análises de expressão e de toxicidade em plantas de...

Análises de expressão e de toxicidade em plantas de algodão contendo o gene cry1Ia

que confere resistência à insetos

Carliane Rebeca Coelho da Silva

Orientação: Prof Dr. Péricles de Albuquerque Melo FilhoCo-orientação: Dra. Roseane Cavalcanti dos Santos

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCODepartamento de Agronomia

Programa de Pós-Graduação em Agronomia Melhoramento Genético de Plantas

Introdução

Revisão de literatura

Objetivos

Material e Métodos

Resultados Esperados

Revisão Bibliográfica Aspectos econômicos do algodoeiro

Gossypium hirsutum L. – principal espécie cultivada


Cultivo comercial abrange mais de 100 países, com área anual superior a 40 milhões de hectares;

Aspectos econômicos do algodoeiro

Principais produtores mundiais de algodão


Cultivo comercial abrange mais de 100 países, com área anual superior a 40 milhões de hectares;

Situação nacional:

Estimativa para safra 2009/10:

Caroço – 2 milhões de toneladas

Área – 843 mil ha

Aspectos econômicos do algodoeiro

Principais estados produtores:

Classificação Taxonômica e Botânica do Gênero Gossypium

Filo: Angiospermae

Classe: Dicotiledoneae

Ordem: Malvales

Família: Malvaceae

Tribo: Hibisceae

Porte arbustivo ou herbáceo: 1,0 – 1,70 m


Porte arbustivo ou herbáceo: 1,0 – 1,70 m Característica da espécie: presença de bráctea protegendo o botão floral


Porte arbustivo ou herbáceo: 1,0 – 1,70 m Característica da espécie: presença de bráctea protegendo o botão floral Inicio dos botões florais - 35 a 45 dias após a emergência


Porte arbustivo ou herbáceo: 1,0 – 1,70 m Característica da espécie: presença de bráctea protegendo o botão floral Inicio dos botões florais - 35 a 45 dias após a emergência A flor é do tipo hermafrodita com sistema de reprodução intermediário


Porte arbustivo ou herbáceo: 1,0 – 1,70 m Característica da espécie: presença de bráctea protegendo o botão floral Inicio dos botões florais - 35 a 45 dias após a emergência A flor é do tipo hermafrodita com sistema de reprodução intermediário Fruto: maçã que após a maturação transforma-se em capulho


Principais problemas na cultura do algodão

Alto custo de produção: U$ 1,500 - 3,000/ha

Cerca de 40% são destinados a:

mecanização da lavouracontrole de plantas invasorascontrole de pragas e doenças

Principais pragas:

Plutela xylostella (tarças-das-crucíferas)

Spodoptera frugiperda(lagarta do cartucho do milho)

Anthonomus grandis (bicudo do algodoeiro)

Heliothis virescens(lagarta da maçã)

Pectinophora gossypiella (lagarta rosada)

Anticarsia gemmatalis (lagarta da soja)

Técnica de transferência de gens entre espécies vivas que, em condições naturais, não se cruzam

Transgenia

Técnica de transferência de gens entre espécies vivas que, em condições naturais, não se cruzam

Transgenia

Aplicabilidade da transgenia no melhoramento de plantas

a) Possibilidade de transferir genes sem a limitação imposta pelas barreiras naturais

(ex. Incompatibilidades cromossômicas)

Transgenia

b) Maior controle na transferência de genes específicos (ex. Alguns genes são transferidos em grupo)

Transgenia

c) Redução de tempo para obtenção da cultivar melhorada (ex. Leva-se entre 5 a 15 anos no melhoramento convencional)


Transgenia

c) Redução de tempo para obtenção da cultivar melhorada (ex. Leva-se entre 5 a 15 anos no melhoramento convencional)

d) Possibilidade de transferência de genes exógenos (ex. gene de bactéria para planta)


Área com LGM no mundo

Evolução da área cultivada com LGM (em milhões de ha) no período de 1996 a 2008 nos paises industrializados e em crescimento. Fonte: James (2008)

Fonte: James (2008)

Países que adotam as LGM

Principais Métodos de Transformação

Absorção de DNA mediada via polietilenoglicol (PEG)

Biobalística

Vetores biológicos (espécies de gênero Agrobacterium)

Transformação via microinjeção

Tecnologia Bt

VANTAGENS

Especificidade

Redução do uso de pesticidas (menor dano ambiental)

Mecanismo de ação da toxina do Bt

Objetivos Objetivo Geral

Avaliar a expressão e a toxicidade da proteína cry1Ia em plantas transformadas de algodão por meio de testes moleculares e bioensaios conduzidos com a lagarta militar.

