição de parâmetros físicos, químicos e biológicos, suas tolerâncias, métodos de controle
e pré-requisitos de projetos de instalação e execução de sistemas de climatização (Ministério
da Saúde, 1998).
No ano 2000, a Anvisa, com a Resolução RE nº 176, de 24 de outubro de 2000
(Anvisa, 2000) definiu padrões referenciais de qualidade do ar interior, em ambientes
climatizados artificialmente de uso público e coletivo, sendo atualizada pela Resolução RE nº
9, de 16 de janeiro de 2003 (Anvisa, 2003). Desta forma, as vigilâncias municipais e estaduais
passam a ter parâmetros para avaliar se o ar que circula em edifícios com sistema de ar
condicionado está prejudicando ou não a saúde de quem trabalha ou transita por esses locais,
pois foram determinados os valores máximos recomendáveis para parâmetros físicos do ar
interior, contaminação química e biológica (≤ 780 UFC/m3 de fungos).
Similarmente ao que já vem se observando internacionalmente, a expectativa é de que,
também no Brasil, ocorra um aumento no controle da qualidade do ar de ambientes internos,
com a adoção de medidas mais rigorosas específicas para fontes de diferentes naturezas e a
inclusão de um programa de medida e controle desses contaminantes.
O controle do ar de ambientes internos é feito natural ou artificialmente, por
ventilação, filtração e troca de ar, entre outras formas, com o objetivo de remover os
microrganismos do ambiente, bem como prevenir a entrada dos mesmos. A utilização de
mecanismos alternativos torna-se necessária pelo fato dos mecanismos mais usados
proporcionarem decomposição/purificação do bioaerossol muito lentamente na maioria dos
ambientes. Atualmente esses mecanismos apresentam algumas desvantagens, como os custos
inerentes e instabilidade operacional que limitam sua viabilidade para diferentes usos. Além
disso, podem apresentar efeito limitado, não destruindo os microrganismos, e sim os
transferindo para outro meio (Kowalski e Bahnflesh, 1998).
Os microrganismos que apresentam dimensões entre 0,01 μm até 100 μm têm o seu
comportamento governado pelos princípios da física como qualquer outra partícula e apesar
da maioria ser rapidamente inativada por dessecação, aumento da temperatura ou radiação
ultravioleta, algumas bactérias e esporos fúngicos podem permanecer vivos e ser
transportados pelo ar para regiões distantes do seu local de origem (Albrecht et al., 2008).
34
Além da suscetibilidade do indivíduo (imunidade), a duração da exposição, concentração do
agente infeccioso, dose infecciosa e rota da infecção (por inalação, olhos, nasofaringe, etc.)
são fatores importantes para a aquisição de uma infecção transmitida pelo ar (Kowalski e
Bahnfleth, 1998).
Em ambientes externos, vários fatores naturais podem minimizar a concentração de
microrganismos presentes no ar. A radiação solar contém níveis letais de radiação ultravioleta
e a desidratação provoca a inativação de muitos microrganismos, embora vários esporos
possam sobreviver indefinidamente (Kowalski e Bahnfleth, 1998). Em locais fechados, estes
fatores são controlados para o conforto humano, resultando em um tempo de sobrevivência
desses seres, o que interfere na prevenção de problemas de saúde. Um conjunto de tecnologias
foi desenvolvido para diminuir a concentração de bioaerossóis, porém muitas delas ainda
exigem aprimoramento para o efetivo controle de contaminações (Kowalski e Bahnfleth,
1998). Dentre as ferramentas utilizadas atualmente pode-se mencionar a filtração e a radiação
ultravioleta.
O princípio da filtração não é restringir a passagem de partícula pelo espaço entre
fibras, mas sim alterar a direção das linhas o fluxo de ar. O ar passa em torno da fibra, mas
quaisquer bioaerossóis de alta densidade ou partículas em suspensão não mudam de direção
tão rapidamente e, como resultado de sua inércia, tendem a impactar na fibra. A retenção da
partícula na fibra ocorre devido à atração elétrica estática ou simplesmente por aderência
física, e uma vez retida, a maioria das partículas não retornará a corrente de ar.
A utilização da irradiação ultravioleta germicida (UVGI) para a esterilização de
microrganismos tem sido estudada desde a década de 1930. A componente de radiação solar
ultravioleta é a principal razão de morte dos micróbios no ar exterior.
Os testes laboratoriais têm alcançado taxas extremamente elevadas de mortalidade sob
condições idealizadas, no entanto, em aplicações reais muitos fatores podem alterar a eficácia
dos UVGI, incluindo o tempo de exposição, a presença de umidade e partículas interferentes,
dentre outros.
No começo da década de 90 houve uma grande preocupação com níveis de
contaminação em ambientes envolvendo decomposição microbiana, como aterros sanitários,
estações de tratamento de esgotos, indústrias de processamento de papel e celulose e plantas
de refrigeração. Vários estudos indicaram que tais processos levam ao aumento das emissões
35
de microrganismos no ar. Bactérias e fungos passaram a ser detectados em altas
concentrações nas proximidades e em pontos mais afastados dessas estações, o que acarretava
um risco potencial à saúde de trabalhadores e moradores vizinhos dessas áreas. Em um
trabalho realizado por Herr et al. (2004) foi demonstrada uma associação entre poluição por
bioaerossóis em áreas residenciais e queixas de irritação das vias aéreas, bem como uma
excessiva fadiga e tremores que são sintomas reportados em trabalhadores de das estações de
compostagem. Estas áreas residenciais distantes 200 m das estações de compostagem
apresentaram níveis de bactérias e fungos similares às exposições ocupacionais nessas
estações. Em 2006, Muller et al. verificaram que jovens saudáveis expostos a uma estação de
compostagem por duas horas, fazendo atividades moderadas, apresentaram alterações na
contagem de células brancas do sangue, um aumento de neutrófilos e uma diminuição
significativa de eosinófilos.
Em suma, a busca por novas alternativas de produtos e materiais microbicidas que
apresentem baixos custos, baixo consumo de energia e sem riscos adicionais à saúde humana
têm sido cada vez mais necessárias a fim de mitigar o problema da contaminação
microbiológica em ambientes internos e externos.
2.6- POLISSACARÍDEOS E APLICAÇÕES ANTIMICROBIANAS
Na maioria dos casos em que se avalia o custo de um tratamento decorrente de
contaminação por biofilmes, verifica-se que o valor é muito maior do que o que seria gasto se
houvesse ações de prevenção à sua ocorrência. Uma opção atual, bastante atrativa e de
comprovada eficácia, é o uso de filtros em ponto de uso final (tais como em torneiras e
chuveiros) que podem ser empregados em associação aos tratamentos químicos de
desinfecção, com a vantagem de capturar eventuais microrganismos que possam ter
sobrevivido após exposição a estes agentes ou que não tenham sido atingidos em locais de
estagnação em tubulações, como o sistema mostrado na Figura 5.
Uma interessante alternativa complementar a este tipo de tratamento é a de recobrir
superfícies de materiais comercialmente disponíveis com produtos com atividade
antimicrobiana. Neste sentido, a quitosana, um polissacarídeo derivado da quitina, vem
despertando grande interesse para aplicação na área biomédica. Recentes pesquisas
envolvendo sua aplicação na forma de revestimento para superfícies sugerem que este método
36
de proteção antimicrobiana apresenta um promissor campo de aplicação no controle de
patógenos. Cupons de estireno-acrílico revestidos com este polímero e expostos a biofilmes
formados por microrganismos clinicamente relevantes, como por exemplo, Staphylococcus
epidermidis e Candida albicans, mostraram desempenho anti-incrustrante superior aos
apresentados pelos tratados com antimicrobianos convencionais como a clorexidina e
rifampicina (Carlson et al., 2008). Também, é mencionado que agentes antimicrobianos
catiônicos, tais como a quitosana, não são passíveis de gerar culturas fenotipicamente
resistentes (Milovic et al., 2005).
Figura 5: Exemplo de esquema de tratamento de água utilizando-se filtro para aplicação
direta no ponto de uso.
A quitina, que possui estrutura semelhante à da celulose, é o segundo biopolímero
mais abundante na natureza e foi descoberta em cogumelos pelo professor francês Henri
Braconnot, em 1811, recebendo então a denominação inicial de fungina. O nome quitina foi
dado por Odier, em 1823, quando esta foi isolada de insetos. O grau de modificação estrutural
da quitina acarreta diferentes características físico-químicas, conferindo à quitosana a
facilidade de ser incorporada em soluções e a outros polímeros para a obtenção das
Água da rede externa
Filtro de água podendo
conter membranas
antimicrobianas
Torneira com
água tratada
37
propriedades finais desejadas. A quitosana é obtida pela desacetilação da quitina, consistindo
predominantemente em uma sequência linear de açúcares monoméricos do tipo β-(1-4) 2-
acetamido-2-deoxi-d-glicose (n-acetilglicosamina), mas podendo também apresentar uma
fração dos grupos (inferior a 50%) na forma acetilada, conforme mostrado na Figura 6. A
fórmula molecular genérica da quitosana pode ser expressa como (C6H11NO4)n.
0 50% 100%
100 0
Quitina Quitosana
CH2OH
O
OH
NHCOCH3
O
OH-
n n
H+
O
NH2
OH
O
CH2OH CH2OH
O
OH
NH3+
O
n
Figura 6: Grupos químicos predominantes da quitina e da quitosana e sua solubilidade após
diferentes tipos de tratamento.
A quitosana é o único polissacarídeo catiônico obtido a partir de polímero natural.
Apresenta reconhecida propriedade antimicrobiana (bactericida, bacteriostática, fungicida e
fungistática) (Craveiro et al.,1999), além de ser biocompatível (Chandy e Sharma, 1990) e
Quitina
insolúvel em água
Quitosana
não solubilizada:
predomínio de grupos
poliamina não ionizados
Quitosana
solubilizada:
predomínio de
policátions
Tratamento
com base
Solubilização
em ácido
fraco
Grau de desacetilação
Grau de acetilação
38
conferir boa resistência mecânica aos biomateriais produzidos a partir de seu uso (Mima et
al., 1983). Sua alta densidade de cargas positivas é citada em diversos estudos como um dos
principais fatores envolvidos em seu modo de ação, facilitando a interação com células
microbianas e suas toxinas, que geralmente possuem carga líquida negativa. A composição da
parede celular das cianobactérias (algas azuis) é similar à das bactérias Gram-negativas, que
também possui carga negativa em sua superfície (Cossich et al., 2007). Tais microrganismos
são majoritariamente encontrados em águas de diversas fontes. Também as estruturas
reprodutivas de certos fungos filamentosos (blastosporos) são negativamente carregadas
(Dunlap et al., 2005), assim como a carga superficial dos gêneros mais comuns de leveduras
(Candida sp e Saccharomyces sp).
Além disso, a toxicidade da quitosana é baixa, sua dose letal (DL 50) é de 16 g/kg em
ratos, enquanto, por exemplo a dose letal de um composto reconhecidamente não tóxico como
a glicose em mamíferos é de 8 a 12g/Kg de massa corporal em mamíferos (Costa Silva et al.,
2006).
Dispositivos de quitosana podem ser confeccionados em diferentes formas, tais como
partículas, películas densas e porosas, dentre outras. Em solução, está sendo atualmente
utilizada como agente floculante para a remoção de impurezas químicas e biológicas em
tratamento de água (Chandy e Sharma, 1990).
Portanto, este biopolímero bioativo vem despertando grande interesse de cientistas
para aplicação na área biomédica. Além disto, sua matéria-prima apresenta um atrativo
econômico relevante, pois pode ser obtida de resíduos da indústria pesqueira (a partir do
processamento da carapaça de crustáceos), também podendo ser encontrada em insetos,
moluscos e na parede celular de fungos (principalmente do grupo Zigomicetos). A quitina e a
quitosana são biologicamente sintetizadas em aproximadamente um bilhão de toneladas por
ano (Khor e Lim, 2003). Em torno de 75.000 toneladas de cascas de camarão são geradas
como subproduto de indústrias européias a cada ano, sendo somente 10% utilizadas para
aproveitamento como quitina e quitosana (CARAPAX Project, 2001), contudo, há potencial
para grande expansão deste número. A estimativa mundial para a produção industrial de
quitina a partir de carapaças de crustáceos é de 50.000 toneladas por ano. Somente a produção
de crustáceos nos Estados Unidos computa 260.000 toneladas, sendo capaz de fornecer
matéria-prima para a produção anual de aproximadamente 15.000 toneladas de quitina
(Pradella, 2006).
39
Comercialmente, a quitina e a quitosana são produzidas, principalmente, na Índia, no
Japão, na Polônia, na Noruega, na Austrália e na China, sendo que o seu valor de mercado
depende diretamente de fatores relacionados às suas características físico-químicas, bem
como da sua aplicação final (Pradella, 2006).
O Brasil possui uma das áreas costeiras mais extensas do mundo, com cerca de
8.500 km e relevante produção de crustáceos, possuindo, assim, grande potencial para
aprimoramento neste campo. Um dos centros de pesquisas nacionais que tem investido no
estudo colaborativo com empresas para a comercialização de produtos diversificados
derivados da quitina e da quitosana é o Padetec (Parque de desenvolvimento tecnológico da
Universidade Federal do Ceará). As linhas de pesquisa envolvem principalmente na
associação da quitosana com diversos materiais, visando a melhoria e/ou desenvolvimento de
produtos e processos, tais como um gel de quitosana com extratos vegetais ou colágeno para
cosméticos, produtos à base de quitosana para redução de peso e colesterol, microesferas de
quitosana (produtos análogos aos lipossomas) onde são encapsuladas substâncias que se
desejem liberação lenta no estômago ou para a imobilização de leveduras utilizadas em
processos de fermentação alcoólica; spray à base de sal de quitosana para purificação de
alimentos; produtos da complexação de quitosana com sais de ferro gerando microesferas que
são atraídas pelo campo magnético para aplicações em medicina e produtos farmacêuticos ou
na remoção de metais em água, formando complexos com cobre, níquel, cádmio, etc.
(Padetec, 2015). Não consta entretanto, atuação na linha de prevenção à formação de
biofilmes microbianos.
Os principais dados já publicados para a utilização da quitosana estão centrados no
processamento de alimentos, na quelação de íons metálicos utilizada na purificação de água,
como inibidor da formação de cáries dentárias, no tratamento auxiliar da acne evitando o
crescimento de determinados tipos de bactérias (Craveiro et al., 1999), dentre outras. Na
Tabela 2 são apresentados os campos de pesquisa de maior destaque em relação ao estudo e
desenvolvimento de tecnologias aplicadas ao uso da quitosana.
A quitosana é um material versátil que pode ser utilizado isoladamente ou em
combinação com outros compostos, visando à melhoria das características físicas, mecânicas
e/ou biológicas para cada aplicação específica. Como exemplo, sabe-se que suas propriedades
mecânicas podem ser modificadas por alquilação, enquanto que a solubilidade em água pode
ser melhorada por processos de quaternização (Britto e Assis, 2007). Alguns dos agentes já
40
utilizados em conjunto com a quitosana são: polivinilpirrolidona (Risbud et al., 2000), sulfato
de dextrana (Chupa et al., 2000), alginato (Wang et al., 2002), etóxido de sílica (Suzuki e
Mizushima, 1997), polietilenoglicol (Caner et al., 1998), glicerol (Mu et al., 1999) e soluções
antimicrobianas complementares (Loke et al., 2000), dentre outros. O emprego da quitosana
aumentou consideravelmente nos últimos anos em diversos países e em variadas aplicações.
Computando-se apenas as publicações na forma de patentes e artigos envolvendo o termo
quitosana no período compreendido entre os anos 2000 e 2006, observa-se que houve um
crescimento de 196% e que desde então, até 2014, o número de trabalhos científicos
envolvendo a quitosana passou a ser de 1.265% a mais que o compilado em 2006 (Tabela 3).
Estes dados mostram a vastidão de estudos acerca do uso da quitosana e de suas
aplicações. Porém, há muito a ser explorado neste campo, visto que a atividade
antimicrobiana da quitosana é ainda alvo de investigação, por depender de alguns fatores
intrínsecos ao biopolímero e ao meio onde será aplicado, tais como: grau de desacetilação,
massa molar, pH, tipo e concentração do microrganismo contaminante, dentre outros.
Portanto, seu mecanismo de ação ainda é controverso, sendo os mais citados em trabalhos
científicos a interação de seus grupos iônicos com a membrana celular causando seu
rompimento ou a inibição do mRNA e da síntese protéica via penetração da quitosana no
núcleo celular, ou ainda, a formação de uma barreira externa, quelatando metais e podendo
suprimir a absorção de nutrientes essenciais às células e a produção de toxinas. Porém, é
provável que tais eventos ocorram simultaneamente, em diferentes intensidades (Goy et al.,
2009).
Tabela 2: Exemplos de aplicações da quitosana (Dallan, 2005).
Área industrial Áreas de saúde e nutricional
Purificação de água residual
Estabilizante de aromas
Meio de troca iônica
Aditivo de cosméticos
Adsorvente na remoção de metais pesados
Proteção bactericida de sementes
Estabilizante de frutas e verduras perecíveis
Agente absorvedor de gorduras
Regeneração de pele
Antiácido
Auxiliar no controle na pressão arterial
Regenerador de estrutura óssea
Inibidor da formação de placas dentárias
41
Tabela 3: Evolução do número de publicações envolvendo a quitosana em diversas
aplicações, entre os anos 2000 e 2006 (Higuera e Toledo, 2007). Atualização 2014 (INPI,
2015).
