Avaliação e Identificação da toxicidade aguda e

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CENTRO UNIVERSITRIO MONTE SERRAT CAIO CESAR RIBEIRO AVALIAO E IDENTIFICAO DA TOXICIDADE AGUDA E CRNICA DO LIGHT-STICK, SINALIZADOR UTILIZADO EM PESCA DE ESPINHEL, ATRAVS DE ENSAIOS COM DIFERENTES ORGANISMOS MARINHOS. Santos 2010 CAIO CESAR RIBEIRO AVALIAO E IDENTIFICAO DA TOXICIDADE AGUDA E CRNICA DO LIGHT-STICK, SINALIZADOR UTILIZADO EM PESCA DE ESPINHEL, ATRAVS DE ENSAIOS COM DIFERENTES ORGANISMOS MARINHOS. Trabalho de Concluso de Curso apresentado ao Centro Universitrio Monte Serrat como exigncia parcial para a obteno do Ttulo de Bacharel em Oceanografia. Orientador: Prof. Ms. Alessandro Augusto Rogick Athi Co-orientador: Prof. Ms. Maria Fernanda Palanch-Hans Santos 2010 Cesar-Ribeiro, Caio. R484a Avaliao e Identificao da toxicidade aguda e crnica do Light-stick, sinalizador utilizado em pesca de espinhel, atravs de ensaios com diferentes organismos marinhos. Santos/ So Paulo. Caio Cesar Ribeiro - 2010 59 f.: Il preto e branco: 30 cm. Trabalho de Concluso de Curso (Graduao) - Centro Universitrio Monte Serrat, 2010. Curso: Oceanografia Orientador: Prof. Ms. Alessandro Augusto Rogick Athi; Prof. Ms. Maria Fernanda Palanch-Hans 1. Light-stick. 2.Ecotoxicologia. I. Palanch-Hans, Maria Fernanda. II. Athi, Alessandro Augusto Rogick.. III Avaliao e Identificao da toxicidade aguda e crnica do Light-stick, sinalizador utilizado em pesca de espinhel, atravs de ensaios com diferentes organismos marinhos. CAIO CESAR RIBEIRO AVALIAO E IDENTIFICAO DA TOXICIDADE AGUDA E CRNICA DO LIGHT-STICK, ATRAVS DE ENSAIOS COM DIFERENTES ORGANISMOS MARINHOS. Trabalho de Concluso de Curso apresentado ao Centro Universitrio Monte Serrat como exigncia parcial para a obteno do Ttulo de Bacharel em Oceanografia. Orientador: Prof. Ms. Alessandro Augusto Rogick Athi Co-orientador: Prof. Ms. Maria Fernanda Palanch-Hans BANCA EXAMINADORA: ___________________________________________________________________ Nome do examinador: Titulao: Instituio: ___________________________________________________________________ Nome do examinador: Titulao: Instituio: Local: Centro Universitrio Monte Serrat UNIMONTE DEDICATRIA Dedico esse trabalho a minha famlia: minha me (Margareth) que a pessoa que eu mais amo nesse mundo e com certeza a que torce mais por mim e se orgulha das minhas atitudes, e que uma me maravilhosa, poderosa e absoluta, ao meu pai (Alcides) que sempre me apia e que foi e um exemplo pra mim, minhas irms (Adriana e Erica), vigi nem sei o que falar dessas figurinhas a, como eu as amo, elas so muito importantes pra mim e sou o que sou hoje graas amizade e conselhos dessas duas, minha sobrinha (Nicole) que eu amo de monto, meu cachorro (Bob, rsss), embora j tenha ido me aturou por um bom tempo, meus padrinhos (Dinha e Paulo) que eu preciso v-los mais vezes, mas meus pais escolheram os melhores padrinhos pra mim, meus avs que embora no estejam mais conosco so muito importantes, uma vez que sem eles eu no estaria aqui hoje, meus parentes em geral (tios (as), primos (as) e etc.), minha namorada (Flvia) estrela-do-mar, aos amigos PROUNI (Vivi, Mari e Gui) under ground comigo dos momentos difceis aos momentos difceis (rsss), minhas companheiras de lab. e amigas maravilhosas Helena (Pescadoooores e Lavadeeeeiras), Tbata (ex-pamonha), Dani (Magrrima) e Camila (saudades) que