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Análises de Imunogenecidade das proteínas recombina
Análises de Western Blot
expressadas apresentaram forte imunoreatividade
galinhas reconhecedores de proteínas de
foram imunoreativas a partir de 1 hora até até
As bandas apresentaram um perfil intenso de reativi
PRB. Estes resultados confirmam
são imunologicamente similar
bibliotecas de Phage Display
mimético aos antígenos nativos totais do
Figura 34 – Western Blot
E.coli. Amostras da cultura foram coletadas em diversos t
(poço 2 e 3), 1 hora (poço
e 9), e separadas em gel SDS
transferência para as membranas de nitrocelulose. O
representa o marcador de massa molecular (Bio
Preparação das proteínas
As proteínas recombinantes
no pellet das células bacterianas
recombinantes formaram corpos de inclusão.
1 2 3 4 5 6
209
124 80
49,1
34,8
28,9
128
Análises de Imunogenecidade das proteínas recombinates
Western Blot mostraram que as proteínas
apresentaram forte imunoreatividade aos anticorpos policlonais de
galinhas reconhecedores de proteínas de carrapato (Figura 34
a partir de 1 hora até até 5 horas, após a indução por IPTG.
As bandas apresentaram um perfil intenso de reatividade, especialmente para a
confirmam que as proteínas recombinantes PRA e PRB
nologicamente similares aos peptídeos recombinantes selecionados por
Display e também por conter pelo menos um único epítopo
os antígenos nativos totais do Rhipicephalus (Boophilu
Western Blot da indução da expressão das proteínas PRA e PRB em
. Amostras da cultura foram coletadas em diversos t
), 1 hora (poço 4 e 5), 2 horas (poço 6 e 7), 3 horas (poço
), e separadas em gel SDS-PAGE 16% antes do processo de
transferência para as membranas de nitrocelulose. O
representa o marcador de massa molecular (Bio-Rad Protein Ladder).
Preparação das proteínas recombinantes
recombinantes expressadas em E. coli foram encontradas
das células bacterianas rompidas, indicando que as proteínas
formaram corpos de inclusão. Ensaios de solubilidade foram
2 3 4 5 6 7 8 9
mostraram que as proteínas recombinantes
os anticorpos policlonais de
34). As proteínas
após a indução por IPTG.
dade, especialmente para a
e as proteínas recombinantes PRA e PRB
peptídeos recombinantes selecionados por
enos um único epítopo
Rhipicephalus (Boophilus) microplus.
da indução da expressão das proteínas PRA e PRB em
. Amostras da cultura foram coletadas em diversos tempos, 0
), 3 horas (poço 8
PAGE 16% antes do processo de
transferência para as membranas de nitrocelulose. O poço 1
ad Protein Ladder).
foram encontradas
, indicando que as proteínas
Ensaios de solubilidade foram
7 8 9
realizados para as proteínas oriundas da expressão
contendo as proteínas PRA e PRB. Foram
os testes com uréia 5M
insolúveis. Foi verificado que a concentração de uréia a 5M apr
solubilização do pellet do
de solubilização com uréia 8M
uma etapa de solubilização dos corpos de inclusão
relativa quanto à qualidade da fração solúvel
Figura 37). Por fim,
por cromatografia de afinidade (
foram satisfatórias em cultura bacteriana e a purez
qualidade ao longo das etapas de purificação.
Figura 35 – Ensaios de solubilidade para
contendo a proteína PRA em
molecular, (2) controle positivo. Poços 3, 5, 7 e 9
os testes com uréia 5
6, 8 e 10 repr
uréia a 5M; 2,5M;
1 2 3 4 5 6
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80
49,1
34,8
28,9
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realizados para as proteínas oriundas da expressão de recombinantes pET
PRA e PRB. Foram determinadas as frações solúveis
os testes com uréia 5M; 2,5M; 1.2M e 0,6M e comparadas
Foi verificado que a concentração de uréia a 5M apr
dos corpos de inclusão (Figura 35). Em um posterior teste
solubilização com uréia 8M seguida de uma solubilização parcial de 5M, em
uma etapa de solubilização dos corpos de inclusão, foi constatado
qualidade da fração solúvel (Figura 36 e
). Por fim, foi possível a obtenção das proteínas recombinantes
por cromatografia de afinidade (Figura 38). A produção das proteínas PRA e PRB
foram satisfatórias em cultura bacteriana e a pureza foi considerada de boa
qualidade ao longo das etapas de purificação.
nsaios de solubilidade para a expressão de recombinantes
contendo a proteína PRA em SDS-PAGE 16%. (1) marcador de peso
molecular, (2) controle positivo. Poços 3, 5, 7 e 9 frações solúveis para
os testes com uréia 5M; 2,5 M; 1,2M e 0,6M, respectivamente.