Tipo de
publicação Fonte 2000 2006 2014
Patentes
USPTO: United States Patent and Trademark Office
WIPO: World Intellectual Property Organization
EPO: The European Patent Office
INPI (Instituto Nacional da Propriedade Industrial)
LATPAT (Institutos de Patentes da América Latina)
Free Patents on line
516
922
463
-
-
-
3.378
2.166
496
-
-
-
20.467
16.101
19.430
11
189
12.521
Artigos SCOPUS: Data base Elsevier 761 1.847 38.992
Foi atribuída à quitosana a capacidade de inibição do crescimento de uma ampla
diversidade de bactérias, bolores e leveduras, tais como: E. coli, Fusarium, Alternaria,
Helminthosporium, S. epidermidis, P. aeruginosa, S. pyogenes, K. pneumoniae, S. aureus, S.
faecalis, Shigella dysenteriae, Aeromonas hydrophila, Salmonella typhimurium, Bacillus
cereus, Coliformes, Vibrio, Agrobacterium tumefaciens, Corynebacterium michiganence,
Erwinia sp., Micrococcus luteus, Pseudomonas fluorescens, Xanthomonas campestris,
Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, Drechslera sorokiniana, Micronectriella nivalis,
Procularia oryzae, Rhizoctonia solani, Tricophyton equinum, Candida, dentre outros (Singla
e Chawla, 2001).
Em um estudo realizado por Suárez e Cerino (2007), foi verificado que a capacidade
do fungo Aspergillus niger de adsorver metais, tal como o cobre, é alterada quando a
quitosana é adicionada ao meio de cultivo, provocando alterações metabólicas nas células.
A quitosana também está sendo aplicada com êxito em estudos para seu emprego no
processo de remoção de venenos agrários, bem como no controle de pragas e de
microrganismos patogênicos neste ambiente (Synowiecki e Al-Khatteb, 2003). Liu et al.
(2007) comprovaram a atividade antifúngica da quitosana na inibição do crescimento micelial
e na germinação de esporos de Botrytis cinerea e Penicillium expansum. Rappussi et al.
(2009) também obtiveram efeito antifúngico com a quitosana em concentração a partir de
0,5% em cultura de Guignardia citricarpa, fungo causador da mancha negra em frutos
42
cítricos.
Portanto, considerando as propriedades que a quitosana apresenta e que direcionam
seu uso como biomaterial, sua aplicação possibilita várias perspectivas de pesquisa a serem
exploradas.
Outro biopolímero bioativo foi considerado como matriz para a manufatura das
membranas no presente trabalho, o alginato, que é um polissacarídeo extraído com soluções
alcalinas de várias espécies de algas Phaeophyceae. Desde a sua descoberta por Stanford em
1881, tem sido utilizado em vários tipos de indústrias, como as alimentícias, têxteis e
farmacêuticas (Qin, 2008). Assim como a quitosana, é biocompatível e resulta em géis com
boas propriedades mucoadesivas, sendo atualmente relevante na produção de vários
dispositivos biomédicos comercialmente disponíveis (Girata, 2011). De fato, o alginato é um
dos mais estudados exopolissacarídeos envolvidos na formação e estabilização de biofilmes
(Flemming e Wingender, 2010), sendo notoriamente produzido por cepas de Pseudomonas
aeruginosa. O alginato não é essencial para a formação do biofilme, mas tem efeito acentuado
em sua arquitetura.
O alginato é uma molécula da família de copolímeros binários, que apresenta estrutura
formada por ligações 1-4 de ácido β-D-manurônico (M) e ácido α-L-gulurônico (G). Estes
monômeros podem ser agrupados por homopolímeros (GG e MM) ou por blocos alternados
(MG) ao longo da cadeia da mesma molécula, como pode ser visto na Figura 7. Blocos MG,
por exemplo, formam cadeias mais flexíveis e mais solúveis em condições de baixo pH e a
estabilidade do gel está diretamente relacionada ao conteúdo de blocos contendo o composto
G (Ertesvág e Valla, 1998).
O uso do alginato no âmbito deste trabalho foi motivado para a avaliação comparativa
da efetividade antimicrobiana das membranas formadas por biopolímeros com cargas opostas.
Sabe-se que a maioria dos microrganismos apresenta densidade de cargas negativas em sua
superfície (tal como o alginato) e, assim, espera-se que uma menor interação ocorra entre os
mesmos. Porém, pouco se sabe sobre a influência neste evento quando as células estão
recobertas por EPS (biofilmes), despertando o interesse para esta avaliação. Na Tabela 4 são
apresentadas algumas das principais aplicações dos biopolímeros quitosana e alginato.
Como todos os materiais versáteis, dependendo da metodologia de preparação e das
variáveis associadas ao seu emprego, estes biopolímeros podem apresentar distintas
43
características que influenciam sua atividade, cabendo, portanto, uma análise criteriosa de sua
forma de aplicação na condição desejada.
Figura 7: Estrutura do ácido β-D-manurônico (a), α-L-gulurônico (b) e alginato (c). Fonte:
Ertesvág e Valla (1998).
A contribuição dos dispêndios com polissacarídeos na composição de membranas para
a finalidade proposta possivelmente não seria muito impactante, visto que os biocidas podem
ter custos por quilograma mais elevados. Entretanto, é difícil se efetuar estimativas concretas
acerca deste tema, pois diferentes biocidas podem ser requeridos em diferentes proporções
mássicas nas membranas, onerando o material final, assim, também de formas diferentes.
2.7- CONSIDERAÇÕES FINAIS SOBRE A LITERATURA CONSULTADA
De acordo com o levantamento bibliográfico realizado, observa-se que a presença de
contaminantes microbianos, principalmente instalados na forma de biofilmes, é uma condição
relevante que envolve diversos ambientes, desde o hospitalar até o industrial. Apesar de
controles periódicos, medidas preventivas mais eficazes devem ser implementadas para a
detecção precoce de níveis críticos de contaminação, de modo a minimizar o uso
indiscriminado de produtos que possam ser prejudiciais a sistemas envolvendo fluxo de água
e condicionar à persistência e resistência microbiana.
44
Tabela 4: Principais aplicações dos biopolímeros bioativos quitosana e alginato na área
biotecnológica (adaptada de Dornish e Dessen, 2004).
Na maioria dos casos onde se investiga a atuação antimicrobiana da quitosana, ela está
empregada na forma de solução e menos na forma de membrana. Também, em muitos casos,
são usados agentes antimicrobianos complementares aliados à quitosana para o aumento de
sua eficácia.
Desta forma, dispõe-se de poucas informações direcionadas à sua atividade sob a
forma de membrana, na prevenção e erradicação de contaminantes mistos e em biofilmes,
principalmente com enfoque em contaminantes oriundos de sistemas de água.
No que se refere à análise sobre saúde ocupacional no âmbito industrial, os dados
envolvendo a água são escassos, obtendo-se apenas informações sobre produtos e processos.
Pode-se, também, concluir que para se ter uma maior probabilidade de sucesso ao se
debelar uma contaminação microbiana veiculada por água, é crucial se ter estratégias de
Característica
relevante
Propriedades
funcionais Aplicação Uso específico
Utilidade
Alginato Quitosana
Massa molar Viscosidade
Espessante
Formador de filme
Suspensões
Revestimentos
+++
++
++
++
Composição
Cross-linking Gelificante Encapsulação /
Imobilização +++ ++
Atividade
biológica
Modulação do
sistema imunológico
Invólucro
Imuno-estimulação
Liberação
controlada de
compostos
+++
+
+
+++
Dissociação,
pKa
Solubilidade
Precipitação
Expansão
Formação de
soluções e pastas
Formação de fibras
e filmes
Absorção
Contenção de
medicamentos
Curativos /
Engenharia celular
Desintegração e
liberação de
conteúdo
+++
+++
+++
+++
+++
++
Poli-íon Afinidade
cátion / ânion
Quelação
Polieletrólito com
alta densidade de
cargas
Ligação metal-
composto ativo
Bioadesão
++
+
++
+++
45
detecção dos pontos problemáticos potenciais, seja em ambiente hospitalar, industrial ou com
escopo vulnerável a esta ocorrência. A forma de abordagem pode ser considerada como de
base, devendo-se fazer as adequações procedimentais devidas caso a caso.
46
CAPÍTULO 3:
METODOLOGIA EXPERIMENTAL E
ANÁLISE DOS DADOS
47
3.1- ESTRUTURA GERAL DOS ENSAIOS EXPERIMENTAIS
Com base na literatura analisada, a estrutura deste trabalho foi organizada
compreendendo as etapas e atividades mostradas na Figura 8. Na sequência, estão descritos o
material e os procedimentos utilizados nos ensaios experimentais.
Figura 8: Estrutura geral para os métodos de análise e sequência dos ensaios.
- Estratégias para a amostragem, diagnóstico e proposição de recomendações;
- Coleta de contaminantes de sistemas de distribuição de água industriais;
- Preparo dos inóculos microbianos individuais ou mistos utilizando-se coleções
de cultura e os contaminantes isolados;
- Seleção dos biocidas.
4. Triagem das
membranas com
biocidas em
condições basais
5. Análise da
eficácia das
membranas com
biocidas em
condições de uso
simuladas
6. Comparação final dos resultados:
Formulações da membrana com maior competência para debelar contaminantes representativos do sistema
- Avaliação da qualidade microbiológica inicial dos biopolímeros contra
microrganismos padronizados, para a seleção da composição de base da
membrana.
- Preparação das membranas e avaliação da conformidade para os ensaios;
- Atividade das membranas contra microrganismos planctônicos em culturas
padronizadas isoladas e mistas;
- Atividade das membranas contra biofilmes;
- Seleção e caracterização da membrana antimicrobiana;
- Incorporação dos biocidas na composição da membrana.
1. Avaliação do
sistema estudado:
Amostragem, preparo
de inóculos e triagem
dos biocidas
convencionais
2. Ensaios
preliminares: Análise
da atividade
antimicrobiana dos
biopolímeros
3. Preparação das
membranas
biopoliméricas:
Seleção do
biopolímero e adição
dos biocidas
- Atividade preliminar das membranas contra culturas padronizadas;
- Aplicação das membranas sobre contaminantes de sistema de água.
- Análise do desempenho das membranas em condições de lixiviação;
- Atuação contra microrganismos reconhecidamente patogênicos;
- Resistência à exposição microbiana continuada.
48
3.2- MATERIAL
3.2.1- Biopolímeros
Considerando-se os parâmetros que fazem da quitosana um material de características
diversificadas e que podem ter influência em sua atividade antimicrobiana, foram avaliadas as
seguintes matérias-primas para a confecção das membranas:
- Quitosana nacionalmente processada, obtida de carapaças de caranguejos com grau de
desacetilação mínimo de 98% (obtida da Polymar) e quitosana de grau técnico, com
desacetilação mínima de 85% (Sigma Chemical Co., código: C3646).
- Quitosana de baixa massa molar (150 kDa, Sigma Chemical Co., lote: 06720AE) e de média
massa molar (400 kDa, Sigma Chemical Co., lote: 07918TE).
- Lactato de quitosana (oligossacarídeo de 340 kDa, Sigma Chemical Co., lote: 11925MU).
Além das diferentes quitosanas, testou-se também o alginato de sódio de baixa
viscosidade (Sigma Chemical Co.) para avaliação comparativa entre as cargas superfíciais dos
biopolímeros e sua influência na atividade antimicrobiana das membranas.
O uso de polissacarídeos de baixa e média massa molar foi realizado com vistas a
facilitar o processamento dos materiais por ocasião da produção das membranas.
3.2.2- Agentes antimicrobianos complementares
Alguns dos principais biocidas comumente empregados para o tratamento
microbiológico de uma vasta diversidade de segmentos industriais foram utilizados para a
avaliação da capacidade de erradicação da microbiota estudada, bem como para serem
incorporados como agentes coadjuvantes na composição da membrana biopolimérica. Estes
produtos, apresentados na Tabela 5, foram submetidos à consulta de suas fichas técnicas
disponibilizadas pelos fabricantes e selecionados por apresentarem propriedades relevantes
que corroboram com a aplicação almejada, apresentando grande potencial para o tratamento
de um amplo espectro de contaminantes.
49
Tabela 5: Agentes antimicrobianos empregados na formulação das membranas para avaliação
do espectro de atuação contra contaminantes de sistema de água.
Produto Ingrediente(s)
ativo(s)
Conteúdo
de ativos
(% m/v)
Descrição e propriedades de destaque
Biocida
1
Fosfato hidrogenado
de zircônio e sódio e
prata
10% em
massa de
prata
Confere ação antimicrobiana aos materiais
tratados, tais como recipientes plásticos para
contato com alimento ou água, aparatos para
purificadores de ar, materiais de construção para
banheiros e cozinhas (EPA, 2002) e no tratamento
de infecções em feridas (Atiyeh et al., 2007).
Biocida
2 Cloreto de prata 2%
Eficácia de acordo com a norma JIS Z 2801
(2000)*.
Atua principalmente contra o desenvolvimento de
bactérias.
Produto com baixo AOX (Adsorbable Organic
halogens) e isento de VOC (Volatile Organic
Compounds).
Biocida
3
Nitrato de prata; 1,5% Eficácia de acordo com a norma JIS Z 2801
(2000)*. Benzisotiazolinona
(BIT) 9%
Biocida
4
n-octilisotiazolinona
(OIT) encapsulada
em sílica
8%
Utilizado para tratamento de superfícies, com
liberação controlada do ingrediente ativo,
proporcionando um maior período de atuação.
Produto com baixa toxicidade**.
Biocida
5
n-octilisotiazolinona
(OIT) 8%
Utilizado para tratamento de superfícies. Atua
contra o desenvolvimento de bactérias e
principalmente de fungos.
Biocida
6
Quaternário de
amônio 80%
Utilizado em tratamento de água na indústria de
papel e em produtos para uso humano, como em
lenços umedecidos. Pode ser utilizado para
contato direto com a pele no máximo a 0,12%.
Efetivo contra L. pneumophila.
Biocida
7
DBNPA; 12% Utilizado para a sanitização de equipamentos
industriais contra incrustações e recomendável
para a preservação de membranas de Osmose
Reversa. Compatível com todos os tipos de
aplicações de tratamento de água e eficaz contra a
erradicação de bactérias redutoras de sulfato
(anaeróbias), contaminantes planctônicos
persistentes, L. pneumophila e microrganismos
sésseis como boa alternativa a biocidas oxidantes.
Produto com baixa toxicidade**.
Bronopol;
10%
CIT/MIT
(Clorometil/Metil-
isotiazolinona)
1%
Biocida
8
Polihexametileno-
biguanida (PHMB) 20%
Produto utilizado como desinfetante, limpador e
esterilizante, também para a proteção de água de
banho e em produtos para cuidados pessoais.
* Norma JIS Z 2801-2000: Aprovação especial para uso em superfícies higiênicas aplicáveis em áreas tais como
hospitais e indústria de processamento de alimentos ou em demais ambientes que apresentem elevado risco de
infecção microbiana e onde criteriosos níveis de higiene são requeridos.
** Produto com baixa toxicidade, apresentando os seguintes atributos: seguro no contato com alimentos, possui
facilidade de inativação em casos emergenciais, é biodegradável e tem baixo potencial de bioacumulação.
50
Estes biocidas estão codificados sequencialmente e identificados pela sua composição
química. As identidades de seus nomes comerciais foram preservadas, com exceção do
Biocida 1 (AlphaSan® RC2000, Milliken), por este fabricante ter parceria em pesquisas com
o grupo de trabalho na área de Biomateriais da FEQ/Unicamp, facilitando assim a correlação
dos resultados com outros trabalhos. Por outro lado, a ausência dos nomes comerciais dos
demais biocidas justifica-se, uma vez que a aplicação estudada ainda não faz parte do escopo
direto de atuação da empresa (Biocidas 2 a 8, Thor Brasil Ltda.) e sua política interna requer
validação paralela com dados de prática industrial para a divulgação definitiva de sua
efetividade. Porém, tais agentes ativos podem ser facilmente localizados e estão
comercialmente disponíveis em diferentes empresas fabricantes e/ou fornecedoras de
biocidas, tais como Nalco, Dow, Miracema e Ipel, dentre outras.
3.2.3- Diluentes e reagentes
Ácido acético glacial P.A. (Ecibra) foi utilizado para a solubilização da quitosana para
o preparo das membranas poliméricas. Hidróxido de sódio P.A. (Synth) foi utilizado para a
neutralização do excesso de ácido após a manufatura das membranas contendo quitosana e
cloreto de cálcio (Synth) foi utilizado como agente reticulante para as membranas contendo
alginato. O corante cloreto de trifeniltetrazólio (TTC), marca Inlab, foi utilizado nos meios de
cultura, quando aplicável, para a evidenciação de células microbianas. O corante Congo Red
Agar (CRA), marca Inlab, foi utilizado nos meios de cultura, quando aplicável, para a
evidenciação de matriz extracelular.
3.2.4- Meios de cultura
Para a detecção de microrganismos por grupos, foram utilizados para bactérias
aeróbias totais o meio Tryptic Soy Agar (TSA, Difco), para fungos (bolores e leveduras) o
meio Sabouraud Dextrose Agar (SDA, Difco), para enriquecimento celular um caldo nutritivo
(Nutrient Broth, Oxoid) e um meio pobre em nutrientes (Mineral Salts Agar), formulado de
acordo com a composição explicitada na norma AATCC 147 (1998), originalmente utilizada
para a avaliação antimicrobiana de materiais têxteis. Os mesmos foram preparados de acordo
com as instruções dos fabricantes, esterilizados a 121ºC por 20 minutos e resfriados a 40ºC,
antes do uso.
51
3.2.5- Microrganismos
Os microrganismos selecionados para os ensaios foram contaminantes representativos
da água, do ar, de superfícies e da microbiota humana originários de coleções de cultura ou de
estudos de isolamento de cepas de ambientes industriais (Tabela 6) para avaliação da
atividade antimicrobiana dos biopolímeros. Estas culturas foram utilizadas individualmente
ou como suspensões mistas, em concentração mínima de 108 UFC/mL para bactérias e de
107
UFC/mL para fungos, para que se tivesse uma massa celular robusta, e seu uso
direcionado ao atendimento da finalidade proposta em cada ensaio.
