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  • 1

    Bacterial GeneticsLa Gentica Bacteriana ha contribuido al desarrollo de

    conceptos en Gentica y Biologa Molecular:

    - El DNA contiene la informacin gentica.

    - Desciframiento del cdigo gentico

    - La naturaleza de las mutaciones como cambios en secuencias de nucletidos en el DNA

    - Estudio de los procesos de replicacin del DNA, de transcripcin y traduccin

    - Regulacin de la expresin gentica (represores, activadores)

    Tema IV. Gentica Bacteriana

    Tema IV. Gentica Bacteriana

    Por qu podemos hablar de Gentica Bacteriana? Las bacterias son haploides (Un cromosoma)

    No hay alelos dominantes y recesivos. Se reproducen de manera asexual

    Sin embargo, hay una alta diversidad gentica:Se encuentra en una poblacin resistencia a antibiticos, resistencia a bacterifagos, diversidad metablica (sntesis de aminocidos, vitaminas etc.)

    La principal fuente de variabilidad gentica en bacterias es la mutacin.

    Mutacin espontnea: cambios que ocurren durante la duplicacin del DNA

    Mutacin inducida: cambios que ocurren por dao al DNA

  • 2

    Cadena de

    DNA molde

    Cadena de

    DNA nueva

    Correccin del error

    Sin correccin del error

    Siguiente ronda de replicacin

    Mutacin espontnea: cambios que ocurren durante duplicacin del DNA

    Mutacin inducida: cambios que ocurren por dao al DNA

    Desaminacin oxidativa del DNA Una hipoxantina se aparea con una citosina

    Escherichia coli

    Genoma: 4.4 x 106 pares de bases. La replicacin del genoma implica la polimerizacin de 8.8 x 106 nts

    La DNA polimerasa que replica el genoma de E. coli, en cooperacin con otros mecanismos, comete un error cada 1010nucletidos incorporados.

    Si cada genoma implica la incorporacin de 8.8 x 106 nts, habra un error aprox. cada 1136 divisiones (1010 / 8.8 x 106)

    Tasa de mutacin en E. coli

    Un mL de un cultivo de bacterias en fase exponencial tiene:

    1 x 109 clulas. Como habra un error cada 1136 replicaciones, si se dividen todas las clulas, 1 x 109 / 1136 = 8.8 x 105mutaciones en una generacin.

  • 3

    Escherichia coli sensible a bacterifagos

    Diluir el cultivo

    Inocular el cultivo con el fago

    Determinar el nmero de colonias resistentes al fago:

    142/ 146/ 155/ 140/ 132/ 123/138/149

    Inocular y determinar el # de colonias resistentes al fago:

    67/ 159/ 117/ 291/75/ 135/ 220/ 0

    Experimento de Luria y Delbrck. Prueba de fluctuacin

    Muchos subcultivos

    Experimento de Luria y Delbrck. Prueba de fluctuacin

    La resistencia al bacterifago se debe a mutaciones en algn(os) gen(es) de la bacteria.

    Se observa mayor variabilidad en el nmero de colonias resistentes al fago en los cultivos independientes: las mutaciones ocurren espontneamente, en ausencia del bacterifago.

    La alta variabilidad se explica porque en cada cultivo, la mutante resistente se dio en distintas generaciones.

  • 4

    Gentica Bacteriana. Anlisis fenotpico en bacterias.

    AUXOTROFA

    Las cepas silvestres son prottrofas (crecimiento en medio mnimo), se pueden identificar mutantes incapaces de sintetizar algn metabolito esencial, por lo que este debe ser aadido al medio (bio-, arg-, met-, ad-)

    FUENTE DE ENERGA

    Capacidad de las bacterias para utilizar determinados sustratos como fuentes de energa, generalmente carbohidratos (galactosa; gal-/gal+, lactosa; lac-/lac+, melobiosa,

    RESISTENCIA/SUSCEPTIBILIDAD A ANTIBITICOS

    Capacidad de crecen en presencia de inhibidores, como antibiticos (estreptomicina, ampicilina, kanamicina, etc.

    strR/strS; ampR/ampS

    Otras caractersticas como morfologa colonial y pruebas bioqumicas tambin se emplean.

    Experimento de Lederberg y Tatum

    E. coli E. coli

    Medio mnimo

  • 5

    Experimento de Lederberg y Tatum

    Medio mnimo

    Se requiere contacto fsico entre las bacterias para que ocurra este intercambio

    Mecanismos mediante los cuales las bacterias adquieren nueva informacin gentica

    Transformacin

    Conjugacin

    Transduccin

  • 6

    1. TRANSFORMACIN

    En la transformacin, DNA exgeno es introducido a la clula e incorporado al DNA cromosomal por recombinacin.

    .

    El DNA se une a un receptor en la superficie de la clula

    Una nucleasa extracelular corta el DNA en fragmentos ms pequeos.

    Una de las cadenas es degradada y la otra cadena es transportada al interior de la clula

    La cadena de DNA se alinea con una regin homloga en el cromosoma bacteriano.

    La cadena de DNA se incorpora al cromosoma bacteriano por recombinacin homloga.

    Reparacin de DNA.