6, 8 e 10 representam as frações insolúveis nas concentrações de
uréia a 5M; 2,5M; 1,2M e 0,6M, respectivamente.
2 3 4 5 6 7 8 9 10
de recombinantes pET32a
determinadas as frações solúveis para
com as frações
Foi verificado que a concentração de uréia a 5M apresentou melhor
um posterior teste
seguida de uma solubilização parcial de 5M, em
ado uma melhora
a obtenção das proteínas recombinantes
produção das proteínas PRA e PRB
a foi considerada de boa
a expressão de recombinantes pET32a
(1) marcador de peso
frações solúveis para
2M e 0,6M, respectivamente. Poços 4,
nas concentrações de
7 8 9 10
Figura 36 Ensaios de solubilidade para a expressão de recombi
contendo a proteína PRA
molecular, (9) controle positivo. Poços
os testes com uréia 5 M;
6 e 8 representam as frações insolúveis
5M; 8M; 5M e
Figura 37 – Processo de purificação da proteína recombinante e
corpos de inclusão.
molecular, a coluna
proteína purificada. As colunas 3, 4, 5
insolúvel e as
corpos de inclusão.
1 2 3 4 5
209
124 80
49,1
34,8
28,9
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130
Ensaios de solubilidade para a expressão de recombi
contendo a proteína PRA em SDS-PAGE 16%. (10) marc
) controle positivo. Poços 1, 3, 5 e 7 frações solúv
os testes com uréia 5 M; 8 M; 5 M e 8 M, respectivamente.
8 representam as frações insolúveis nas concentrações de uréia a
M e 8M, respectivamente.
Processo de purificação da proteína recombinante e solubilização dos
corpos de inclusão. O poço 1 representa o marcador de peso
coluna 2 representa um controle positivo para presença da
ificada. As colunas 3, 4, 5 e 6 representam a parte
s colunas 7, 8, 9, e 10 representa a parte solúvel dos
corpos de inclusão.
2 3 4 5 6 7 8 9 10
2 3 4 5 6 7 8 9 10
Ensaios de solubilidade para a expressão de recombinantes pET32a
) marcador de peso
7 frações solúveis para
M, respectivamente. Poços 2, 4,
nas concentrações de uréia a
Processo de purificação da proteína recombinante e solubilização dos
O poço 1 representa o marcador de peso
2 representa um controle positivo para presença da
epresentam a parte
7, 8, 9, e 10 representa a parte solúvel dos
6 7 8 9 10
8 9 10
209
124 80
49,1
34,8
28,9
Figura 38 - Purificação das proteínas PRA e PRB por cromatograf
Ni-NTA, analisada em gel SDS
representam
Ladder). Os poços
da eluição com imidazol para a proteína PRA
11-13, as frações
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
131
Purificação das proteínas PRA e PRB por cromatograf
, analisada em gel SDS-PAGE 16%. Os poços
o marcador de massa molecular (
Ladder). Os poços 4-8 e 14 - 18 representam as frações obtidas a partir
da eluição com imidazol para a proteína PRA e PRB. Os po
as frações brutas.
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Purificação das proteínas PRA e PRB por cromatografia de afinidade
PAGE 16%. Os poços 9, 10 e 19
o marcador de massa molecular (BIORAD Protein
representam as frações obtidas a partir
e PRB. Os poços 1-3 e
202 133
71
41 30
11 12 13 14 15 16 17 18 19
132
DISCUSSÃO
Técnicas de Phage Display têm sido usadas para a resolução de diversos
problemas de origem biológica (Smith e Petrenko, 1997). No campo do
desenvolvimento de vacinas os mimetopos têm sido recentemente usados como
componentes vacinais, os quais não necessariamente representam equivalência
estrutural, mas sim uma imagem funcional que poderia substituir o antígeno
original para o desenvolvimento de vacinas moleculares (Agadjanyan et al., 1997;
Bastien et al., 1997; De Berardinis et al., 2000; Frenkel et al., 2000). Esta
metodologia possibilita a obtenção de um perfil de epítopos de um determinado
alvo biológico de forma eficiente e evita, pela forma tradicional, o processo de
obtenção de anticorpos monoclonais para a caracterização. Nesta metodologia
novos antígenos podem ser identificados sem informação prévia a respeito da
especificidade dos anticorpos (Parmley e Smith, 1988; Parmley e Smith, 1989).