Adicionalmente, foram utilizados microrganismos coletados de diferentes ambientes
de um vestiário industrial, nos quais foi detectada a presença de contaminantes oriundos de
sistemas de distribuição de água. O nome da empresa não é divulgado por questões éticas. As
formas de coleta e isolamento dos microrganismos são descritas a seguir, no item 3.3.1.2. Os
tipos microbianos específicos detectados são descritos no item 4.1.2 do Capítulo Resultados e
Discussão.
3.3- MÉTODOS
As manipulações assépticas foram realizadas em laboratório microbiológico, equipado
com câmara de fluxo laminar vertical provida de filtro HEPA Classe II/A1 (Veco, VLFS-12)
e lâmpada UV. Todos os ensaios foram realizados em triplicata, com duas repetições por
experimento e os resultados são reportados pela média de leitura das avaliações (n=6).
3.3.1- Avaliação microbiológica do sistema estudado
3.3.1.1- Estratégias para a conduta de amostragem, diagnóstico microbiológico e
proposição de recomendações
Para a análise da criticidade de sistemas envolvendo água, sob o ponto de vista
microbiológico, de modo a se obter um panorama geral do cenário industrial neste quesito, a
avaliação microbiológica de amostras representativas foi realizada em 15 empresas totais,
abrangendo 15 amostras coletadas em cada um dos pontos críticos observados nos processos.
52
Tabela 6: Culturas empregadas para a avaliação da atividade antimicrobiana dos
biopolímeros bioativos associados ou não aos outros agentes testados.
Microrganismo Cepas Características
Cult
ura
s p
ara
uso
no
s en
saio
s p
adro
niz
ados Pseudomonas
aeruginosa* ATCC 9027
Bactéria Gram-negativa, de fácil adaptação a
diferentes ambientes.
Escherichia
coli*
ATCC 8739 Bactéria Gram-negativa, indicadora de contaminação
fecal em água.
Staphylococcus
aureus* ATCC 6538
Bactéria Gram-positiva, naturalmente presente na pele
humana, mas com alta capacidade de se tornar
patogênica.
Aspergillus
niger** ATCC 6275
Bolor (fungo filamentoso) formador de esporos de
fácil dispersão, comum em diversos ambientes e
frequentemente causador de doenças respiratórias.
Candida
albicans** ATCC 10231
Levedura (fungo unicelular), importante patógeno
envolvido em infecções transmitidas por dispositivos
médicos e de comum associação com bactérias.
Cu
ltura
s p
ara
uso
em
ensa
ios
espec
ífic
os
Serratia
marcescens CBMAI 325 Bactéria Gram-negativa, de crescimento lento.
Staphylococcus
epidermidis
ATCC 9142
Bactéria padrão para ensaio de biofilmes, formadora
de matriz extracelular abundante
(Cerca et al., 2005).
ATCC 12228 Bactéria padrão para ensaio de biofilmes, não
formadora de matriz extracelular
(Mathur et al., 2006).
Pseudomonas
aeruginosa
Isolado
industrial,
cedido pela
empresa
Thor Brasil
Ltda.
Bactéria Gram-negativa resistente a biocida clorado
(500 ppm).
Pseudomonas
mendocina
(patogênico)
Isolado
ambiental,
cedido pela
empresa
Thor Brasil
Ltda.
Bactéria Gram-negativa que pode causar infecções
oportunistas.
Enterobacter
gergoviae
(patogênico)
ATCC 33028
Bactéria Gram-negativa, comumente utilizada em
ensaios de produtos para lavagem das mãos contendo
medicamentos.
* Cepa utilizada no Inóculo misto de Bactérias
** Cepa utilizada no Inóculo misto de Fungos
53
As empresas selecionadas para esta investigação apresentam diferentes portes e
estruturas de processo, contemplando segmentos industriais envolvidos com a fabricação de
cosméticos (produtos relevantes: shampoos, cremes, etc), de domissanitários (produtos
relevantes: detergentes, amaciantes, etc) e de processamento de artigos para uso escolar
(produtos relevantes: colas, massas de modelar, etc). Estes processos foram escolhidos por
produzirem itens de uso humano passíveis de controles rigorosos, bem como por disporem de
intenso uso de seus sistemas de distribuição de água ao longo do processo, além de serem
acessíveis a contribuir para este estudo. Os seus nomes foram mantidos em sigilo por questões
éticas.
A sistemática utilizada baseou-se nas diretrizes reportadas para a Análise de Perigos e
Pontos Críticos de Controle (APPCC ou HACCP Hazard Analysis and Critical Control Point
HACCP), conforme ASTM E 2590 (2015), muito utilizada para a garantia de segurança em
diversos processos, mas especialmente na indústria de alimentos, é referida como fundamento
de regulamentação (Resolução RDC nº 12, 2001).
3.3.1.2- Coleta, isolamento e caracterização de contaminantes críticos identificados de
sistemas de distribuição de água
A partir da análise crítica de sistemas de distribuição de água, envolvendo o cenário
industrial, as amostras foram coletadas e processadas da seguinte maneira: para as coletas de
água, um volume de 100 mL foi coletado em frascos estéreis; para a avaliação de
contaminantes em aerossóis, placas contendo meio de cultivo específico para o
desenvolvimento de bactérias e de fungos foram expostas ao ambiente por 20 minutos,
enquanto que o material incrustrado nas superfícies dos diversos materiais em contato com
água foi coletado com a utilização de swabs (haste com algodão estéril para fins
laboratoriais), com posterior estriamento em placas contendo os meios de cultura apropriados
para o desenvolvimento de bactérias e de fungos. Para a efetiva avaliação do material presente
no chuveiro foi necessária a abertura do aparato e coleta do biofilme em seu interior.
Para a seleção e caracterização dos grupos microbianos mais críticos, os
procedimentos descritos a seguir foram adotados para a obtenção destes contaminantes.
Abrangeu-se nesta avaliação apenas uma área específica, identificada como sendo de grande
risco dentre os locais inspecionados nas empresas envolvidas, a fim de se compreender a
diversidade da microbiota nas fases livre, em biofilmes e dispersas no ambiente.
54
A classificação dos principais microrganismos detectados foi baseada em diferenciá-
los em gênero e quando possível, em espécie, considerando que os gêneros reúnem os
microrganismos com características em comum no que se refere à morfologia e metabolismo
de um modo geral e que as espécies são subdivisões dos gêneros, discriminando com maior
detalhamento as diferenças intrínsecas entre os microrganismos. A visualização da morfologia
dos microrganismos foi realizada por microscopia óptica convencional (microscópio óptico
binocular de bancada modelo DME, Leica) e suas prováveis identidades foram
correlacionadas com as descrições estruturais de referência para a identificação de
microrganismos, utilizando-se um manual de diagnóstico microbiológico tradicional
(Koneman, 2001).
A estrutura celular das bactérias foi evidenciada por coloração de Gram, enquanto os
micélios e esporos fúngicos foram visualizados com o auxílio de um manual de identificação
(Koneman et al., 2001).
Tais formas de caracterização foram utilizadas por serem de mais fácil acesso e baixo
custo para a indústria e também por serem suficientes para o propósito apresentado.
3.3.1.3- Preparo dos inóculos microbianos individuais ou mistos
Cada microrganismo-teste foi inicialmente retirado de um tubo de ensaio, armazenado
sob refrigeração, contendo o meio de cultura sólido apropriado para cada grupo microbiano.
Utilizou-se uma alça de inoculação de 0,1µL para a sua transferência para um novo tubo com
o mesmo tipo de meio de cultura do tubo original (primeiro repique) para a confirmação de
sua viabilidade e do crescimento livre de outros microrganismos contaminantes após 24 horas
sob incubação em estufa com temperatura controlada de 35±2oC para bactérias e de 25±2
oC
para fungos (modelo Orion 502, Fanem). Uma nova transferência de cada cepa após 24 horas
(segundo repique) foi realizada a partir do tubo do primeiro repique a fim de aumentar a
probabilidade de que a maioria das células estivessem em fase de crescimento exponencial,
usualmente requerida para a avaliação de agentes antimicrobianos.
Para o preparo das suspensões individuais, uma porção de cada cepa foi retirada do
tubo de segundo repique com o uso da alça de inoculação e suspensa em um frasco para coleta
de material biológico (com capacidade para 80 mL) contendo 50 mL de água destilada
55
esterilizada, de acordo com Capelletti (2006). A concentração celular final desejada,
minimamente contendo 108 UFC/mL de bactérias e 10
7 UFC/mL de fungos foi ajustada após
a contagem do número de células viáveis presentes em 1mL da suspensão que foi disposta em
placa de Petri com o respectivo meio de cultura sólido, após incubação por 24 horas.
Para o preparo das suspensões mistas, quantidades equivalentes de cada suspensão
individual foram dispostas em um mesmo frasco e homogeneizadas. A concentração celular
final do inóculo foi então reconfirmada para eventual ajuste.
As suspensões foram mantidas sob refrigeração para a diminuição do metabolismo
celular e manutenção do número de células presentes, até que fossem utilizadas como
inóculos nos ensaios pertinentes.
3.3.1.4- Seleção dos biocidas para os ensaios de incorporação nas membranas
Os biocidas utilizados como agentes coadjuvantes na preparação das membranas
biopoliméricas foram selecionados considerando-se principalmente os seguintes parâmetros
desejáveis à aplicação pretendida: apresentarem ampla efetividade contra microrganismos,
incluindo-se cepas patogênicas; possuírem atributos em segurança (baixa toxicidade e uso em
aplicações sanitárias), além de serem dotados de compostos ativos com efetividade hipotética
contra os microrganismos ambientais coletados para os experimentos. Dados referenciais
sobre a interação entre os tipos de microrganismos e os biocidas, bem como o uso prático dos
diversos componentes ativos em diferentes segmentos industriais foram consultados (Paulus,
2004) para a proposição dos ensaios.
De maneira sucinta, os biocidas selecionados eram das classes dos conservantes ou
dos sanitizantes. Os conservantes são substâncias ou preparações que previnem ou inibem o
desenvolvimento microbiano e são usados em formulações diversas para a preservação a
longo prazo destes materiais. Sanitizantes são substâncias ou preparações destinadas à
higienização e desinfecção em superfícies inanimadas e apresentam atuação rápida, mas não
duradoura (adaptado de Paulus, 2004). De acordo com a sua composição química (explicitada
em 3.2.2), tem-se que o Biocida 1 apresenta as duas propriedades acima mencionadas, mas
preponderantemente é um conservante. Os Biocidas 2 a 5 são da classe dos conservantes e os
Biocidas 6 a 8, da classe dos sanitizantes.
56
3.3.2- Ensaios preliminares: análise da atividade antimicrobiana dos biopolímeros
3.3.2.1- Avaliação da qualidade microbiológica inicial dos biopolímeros utilizados
A realização deste ensaio visou analisar interferentes naturais do produto para validar
os ensaios pretendidos de atividade antimicrobiana das quitosanas e do alginato.
Foram realizadas as análises considerando-se os polímeros em sua apresentação
original (pó), bem como em suas formas solubilizadas a 1% em seus respectivos solventes
estéreis, sendo solução aquosa contendo 1% de ácido acético para as quitosanas e água
destilada para o alginato. A presença de microrganismos nestes materiais foi verificada
conforme metodologias descritas a seguir.
Para as amostras na forma sólida, foi realizado o procedimento referido como teste de
exposição em placas. Foi pesado 1 g do material, dispondo-se o mesmo no centro de cada
placa de Petri contendo os meios de cultura sólidos seletivos para bactérias e fungos
(especificados no item 3.2.4). Com o auxílio de uma espátula esterilizada, o material foi
espalhado de modo a ocupar uma área de aproximadamente 4 cm2. As placas foram incubadas
em condições adequadas ao desenvolvimento dos microrganismos (informadas no item
3.3.1.3) e após incubação o grau de contaminação dos materiais foi avaliado considerando-se
a eventual área recoberta pelos contaminantes na superfície do material exposto, em
porcentagem.
Para as amostras na forma solubilizada, foi realizado o procedimento referido como
detecção microbiana por plaqueamento. Foi retirado 1 mL da solução e transferido para um
tubo de ensaio contendo 9 mL de água destilada estéril (diluição 10-1
). Tal procedimento foi
realizado sucessivamente por 3 vezes visando facilitar a posterior enumeração das células
presentes. Posteriormente, 1 mL do conteúdo de cada tubo contendo as diferentes diluições
preparadas foi adicionado e homogeneizado em placas de Petri separadas contendo os meios
de cultura seletivos para cada grupo microbiano. Após incubação nas condições especificadas,
foi efetuada a contagem das colônias microbianas (contador de colônias modelo CP-602,
Phoenix), e os resultados registrados, levando-se em consideração o número de colônias
microbianas presentes no meio de cultura e o fator de diluição da amostra plaqueada.
57
3.3.2.2- Avaliação da atividade antimicrobiana da quitosana sólida e em solução
Diferentemente do alginato, que é solúvel em água, a quitosana é solubilizada em
soluções ácidas que podem ser potencialmente ativas contra bactérias. Portanto, o objetivo
deste ensaio foi determinar a influência do ácido acético na atividade da quitosana, fixando-se
o uso da quitosana com desacetilação mínima de 85% para o preparo de soluções de
concentração de 1% (m/v) em ácido acético a 1% (v/v), com ajuste de pH para 4,0 e 7,0
(pHmetro e potenciômetro Gehaka PG-2000). Também, foram utilizadas a solução de ácido
acético a 1% e a quitosana in natura (sem diluição) isoladamente. As soluções foram
impregnadas em discos de papel de filtro de 2 cm, enquanto a quitosana na forma sólida foi
disposta diretamente sobre os meios de cultura previamente inoculados com os
microrganismos em culturas isoladas e mista.
Os seguintes ensaios foram realizados: avaliação da viabilidade celular de suspensões
microbianas após contato com a solução (morte celular) e a efetividade de inibição contra os
mesmos microrganismos, como segue.
Para avaliar a redução da contaminação inicial dos inóculos microbianos na forma de
suspensões mistas de bactérias, fungo filamentoso e leveduras, separadamente em tubos de
ensaio contendo água destilada esterilizada, a solução de quitosana foi adicionada às
suspensões contaminadas, na proporção de 1:1 (v/v). Posteriormente, fez-se a contagem das
células viáveis em cada suspensão, após o contato imediato com a quitosana (cerca de 15 s) e
após 24 h, para simulação da passagem da água através da membrana), de acordo com a
metodologia de detecção microbiana por plaqueamento, descrita no item 3.3.2.1.
Para a verificação da ação inibitória contra os mesmos microrganismos, teve-se
como base para as devidas adaptações a norma ABNT NBR 15987 (2011), originalmente
utilizada para a avaliação antimicrobiana e resistência de tintas após aplicação em superfícies.
Este ensaio consistiu na exposição do material a ser analisado em placas de Petri contendo
meio de cultura contaminado com os microrganismos-teste (a 106 UFC/mL), separadamente
por grupos microbianos. Após incubação em condições específicas para cada microrganismo
(vide item 3.3.3.2), a análise dos resultados foi realizada com base nos seguintes critérios:
a) observação da formação de uma área sem crescimento microbiano ao redor da amostra
(halo de inibição) significa atividade antimicrobiana satisfatória, atribuindo-se como critério
de seleção que a atividade antimicrobiana da amostra seria mais pronunciada quanto maior
58
fosse o tamanho do halo de inibição. Tal resultado indica que o agente antimicrobiano se
mostra apropriado para a proteção do material.
b) a não formação de um halo de inibição, com ausência de colônias microbianas sobrepostas
à amostra, indica atividade apreciável, mas não totalmente satisfatória. Neste caso, o resultado
indica que o agente antimicrobiano pode apresentar limitações de uso ou que sua dosagem
pode ser otimizada para maior efetividade de proteção do material (otimização esta não
realizada no presente trabalho).
c) a não formação de um halo de inibição acompanhada da presença de colônias microbianas
sobrepostas à amostra indica que a proteção antimicrobiana da amostra é relativamente baixa
ou ausente, dependendo da porcentagem de recobrimento evidenciado na superfície. O
resultado indica que o agente antimicrobiano pode não ser o mais apropriado para a aplicação
ou que potencialmente possa ser avaliado em dosagem aumentada, devendo-se considerar o
risco envolvido com a toxicidade versus o benefício.
3.3.3- Preparação das membranas: seleção do biopolímero e incorporação dos biocidas
3.3.3.1- Preparação das membranas
Com exceção do lactato de quitosana, que é solúvel em água, as demais quitosanas
foram solubilizadas em solução aquosa contendo ácido acético, conforme recomendado por
Bégin e van Calsteren (1999) em concentração proporcional à de quitosana utilizada (1 e 2%
m/v), mediante agitação suave em um agitador magnético (modelo 752-A Fisatom) à
temperatura ambiente por 24 horas.
No caso de membranas contendo agentes antimicrobianos coadjuvantes, sua adição foi
feita nesta etapa, em concentração de 1% (m/v). Posteriormente, para todas as formulações de
membranas, realizou-se a filtração da solução em placa de vidro sinterizado (modelo ISO-
P40, porosidade 3, Schott Duran) e desaeração (bomba de vácuo, 10 mbar, Buchi), e
armazenamento sob refrigeração. Foram adicionados 30 mL da solução de quitosana em uma
placa de Petri de poliestireno (90 x 15 mm), que foi colocada em estufa a 60ºC para secagem
até a evaporação do solvente (obtenção de película com consistência sólida e massa
constante). A seguir, a membrana foi transferida para um béquer contendo aproximadamente
59
200 mL de uma solução de hidróxido de sódio a 1M por 24 horas, visando a neutralização do
ácido residual, com posterior lavagem em água destilada. Após secagem à temperatura
ambiente, a membrana foi esterilizada com óxido de etileno (Acecil Central de Esterilização,
Campinas, SP) sob as seguintes condições: vácuo de 400 mmHg, 8 horas de exposição ao gás,
pressão de 0,5 kgf/cm2, umidade entre 40 e 50%, temperatura de 40°C e aeração de três trocas
com nitrogênio. As membranas foram utilizadas para os ensaios de efetividade logo após sua
preparação.