Metas:

Confirmar a inserção do transgene por meio de ensaios moleculares e análise de seqüenciamento no período de 12 meses

Estimar o nível de expressão da proteína por meio de Dot-ELISA e Western blot no período de 06 meses

Estimar a taxa de mortalidade dos transgenes em Spodoptera por meio de bioensaios de toxicidade no período de 06 meses

Material e Métodos

Material Vegetal

cv BRS 293

Transformação Via microinjeção

Surgimento dos primeiros botões florais

O volume de 10 µL (50 ng/µL).

Foram microinjetadas 20 maçãs/planta

Amplificação dos Fragmentos por PCR

Extração de DNA (Kit DNA Easy)

Ensaios de PCR (Taq polimerase)

Quantificação (Gel de agarose 1%)

Alíquotas 30 ng/μl

Amplificação dos Fragmentos por PCR

Primers (1F/3R, 2F/2R e 1F/2R)

Produtos de PCR (gel de agarose 0,8%)

Syber Green (LGC)

Fotodocumentação (luz ultravioleta).

Análise de Integração do DNA por Southern blot

Formas mais simples de determinar em que altura certos genes estão sendo expressos

DNA genômico digerido com enzimas específicas

Transferência para membrana de nylon

Pré-hibridização

Hibridização com sonda fria (BioNick, Invitrogen)

Southern blot (SAMBROOK, 1989)

Análise do Seqüenciamento

LGBS/UFRPE

Primer 2F/2R (fragmento de 360 pb)

Purificação (Kit SNAP, Invitrogen)

Amostra: 100 ng/ul

MegaBace1000 (Amersham/GE Healthcare) Análise da seqüência (Sequence Analyzer)Edição (BioEdit version 7.0.9.0)Alinhamento (Blastn (Basic Local Alignment Search Tool)

Extração e Quantificação das proteínas

Extração (ARAGÃO, 1998)

Centrifugação (11.000 rpm / 30 min / 4ºC)Separação do sobrenadanteRe-centrifugação (11.000 rpm / 10 min / 4ºC)

Quantificação

Método de Bradford (1976).

Dot-Elisa

Material vegetal

Controle positivo (Bollgard I, Monsanto )Controle negativo (CNPA BRS 293, Embrapa)24 transformantes

Ensaio qualitativo

Dac-ELISA

Material vegetal

Controle positivo (Bollgard I, Monsanto )Controle negativo (CNPA BRS 293, Embrapa)24 transformantes

Dac-ELISA

Técnica utilizada para detectar expressão protéica Técnica imunológica: uso de anticorposQuantitativa. Muito sensível. Placa especifica com 96 poços sendo três repetições

Western blot

Estuda o perfil de expressão protéica.

Tecnica comparativa

Os extratos protéicos são separados por eletroforese, sistema SDS-PAGE

As proteínas transferidas para membrana de nitrocelulose.

Os procedimentos posteriores seguirão de acordo com o descrito em Sambrook et al (1989).

Bioensaio

Material vegetal

Controle positivo (Bollgard I, Monsanto )Controle negativo (CNPA BRS 293, Embrapa) 24 transformantes

Bioensaio

Folhas liofilizadas (metodologia descrita por Martins et al., 2001)Larvas de Spodoptera no segundo estágioPlacas com 24 poços, contendo oito repetiçõesLeitura feita a partir de 48h até o sétimo diaTaxa de mortalidade será calculada pela por meio da formula de Abbot (1925).

Resultados esperados

Identificar eventos de elite expressando a proteína CryIa

em uma dosagem igual ou superior a 50 ng/µg de tecido.

Cronograma:Planejamento das atividades e revisão da literatura

xDefesa da dissertação

DNOSAJJMAMFJ

xxxx

xxxElaboração de relatório

xxxxRedação de artigos para eventos científicos

xxxxxxxxxxxxRevisão de literatura

M

x xxxxxEnsaios de toxicidade

xxxWestern blot

xxxDot ELISA

xxxExtração e Quantificação das proteínas

xxxxxAnálise de seqüenciamento

xxxxAnálise de integração do DNA via Southern

xxxEnsaios de PCR

xxxxxx

DNOSAJJMAMFJAtividades moleculares (2010)

JAtividades complementares (2009/2010) F AM JJM NOSA D

Atividades complementares (2011)

Elaboração da dissertação

Agradecimentos:

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