Neste estudo foram identificados mimetopos de proteínas totais do
Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Os peptídeos foram obtidos pela
imunoseleção de bibliotecas randômicas de peptídeos apresentados em fagos
contra Imunoglobulinas Y reconhecedoras de antígenos dos estádios de larvas e
adultos do ectoparasito. Para a obtenção das IgYs, galinhas foram imunozadas
com proteínas totais de carrapato. O isolamento dos peptídeos homólogos às
proteínas do carrapato é explicado pelos repetidos ciclos de seleção dos
peptídeos por imunoafinidade ao alvo biológico (Parmley & Smith, 1988; Parmley
e Smith, 1989). Assim, os ciclos de seleção e amplificação tenderiam a
prevalência dos peptídeos reconhecidos pelos anticorpos com maiores títulos
gerando sub-populações específicas de clones de fagos ligantes aos anticorpos
IgY. Após as seleções biológicas os clones de fagos foram caracterizados e
validados através da adoção de critérios específicos.
Inicialmente foi constatado o enriquecimento do eluato durante a evolução
do processo seletivo através da titulação dos fagos na entrada e na saída dos
processos seletivos (Tabela 1). Foi possível identificar 107 seqüências distintas
entre as 286 seqüências completas obtidas no seqüenciamento de DNA das
regiões correspondentes aos insertos (Tabela 2). As seqüências de aminoácidos
deduzidas foram analisadas por diferentes metodologias de análises in silico
gerando motivos importantes. Pelos testes de imunoreatividade foi possível a
133
caracterização do reconhecimento específico dos mimetopos pelos anticorpos
seletores. Os dados indicam que proteínas PIII e PVIII contendo os peptídeos
recombinantes podem ser reconhecidas de forma específica quando comparados
ao fago selvagem (M13) na região correspondente ao inserto. A imunização com
os mimetopos em camundongos confirmou a reatividade cruzada contra as
proteínas do carrapato. Pelo teste de imunotriagem foi possível a confirmação da
reatividade cruzada e a identificação de perfis diferenciados de reatividade entre
as raças no reconhecimento dos clones de fagos pelas IgGs do soro de animais
infestados naturalmente. Em testes de hipersensibilidade cutânea foram
identificados graus diferenciados de reatividade entre os clones, via de aplicação
e raças testadas. Ainda, após o desafio em bovinos, em um experimento piloto, foi
verificado por observações diretas, alterações sugestivas de lesão tecidual no
intestino de carrapatos submetidos a testes de oviposição, mas não ocorreu
diminuição no número de carrapatos entre o grupo tratamento e o controle.
Finalmente, foram sintetizados dois genes artificiais para a constituição
das proteínas recombinantes multi-antigênicas, sendo estas imunorreativas aos
anticorpos reconhecedores de proteínas de carrapato. A produção das proteínas
recombinantes provou ser eficiente em larga escala. Estes resultados
representam um avanço em direção à obtenção de novos imunógenos para a
confecção de uma vacina contra este ectoparasito.
Pelo nosso conhecimento, este estudo é a primeira descrição de
peptídeos mimetopos do carrapato bovino, desenvolvidos por Phage Display, com
aplicações vacinais. Os resultados apresentam os clones como importantes
epítopos de antígenos vacinais candidatos do Rhipicephalus (Boophilus)
microplus. A presença de uma ferramenta molecular que direcione o
desenvolvimento de uma vacina poli-imunogênica apoia-se na utilização de um
grande número de dados baseados em seqüências peptídicas. Neste trabalho,
foram geradas 107 seqüências distintas representando diferentes epítopos de
diversos órgãos e estádios de desenvolvimento do carrapato bovino. Estas
seqüências representam um banco de epítopos selecionados pela interação
imune com anticorpos reconhecedores de proteínas totais dos estádios de larvas
e teleóginas do Rhipicephalus (Boophilus) microplus prontos para serem testados
em diferentes formulações.
134
A escolha do extrato total do parasito para a geração de anticorpos
policlonais ocorreu em função dos anticorpos bovinos funcionais serem
encontrados em vários tecidos do carrapato. Isto expandiu a variedade de
moléculas-alvo além daquelas presentes no intestino, de forma que moléculas
presentes em praticamente qualquer tecido do carrapato passaram a ser alvo
potencial (Da Silva Vaz Junior et al., 1996).
A capacidade de desenvolvimento da resposta humoral em galinhas para
antígenos de carrapato necessita de mais estudos. Os resultados apresentados
na Figura 5 colaboram com o enunciado por Lemamy et al.,(1999), que discorre
da capacidade das aves produzirem anticorpos com alto título e grande
persistência da resposta imune para proteínas de bactérias e mamíferos. Isto
provavelmente se deve ao fato do Rhipicephalus (Boophilus) microplus não ser
um ectoparasito natural de galinhas. Outro importante fator é que os anticorpos
produzidos em galinhas possuem vantagens bioquímicas como resistência ao pH
extremo (Lee et al.,2002), resistência à temperatura elevada (Jensenius et
al.,1981), grande afinidade (Ikemori et al.,1993) e avidicidade (Stuart et al.,1988),
motivo pelo qual têm sido usadas eficientemente em análises imunológicas
(Schade e Hlinak,1996). Estas características são essenciais na escolha de
galinhas para o desenvolvimento da resposta imune em ensaios clínicos diversos.