Alternativamente, foram preparadas membranas de alginato, que foi solubilizado em
água destilada nas concentrações de 1 e 2% m/v, seguindo-se o mesmo procedimento descrito
anteriormente para a obtenção de membranas de quitosana, mas utilizando-se solução aquosa
de cloreto de cálcio dihidratado a 0,05M como agente reticulante em substituição à de NaOH,
por 24 horas.
Os critérios eliminatórios aplicados na seleção das membranas contendo os biocidas
visando considerá-las competentes para o prosseguimento dos ensaios foram: apresentaram-se
com aspecto uniforme e terem adequada resistência física (facilidade no manuseio).
3.3.3.2- Atividade das membranas contra microrganismos planctônicos em cultivo de
superfície
Após a determinação das formulações que geraram membranas competentes pelo
ensaio anterior, tais membranas foram submetidas ao ensaio microbiológico preliminar de
exposição a microrganismos na forma planctônica.
Assim como previamente explicitado no item 3.3.2.2, o método de análise pela
formação do halo de inibição com base na norma ABNT NBR 15987 (2011), também foi
aplicado, mediante adaptações, para a avaliação das membranas. As mesmas foram cortadas
na forma de discos de 2 cm de diâmetro com o auxílio de um molde confeccionado de aço
inoxidável (esterilizado após cada uso por tipo de amostra), submersas rapidamente em água
destilada estéril para hidratação e transferidas para a superfície de placas de Petri contendo
meio de cultura contaminado com os microrganismos em culturas isoladas e mista. Após
incubação a 35±2ºC por 48 horas para bactérias e leveduras, e a 27±2ºC por até 7 dias para
bolores (em estufa modelo BOD, Tecnal), foi avaliada a presença de colônias sobrepostas ao
60
corpo-de-prova e a formação de um halo de inibição (sem crescimento microbiano) ao redor
do mesmo.
Em paralelo, o mesmo método foi aplicado para a formulação de membrana com
maior atividade global, utilizando-se um meio de cultura pobre em nutrientes (ágar mineral)
para avaliar se os microrganismos poderiam se desenvolver em maior proporção sobre a
membrana, tendo a mesma como única fonte de carbono disponível (ISO 846, 1997).
Para a avaliação comparativa da eficácia da membrana sob estudo com relação a uma
membrana atualmente comercializada para filtração de pequenos volumes de água
(membrana filtrante à base de celulose, com poros de 0,22μm e 75% de porosidade, tipo
GSTF02500 Millipore), empregou-se dois diferentes tipos de culturas mistas com carga
inicial de 106 UFC/mL, sendo o primeiro com as bactérias P. aeruginosa e S. aureus, e o
segundo com os fungos A. niger e C. albicans. Inoculou-se 0,5 mL da suspensão celular
diretamente na superfície de cada corpo de prova, que fora previamente depositado em meio
de cultura apropriado para o crescimento das culturas. Após o tempo de incubação padrão,
foi efetuada a quantificação das células viáveis (UFC/cm2) e mensurado o grau de
recobrimento de seu crescimento sobre cada material (porcentagem).
3.3.3.3- Atividade das membranas na prevenção do desenvolvimento de biofilmes
Para os estudos de formação dos biofilmes foram preparadas suspensões dos
microrganismos-teste isolados e em cultura mista e adicionados 10 mL das mesmas em cada
tubo de ensaio com tampa de rosca a uma concentração mínima de 107
UFC/mL. Membranas
de quitosana e de alginato (2 cm2) foram colocadas em contato com cada suspensão e
incubadas a 30ºC sob agitação (homogeneizador de sangue, modelo AP-22, Phoenix), por 48
horas (Capelletti, 2006). As membranas foram então retiradas e lavadas por três vezes com
água destilada esterilizada, transferidas para tubos contendo 10 mL de água destilada
esterilizada e as células formadoras de biofilme em sua superfície (aderidas) foram
desagregadas pelo uso de um sonicador de bancada (Ultrasonic Cleaner, modelo USC-1450,
25 kHz, Thornton) por 30 minutos, e quantificadas nos meios de cultura por plaqueamento.
Para a confirmação de que as células aderidas foram efetivamente removidas após a
sonicação por 30 min (destaca-se que as membranas mantinham sua integridade durante este
61
procedimento), as membranas foram colocadas sobre os meios de cultura aos quais foi
adicionado 0,1% (m/v) de um corante celular (cloreto de trifeniltetrazólio - TTC, Inlab). A
formação de coloração avermelhada clara, indicadora de difusão do corante através da
membrana de microrganismos eventualmente presentes, foi visualmente analisada (Ohara e
Saito, 1995).
A caracterização da formação de biofilme foi realizada com a utilização de um corante
que evidencia a matriz extracelular (Congo Red Agar - CRA), adicionando-se 0,08% (m/v)
nos meios de cultura utilizados para a visualização das células aderidas na membrana. A
detecção qualitativa de sua formação por bactérias com a utilização deste corante foi descrita
por Freeman et al. (1989), segundo os quais as culturas positivas formaram colônias negras e
as negativas, colônias vermelhas escuras.
3.3.3.4- Caracterização da membrana antimicrobiana selecionada
A membrana selecionada com melhor desempenho antimicrobiano global, que
mostrou-se apta para o prosseguimento dos ensaios utilizando-se agentes antimicrobianos
complementares, foi avaliada quanto à morfologia de sua superfície, ao grau de hidratação, e
ao grau de degradação microbiológica, como se segue.
O aspecto visual da membrana foi verificado quanto à ausência de rupturas ou fraturas
após a secagem e sua superfície foi analisada por microscopia eletrônica de varredura (modelo
LEO 440, 10 KV de potência, 100 pA corrente, Leica) e por microscopia de força atômica
(modelo Park-M5AFM, varredura de 25 µm e taxa de 1.5 Hz, Park Scientific Instruments,
CA).
O preparo da membrana para análise de microscopia eletrônica de varredura envolveu
o seu dimensionamento em corpo de prova de 2 cm x 1 cm com o auxílio de um molde de
vidro, e exposição a um dessecador por 24 horas. Após este período, a membrana foi fixada
em um suporte adequado e metalizada (mini Sputter 40 coater, SC 7620) através da deposição
de uma fina camada de ouro (espessura de 92 Angstrons) em sua superfície. Para a obtenção
das imagens da seção transversal, a amostra foi fraturada em nitrogênio líquido antes de sua
metalização.
Ao contrário dos microscópios óticos ou eletrônicos, o microscópio de força atômica
62
não se utiliza de lentes para a obtenção de imagens nem de feixe de elétrons. Esse
equipamento usa uma sonda de dimensões muito reduzidas para ampliar as características da
superfície e o preparo da amostra não necessita de etapas complexas, sendo suficiente a
exposição da membrana sem qualquer agente fixador. Optou-se por analisar a membrana em
estudo de duas maneiras, na forma seca e após submersão em água destilada até sua
hidratação.
Para a análise do grau de hidratação, a membrana foi cortada para a obtenção de
amostras redondas com área de 2 cm2, pesada e posteriormente imersa por 48 horas em um
frasco contendo 50 mL de água destilada ou de solução com nutrientes (Nutrient Broth,
Oxoid). Após secagem sob leve compressão entre duas folhas de papel de filtro por um
minuto, foi novamente pesada. O valor foi determinado a partir da diferença percentual entre
as massas obtidas da membrana antes e após a hidratação.
O grau de degradação microbiológica foi avaliado pela variação da massa de amostras
de membrana de 2 cm2 após 30 dias de contato com suspensões mistas de bactérias e de
fungos com concentrações de 108 UFC/mL e de 10
7 UFC/mL, respectivamente, contendo
50 mL de inóculo acondicionado em frascos separados. A secagem prévia da membrana para
a sua pesagem final foi realizada em temperatura ambiente por 24 horas.
3.3.4- Ensaios de triagem das membranas com biocidas em condições basais
3.3.4.1- Atividade preliminar das membranas contendo biocidas na avaliação contra
microrganismos padronizados
A norma ABNT NBR 15987 (2011) foi também empregada nesta avaliação, conforme
descrito inicialmente em 3.3.2.2.
3.3.4.2- Atividade da membrana contra microrganismos amostrados de sistema de água
contaminado
A membrana selecionada através dos ensaios preliminares foi submetida aos
63
microrganismos nativos, adaptados em um sistema de água contaminado de um vestiário
industrial, conforme previamente definido (item 3.3.1.2). Utilizou-se, também, os mesmo
métodos estabelecidos e descritos nas avaliações anteriores (norma ABNT NBR 15987, 2011)
para a avaliação da formação do halo de inibição, bem como especificado no item 3.3.3.3 para
a avaliação de atividade contra biofilmes.
3.3.5- Condições de exposição críticas para a avaliação da ampliação de atuação das
membranas
3.3.5.1- Ensaio de lixiviação das membranas
As membranas contendo os agentes antimicrobianos coadjuvantes foram submetidas a
um fluxo contínuo de água por 5 dias (lixiviação), tendo como base a Norma ABNT NBR
15987 (2011) para a verificação da manutenção de seu efeito antimicrobiano mediante a
simulação de contato prolongado ao fluxo de água. Foi utilizado um tanque de acrílico (Figura
9), confeccionado de acordo com os parâmetros estabelecidos na referida norma.
(a) (b)
Figura 9: (a) Tanque de acrílico utilizado no ensaio de lixiviação das membranas; (b)
Exemplo de gancho revestido em plástico para acoplar e manter as membranas submersas no
tanque.
64
O tanque apresentava 20 compartimentos, e tinha capacidade para comportar
aproximadamente 2 L de água e acomodar cada amostra separadamente para evitar
contaminação cruzada por substâncias interferentes, com o uso de um gancho em formato de
S, que permitiu deixar cada membrana em posição vertical, paralela ao fluxo de água dentro
do tanque. O tanque foi interligado a uma torneira com fluxo contínuo de água potável, em
que o aparato de controle de esgotamento de água foi ajustado para garantir que um ciclo de
troca completa da água se concluísse a cada 24 horas (fluxo de 1,5 mL/min). Após secagem à
temperatura ambiente, as membranas foram avaliadas quanto à sua capacidade de inibição
microbiológica comparativa aos resultados anteriores a este experimento.
3.3.5.2- Atuação antimicrobiana por exposição a microrganismos patogênicos
Neste ensaio verificou-se a atuação das membranas contra microrganismos com
caráter patogênico por estes disporem de mecanismos de inativação de agentes
antimicrobianos geralmente diferenciados das células microbianas ambientais. O método
utilizado foi o mesmo empregado para as células não-patogênicas, para fins de comparação
(norma ABNT NBR 15987, 2011).
3.3.5.3- Análise da variação do desempenho da membrana biopolimérica ao longo do
tempo de utilização
Este ensaio consistiu em avaliar de maneira presuntiva a durabilidade e eficácia
antimicrobiana da membrana, a partir dos ensaios do tipo Challenge test tendo como base a
norma ABNT NBR 15821 (2010) originalmente utilizada na simulação de inoculações
ambientais ou oriundas de processo para a garantia da preservação antimicrobiana de
materiais, como tintas e produtos afins, e a estimada presença de cepas persistentes, conforme
explicitado a seguir.
Para simular condições críticas de utilização da membrana e avaliar a preservação das
suas características físicas e da efetividade do material durante o período de utilização, foi
efetuada a contaminação da membrana com elevada carga microbiana inicial (108 UFC/mL
para bactérias e de 107 UFC/mL para fungos). Após 30 dias de ensaio, contemplando 3
recontaminações a cada 7 dias, a enumeração das células remanescentes ao contato com a
65
membrana foi avaliada e classificada de forma comparativa com uma escala de densidade de
recobrimento da área amostrada em placa de Petri, ilustrada na Figura 10. Também, a
presença de cepas persistentes após exposição continuada à membrana foi avaliada,
utilizando-se um inóculo inicial de 108 UFC/mL para bactérias e de 10
7 UFC/mL para fungos,
seguindo a metodologia de halo de inibição, porém com exposições sequenciais, conforme
ilustrado na Figura 11.
Grau 4 Grau 3 Grau 2 Grau 1 Grau 0
Figura 10: Ilustração dos graus de contaminação microbiana para a leitura dos resultados.
Figura 11: Ilustração da técnica empregada de validação estimada para o uso da membrana.
Exposições sucessivas:
Avaliação da diminuição
da atividade
Primeira exposição:
Atividade antimicrobiana
inicial
Após n exposições:
Eventual perda da
atividade
Membrana
polimérica
Meio de cultura com
microrganismo-padrão
Halo de
inibição
Retirada de cepas para
inoculação em
exposição posterior
Recobrimento da
membrana pelo
microrganismo
Interpretação dos resultados:
Grau 0 = Ausência de crescimento microbiano
Grau 1 = Presença de 1 a 9 colônias
Grau 2 = Presença de 10 a 99 colônias
Grau 3 = Presença de 100 a 300 colônias
Grau 4 = Crescimento contínuo, não sendo possível distinguir cada colônia separadamente
66
O procedimento foi realizado por dez vezes consecutivas, utilizando como inóculo a
cultura próxima à membrana contida na placa anterior, com substituição por uma nova
membrana estéril a cada passagem. O grau de contaminação na superfície das membranas foi
avaliado em porcentagem de recobrimento microbiano.
67
CAPÍTULO 4:
RESULTADOS E DISCUSSÃO
68
4.1- AVALIAÇÃO DO CENÁRIO, AMOSTRAGEM DE CONTAMINANTES INDUSTRIAIS
DE SISTEMAS DE DISTRIBUIÇÃO DE ÁGUA VISANDO À SELEÇÃO DE BIOCIDAS
4.1.1- Levantamento do panorama geral e do perfil de contaminantes em sistemas
envolvendo água no segmento industrial.
O objetivo principal desta seção é a apresentação e análise dos dados de contaminação
coletados de variados ambientes industriais nos quais há circulação de água visando
inicialmente confirmar dados de sua ocorrência em setores específicos para, em seguida,
direcionar a análise de factibilidade de uso das membranas de biopolímeros produzidas
associadas ou não a biocidas.
Para isto, executou-se uma sequência de inspeções para a identificação de pontos
críticos que pudessem favorecer o desenvolvimento microbiano indesejado no sistema de
distribuição de água de processo implantado nestas empresas. Esta avaliação inicial à coleta
de amostras se faz importante, uma vez que potenciais fontes de contaminação não
identificadas previamente podem ocasionar surtos de dispersão microbiana recorrentes, o que
comprometeria os resultados de efetividade do tratamento do sistema contra o
desenvolvimento indesejado de microrganismos.
Foram analisados setores idênticos em natureza de sua função em indústrias dos
seguintes segmentos: de cosméticos, de domissanitários e de processamento de artigos para
uso escolar. Os contaminantes e seus respectivos locais de incidência nestes sistemas de água
são mostrados na Tabela 7. Além dos pontos críticos estabelecidos para a coleta destas
amostras, foi, em paralelo, identificada uma área crítica de uso comum em uma das indústrias
relacionadas, um vestiário apresentando focos de dispersão de contaminação, cujas análises
estão explicitadas na Tabela 8.
Os resultados das amostras dos três segmentos investigados indicam que, mesmo sob
rigorosos protocolos e procedimentos de higiene e manutenção, como pela adição de biocidas,
adotados por tais empresas com exigências regulatórias acentuadas, ainda são observados
níveis de contaminação críticos, que podem comprometer tanto a cadeia produtiva quanto a
saúde de profissionais pela exposição continuada a possíveis patógenos.
69
Tabela 7: Contaminação microbiológica em amostras de água industrial, abrangendo a média de 15 amostras para cada ponto avaliado.
Amostras coletadas nos pontos críticos avaliados
Perfil de contaminação (UFC/mL)
Segmento de
Cosméticos
Segmento de
Domissanitários
Segmento de
Artigos escolares
Média de
contaminação por
grupo microbiano
Água de entrada de processo
Bactérias 104 10
5 10
5 10
5
Fungos 102 10
3 10
3 10
3
Biofilme misto 0 103 10
2 10
2
Água após filtração
Bactérias 102 10
4 10
3 10
3
Fungos 101 10
1 10
2 10
1
Biofilme misto 102 10
3 10
3 10
3
Água desmineralizada
Bactérias 102 10
3 10
3 10
3
Fungos 0 0 0 0
Biofilme misto 101 10
2 10
1 10
1
Água após osmose reversa
Bactérias 101 10
2 10
3 10
2
Fungos 0 0 0 0
Biofilme misto 102 10
2 10
2 10
2
Água de torre de resfriamento
Bactérias 102 10
2 10
2 10
2
Fungos 101 10
2 10
2 10
2
Biofilme misto 103 10
4 10
4 10
4
Água de reservatório
Bactérias 103 10
4 10
6 10
5
Fungos 102 10
4 10
6 10
5
Biofilme misto 103 10
4 10
4 10
4
Água de tubulações
Bactérias 105 10
5 10
5 10
5
Fungos 104 10
4 10
5 10
4
Biofilme misto 106 10
6 10
6 10
6
Água de mangueira para a
lavagem de acessórios
Bactérias 102 10
4 10
3 10
3
Fungos 102 10
3 10
3 10
3
Biofilme misto 105 10
5 10
5 10
5
Água em tanque para
reprocesso/reuso
Bactérias 102 10
4 10
4 10
3
Fungos 0 101 10
1 0
Biofilme misto 102 10
2 10
2 10
2
Bioaerossol em área de
produção
Bactérias 102 10
3 10
3 10
3
Fungos 106 10
6 10
6 10
6
Biofilme misto - - - -
70
Tabela 8: Contaminação microbiológica em amostras de um vestiário industrial, com
evidentes focos de contaminação por dispersão no ambiente.