    Clula transformada

    El transporte del DNA del medio extracelular al citoplasma es un proceso muy complejo que todava no est bien entendido.

    Se requieren protenas que estn involucradas en los sistemas de secrecin, as como de una translocasa de DNA en la membrana.

  • 7

    Escherichia coli tiene dos tipos de clulas: donadores/machos y receptoras/hembras. La diferencia radica en la presencia del plsmido F (plsmido sexual/ factor de Fertilidad) F+/F-

    El plsmido F contiene unos 100 genes, algunos de ellos codifican protenas involucradas en la replicacin del DNA. Otros genes codifican protenas tubulares que forman el pilus.

    CONJUGACIN

    Conjugacin es el proceso de apareamiento de bacterias mediante el cual se transfiere informacin gentica. Involucra el contacto fsico entre bacterias (F+ y F-)

  • 8

    La clula F+ sintetiza el pilus

    El pilus entra en contacto con la clula F-

    El plsmido es activado para transferencia cuando una endonucleasa corta una cadena en el origen de transferencia

    El pilus se retrae causando que las cls. donadora y receptora se unan. El plasmido F se transfiere como DNA de cadena sencilla

    La cadena complementaria de ambos plsmidos se sintetiza

    Conjugacin

    Conjugacin. Apareamiento entre bacterias (F+ y F-)

    La clula F+ inicia la conjugacin al sintetizar y extender el pilus que se adhiere a la superficie de la clula F-

    El pilus se retrae y acerca a las dos clulas.

  • 9

    Una de las cadenas del DNA F es cortada y se separa de la otra cadena. Se transfiere esa cadena a la otra clula, mientras que se comienza a replicar el DNA de la cadena que se qued en la clula F+

    La cadena de DNA recin transferida tambin se replica. Las dos clulas contienen un plsmido F integro, por lo que ambas son F+

    Las cepas Hfr resultan de la integracin del factor F al cromosoma.

    Clulas Hfr (high frequency recombination). Cepas de Escherichia coli que son muy eficientes en transferir genes cromosomales.

    Episoma. Fragmento de DNA que puede existir como plsmido y que se puede integrar al cromosoma.

    Integracin del Factor F al cromosoma

  • 10

    Clulas Hfr (high frequency recombination). Otra propiedad que tiene el plsmido F es su capacidad de integrarse al cromosoma bacteriano, incrementando el tamao de ste.

    La clula Hfr mantiene su capacidad de conjugacin, por lo que se puede aparear con una clula F-

    Ocurre transferencia de material gentico, sin embargo, no se transfiere el cromosoma completo pues las clulas se separan. La secuencia correspondiente al plsmido F no se transfiere.

    Como se transfiri un fragmento del DNA cromosomal, hay homologa con el cromosoma de la clula receptora y ocurre recombinacin con alta frecuencia (Hfr)

  • 11

    Figure 6.5b

    order of transfer is lac+ pro+

    F now lac+ pro

    F now lac+ pro+

    Hfr Conjugation

    CONJUGACIN F

    En clulas Hfr ocurre con baja frecuencia que F se escinda del cromosoma y forme un plsmido circular nuevamente. Cuando esto ocurre, F acarrea consigo genes adyacentes del cromosoma que ahora se encuentran formando parte del plsmido F. Entonces, a ste se le llama plsmido F.

  • 12

    Con esta transferencia se pueden crear clulas diploides parciales (merocigotos).

    Los plsmidos F tambin pueden ser transferidos por conjugacin

    CONJUGACIN F

    Una caracterstica importante del apareamiento Hfr / F- es que la transferencia del cromosoma Hfr ocurre a una tasa constante a partir de un punto fijo determinado por el sitio donde est insertado el episoma F.

    Esta propiedad permite controlar la cantidad de informacin gentica transferida y mapear la posicin de los genes transferidos con respecto a la secuencia F de acuerdo al tiempo de conjugacin.

  • 13

    Mapeo de genes en E. coli por conjugacin

    El tiempo que se requiere para que los genes entren en la clula receptora est asociado con el ordenamiento en el cromosoma bacteriano.

    El cromosoma Hfr es transferido linealmente a la clula F -

    receptora.

    Si se interrumpe la conjugacin a distintos tiempos ocurrirn transferencias parciales de los genes.

    El orden de los genes a lo largo del cromosoma se puede deducir al determinar los genes transferidos durante apareamientos cortos y comparados con apareamientos largos.

    Cepa Donadora Hfr: thr+; leu+; azis; tons; lac+; gal+; strs

    Cepa receptora (F-): thr-; leu-; azir; tonr; lac-; gal-; strr

    1. Poner en contacto a las dos cepas

    2. Interrumpir por agitacin la conjugacin a distintos tiempos

    3. Sembrar en medio con streptomicina (elimina a la cepa donadora)

    4. Evaluar el fenotipo de las bacterias conjugantes

    Experimento de Conjugacin a tiempos controlados.

  • 14

    Tiempo de conjugacin

    (min)

    % de colonias que sobreviven con los genotipos indicados

    thr+leu+ azis tons lac+ gal+

    Resultados del Experimento

    Punto de inicio

    Las unidades son minutos. Se refiere al tiempo que tardan los genes en entrar a una bacteria