Neste trabalho, estes mesmos animais foram utilizadas para a construção
de bibliotecas combinatórias de fragmentos de anticorpos scFv expressados em
bacteriófagos filamentosos, tendo como objetivo o isolamento de anticorpos
monoclonais específicos para o Rhipicephalus (Boophilus) microplus (dados a
serem publicados). A maior facilidade da utilização de aves como fonte produtora
de genes de anticorpos ocorre em função do mecanismo de produção de
anticorpos se fazer por conversão gênica, diferentemente dos mamíferos, sendo
por mutação somática, embora com a mesma taxa de variabilidade de anticorpos.
Neste processo, ocorre a necessidade de um baixo número de iniciadores
necessários para a construção de anticorpos scFv quando comparado aos
mamíferos (Barbas et al., 2001).
Nas etapas de seleção foi verificado o enriquecimento dos peptídeos (ver
Tabela 1). Neste passo foi possível a seleção de sub-populações de clones de
fagos contendo peptídeos recombinantes ligantes ao alvo biológico. Os casos de
135
empobrecimento nos ciclos iniciais podem ser explicados pelo aumento da
estringência, a qual foi alterada pela diminuição do número de partículas na
entrada do segundo ciclo e aumento do detergente tween 20 nas lavagens. Como
exemplo, na seleção S1 ocorreu empobrecimento (0,6 vezes) demonstrando
pouca efetividade na seleção. Foi demonstrada de forma predominante a
ocorrência de seleção positiva dos clones, os quais representam em cada
seleção, uma sub-população específica de peptídeos específicos para o alvo.
Exemplificamos isto através da seleção S6 a qual enriqueceu 1091 vezes a partir
do conjunto de clones da biblioteca inicial representando a maior taxa entre estas
seleções. Os mimetopos que apresentaram maior freqüência entre as seqüências
selecionadas foram considerados importantes candidatos (Tabela 2). A análise da
freqüência de aminoácidos ao longo das seqüências peptídicas e também como
percentual geral (Tabela 3) evidenciou a presença de aminoácidos críticos na
seqüência peptídica e outros desnecessários ao processo de seleção, fornecendo
indícios de especificidade no processo de reconhecimento dos ligantes.
A presença dos motivos protéicos pode ser relacionada com a seleção a
favor do ligante, pela indicação de que estes aminoácidos poderiam ser cruciais
para o reconhecimento dos peptídeos pelo paratopo (Cortese et al.,1995). Pelas
análises de alinhamentos protéicos foi possível demonstrar que os peptídeos
isolados possuem resíduos críticos que apresentam identidade e conservação,
que poderiam mimetizar a estrutura e função dos epítopos originais existentes nas
proteínas do Rhipicephalus (Boophilus) microplus, sendo semelhante ao trabalho
desenvolvido por Yang et al. (2005). Apenas a seqüência consenso PxxKxH não
apresentou similaridade, possivelmente devido ao fato de que os peptídeos foram
selecionados a partir de bibliotecas Ph.D.-C7C e, desta forma, pelo fato de serem
bibliotecas constritas, poderiam representar uma estrutura conformacional de
proteínas de carrapato, não sendo possível determinar por alinhamentos lineares.
Como mostrado nas Tabela 5, Tabela 6, Tabela 7, Tabela 8 e Tabela 9 as
seqüências de peptídeos epitopos específicos freqüentemente correlacionam com
muitas proteínas antigênicas de carrapato, assim como proteínas preditas de
ESTs. Neste caso, a seleção de peptídeos pode-se tornar uma ferramenta
importante para a identificação de seqüencias gênica em bancos de genomas,
sem função imunológica definida. Além disso, o perfil não só revela os
136
importantes papéis de cada antígeno, mas também apresenta a estrutura do
epítopo dentro de uma proteína antigênica possivelmente relacionada com a
indução de uma resposta imune (Yang et al., 2005).
Em todas as estratégias de seleção utilizadas ocorreram similaridades
significativas (Tabela 7). Entre as proteínas identificadas com motivos similares
aos peptídeos selecionados temos alguns antígenos, ou mesmo proteínas com
importantes funções fisiológicas. Entre eles podemos citar a BmTI-A, cistatina
intracelular, receptor de serotonina, canal de sódio, protease inibidora de
carrapatina, BM86, precursor de GP80.