Amostras coletadas em um
vestiário industrial
Perfil de contaminação
(UFC/mL)
Bactérias Fungos Biofilmes
mistos
Água de chuveiro em vestiário 106 0 0
Chuveiro em vestiário 0 106 10
6
Bioaerossol ambiental em vestiário 0 106 0
Na Tabela 7 as amostras foram ordenadas de tal modo que se pudesse visualizar a
sequência convencional encontrada nas linhas industriais inspecionadas. Evidencia-se, desta
forma, que o nível de contaminação tende a aumentar conforme se avança nos pontos
amostrados por onde a água percorre o sistema, evidenciando também que nos locais em que
a água pode estagnar há uma maior concentração de contaminantes e que potencialmente pode
atingir pontos posteriores do sistema, o que, consequentemente, interfere na atuação dos
tratamentos de higiene e sanitização convencionais.
Observa-se que a predominância microbiana nas amostras de água é de bactérias,
porém na amostragem da estrutura de abrigo em cada ponto de coleta a presença de biofilmes
é uma constante, contendo majoritariamente a presença de fungos (dados não reportados em
separado).
Também, observa-se que um prováveis focos iniciadores da contaminação é a própria
água de entrada dos sistemas, a qual apresenta contaminação inicial elevada que compromete
boa parte dos componentes ativos disponíveis em produtos antimicrobianos, fazendo com que
a dosagem a princípio tida como satisfatória para o controle do sistema se mostre insuficiente
para a manutenção integral de sua efetividade.
Do mesmo modo, os processos de filtração e de osmose reversa sofrem as
consequências da contaminação cruzada, causando ainda mais danos ao sistema, por
abrigarem contaminantes que, muitas vezes podem não ser detectados nas amostragens de
rotina, inspirando uma falsa segurança microbiológica pontual.
71
Na Tabela 8, os resultados da coleta de amostras em um dos setores mais críticos, a
área de vestiários, evidencia-se que além de o sistema apresentar elevada contaminação em
diferentes pontos de circulação de água, há grande potencial de risco com a disseminação
direta de contaminantes aos usuários durante sua higienização. O sistema de interligação da
água aos chuveiros está comprometido com a presença de biofilmes, em nível de
desenvolvimento que afetou também o ar, considerada como outra via importante de
dispersão.
Conforme mencionado na revisão bibliográfica, em um sistema industrial, o processo
de controle deve ser delineado no sentido de que haja adequação do projeto para a construção
e instalação dos equipamentos (sem zonas de estagnação em tubulações e conexões),
utilização de materiais que apresentem características que facilitem a limpeza e a
implementação de monitoramento para o controle efetivo de contaminantes e de sua remoção
(LeChevallier, 1990). Em processos cujos equipamentos já estão instalados e em
funcionamento, com frequência não é possível fazer grandes modificações por restrições de
espaço físico ou orçamentárias, de modo a consolidar a proposta do presente trabalho, de
instalação de dispositivos de filtração constituídos de membranas de polissacarídeos
incorporando ou não biocidas, como estratégia de mitigação do problema de contaminação
microbiana em sistemas de distribuição de água.
Visto que, com base no levantamento inicial efetuado, a área de vestiários apresenta
elevado nível de contaminação microbiana e que não só indústrias dos segmentos avaliados
apresentam este setor, mas também empresas de prestação de serviços das mais diversas
naturezas assim como clínicas e hospitais, dentre outros empreendimentos, selecionou-se para
este estudo, como sistema modelo, um ambiente de vestiário típico de uma empresa
frequentado por mais de 50 usuários ao longo do dia.
4.1.2- Análise da microbiota coletada de sistema de água visando seu uso nos ensaios de
efetividade
As amostras coletadas em três distintos locais no sistema de água sob estudo (da água
de chuveiro, do biofilme de chuveiro e do bioaerossol de um vestiário industrial) mostraram
elevado nível de contaminação para todas as amostragens (acima de 106 UFC/mL) e ampla
diversidade de microrganismos, havendo predomínio de fungos em relação a bactérias
72
(Tabela 9).
Algumas características importantes podem ser ressaltadas na análise dos gêneros de
contaminantes fúngicos detectados. O Alternaria é comum em causar reações de
hipersensibilidade em humanos. Seus esporos deslocam-se pelo ar e podem ser encontrados
no solo e na água, bem como no interior de construções. O Monilia é um dos fungos
contaminantes mais comuns, pois tem grande habilidade de adaptação a diversificadas
condições ambientais. O Penicillium, comum bolor do pão, cresce em presença de matéria
orgânica, especialmente no solo e outros ambientes úmidos e escuros. Por contágio, chegam a
invadir habitações e, com frequência, se instalam em alimentos de consumo humano. O
Aureobasidium pode produzir diferentes enzimas e a exposição crônica a ele via
umidificadores ou ar condicionado pode levar a problemas respiratórios graves. O
Trichophyton é o mais frequente isolado de material clínico que acomete a pele, cabelo e
unhas, por serem queratinofílicos (Koneman et al., 2001).
Quanto a bactérias, destacam-se as células de Pseudomonas aeruginosa e
Staphylococcus aureus. A Pseudomonas aeruginosa, espécie do tipo Gram-negativa, aeróbia
e baciliforme, tem como ambiente de origem o solo, mas por ser capaz de sobreviver em
outros ambientes hostis, sua ocorrência é comum. É um patógeno oportunista, e apresenta
resistência natural a um grande número de antibióticos e antissépticos, o que a torna uma
importante causa de infecções hospitalares. A Staphylococcus aureus é uma bactéria esférica,
do grupo dos cocos Gram-positivos, frequentemente encontrada na pele e nas fossas nasais de
pessoas saudáveis. Entretanto, pode provocar doenças, que vão desde uma simples infeção
(espinhas, furúnculos e celulites) até infeções graves (pneumonia, meningite, endocardite,
síndrome do choque tóxico, septicemia e outras) (Koneman et al., 2001).
Os microrganismos coletados foram preparados na forma de inóculos (vide item
3.3.1.3) e utilizados nas etapas subsequentes do estudo, de análise da atividade das
formulações de membranas biopoliméricas contra contaminantes diversos até a validação de
efetividade sob condições adversas.
73
Tabela 9: Gênero provável e aspecto dos contaminantes detectados nas amostras coletadas do sistema de água em vestiário industrial.
Local de amostragem
e concentração
celular detectada
Aspecto dos
contaminantes
Descrição visual
dos contaminantes
Aspecto avaliado por visualização
microscópica
Gênero provável do
microrganismo
Bioaerossol
Ambiental
>10
6UFC/mL
Biofilme
de chuveiro
>10
6UFC/mL
Água
de chuveiro
>10
6UFC/mL
Bactéria esverdeada Bacilos Gram-negativos Pseudomonas aeruginosa
Bactéria alaranjada Cocos Gram-positivos Staphylococcus aureus
Bolor negro Hifas e glóbulos negros repletos de esporos Aureobasidium
Bolor bege Hifas septadas arredondadas Trichophyton
Bolor branco Septos nodulares formadores de esporos Monilia
Bolor branco com centro negro Hifas asseptadas e esporos ovalados Penicillium
Bolor amarronzado Hifas delgadas e esporos arredondados Alternaria
Bolor verde Hifas asseptadas e esporos ovalados Penicillium
74
4.2- ANÁLISE PRELIMINAR DOS BIOPOLÍMEROS
4.2.1- Avaliação microbiológica dos biopolímeros e interferência do ácido acético usado
na solubilização da quitosana
Inicialmente, o alginato de sódio, bem como os diferentes tipos de quitosana sob
avaliação, foram expostos aos meios de cultura seletivos para o desenvolvimento de bactérias
e de fungos, visando a verificação de sua qualidade microbiológica inicial na ausência de
microrganismos inoculados. Não foi detectada a presença de quaisquer contaminantes nos
meios utilizados para os biopolímeros em questão. Assim, qualquer crescimento microbiano
apresentado nos resultados subsequentes foi interpretado como decorrente do próprio inóculo
utilizado.
Especialmente para a avaliação da atividade antimicrobiana conferida à quitosana,
levou-se em conta a conhecida atuação proporcionada pelo ácido acético usado para a sua
dissolução. Várias são as citações de sua efetividade em solução contra bactérias, fungos e
leveduras, porém com cepas testadas de maneira isolada. A fim de se verificar se há atividade
contra contaminantes em consórcio (forma abundantemente encontrada em diversos
ambientes), a quitosana em pó a 1% (forma inativa) e o diluente preconizado para sua
solubilização e ativação de cargas positivas (ácido acético a 1%) foram avaliados quanto à
atividade desempenhada contra microrganismos padronizados mistos. O desempenho
antimicrobiano da quitosana em solução contra os inóculos testados é apresentado na Tabela
10.
De acordo com os resultados abaixo, pode-se verificar que houve redução no número
de células viáveis nos três inóculos após contato com a solução de quitosana. A atividade
antimicrobiana mais pronunciada da solução foi verificada em relação à levedura, para a qual
foi observada maior redução (acima de 2 escalas logarítmicas) no número inicial de células.
Deve-se considerar que embora sutil, a erradicação celular global foi instantânea, resultado
este favorável para a continuidade dos ensaios com a quitosana para a finalidade proposta. Ao
final de 24 horas notou-se maior redução na carga de bactérias, enquanto que para as
leveduras a redução foi a menos pronunciada.
75
Tabela 10: Quantificação das células viáveis presentes nas suspensões microbianas antes e
após contato com a quitosana a 1% em solução aquosa de ácido acético a 1% (pH 5,0),
durante diferentes períodos.
Tipo celular Concentração inicial
(Log UFC/mL)
Concentração final
(Log UFC/mL)
Após contato imediato
(15 segundos)
Após contato de
24 horas
Bactérias mistas
Fungo
Levedura
6,40
4,47
4,65
6,10
4,17
2,00
3,30
3,00
1,50
Foi também realizado o ensaio de formação de halo de inibição, avaliando-se a
quitosana e o ácido acético isoladamente, bem como a interação entre os mesmos e o efeito do
pH da solução de quitosana em ácido acético, para a verificação da atividade antimicrobiana
inerente a cada componente. Os resultados são apresentados na Tabela 11 e ilustrados na
Figura 13. Destaca-se, de antemão, que nas situações em que o halo é nulo (H = 0), pode ter
ocorrido difusão de compostos que inibem o crescimento celular, e que quando o
recobrimento é nulo (R = 0), pode ser observada inibição do crescimento por contato.
Tabela 11: Avaliação individual do desempenho antimicrobiano da quitosana in natura com
desacetilação mínima de 85%, em solução ácida a 1%, e de seu diluente, ácido acético a 1%
em água.
H = halo de inibição; R: recobrimento da superfície da amostra.
* = crescimento debilitado do microrganismo, visualizado macroscopicamente.
Amostras
Bactérias Bolor Levedura
H
(mm)
R
(%)
H
(mm)
R
(%)
H
(mm)
R
(%)
Quitosana in natura (10 g) 0 25 0 50 * 0 75
Solução de ácido acético a 1% (pH 5,0) 3 0 0 100 0 100
Quitosana a 1% em ácido acético a 1%
(com ajuste de pH para 4,0)
0 25 0 100 0 0
Quitosana a 1% em ácido acético a 1%,
(com ajuste de pH para 7,0)
0 100 0 75 100 0
76
Figura 13: Aspecto das amostras avaliadas quanto aos halos de inibição contra
microrganismos. Colunas: a coluna 1 abrange os ensaios utilizando-se o inóculo misto de
bactérias Gram-positivas e Gram-negativas; a coluna 2, o inóculo de bolores e a coluna 3, o
inóculo de leveduras. Linhas: (a, b, c) representam a quitosana in natura; (d, e, f) referem-se
à solução de ácido acético a 1%; (g, h, i) indicam formulação de quitosana a 1% em pH 4,0;
(j, k, l) referem-se à formulação de quitosana a 1% em pH 7,0.
A quitosana in natura mostrou-se parcialmente inibitória ao desenvolvimento
microbiano, pois sua superfície não foi totalmente recoberta pelos microrganismos testados,
G
I
G
I
1 2 3
77
mesmo não estando em sua forma ativada solúvel.
A solução de ácido acético (seu diluente padrão) apresentou atividade contra o
crescimento misto de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, formando um evidente halo
de inibição, mas o mesmo efeito não foi obtido contra os bolores e leveduras. Liu et al. (2004)
obtiveram bons resultados na erradicação da bactéria Escherichia coli utilizando uma solução
de acetato de quitosana a 1%, em suspensão microbiana com concentração de 104
UFC/mL. O
número de células viáveis foi reduzido em uma escala logarítmica por um período de 5
minutos de exposição e as demais células foram erradicadas em 120 minutos. Outros
pesquisadores têm reportado resultados semelhantes com o uso de glutamato de quitosana
contra Enterobacter aerogenes e Staphylococcus aureus (Sudarshan et al., 1992).
A formulação em pH 4,0 foi mais efetiva no controle de bactérias, enquanto que em
pH 7,0 a atividade contra bactérias foi desfavorecida, porém com atividade mais pronunciada
contra o grupo dos fungos (bolores e leveduras). O pH da solução tem influência na ativação
iônica dos grupamentos amino da quitosana. Uma vez que o pKa dos grupos d-glicosamina da
quitosana é de aproximadamente 6,5, o biopolímero se encontra em condições favoráveis para
sua protonação em soluções ácidas com pH inferior a este valor (Santos et al., 2007). Porém,
neste ensaio a quitosana também atuou em pH 7,0, mas de modo distinto ao verificado em pH
4,0. Um fator relevante que pode ser atribuído aos resultados obtidos é que as bactérias se
desenvolvem preferencialmente em ambientes alcalinos, na faixa de pH entre 7,0 a 10,0 já os
fungos se adaptam melhor em meio ácido, compreendendo valores de pH entre 4,0 a 7,0
(Thor Brasil Ltda., 2008). Portanto, é possível que tais condições distintas de pH das soluções
precursoras das membranas favoreceram a seleção dos microrganismos, vindo a contribuir
para a atuação da quitosana.
Destaca-se que estudos equivalentes aos realizados para a quitosana solubilizada em
solução aquosa de ácido acético não foram realizados para o alginato por este composto ser
comumente dissolvido em água para a formulação de membranas.
Com este conjunto de dados, tem-se que os biopolímeros quitosana e alginato nas
formas sólida e em solução aquosa apresentam potencial de uso para as formulações de
membrana pretendidas.
78
4.3- PREPARAÇÃO DAS MEMBRANAS POLIMÉRICAS, SELEÇÃO DO BIOPOLÍMERO E
INCORPORAÇÃO DOS BIOCIDAS
4.3.1- Avaliação do desempenho de membranas competentes após formulação e seleção
do biopolímero antimicrobiano mais promissor
Todas as membranas obtidas a partir das soluções poliméricas preparadas mostraram-
se íntegras e foram consideradas aptas para a continuidade dos ensaios, considerando-se os
diversos materiais empregados que contemplaram as variáveis: grau de desacetilação da
quitosana (85 e 98%), massa molar da quitosana (150, 300 e 400 KDa) e concentração dos
biopolímeros quitosana e alginato (1 e 2%).
4.3.2- Desempenho das membranas contra culturas padronizadas isoladas e mistas
As membranas preparadas que se apresentaram morfologicamente adequadas no
ensaio anterior foram submetidas ao teste microbiológico preliminar de exposição a
microrganismos na forma planctônica, cujos resultados estão explicitados na Tabela 12.
Destaca-se que após sua confecção, as membranas foram submersas em água destilada
estéril e os valores de pH (7,2) e de potencial redox (270 mV) foram mensurados antes e após
contato estático e dinâmico em tubos agitados por 72 horas. Como os valores obtidos não
sofreram alteração, supôs-se que as etapas de lavagem foram capazes de remover eventuais
moléculas livres não incorporadas às membranas, já que não foram detectados resíduos
químicos em quantidade suficiente, evitando assim a presença de relevantes interferentes nos
ensaios de desempenho antimicrobiano propostos.
De acordo com os dados abaixo explicitados, abordando-se a diferenciação de atuação
entre os tipos e polímeros, tem-se que o alginato (que tem cargas negativas) apresentou
resultados gerais inferiores aos apresentados pela quitosana (que tem cargas positivas), em
relação ao ensaio com bactérias. Em relação à inibição do desenvolvimento dos
microrganismos Serratia marcescens e Candida albicans, as membranas tanto de quitosana
quanto de alginato apresentaram similaridade de desempenho, sendo verificada ausência da
formação de halo, porém sem recobrimento de sua superfície. Para fungos (levedura e bolor),
os resultados obtidos foram os mesmos para ambos os polímeros testados, apesar de se saber
que majoritariamente a membrana celular de microrganismos apresenta preponderantemente
79
cargas superficiais negativas e, considerando a ocorrência de interação eletrostática, a atração
entre as células e os agentes catiônicos pode favorecer o mecanismo de ação antimicrobiano.
Tabela 12: Resultados do teste de inibição das membranas contra microrganismos isolados.
Tipo de membrana
Bactérias
mistas
P.
aeruginosa
S.
marcescens
S.
aureus
C.
albicans
A.
niger
H
(mm)
R
(%)
H
(mm)
R
(%)
H
(mm)
R
(%)
H
(mm)
R
(%)
H
(mm)
R
(%)
H
(mm)
R
(%)
Quitosana a 1%
(desacetilação mínima de 98%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 75
Quitosana a 2%
(desacetilação mínima de 98%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 75
Quitosana a 1%
(desacetilação mínima de 85%) 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0
Quitosana a 2%
(desacetilação mínima de 85%) 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0
Quitosana a 1%
(baixa massa molar: 150 g/mol) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Quitosana a 1%
(média massa molar: 400
g/mol)
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Lactato de quitosana a 1%
(340 g/mol) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Alginato de sódio a 1% 0 25 0 50 0 0 0 0 0 0 0 75
Alginato de sódio a 2% 0 25 0 50 0 0 0 0 0 0 0 75
H = halo de inibição; R: recobrimento da superfície da amostra.
Com relação à correlação entre a concentração dos biopolímeros e sua atividade,
verificou-se que o aumento da concentração de 1% para 2%, tanto das quitosanas com
desacetilação mínima de 98% ou de 85% quanto do alginato, não potencializou o efeito das
membranas contra os microrganismos testados e, portanto, a concentração de 1% dos
polímeros foi fixada para o preparo das membranas nas próximas avaliações.
Quanto ao uso das quitosanas de baixa e média massas molares, bem como o uso de
80
lactato de quitosana não geraram membranas com atividade superior, de forma que tais
formulações foram desconsideradas nos ensaios posteriores. Para correlacionar tais evidências
com dados previamente reportados por outros pesquisadores, os resultados obtidos foram
comparados aos de Zheng e Zhu (2003) e Mi et al. (2001).
De acordo com Zheng e Zhu (2003), micrografias eletrônicas de S. aureus (bactéria
Gram-positiva) e de E. coli (bactéria Gram-negativa) mostram que na presença de quitosana
em solução a membrana da S. aureus foi enfraquecida e fragmentada, enquanto o citoplasma
da E. coli foi concentrado e o interstício da célula ampliado. Demonstrou também que a
atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas aumenta com a elevação da massa
molar do polímero, enquanto que, para bactérias Gram-negativas, ocorre o inverso. Os
resultados sugerem que os efeitos da quitosana são distintos nos dois tipos de bactérias: no
caso das Gram-positivas, a hipótese é de que a quitosana de alta massa molar forma uma
película ao redor da célula que acaba por inibir a absorção de nutrientes, enquanto que a
quitosana de baixa massa molar penetra mais facilmente em bactérias Gram-negativas,
causando distúrbios no metabolismo desses microrganismos.
Já Mi et al. (2001) constataram que membranas de quitosana com tamanho de poros
superior ao das células de Pseudomonas aeruginosa e de Staphylococcus aureus (acima de
0,5 µm) foram capazes de retê-las. Porém, nos ensaios aqui apresentados, foi constatado que a
atividade antimicrobiana da membrana de quitosana foi proeminente apenas contra a bactéria
Gram-positiva Staphylococcus aureus. Pode-se inferir dos resultados que a ação da membrana
não é apenas por retenção mecânica, podendo também se dar por interação química.
De modo geral, nota-se que a formulação de membrana com resultados mais
apreciáveis é a contendo quitosana no mínimo 85% desacetilada, que se destacou com relação
à inibição do crescimento da bactéria Staphylococcus aureus (Gram-positiva) formando um
halo de inibição. Contrariamente ao que possa ocorrer com soluções ou agentes carreadores
de antimicrobianos de liberação controlada nos quais a formação do halo pode ser devido à
solubilidade em água do agente ativo que se dispersa para o meio circundante e
desprotegendo a superfície do material, a formação do halo apresentado pela membrana de
quitosana a 1% com desacetilação mínima de 85% foi proporcionada sem que houvesse o
comprometimento da proteção antimicrobiana de sua superfície, que se mostrou isenta de
contaminantes. Apesar disto, o mesmo efeito não ocorreu com a suspensão mista de bactérias,
que também contém tal microrganismo. Para esclarecer tal resultado, pode-se levar em conta
81
que na interação entre as espécies microbianas presentes na suspensão ocorre o favorecimento
do crescimento das cepas com melhor adaptação e que interfere diretamente nos resultados de
erradicação. Outro fator que pode ser destacado é que a estrutura celular das bactérias Gram-
negativas se diferencia das Gram-positivas por apresentarem uma parede celular espessa, um
sistema eficiente de efluxo de substâncias agressivas às células e enzimas capazes de degradar
antibióticos (tais como L-lactamase) e que contribuem para que estas sejam mais difíceis de
serem erradicadas (Hancock, 1997). Em adição, de acordo com dados da literatura, o gênero
Pseudomonas tem maior caráter hidrofóbico, enquanto o gênero Staphylococcus, hidrofílico.
Porém, um estudo realizado por Bayoudt et al. (2006) demonstrou que quando expostas a
superfícies, a energia de adesão da bactéria Pseudomonas é superior à da Staphylococcus
tanto para materiais hidrofílicos (vidro) quanto para hidrofóbicos (óxido índico). No entanto,
estas informações elucidam apenas uma parte da complexa interação entre microrganismos e
agentes antimicrobianos.
Outro estudo que pode ser correlacionado aos dados aqui relatados é o de Nadarajah
(2005). Este autor observou que membranas compostas por quitosana a 1%, dissolvida em
dois diferentes ácidos apresentaram atividade antibacteriana. O uso do ácido fórmico a 1%,
caracterizou atividade antimicrobiana contra bactérias patogênicas, como Staphylococcus
aureus, Salmonella typhimurium e Shigella sonnei. Membranas formadas com a quitosana
solubilizada em ácido cítrico em substituição ao ácido fórmico apresentaram maior
capacidade para a redução dos níveis de contaminação contra estes microrganismos (4 escalas
logarítmicas em 24 horas, em comparação com 2 escalas), mas mostraram menor resistência
mecânica). No entanto, nos ensaios aqui apresentados, apesar de ter sido verificada atividade
inibitória apenas contra a cultura Gram-positiva, optou-se por dar continuidade ao uso do
ácido acético e incrementar a atuação antimicrobiana deficitária da membrana de quitosana
com a incorporação dos agentes biocidas pretendidos.
Portanto, tendo-se que a membrana com melhor atividade global foi a de formulação
com quitosana no mínimo 85% desacetilada, cujas imagens representativas do ensaio de halo
de inibição são mostradas na Figura 14, foi realizado um teste complementar com os mesmos
microrganismos-teste, mas utilizando-se um meio de cultura com composição mínima para o
desenvolvimento microbiano, a fim de se verificar o ataque direto dos contaminantes na
superfície da membrana que, nestas condições, poderia atuar como fonte de carbono,
nitrogênio e outros nutrientes para as células. As imagens são mostradas na Figura 15 e os
resultados sumarizados na Tabela 13.
82
Figura 14: Placas do ensaio de halo de inibição referentes à membrana de melhor
desempenho antimicrobiano (quitosana a 1% com desacetilação mínima de 85%).
Figura 15: Aspecto da membrana de quitosana a 1% com desacetilação mínima de 85%,
exposta a microrganismos em meio de cultura com condições nutricionais inóspitas para seu
desenvolvimento.
Staphylococcus aureus
Pseudomonas aeruginosa
Aspergillus niger
Bactérias mistas
Bactérias mistas Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus Aspergillus niger
83
Como se pode verificar pela análise destes resultados, em condições ideais de
suprimento de nutrientes a maioria dos microrganismos-teste não recobriu a membrana de
quitosana, consumindo apenas o meio de cultura e sendo este suficiente para o seu
crescimento, enquanto que, quando os mesmos contaminantes foram colocados em meio de
cultivo com composição pobre de nutrientes apenas ocorreu o recobrimento da membrana por
bactérias mistas em aproximadamente 10% da superfície amostrada. Porém, as bactérias
expostas isoladamente não se desenvolveram no meio pobre. Em relação ao fungo, houve leve
crescimento neste meio, porém em sua forma leveduriforme, ou seja, o microrganismo não se
desenvolveu adequadamente, mostrando-se debilitado perante as condições apresentadas.
Em suma, a membrana de quitosana mostrou-se moderadamente susceptível à
contaminação, mesmo sob condição propícia para o ataque microbiano.
Tabela 13: Resultados do teste de inibição da membrana de quitosana a 1% com
desacetilação mínima de 85%, contra microrganismos dispersos em água contaminada
inoculados em meio de cultura sólido nutritivo (padrão) e sem fonte de carbono (meio
inóspito).
Membrana de quitosana a 1% com
desacetilação mínima de 85%
Bactérias
mistas
Pseudomonas
aeruginosa
Staphylococcus
aureus
Aspergillus
niger
H
(mm)
R
(%)
H
(mm)
R
(%)
H
(mm)
R
(%)
H
(mm)
R
(%)
Membrana em meio nutritivo convencional 0 0 0 0 3 0 0 0
Membrana em meio sem fonte de carbono 0 10 0 0* 0 0* 0 0
H = halo de inibição; R: recobrimento da superfície da amostra.
*: ausência de crescimento no meio de cultivo.
Para a avaliação comparativa da eficácia da membrana biopolimérica mais promissora
com relação a uma membrana à base de celulose atualmente comercializada para filtração de
pequenos volumes de água, efetuou-se a inoculação direta de culturas mistas em suas
84
superfícies com o interesse de se averiguar eventual nível de viabilidade celular entre ambas.
Na Figura 16 estão apresentados os aspectos finais típicos deste ensaio.
Membranas Inóculo misto de Bactérias
(106 UFC/mL)
Inóculo misto de Fungos
(106 UFC/mL)
Membrana comercial à base
de celulose (tipo
GSTF02500, Millipore)
(a) (b)
Membrana composta por
quitosana a 1% com
desacetilação mínima de
85% (c) (d)
Figura 16: Aspecto visual típico do desempenho comparativo das membranas de celulose
GSTF02500 da Millipore (a e b) e da membrana de quitosana a 1% (c e d) sobre culturas
mistas de bactérias (a e c) e fungos (b e d).
A quantificação das culturas resultantes do ensaio cujos resultados estão mostrados na
Figura 16 indicou que a membrana comercial à base de celulose GSTF02500 apresentou, após
inoculação direta de bactérias mistas, 40% de recobrimento, contendo 103
UFC/2cm2 e, após
inoculação direta por fungos mistos, 90% de recobrimento e 1 UFC/2cm
2. Já a membrana de
quitosana a 1% (MQ) apresentou-se isenta de células após inoculação direta por bactérias
mistas e recobrimento de 40%, com 1 UFC/2cm
2 após inoculação direta por fungos mistos.
Ao se comparar os resultados obtidos, foi notória a diferença quanto ao
desenvolvimento microbiano entre ambos materiais, destacando-se a maior atividade para a
membrana de quitosana, principalmente na inibição bacteriana. Quanto à inibição fúngica,
85
teve-se uma efetiva erradicação da cultura de levedura (Candida albicans) e o bolor
(Aspergillus niger) sofreu relevante efeito fungistático, com a diminuição de sua capacidade
de desenvolvimento. Estes resultados mostram um bom potencial de uso da membrana sob
estudo, visto que a membrana comercialmente disponível tem seu uso amplamente difundido
apenas na retenção de microrganismos. Ampliando-se o campo de aplicação, pode-se aliar a
inibição antimicrobiana em membranas deste tipo de modo a aprimorar a atuação de sistemas
filtrantes contra a deposição de contaminantes.
Assim, a partir dos resultados obtidos nesta etapa dos ensaios, ressalta-se que a
membrana utilizando-se da quitosana a 1% com grau de desacetilação mínimo de 85% é a que
apresenta maior potencial de efetividade, mas que a membrana contendo alginato deve ainda
ter sua avaliação continuada no desempenho contra biofilmes para fins comparativos e,
portanto, ambas foram empregadas nas etapas subsequentes do estudo.
4.3.3- Desempenho das membranas contra biofilmes
Primeiramente, para a correta avaliação dos resultados envolvendo a formação de
biofilmes, foram utilizados dois ensaios-controle considerando-se o aspecto qualitativo das
células (identificação de culturas que formaram ou não formaram biofilme) e o quantitativo
(efetiva recuperação das células aderidas).
O primeiro ensaio-controle tem como fundamento verificar se os microrganismos
avaliados se desenvolveram adequadamente na forma de biofilmes maduros, envoltos pela
estrutura típica de matriz extracelular. Para esta validação, foram utilizadas duas cepas de
referência da bactéria Staphylococcus epidermidis, uma catalogada como não ou pouco
formadora de matriz extracelular (ATCC 12228) e outra como formadora (ATCC 9142),
cultivadas em meio de cultura TSA com Congo Red Agar, que evidencia a matriz extracelular
secretada pelas células tornando-as negras. Desta forma, poderia ser averiguado se as
membranas possuiriam a capacidade de inibição da formação de biofilmes maduros,
independentemente da adesão celular. Resultados típicos obtidos neste ensaio são mostrados
na Figura 17.
O segundo ensaio-controle remete à quantificação eficiente das células aderidas à
membrana, pressupondo que não haja células remanescentes na superfície do material testado
86
Cu
ltu
ra p
lan
ctô
nic
a
após o procedimento de sonicação. Ou seja, este ensaio indicaria se os contaminantes foram
adequadamente extraídos para a solução a ser quantificada (condição apresentada na Figura
18, ilustração a) ou se a sonicação se mostra insuficiente para a liberação das células aderidas
à membrana (Figura 18, ilustração b). Para esta validação, o ensaio de formação de biofilmes
foi executado, conforme previamente descrito na seção de métodos, utilizando-se a cepa
padronizada de Staphylococcus epidermidis formadora de matriz extracelular (ATCC 9142)
para melhor visualização das células plaqueadas após o procedimento de sonicação, por 30
minutos.
Figura 17: Primeiro ensaio-controle: coloração de cepas padronizadas para a referência da
análise da diferença entre células quanto à capacidade de produção de matriz extracelular
(meio TSA com Congo Red Agar).
Portanto, de acordo com os resultados reportados nas Figuras 17 e 18, foi confirmado
que o tempo de sonicação estabelecido de 30 minutos se mostrou adequado para a completa
remoção celular aderida à membrana, conferindo, então, a sua acurada quantificação. Além
disto, constatou-se que, com este procedimento, não houve o comprometimento da
integridade física das membranas.
Após a validação dos ensaios-controle supramencionados, os testes completos
envolvendo a formação de biofilmes foram realizados.
Staphylococcus epidermidis ATCC 12228
(não formadora de matriz extracelular)
Staphylococcus epidermidis ATCC 9142
(formadora de matriz extracelular)
Ap
ós
form
ação
de
bio
film
e
87
Figura 18: Segundo ensaio-controle para a avaliação da atividade antimicrobiana da
membrana contra biofilmes: evidenciação de células bacterianas mistas aderidas à membrana
de quitosana a 1% após sonicação quando expostas ao meio TSA com corante TTC: (a)
membrana sem contaminação, demonstrando efetiva remoção das células aderidas para sua
quantificação e (b) membrana com contaminantes aderidos, que não serão contabilizados,
subestimando a contagem celular aderida.
A membrana de quitosana selecionada e a de alginato de sódio, ambas preparadas com
1% dos polissacarídeos foram avaliadas neste ensaio quanto à sua capacidade de impedir o
desenvolvimento de biofilmes, utilizando-se culturas padronizadas, e, dentre elas, uma cepa
de Pseudomonas aeruginosa catalogada como resistente a agentes clorados. As membranas
foram incubadas com as suspensões dos microrganismos avaliados (conforme condições
descritas no item 3.3.3.3) e após 48 horas de incubação, a população microbiana foi analisada,
quantificando-se as células aderidas à membrana, por sonicação. Os dados são mostrados na
Tabela 14 e na Figura 19.
De forma geral, os biopolímeros apresentaram níveis de erradicação satisfatórios.
Observam-se diferenças na atuação dos biopolímeros nos biofilmes resultantes de culturas
isoladas, entretanto, para os biofilmes provenientes de contaminantes mistos, os resultados
foram equivalentes. A quitosana apresentou atividade superior ao alginato sobre a cepa de
Pseudomonas aeruginosa resistente a agentes clorados, podendo-se inferir que como o cloro e
o alginato apresentam cargas negativas livres, podem promover respostas similares neste
espécime. Assim, considera-se que a membrana de quitosana a 1% apresentou atividade
global superior às demais testadas, em especial pela resposta à erradicação da cepa resistente.
Em paralelo (dados não reportados), verificou-se que as células que passaram pelo
processo de formação de biofilmes mas que não aderiram às membranas também sofreram
(a) (b)
88
ligeira redução da carga inicial, também pela atividade dos polímeros. Porém, comparando-se
com os dados de erradicação anteriormente apresentados para células em suspensão, as
culturas não aderidas foram menos susceptíveis à erradicação do que as mesmas espécies em
estado planctônico. Tal habilidade provavelmente foi desenvolvida pelo estresse provocado
durante o procedimento e que gerou maior resposta em garantir sua sobrevivência. Um
recente estudo que corrobora com estes resultados (Finkel e Kraisgley, 2009) demonstrou que
após competição, as células adquirem vantagem de crescimento, exibindo dominância sobre
as culturas mais jovens.
Tabela 14: Comportamento das membranas de quitosana e de alginato com relação à
prevenção do desenvolvimento de biofilmes a partir de diferentes tipos de inóculos
microbianos, pela medida do nível de contaminação das membranas após o ensaio de adesão
avaliando-se as células não aderidas durante a indução de formação dos biofilmes.
*Concentração inicial de 107 UFC/mL para os fungos C. albicans e A. Níger e de 108 UFC/mLpara os demais inóculos.
De modo complementar e visando elucidar um dado reportado por Stewart (2003),
ensaios suplementares conduzidos apenas com a membrana de quitosana a 1% foram
realizados, considerando-se a sua melhor atividade contra a bactéria P. aeruginosa resistente.