Foram evidenciados alinhamentos específicos entre os peptídeos e
algumas proteínas importantes, como metaloproteases de glândulas salivares,
proteina Notch-like, GP80 e proteínas não identificadas ou mesmo preditas sem
funções definidas, as quais podem indicar importantes imunógenos (Tabela 6,
Tabela 7 e Tabela 8). As metaloproteases estão diretamente relacionadas com a
alimentação do carrapato Ixodes ricinus no hospedeiro pois afetam a habilidade
da saliva de interferir na fibrinólise. Esta família de proteínas participa na inibição
da cicatrização após a picada do carrapato, facilitando a absorção de sangue
(Decrem et al., 2008). Embora a vacinação com esta metaloprotease não
alterasse a taxa de sobrevivência ou o tempo de alimentação de carrapatos, o seu
ganho de peso e a taxa de oviposição foram reduzidas (Decrem et al., 2007). A
proteína Notch-like não possui função conhecida e também não foi utilizada como
imunógeno. Ovinos vacinados com GP80, purificada de extratos de larva de
Rhipicephalus (Boophilus) microplus definida como sendo um produto
transformado a partir de vitelogenina, reduziu significativamente o número de
teleóginas com diminuição do peso e oviposição.
Nos trabalhos realizados por Souza (2007), o repertório de anticorpos
monoclonais do tipo scFv desenvolvidos a partir do repertório imune dos mesmos
animais utilizados neste trabalho, foi comprovado o reconhecimento pelos
anticorpos de uma proteína natural similar a uma GP80 ou vitelina a partir do
seqüenciamento N- terminal da proteína nativa por espectometria de massa e
também por determinação de peptídeos epítopos específicos selecionados por
Phage Display a partir do mesmo repertorio de scFvs.
137
Os fagos recombinantes foram escolhidos para a checagem da resposta
imune em camundongos, embora o sistema imune de camundongos e bovinos
sejam diferentes, ainda é informativo a determinação do grau de
imunogenicidade. Os resultados mostraram que os soros da maioria dos
fagotopos, comprovados por ELISA, apresentaram capacidade de
reconhecimento das proteínas totais, comprovando o potencial imunogênico dos
peptídeos recombinantes, fato comprovado principalmente para o clone Seq. ID
No 32, que atingiu um IE próximo de 3 (Figura 19) e também o clone Seq. ID No
18 (Figura 21) com índice IE 3. Ambos os clones foram obtidos na seleção S2.
Estes clones comprovaram ser imunoreativos aos anticorpos de galinhas anti-
carrapato por Dot-Blot (Figura 12) e ELISA (Figura 11B) e também o
reconhecimento destes clones foram inibidos na presença do antígeno nativo de
carrapato (Figura 13A,13B e 13C). Assim, fica provado a importância destes
clones como miméticos antigênicos e imunogênicos de proteínas de carrapatos.
Estes peptídeos alinham-se com várias proteínas de carrapato, indicando
que estes mimetopos provavelmente compartilham os epítopos com as proteínas
nativas. Foi visto que o Seq. ID No 32 apresentou similaridade com uma proteína
e o Seq. ID No 18 alinhou com 5 proteínas. É importante ressaltar que estes 2
peptídeos compartilham as mesmas seqüências consenso (Tabela 4), de forma
que foram classificados na sub-população de clones contendo o consenso
predominante (65%), e desta forma, provavelmente apresentam o mesmo resíduo
crítico no respectivo epítopo que mimetizam.
Foi demonstrado que a resposta imunitária induzida pelo fago foi
especificamente dirigida contra os peptídeos expressos na proteína PIII dos fagos
(Yang e Shiuan, 2003). Os testes proporcionaram o reconhecimento do soro do
grupo de camundongos imunizados com o clones Seq. ID No18, tanto para as
proteínas nativas de carrapatos (Figura 19 e Figura 21), quanto o equivalente
sintético e também do equivalente recombinante fusionado no fago (Figura 20).
Desta forma, foi demonstrado que os peptídeos sintetizados quimicamente
apresentaram um enorme potencial para o desenvolvimento de novas seqüências
e oferecem possibilidades atrativas para o desenvolvimento de imunógenos por
síntese química e recombinante, visando a obtenção de antígenos vacinais a
partir dos mimetopos fusionados em fagos. Por outro lado, será necessária a
138
adequação destes peptídeos sintéticos no teste de ELISA, pois o reconhecimento
do soro de camundongos imunizados com fagos tanto com ou sem adjuvantes foi
superior, embora não se tenha feito uma comparação direta em função da não
equivalência na concentração de peptídeos recombinantes expressos em fagos
com os peptídeos sintéticos para se chegar a uma equivalência numérica.
A imunogenicidade dos peptídeos recombinantes em fagos foi avaliada
por meio da capacidade de induzir reações cutâneas e a determinação dos níveis
de resposta mediada por anticorpos do tipo (IgG) do soro. Desta forma, foi
proposta uma hipótese para verificar o potencial dos clones de fagos expressando
os peptídeos recombinantes, serem reconhecidos por soros de animais infestados
naturalmente. Isto foi proposto, em função de que a exposição natural do parasito
no momento do parasitismo, leva a indução da resposta imune natural, contra as
proteínas do aparelho bucal, da saliva, entre outros órgãos e proteínas que
entram na relação parasito com o hospedeiro (Willadsen e Jongejan, 1999;
Willadsen, 2004). Os resultados do teste de imunotriagem corroboram a hipótese
apresentada de que os clones apresentaram reatividade cruzada e poderiam
estar mimetizando estruturas protéicas constituintes de órgãos específicos do
parasito (exemplo clone 32) e que poderiam entrar em contato com o hospedeiro
em infestações naturais por desencadearem resposta imune humoral,
constituindo assim os chamados antígenos expostos. Por outro lado os clones
que não apresentaram reatividade poderiam constituir antígenos ocultos em
função do não reconhecimento destes clones por soros de animais naturalmente
infestados por carrapatos, em função de não receberem o estímulo inicial.
Foi verificada a ocorrência de reatividade entre as raças de bovinos e
também entre os animais, determinados pela contagem de carrapatos. Os
resultados fornecidos pelo Dot-Blot do soro de bovinos (Figura 24) evidenciaram a
capacidade de determinação da reatividade cruzada nos animais sensibilizados
com os antígenos nativos. Desta maneira, foi confirmado o perfil de
reconhecimento humoral dos fagos pelo soro de animais naturalmente infestados
com carrapatos oriundos de cepas de campo. Foi detectado que o clone Seq. ID
No2 apresentou uma reatividade intermediária distinta para o soro do animal
nelore com baixa contagem de carrapatos. Este clone sugere algum processo
polimórfico relacionado a uma possível barreira biológica ao parasitismo por
139
carrapatos nos bovinos. Futuros trabalhos serão conduzidos para investigar o real
valor deste clone. Aparentemente a maioria dos clones da seleção S1 e S2
apresentaram baixa reatividade, com exceção dos clones Seq. ID No 12, Seq. ID
No 15, e Seq. ID No 32 sugerindo que estes clones poderiam estar mimetizando
antígenos ocultos.
Em função do reconhecimento dos clones de fagos pelos anticorpos do
soro de animais naturalmente expostos ao Rhipicephalus (Boophilus) microplus,
foi verificado o perfil de resposta imune celular frente a estes clones de fagos.
Assim, o teste de hipersensibilidade cutânea com antígenos totais de larvas em
bovinos infestados naturalmente com Rhipicephalus (Boophilus) microplus pode
fornecer um padrão de resposta dependente da raça do animal utilizada,
dependente da região do teste cutâneo, da concentração das partículas de fagos
inoculadas e das seqüências dos peptídeos recombinantes expressos nos fagos,
além da verificação de uma reatividade natural do tecido cutâneo ao fago
selvagem (Figura 25, Figura 26, Figura 27 e Figura 28). O aumento da espessura
ocorreu com maior intensidade nos animais inoculados na região cervical do que
na região do pavilhão auricular, tanto para os animais inoculados com proteínas
totais de larvas, quanto para as partículas virais de fagos. Pelas leituras métricas
no pavilhão auricular, foi constato um perfil diferenciado de resposta cutânea tanto
diminuição da espessura, quanto em relação a cinética da resposta. Foi visto que
o animal holandês com alta contagem de carrapatos (susceptível) apresentou os
maiores valores de aumento de espessura nos testes da região cervical e na
região do pavilhão auricular do que os demais animais testados. Pelo nosso
conhecimento, ainda não temos informações a respeito da existência de testes de
hipersensibilidade cutânea em bovinos utilizando partículas de fagos como
inóculos. Os dados gerados pelo teste cutâneo sugerem que os animais
resistentes conseguem modular a resposta de hipersensibilidade gerada pelos
mimetopos expressos em fagos quando comparado aos animais susceptíveis.
A associação destes resultados foi essencial no direcionamento da
escolha de clones específicos para serem testados como antígenos vacinais.
Desta forma, escolhemos um sistema de síntese e expressão de múltiplos
antígenos recombinantes expressados em tandem prontos para serem testados,
abrangendo diversas combinações para os peptídeos selecionados neste
140
trabalho. Este sistema de expressão foi utilizado com sucesso na produção de
polipeptídios recombinantes para a produção de antígenos heterólogos em
métodos de diagnóstico e vacinas relacionados com a doença de gumboro (Wang
et al., 2007). Os peptídeos utilizados foram selecionados previamente a partir de
bibliotecas de Phage Display tendo como alvo biológico os anticorpos
monoclonais monoespecíficos para o vírus causador da doença.