Segundo este estudo, a acetilação de polissacarídeos presentes na matriz extracelular dos
biofilmes pode afetar sensivelmente suas propriedades, pois algumas bactérias geneticamente
Formulação da
membrana Desempenho
Tipo de contaminante*
P.
aeruginosa
P.
aeruginosa
resistente
S.
aureus
C.
albicans
A.
niger
Bactérias
e
Fungos
Alginato
de sódio a 1%
Nível de
contaminação
(UFC/2 cm2 de
membrana)
105 10
7 10
6 10
4 10
6 10
5
Redução
da carga (%) 99,9 90 99
99,9
90
99,9
Quitosana
a 1%
Nível de
contaminação
(UFC/2 cm2 de
membrana)
107 10
6 10
5 10
5 10
6 10
5
Redução
da carga (%) 90 99 99,9
99
90
99,9
89
modificadas em laboratório identificadas como deficientes na capacidade de acetilação,
também o foram na formação de biofilmes.
Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa
resistente ao cloro
(-) Alginato (+) Quitosana (-) Quitosana (+) Alginato (-) Alginato (+) Quitosana
Candida albicans Aspergillus niger Inóculo misto de bactérias e fungos
(-) Quitosana (+) Alginato (+) Quitosana (+) Alginato (+) Quitosana (+) Alginato
(-) = resultados com menor redução microbiana; (+) = resultados com maior redução microbiana.
Figura 19: Resultados típicos obtidos quanto ao desempenho das membranas de quitosana e
de alginato sobre biofilmes, evidenciando-se as células que aderiram às membranas, após
sonicação.
Desta forma, para os ensaios a seguir, considera-se a possibilidade de que a presença
de grupos acetil disponíveis na quitosana possa alterar o metabolismo celular, sendo uma
alternativa para a prevenção da formação de biofilmes. Neste ensaio averiguou-se: a) eventual
alteração no número de células aderidas após 72 horas da quantificação; b) se os
microrganismos aderidos à membrana formaram biofilmes maduros (com presença de EPS).
90
Os resultados obtidos são mostrados na Figura 20.
Figura 20: Aspecto das células após contato com a membrana de quitosana a 1% para a
verificação da presença de células aderidas formadoras de biofilme: (a) membrana
contaminada exposta ao meio específico TSA com Congo Red Agar; (b) contagem inicial de
células aderidas na membrana (106
UFC/mL); (c) recontagem de células aderidas na
membrana após 72 horas (105
UFC/mL).
A partir dos resultados obtidos, verificou-se que passadas 72 horas após a
quantificação celular na membrana (contato estático) foi verificada diminuição de 1 log no
número de células aderidas. Além disso, as células aderidas na membrana de quitosana não se
desenvolveram na forma de biofilme maduro, conforme coloração de referência das colônias
em meio específico para diferenciação. Estes resultados se mostram, portanto, bastante
favoráveis ao uso da membrana de quitosana.
Pode-se, assim, estabelecer que a membrana com melhor atividade global foi a de
formulação com quitosana a 1% com desacetilação mínima de 85%, que foi então utilizada
nos ensaios posteriores de caracterização e atividade antimicrobiana direcionada à aplicação
proposta.
4.3.4- Caracterização da membrana selecionada
A membrana de quitosana, selecionada para a incorporação de agentes
antimicrobianos auxiliares (concentração de uso de 1% e desacetilação mínima de 85%), foi
caracterizada quanto à morfologia, comportamento na presença de soluções aquosas e
degradação ao ataque microbiano por perda de massa.
(a) (b) (c)
91
Os dados resultantes dos ensaios físico-químicos são apresentados na Tabela 15 e as
imagens obtidas por microscopia, na Figura 21.
Tabela 15: Grau de hidratação da membrana de quitosana a 1% após 48 h em imersão e sua
estabilidade após contato prolongado por 30 dias com diferentes culturas microbianas,
avaliados pela diferença de massa inicial e final, por pesagem em balança analítica.
Propriedades avaliadas Valor (%)
Grau de hidratação após 48 horas em imersão
Água destilada 58,5
Solução com nutrientes 34,0
Degradação por perda de massa após 30 dias
de contato com microrganismos
S. Aureus 0,0
P. aeruginosa 0,0
C. albicans 0,0
A. niger 0,0
A análise visual da membrana evidenciou que trata-se de estrutura do tipo densa. Após
hidratação, observou-se que, apesar da significativa aquisição de massa pela mesma após
imersão nas soluções testadas, não houve o comprometimento de sua integridade física.
Também, não foi detectado qualquer dano físico de sua estrutura, perceptível a olho
nu, após a submissão da membrana a contaminantes por 30 dias (Challenge test), nem
ocorreu perda de massa em relação ao seu valor inicial mensurado. Porém, a mesma não
impossibilitou o desenvolvimento microbiano, apresentando níveis de contaminação
elevados para todos os microrganismos testados (Figura 22).
Deste modo, nos ensaios posteriores foi considerado o uso de agentes antimicrobianos
que possam conferir melhor desempenho à membrana, tendo-se também realizado ensaios
envolvendo microrganismos condicionados à ação de antimicrobianos, coletados de um
sistema de água contaminado.
92
Figura 22: Resultados de Challenge test com a membrana de quitosana a 1%, após contato
durante 30 dias com inóculos separados constituído por bactérias mistas a 108 UFC/mL e
fungos mistos a 107 UFC/mL: a) nível final de contaminação por bactérias de 10
4 UFC/mL
(Grau 4); b) nível de contaminação final por fungos de 103 UFC/mL (Grau 3).
(a)
EHT=10 KV Mag= 5 K x 2 µm
(b)
(c) (d)
Figura 21: Aspecto da membrana formada a partir de solução de quitosana a 1% (com
desacetilação mínima de 85%) em ácido acético a 1%: a) avaliação por análise visual
registrada em câmara fotográfica; b) avaliação por microscopia eletrônica de varredura, com
detalhe da borda, que se mostra compacta; c) microscopia de força atômica (MFA) da
superfície da membrana seca; d) MFA da superfície da membrana após imersão em água.
( a ) ( b )
93
4.3.5- Incorporação de agentes antimicrobianos na composição da membrana
De acordo com os resultados até então obtidos com a membrana de quitosana
selecionada, é notória a importância de se ampliar seu espectro de atuação, principalmente
contra os microrganismos nos quais a atividade antimicrobiana não foi satisfatória, utilizando-
se de um agente complementar. Na escolha dos compostos para inclusão na composição das
membranas considerou-se englobar produtos com aplicações e características distintas das
usuais (atributos especiais que contribuam para o uso sustentável), sobretudo buscando
essencialmente a complementação de sua atuação contra bactérias Gram-negativas e fungos.
Os resultados destes ensaios, em termos das características gerais das membranas formadas,
são sumarizados na Tabela 16.
De acordo com os critérios estabelecidos, as membranas contendo os biocidas 1 a 5
resultaram em materiais finais competentes para a finalidade proposta (intactas e firmes). As
demais formulações (biocidas 6 a 8) não foram consideradas satisfatórias, em decorrência de
que em sua avaliação visual e tátil, mostraram-se provavelmente pouco compatíveis
quimicamente com o agente biocida testado.
De acordo com a literatura consultada, a quitosana tem propriedades adequadas para
uso como matriz na liberação controlada de fármacos, tais como poder ser decomposta por
enzimas e por gerar produtos de degradação não tóxicos. Em contrapartida, uma das
principais dificuldades relatadas se refere à sua insolubilidade em água e em alguns solventes
orgânicos, limitando a gama de possibilidades como suporte de drogas (Muzzarelli, 1996) e,
como visto no presente trabalho, esta propriedade pode ser uma das possíveis causas para o
problema apresentado, prejudicando a obtenção de membranas homogêneas apropriadas
quando da incorporação de alguns biocidas, tendo sido possível a ocorrência de interações
indesejáveis entre os compostos ativos com os demais componentes utilizados no
procedimento tradicional de confecção das membranas (Muzzarelli, 1996).
Algumas propriedades sobre os biocidas que não geraram membranas competentes são
sumarizadas na Tabela 17. Um aspecto comum entre os biocidas que não formaram as
membranas conforme esperado, é que podem apresentar carga líquida positiva, repelindo as
cadeias de quitosana. Além disso, são produtos com caráter sanitizante, ou seja, apresentam
modo de ação mais rápido, reagindo prontamente. Os demais biocidas testados possuem modo
de ação distinto, com atuação lenta, continuada.
94
Tabela 16: Resultado da incorporação de diferentes agentes antimicrobianos em membranas
de quitosana a 1% com desacetilação mínima de 85%, com relação à cor, transparência,
integridade física e resistência à manipulação.
Formulação da
membrana de
quitosana
Agente antimicrobiano
incorporado
Aspecto final da membrana obtida e sua
resistência física
Membrana
com Biocida 1
Fosfato hidrogenado de zircônio,
sódio e prata (contendo 10% em
massa de prata)
Membrana transparente com particulados
insolúveis, íntegra, resistente à manipulação.
Membrana
com Biocida 2 Cloreto de prata a 1,5%
Membrana transparente com particulados
insolúveis, íntegra, resistente à manipulação.
Membrana
com Biocida 3
Nitrato de prata a 1,5%
e Benzisotiazolinona (BIT) a 9%
Membrana transparente com particulados
insolúveis, íntegra, resistente à manipulação.
Membrana
com Biocida 4
n-octilisotiazolinona encapsulada
(OIT) a 8%
Membrana esbranquiçada, íntegra, resistente
à manipulação.
Membrana
com Biocida 5 n-octilisotiazolinona (OIT) a 8%
Membrana transparente, íntegra, resistente à
manipulação.
Membrana
com Biocida 6 Quaternário de amônio a 80%
Membrana frágil, pouco resistente à
manipulação.
Membrana
com Biocida 7
DBNPA a 12%, Bronopol a 12%
e CIT/MIT (Clorometil/Metil-
isotiazolinona) a 1%
Membrana frágil, pouco resistente à
manipulação.
Membrana
com Biocida 8
Polihexametileno-biguanida
(PHMB) a 20%
Membrana frágil, pouco resistente à
manipulação.
Com relação ao ativo DBNPA, componente presente no Biocida 7, há uma dificuldade
adicional para se otimizar a formulação nas membranas, já que é recomendado pelo fabricante
que se evite o seu uso combinado com bases fortes, pois o mesmo é passível de ser
hidrolisado em condições de pH de neutro a alcalino, uma etapa que ocorre na produção da
membrana de quitosana. Porém, como o foco maior deste trabalho era de se avaliar os
biopolímeros para selecionar a composição de base da membrana com maior caráter
antimicrobiano de modo a minimizar o uso de agentes biocidas complementares, não se
aprofundou, neste momento, outras formas de obter a apropriada incorporação dos biocidas
remanescentes. Sendo assim, continuou-se a investigação da atividade antimicrobiana das
membranas contendo apenas os biocidas aprovados nesta etapa (Biocidas 1 a 5).
95
Tabela 17. Características relevantes dos biocidas 6, 7 e 8.
Biocida pH do Produto Fórmula molecular e Número CAS Massa molar
(g/mol)
Estrutura química
Biocida
6
Em torno de
7,0 C22H42ClNO
CAS 8001-54-5; 63449-41-2
372.02
Biocida
7
Em torno de
3,0 Componente 1 (Monoetilenoglicol):
C2H6O2; CAS 107-21-1
Componente 2 (DBNPA):
C3H2Br2N2O; CAS 10222-01-2
Componente 3 (Bronopol):
C3H6BrNO4; CAS 52-51-7
Componente 4 (CIT/MIT):
C8H9ClN2O2S2; CAS 55965-84-9
Componente 1:
62.08
Componente 2:
241.87
Componente 3:
199.98
Componente 4:
663.43
Componente 1
Componente 2
Componente 3
Componente 4
Biocida
8
Em torno de
5,0 (C10H18N8)m・(C6H16N2)n・x(HCl)
CAS 27083-27-8
402.96
96
4.4- ATUAÇÃO ANTIMICROBIANA DAS MEMBRANAS COM BIOCIDAS EM
CONDIÇÕES BASAIS
4.4.1- Avaliação antimicrobiana preliminar das membranas compostas de quitosana
com biocidas
Iniciou-se, então, a averiguação preliminar da eficácia da incorporação do agente
antimicrobiano na membrana de quitosana contra microrganismos planctônicos, empregando-
se apenas o sistema com o Biocida 1 (AlphaSan® RC2000) para os quais já se dispunha de
dados para fins comparativos, com as linhagens de Staphylococcus aureus e Pseudomonas
aeruginosa, a partir de outro estudo do mesmo grupo de pesquisas (Girata, 2011). Os
resultados da análise da eficácia da incorporação de agentes antimicrobianos na membrana de
quitosana incorporando o Biocida 1 como candidato preliminar, utilizando-se microrganismos
planctônicos como referência, estão apresentados na Figura 23 e na Tabela 18.
Pelas imagens apresentadas, nota-se que em algumas membranas houve alteração de
sua coloração original, especialmente no caso da membrana exposta à cultura da levedura
Candida albicans, que se tornou prateada. Provavelmente os metabólitos gerados por este
contaminante acarretaram em reações químicas que provocaram tal efeito, que, no entanto,
não desencadearam inativação prejudicial do agente antimicrobiano, visto que não houve
recobrimento das membranas por estes microrganismos. Além disso, a prata presente na
formulação do biocida pode sofrer escurecimento ao ser exposta ao ambiente. No entanto,
eventual comprometimento de atividade a longo prazo, decorrente destas condições, somente
poderá ser verificado mediante aplicação prática investigativa, não contemplada no presente
estudo.
A membrana contendo o Biocida 1 apresentou atuação sobre a bactéria do tipo Gram-
negativa em adição à bactéria Gram-positiva que já havia se mostrado também susceptível à
quitosana em ensaios anteriores. Segundo Girata (2011), o agente AlphaSan® RC2000,
adicionado em concentração de 1,1% de prata em uma membrana contendo quitosana e
alginato, propiciou eficácia contra as bactérias Pseudomonas aeruginosa (Gram-negativa) e
Staphylococus aureus (Gram-positiva), sendo observada a formação de um halo mais amplo
contra a bactéria Gram-positiva. Aqui, notou-se maior formação de halo para a bactéria do
tipo Gram-negativa, porém os resultados não podem ser equivalentemente equiparados devido
à diferente composição das membranas empregadas nos estudos.
97
Figura 23: Avaliação da atividade antimicrobiana da membrana de quitosana preparada com
o Biocida 1 (Alphasan®
RC2000) contra microrganismos planctônicos.
Tabela 18: Resultados comparativos entre as membranas de quitosana com desacetilação
mínima de 85% com e sem o agente antimicrobiano complementar AlphaSan® RC2000
(Biocida 1) na avaliação quantitativa da atividade contra microrganismos planctônicos.
Amostra
Bactérias
mistas
Pseudomonas
aeruginosa
Staphylococcus
aureus
Aspergillus
niger Candida
albicans
H
(mm)
R
(%)
H
(mm)
R
(%)
H
(mm)
R
(%)
H
(mm)
R
(%)
H
(mm)
R
(%)
Membrana sem
biocida 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0
Membrana com
(Biocida 1)
AlphaSan® RC2000
0 0 6 0 4 0 0 0 0 0
H = halo de inibição; R: recobrimento da superfície da amostra.
Para os demais microrganismos testados (bactérias mistas, Aspergillus niger e
Candida albicans) a atuação da membrana contendo o Biocida 1 não foi satisfatoriamente
evidenciada (não houve a formação de halo de inibição, contudo, não ocorreu crescimento
microbiano sobre a superfície das membranas).
P. aeruginosa S. aureus
C. albicans A. niger
Bactérias mistas
98
Como verificado, apesar de ainda não se ter observado um desejável aumento no
espectro de atuação com o uso do biocida na membrana, os resultados preliminares obtidos
com o uso do Biocida 1 foram superiores aos da membrana sem o agente antimicrobiano
complementar, evidenciando-se êxito na incorporação do biocida e sendo uma opção
conveniente para aumentar a efetividade da membrana sobre os contaminantes analisados.
Iniciando-se, portanto, os ensaios envolvendo os contaminantes presentes no escopo
previamente estabelecido, fez-se a análise detalhada da microbiota nativa dos locais alvo de
avaliação, ou seja, da região do vestiário industrial. A partir dos contaminantes obtidos, foram
preparados diferentes inóculos para a verificação da atuação diferenciada das membranas.
Para a complementação da avaliação preliminar do uso da membrana contendo um agente
adicional incorporado, utilizou-se apenas a formulação anteriormente selecionada, contendo o
Biocida 1, em exposição às culturas de cada local amostrado, separadamente (Tabela 19 e
Figura 24). Posteriormente, todas as composições de membranas foram avaliadas com o uso
de uma cultura mista destes microrganismos, sendo os resultados mostrados mais adiante.
Tabela 19: Comportamento das membranas com relação à prevenção do desenvolvimento de
biofilmes formados a partir dos contaminantes coletados em sistema de água, com
concentração inicial ajustada para 106
UFC/mL.
Membrana Desempenho
Origem dos microrganismos
Água de
chuveiro
Biofilme de
chuveiro
Aerossol
ambiental
sem AlphaSan® RC2000
(Biocida 1)
Nível de
contaminação
(UFC/2 cm2 de
membrana)
104 10
5 10
4
Redução
da carga (%) 99 90 99
com AlphaSan® RC2000
(Biocida 1)
Nível de
contaminação
(UFC/2 cm2 de
membrana)
102 10
4 10
3
Redução
da carga (%) 99,99 99 99,9
99
Figura 24: Aspecto típico da microbiota predominante após a formação de biofilmes a partir
das amostragens nos diferentes pontos do sistema de água, e os microrganismos
remanescentes após contato com as membranas poliméricas contendo ou não o Biocida 1.