Subunidades de vacinas recombinantes produzidas através da
biotecnologia apresentam grandes promessas para o futuro das vacinas
veterinárias. A expressão de proteínas recombinantes em E. coli oferece os
benefícios da produção de grandes quantidades do antígeno alvo dentro de
poucas horas após a indução e sendo uma tarefa menos difícil e mais barata
quando comparado com culturas de células (Sambrook et al., 1989). Entretanto, a
produção de proteínas a partir de genes clonados requer freqüentes modificações
pós-traducionais, tais como formação de pontes dissulfeto, glicosilação,
fosforilação, e oligomerização, os quais não são realizados eficientemente em
células bacterianas, tornando esse aspecto um grande desafio a ser resolvido
(Sambrook et al., 1989). Epítopos conformacionais necessitam da produção de
anticorpos neutralizantes que também podem ser destruídos durante o
procedimento de recuperação, tais como sonição ou pelo pH ácido durante a
eluição de uma coluna de afinidade. Adicionalmente, a proteína expressada pode
não se conformacionar adequadamente, de acordo com a demanda para o
desenvolvimento de vacinas recombinantes e testes de diagnósticos (Tellan et al.,
2002). Os peptídeos recombinantes por serem uma estrutura simples poderiam
simplificar o processo de produção em escala e evitar os problemas de
conformação.
As vantagens do uso de proteínas recombinantes para o desenvolvimento
de vacinas objetivando o controle do carrapato bovino são: Uma vacina com
potencial para o controle do carrapato, baseada na expressão em vetores ou na
síntese química, alto nível de pureza biológica por causa da inexistência de
processos complicados de purificação, completa caracterização do antígeno,
segurança pela ausência de contaminantes, reprodutibilidade em média escala,
alta estabilidade em função do sistema de expressão ou síntese química,
tornando mais adequado a armazenagem, baixo custo de produção em escala
141
industrial em função do fago apresentar reprodução ilimitada e purificação
simplificada (Wang et al., 2007).
A expressão de múltiplos mimetopos em uma única proteína em E. coli
apresenta vantagens em relação a expressão de antígenos protéicos nativos ou
mesmo em bacteriófagos. Em primeiro lugar, os mimetopos selecionados por
Phage Display possuem forma linear e mimetizam epítopos que podem ser tanto
lineares quanto conformacionais, uma vez que não ocorre necessidade de
modificações pós traducionais e são mais prováveis conformar-se corretamente
em E. coli com um mínimo de perda de afinidade de ligação. Segundo, a
imunização com uma proteína artificial consistindo de múltiplos mimetopos
minimiza qualquer efeito tóxico associado com a atividade biológica de um
antígeno e minimizam também a interferência da resposta imune do hospedeiro
(tais como anticorpos maternos) contra os antígenos. Terceiro, uma proteína
artificial consistindo de múltiplos mimetopos e espaçadores são usualmente
pequenos em tamanhos e desta forma indicados para a produção em E. coli
(Wang et al., 2007).
O desenho racional é um fator importante na eficácia de imunógenos
multi-mimetopos. Pequenas alterações em apenas um único aminoácido
apresentam efeitos de modulação da eficiência de processamento antigênico
(Livengston et al., 2001). A adição de espaçadores entre os epítopos foi reportada
como sendo crucial para a proteção contra tumores induzidos por antígenos
específicos (Velders et al., 2001). Nesta linha de pensamento, trabalhos futuros
serão encaminhados na direção de identificar e caracterizar mimetopos
específicos e posteriormente aperfeiçoar o arranjo e a apresentação de múltiplos
mimetopos do sistema imune para se alcançar os melhores efeitos de vacinação.
O presente estudo demonstra a capacidade de identificação de
importantes mimetopos para o desenvolvimento de vacinas através da seleção de
bibliotecas de peptídeos (Folgori et al., 1994). Os resultados também indicam o
potencial da utilização destes mimetopos como subunidades vacinais a partir da
síntese de genes artificiais para a constituição de vacinas com múltiplos epítopos
do carrapato bovino.
142
CONCLUSÃO
• A produção de anticorpos policlonais IgY foi eficiente a partir da imunização de
galinhas com proteínas totais do Rhipicephalus (Boophilus) microplus por
gerar alto título de anticorpos e conferir a especificidade necessária para os
experimentos de seleção biológica.
• A seleção das bibliotecas de Phage Display contra o alvo biológico
proporcionou a identificação de 107 clones de fagos distintos altamente
específicos, evidenciado pelo enriquecimento na seleção em seis das sete
seleções utilizadas.
• As análises de alinhamento evidencia a presença de 8 motivos, provavelmente
representantes de estruturas críticas de epítopos naturais como sendo:
NxxxKxxL (SC1), TPDKS (SC2), PxxKxH (SC3), LHS (SC4), LHxxL (SC5),
HTS (SC6), PxFF (SC7), e LYGS (SC8) sendo estas seqüências consenso
detectadas por alinhamento múltiplo com diversas proteínas antigênicas do
parasito.
• As seqüências dos peptídeos apresentaram motivos com alta similaridade às
proteínas descritas em bancos de dados protéicos, sendo as metaloprotease
de glândula salivar, GP80 e proteínas tipo notch as mais representativas e que
representam atualmente importantes alvos em estudos vacinais.
• Os fagos recombinantes apresentaram–se altamente reativos nos testes de
Elisa, Dot-Blot e Western blot, comprovando seus potenciais antigênicos no
reconhecimento pelos anticorpos específicos para proteínas de carrapato e
desta forma estes epítopos certamente apresentam-se estruturalmente
semelhantes aos epítopos nativos.
• Os fagos Seq. ID No 18, Seq. ID No 22, Seq. ID No 32, Seq. ID No 47, Seq. ID
No 48, Seq. ID No 50, Seq. ID No 51, Seq. ID No 69 e Seq. ID No 70
apresentam-se altamente específicos por serem inibidos em ensaios de
competição e comprovando assim que estes peptídeos dividem os mesmos
epítopos com as proteínas de carrapato no reconhecimento pelas IgYs
policlonais anti-carrapato.
• A maioria dos peptídeos apresentaram capacidade de indução de imunidade
cruzada contra as proteínas totais do Riphicephalus (Boophilus) microplus em
143
camundongos, sendo os peptídeos Seq. ID No 18 e Seq. ID No 32 os mais
imunogênicos e provavelmente alvos de estudos vacinais futuros.
• O estudo dos fagos em animais infestados naturalmente permitiram a
detecção de um padrão atípico de resposta imune humoral e celular no
reconhecimento dos fagos.
• A reatividade dos clones em testes cutâneos de hipersensibilidade como
sendo dependente da dose, via de aplicação e o fago por si só apresentam
resposta de hipersensibilidade imediata.
• A expressão e a purificação das proteínas recombinantes multi-epitopos
específicas, expressadas em E. coli, foram eficientemente realizadas, o que
demonstrou que a estratégia utilizada foi eficaz para a obtenção de antígenos
na forma de proteína recombinante.
• As proteínas recombinantes multi-epitopos apresentaram reatividade aos
anticorpos anti-proteínas de carrapato, sendo a primeira evidência de sua
utilização como imunógenos.
• As proteínas recombinantes foram expressas sob a forma de corpos de
inclusão, o que indica uma característica de insolubilidade, embora após os
processos de solubilização, possibilita a sua utilização diretamente em ensaios
vacinais.
• As seqüências miméticas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus obtidas
neste trabalho apresentaram alto potencial como antígenos e estão prontas
para serem testadas, sob diferentes formulações, em futuros ensaios vacinais
para o controle imunológico do carrapato bovino.
144
PERSPECTIVAS FUTURAS
• Torna-se extremamente necessário a abrangência e a realização de novos
testes complementares in vivo com as proteínas recombinantes desenvolvidas
e produzidas neste estudo, a fim de serem testadas em situações artificiais e
também naturais de parasitismo frente ao hospedeiro.
• Testar diferentes combinações e concentrações dos fagos selecionados para
produção de vacinas poligênicas através do sistema de expressão de
proteínas recombinantes multi-epítopos de forma semelhante as utilizadas
neste trabalho, tendo como referência os 107 clones distintos identificados.
Nesta etapa os índices de proteção serão avaliados por testes de desafio
parasitário.
• Identificar e caracterizar mimetopos específicos e posteriormente aperfeiçoar o
arranjo e a apresentação de múltiplos mimetopos do sistema imune para
alcançar os melhores efeitos de vacinação.
• Pela importância fisiológica das prováveis proteínas identificadas neste
trabalho e pelos seus epítopos selecionados da biblioteca de peptídeos
recombinantes, juntamente com as bilbiotecas de scFv, torna-se necessário a
purificação, caracterização e testes vacinais das proteínas nativas referentes
aos epítopos selecionados.
• Seleção de novos epítopos pela utilização da biblioteca de peptídeos, de
forma individualizada, em diferentes tecidos de carrapato como: aparelho
bucal, intestino e ovário por serem os principais órgãos alvo. Assim como, a
seleção de novos peptídeos recombinantes a partir de anticorpos monoclonais
produzidos a partir de hibridomas ou anticorpos monoclonais do tipo scFv,
específicos e já caracterizados no reconhecimento de epítopos nativos.
• Os peptídeos recombinantes selecionados por nosso grupo encontram-se em
fase de patenteamento para a continuidade dos testes e estarão aptos para a
transferência de tecnologia, caso haja necessidade.
145
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