Apesar de se confirmar a esperada atuação superior com a membrana contendo o
Biocida 1, ainda há um considerável contingente de células para que sejam eliminadas na
totalidade. De acordo com o nível de células remanescentes aderidas às membranas, os
contaminantes mais susceptíveis foram os coletados na água de chuveiro, seguidos do
aerossol e por último do biofilme de chuveiro. Tais dados reforçam a importância da
prevenção da contaminação da água para se evitar maior dificuldade na erradicação de
microrganismos aderidos e dispersos no ambiente, e apontam que agentes antimicrobianos
mais potentes podem ser necessários em sistemas com elevado nível de contaminação inicial e
apresentando microbiota muito diversificada.
4.5- APLICAÇÃO DAS MEMBRANAS SOBRE CONTAMINANTES DE SISTEMA DE ÁGUA
ENVOLVENDO CONDIÇÕES MAIS RIGOROSAS
4.5.1- Submissão das membranas à lixiviação
Conforme evidenciado nos ensaios prévios, a metodologia de avaliação antimicrobiana
100
para as membranas com o Biocida 1 se mostrou adequada e, portanto, a seguir estão
declarados os ensaios de eficácia para os outros agentes antimicrobianos. A efetividade dos
outros agentes antimicrobianos testados, tanto incorporados na membrana quanto avaliados na
forma de solução impregnada em papel, foi avaliada após exposição aos contaminantes do
sistema de água em associação. Também, a manutenção da efetividade apresentada pelas
membranas foi avaliada após sua exposição a um constante fluxo de água por 5 dias
(lixiviação). Tais resultados estão apresentados na Tabela 20 e na Figura 25.
Em geral, os agentes antimicrobianos avaliados mostraram-se estáveis na membrana
de quitosana. Com exceção da membrana composta por nitrato de prata a 1,5% +
benzisotiazolinona a 9% (Biocida 3), que apresentou acentuada queda de atividade após
lixiviação, as demais membranas lixiviadas mostraram apenas uma sutil perda de eficiência.
Tabela 20: Atividade dos agentes antimicrobianos coadjuvantes em solução aquosa ou
integrados à membrana de quitosana quanto à inibição de contaminantes do sistema de água
em associação.
Agente
antimicrobiano
Agente em
solução aquosa
Agente na
membrana
Agente na
membrana após
lixiviação
H
(mm)
R
(%)
H
(mm)
R
(%)
H
(mm)
R
(%)
Biocida 1 0** 0 0 0 0 0
Biocida 2 0 10 0 10 0 10
Biocida 3 0 0; 80* 10 0 3 0
Biocida 4 20 0 20; 2* 0 18 0
Biocida 5 25 0 10** 0 7 0
H = halo de inibição microbiana no entorno da amostra.
R = recobrimento microbiano sobre a superfície da amostra.
; = indicado na separação de dados para Halos distintos formados para Fungos e Bactérias, respectivamente.
* = resultado de halo diferenciado contra bactérias.
** = fraca intensidade de crescimento microbiano circundante.
101
Figura 25: Halos de inibição resultantes do uso dos agentes antimicrobianos coadjuvantes em
solução aquosa e quando incorporados às membranas de quitosana a 1% (com desacetilação
mínima de 85%) contra os contaminantes do sistema de água em associação.
Agente
antimicrobiano
Agente em solução aquosa
impregnada em papel de
filtro
Agente na membrana Agente na membrana
após lixiviação
Biocida 1
Biocida 2
Biocida 3
Biocida 4
Biocida 5
102
Observa-se que as formulações contendo o agente OIT (Biocidas 4 e 5) apresentaram
formação de halos mais extensos, sendo a versão não encapsulada (Biocida 5) a de melhor
atuação em condição branda de exposição à água e a versão encapsulada a mais indicada para
aplicação em situação de contato abundante com água em fluxo contínuo. Isto se deve, em
parte, pela alta solubilidade em água, apresentada pelo composto. Porém, analisando-se os
resultados obtidos de uma maneira global e levando-se em conta que a maior parcela de
contaminantes no seio do fluido (água em circulação) é de bactérias, a membrana composta
por nitrato de prata a 1,5% e benzisotiazolinona a 9% (Biocida 3) foi a mais atuante dentre as
formulações testadas até então contra este grupo microbiano, e a mais abrangente, sendo
também capaz de conter contaminações fúngicas em um nível moderado.
4.5.2- Atuação contra microrganismos reconhecidamente patogênicos
Em adição às avaliações apresentadas, as membranas com os diferentes biocidas foram
submetidas a contaminantes patogênicos clinicamente relevantes, mais especificamente,
Enterobacter gergoviae e Pseudomonas mendocina. No ensaio de formação de halo de
inibição realizado, confirma-se que a membrana de quitosana contendo o Biocida 3 apresenta
os melhores resultados na inibição dos tipos de bactérias compreendidas nestes estudos
(Tabela 21 e Figura 26).
Tabela 21: Efetividade das membranas com agentes antimicrobianos complementares contra
patógenos clinicamente importantes presentes em água.
Tipo de biocida incorporado à
membrana de quitosana a 1%
Enterobacter
gergoviae
Pseudomonas
mendocina
H
(mm)
R
(%)
H
(mm)
R
(%)
Biocida 1 0 0 0 0
Biocida 2 1 0 3 0
Biocida 3 1 0 4 0
Biocida 4 1 0 1 0
Biocida 5 2 0 2 0
H = halo de inibição; R: recobrimento da superfície da amostra.
103
Formulação da
Membrana Enterobacter gergoviae Pseudomonas mendocina
Quitosana a 1% com o
Biocida 1
Quitosana a 1% com o
Biocida 2
Quitosana a 1% com o
Biocida 3
Quitosana a 1% com o
Biocida 4
Quitosana a 1% com o
Biocida 5
Figura 26: Aspecto típico dos halos de inibição formados contra patógenos envolvidos na
transmissão de infecção a partir da água, resultantes do uso das membranas com agentes
antimicrobianos complementares.
104
4.5.3- Resistência das membranas à exposição microbiana continuada
Nesta avaliação final, a membrana de quitosana foi submetida a exposições
sequenciais utilizando-se o ensaio de halo de inibição. O procedimento adotado foi coletar as
células crescidas de forma adjacente à membrana e preparar um novo inóculo para uso no
teste sucessivo, até que se procedesse dez exposições totais. O inóculo utilizado foi de
108
UFC/mL para bactérias e de 107 UFC/mL para fungos. O grau de contaminação na
superfície das membranas ao final da décima exposição foi avaliado em porcentagem de
recobrimento microbiano, sendo apresentado na Tabela 22. De acordo com os resultados
apresentados, a membrana de quitosana sem biocidas se mostrou susceptível ao
desenvolvimento microbiano ao término do ensaio, com queda significativa de sua eficácia,
apresentando maior área recoberta pelos fungos e também por bactérias.
Tabela 22: Nível de resistência das membranas preparadas com quitosana a 1%, com
desacetilação mínima de 85%, contendo ou não biocidas, frente ao desenvolvimento
microbiano após exposições continuadas.
Formulação da membrana de quitosana a 1%
Inóculo de
Bactérias
padronizado
Inóculo de
Fungos
padronizado
H
(mm)
R
(%)
H
(mm)
R
(%)
Membrana sem Biocida Exposição 1 0 0 0 0
Exposição 10 0 20 0 30
Membrana com o Biocida 1 Exposição 1 0 0 0 0
Exposição 10 0 0 0 20
Membrana com o Biocida 2 Exposição 1 0 0 0 0
Exposição 10 0 0 0 20
Membrana com o Biocida 3 Exposição 1 0 0 0 0
Exposição 10 0 0 0 10
Membrana com o Biocida 4 Exposição 1 0 0 0 0
Exposição 10 0 10 0 0
Membrana com o Biocida 5 Exposição 1 0 0 0 0
Exposição 10 0 10 0 0
H = halo de inibição; R: recobrimento da superfície amostrada.
105
Em contrapartida, as membranas contendo os biocidas, de modo geral, apresentaram-
se sem recobrimento microbiano, mas após dez exposições com culturas submetidas à
adaptação por contato pelas membranas tiveram sua efetividade reduzida, estando as
composições contendo os Biocidas de 1 a 3 mais susceptíveis ao desenvolvimento fúngico,
enquanto as demais (Biocidas 4 e 5), com relação ao ataque bacteriano.
Contudo, nota-se que o nível de ataque ainda é razoavelmente baixo se considerada a
condição rigorosa do ensaio em questão.
4.6- DISCUSSÃO GLOBAL SOBRE A APLICABILIDADE DAS MEMBRANAS COM OU
SEM BIOCIDAS EM SISTEMAS COM CONTAMINAÇÃO DE ÁGUA
Podem ser destacados alguns pontos em que este trabalho apresentou contribuição
para a melhoria nas condições atualmente empregadas em tratamentos antimicrobianos em
sistemas que envolvem a distribuição e o armazenamento de água, apesar de se contar com
poucos dados disponíveis na literatura para fins de comparação que pudessem ter correlação
direta com os obtidos neste estudo.
Observou-se que é possível a utilização de materiais alternativos, como biopolímeros
antimicrobianos e biocidas ecologicamente amigáveis, com conceitos diferenciados em
relação aos produtos químicos atualmente em uso para o controle microbiano em sistemas de
distribuição de água, visando a atenuação de efeitos prejudiciais. O modo de apresentação
sólido proposto (membranas biopoliméricas imobilizando os biocidas) confere exposição
reduzida aos agentes químicos durante o manuseio e aplicação (evitando respingos,
derramamento, vazamento, névoa), contribuindo também para a prevenção de problemas de
cunho ocupacional.
Pode-se proporcionar, com o material proposto, um controle microbiológico
preventivo abrangente, que pode ser utilizado em diferentes pontos estratégicos do sistema, de
forma isolada ou sinérgica a outros mecanismos, objetivando a contenção da contaminação a
níveis que não permitam dosagens de erradicação excessivas de elevada toxicidade que
possam favorecer a resistência de culturas. Com isso, é possível otimizar a aplicação de
agentes antimicrobianos em sistemas que apresentem configurações complexas (tubulações e
106
equipamentos com restrição de acesso para o tempo de contato necessário com o produto
líquido).
Neste contexto, a abordagem proposta pode ter papel relevante na mitigação da
emergência de linhagens resistentes decorrente de falhas no controle de contaminações por
meio dos métodos comumente praticados e com o uso de diversos agentes para este fim,
surgindo como uma alternativa factível de controle e de fácil adaptação a diferentes
configurações de processos e serviços.
Desta forma, mesmo não se obtendo êxito na incorporação de todos os biocidas
pretendidos na membrana biopolimérica tida como a mais indicada, pôde-se verificar que a
estratégia delineada foi de possível execução mas que ainda exige novas elucidações para a
otimização do processo de manufatura de membranas mais amplamente ativas, desde a
acurada análise de compatibilidade química e interações moleculares entre o produto e a
membrana, até a aplicação final utilizando-se de materiais suporte para o abrigo das
membranas em sistemas em funcionamento.
Dentre os resultados esperados para este estudo, pretendeu-se sobretudo, vincular o
conhecimento científico com a experiência prática no segmento de biocidas, de modo a se
dispor de um consistente planejamento para a tomada de decisão, ação e avaliação dos efeitos
de um sistema prejudicado por contaminação microbiana, almejando-se a obtenção de
resultados satisfatórios em um processo dinâmico, pertinentes para a boa condução da gestão
em sistemas susceptíveis.
Sabendo-se das dificuldades em se conduzir novos experimentos envolvendo sistemas
complexos, principalmente dispondo de poucos dados acerca da temática que se busca
estudar, espera-se que esta linha de pesquisa possa despertar novos interesses, para que o
trabalho adquira novos incrementos de áreas afins. A soma de experiências relatadas pode
auxiliar na busca por novos tratamentos mais sustentáveis para este fundamental recurso, que
é água.
107
CAPÍTULO 5:
CONCLUSÕES
E
SUGESTÕES PARA FUTUROS TRABALHOS
108
5.1- CONCLUSÕES ACERCA DA APLICABILIDADE DAS MEMBRANAS COM A
FINALIDADE PROPOSTA
Tendo por base que o objetivo principal estabelecido para este trabalho foi buscar
estratégias alternativas para o controle microbiológico de sistemas envolvendo distribuição de
água, considerando-se o uso de biocidas aliados ao uso de biopolímeros para a minimização
de danos relacionados ao uso de produtos mais agressivos, podem ser listadas as seguintes
conclusões:
a) A utilização de quitosana ou de alginato como material base na produção de membranas
antimicrobianas se mostrou adequada para a finalidade de controlar o desenvolvimento de
biofilmes formados por contaminantes microbiológicos comumente presentes em água.
b) Dentre as variáveis avaliadas que apresentaram influência na atividade antimicrobiana dos
biopolímeros testados destacam-se o pH da solução polissacarídica precursora e o grau de
desacetilação da quitosana. Em pH 4,0 a quitosana se mostra protonada e ativa contra o grupo
das bactérias, enquanto em pH 7,0 a atividade foi mais pronunciada sobre fungos. A quitosana
com menor grau de desacetilação (mínimo de 85%) mostrou-se mais efetiva de modo geral,
que a de 98%. O aumento da concentração tanto de quitosana quanto de alginato de 1 para 2%
não proporcionou aumento da eficácia antimicrobiana das membranas formadas.
c) A erradicação microbiana foi distinta para cada biopolímero analisado, observando-se
dependência do tipo de contaminante e da interação entre os diferentes microrganismos
estudados. A quitosana 85% desacetilada em pH 7,0 apresentou melhor atividade sobre
microrganismos planctônicos, especialmente contra a bactéria Gram-positiva Staphylococcus
aureus, enquanto o alginato obteve melhor desempenho na erradicação de biofilmes
resultantes de culturas puras. Em biofilmes mistos ambos se mostraram promissores para a
aplicação almejada. Também, notou-se que os microrganismos aderidos à membrana de
quitosana não se desenvolveram como biofilmes.
d) A membrana de quitosana demonstrou relativa atividade antimicrobiana, sendo necessário
o uso de produtos biocidas para ampliação de sua eficácia. Ou seja, não foi possível substituir
integralmente o uso de produtos químicos no combate a contaminantes oriundos de sistemas
de água, mas o uso combinado destes produtos foi considerado como uma alternativa
interessante.
e) Cada membrana com os diferentes biocidas conferiu uma amplitude de atuação
109
diferenciada, mediante as diversas microbiota-alvo. Quanto à aplicação sobre a microbiota
natural coletada em sistemas de água contaminada, a inclusão de agentes antimicrobianos
complementares aumentou o espectro de atuação da membrana de quitosana contra bactérias
do tipo Gram-negativa e bolores, bem como a melhoria do nível de redução de células viáveis
remanescentes. Dentre as formulações sob avaliação antimicrobiana, a membrana contendo
nitrato de prata a 1,5% e benzisotiazolinona a 9% apresentou-se com maior potencial para a
inibição de contaminantes oriundos de sistema de água. Sob condições de lixiviação, as
formulações de membrana contendo o agente OIT foram as que melhor se mantiveram com
atividade pronunciada, sendo a versão encapsulada a que apresentou-se com menor
interferência na formação de halo após submissão a esta condição.
f) Em condições adversas, tais como exposição a contaminantes patogênicos, inoculação
microbiana periódica e submissão à lixiviação, a membrana com os diferentes biocidas
apresentou bom desempenho.
g) A microbiota viável, quando aderida à membrana de quitosana a 1% não desenvolve
biofilmes maduros, ou seja, o material apresenta bom potencial inibidor para o
desenvolvimento de contaminantes agressivos e que porventura possam se dispersar.
h) Mesmo em situações de restrição nutricional (simulação em meio de cultura sem fonte de
carbono), os microrganismos não tendem a degradar os componentes da membrana, o que
aumenta sua longevidade de uso.
5.2- SUGESTÕES PARA FUTUROS TRABALHOS
O presente trabalho mostrou que uma ampla gama de aplicações pode ser explorada
com o uso da membrana de quitosana. Porém, ainda restam muitas variáveis que podem
interferir em sua atuação frente a contaminantes microbiológicos (como, por exemplo, a
avaliação da capacidade de recontaminação das culturas remanescentes a longo prazo),
principalmente quando estas se apresentam adaptadas ao ambiente e sob diversificadas
condições de exposição, tais como a flutuação de concentração de antimicrobianos ou
alterações no fluxo de água.
110
Para que se possa complementar as avaliações aqui realizadas, seria de grande valia o
aprimoramento da técnica de incorporação de produtos antimicrobianos de relevância, tais
como os sugeridos neste trabalho, incluindo aqueles que não geraram membranas
suficientemente qualificadas para o uso pretendido. Este estudo poderia contar com o uso de
ferramentas acuradas para a análise microscópica e físico-química dos compostos em
interação com a membrana, aliadas ao estudo da liberação gradual dos ativos quando expostas
em situações práticas comuns.
Propõe-se, em adição, a aplicação prática de membranas de quitosana como material
de recobrimento de superfícies em instalações de distribuição de água. Dentre os possíveis
materiais para o uso combinado com as membranas, um dos mais apropriados para este fim
seria utilizar membranas de osmose reversa, por serem bastante susceptíveis e por serem
amplamente utilizadas em diversos processos. Neste caso, a confecção de membranas do tipo
porosas também poderia ampliar a sua aplicabilidade em sistemas variados. Ademais, um
estudo da estabilidade das membranas ao armazenamento a longo prazo seria de grande valia
para a determinação do seu período de validade em estoque, para fins de comercialização e
utilização.
Sugere-se também fazer uso de novas tecnologias de detecção de contaminantes por
monitoramento computadorizado em tempo real para a avaliação mais precisa do início da
queda de atividade do sistema com o uso de membranas poliméricas com biocidas, de modo
que eventuais intervenções e melhorias possam ser bem compreendidas e adaptadas.
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CAPÍTULO 6:
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