sempre me agentaram no lab., quando estava estressado, e que adoro; meus professores e coordenadores da oceanografia (vide site da unimonte) que sempre me ensinaram a ser um oceangrafo, principalmente Cintia Miyaji (obrigado pelos conselhos e amizade), Maria Fernanda (obrigado pela super-orientao, super-amizade, super-centro), David (obrigado por me desafiar), Gleyci (obrigado por me banhar de conhecimento), Maringela (obrigado pelas broncas), Garreta (obrigado por me incentivar a plantar sementes), Carol (obrigado pelas timas aulas e risadas), Luvizn (obrigado por no me subestimar), Athi (obrigado pelas conversas e caronas para sampa) , as minhas professoras da E.E. Lcia Silva de Assumpo de Pirapozinho (Silene, Sandra, Mrcia, Leila, Rosngela, etc.) e ao diretor (Dionsio) por terem me apoiado sempre e me ensinado tantas cosias mesmo com as dificuldades do ensino pblico, aos meus colegas de classe que me suportaram por todos estes anos, aos que saram do curso por motivos diversos (Nath: que nasceu no dia do ndio, Jaque: que eu dormia sempre na casa dela, Andr: Crinide), aos meus colegas de trabalho e que na verdade so amigos (Raquel (saudades), Sr. Toninho (grande amigo e conselheiro), Solange (NO, t sem jaleco!!!), Eduardo (D), Wanderlvski e J Solinho - Lab. UNIMONTE; Van (Cintura de Ovo- te adoro), Ricardo e Simone (quer um floral?) (H2O); Gimel (perdeu o balancinho), Cristal (rpido Ricardo), Luvas (Se cuida M..., Vanesso Di Paran???), Fnile (Lvia), Vanessa, Luizo (do tamanho da sua cara), Dani (obrigado pelo apoio), Mari (obrigado por acreditar em mim), Carlos (obrigado por no me mandar muito pro bota-fora), Cris ( ISO a), Raquel (Di boa caaara!) e Camila (Temps) CPEA. E dedico tambm aos meus amigos de Repblica Masmorra que foi timo morar com vocs (Baurog, Seu Bosta, Xic e Tadinho). No posso deixar de falar dos anjos da guarda que me apoiaram na minha estadia na Baixada (Ana Luiza maravilhosa, Dr. Helena; Dona Marilu e Laila amigas eternas). Agora chega de dedicar se no vou ter ningum para agradecer. AGRADECIMENTOS Primeiramente agradeo a Deus por ser to maravilhoso comigo e com minha famlia, tendo nos dado tantas oportunidades para que ns nos desenvolvssemos pessoal e profissionalmente, por isso agradeo pela sade, sorte e dons que o Senhor nos deu, que so essenciais para o nosso crescimento gradativo. Agradeo ao Lula por criar o PROUNI que patrocinou meus estudos. Agradeo a Cntia Badar-Pedroso e ao Instituto de Pesca de So Paulo por me aceitar como estagirio relmpago no meu primeiro estgio, onde comecei a trabalhar com Ecotoxicologia, e consequentemente agradeo aos estagirios Girresse e Gleyck que me auxiliaram quando era extremamente inexperiente. Agradeo a UNIMONTE e seu corpo Docente maravilhoso que me ensinaram a amar OCEANOGRAFIA. Agradeo a Professora Maria Fernanda Palanch-Hans, por ter me aceitado no estgio no laboratrio de Ecotoxicologia da UNIMONTE, e ter me ensinado tudo o que estava ao seu alcance, consequentemente agradeo aos estagirios que tambm faziam parte da equipe e que partilharam dos problemas e vitrias conquistadas no lab. Agradeo a Cintia Miyaji por ter me apoiado nas idias e na escrita deste projeto e por sempre acreditar em mim e me aconselhar com suas sbias palavras; agradeo a Caru e Tubaro por terem selecionado o meu projeto para ser executado na Bahia; agradeo a galera da caminhada por ter me ajudado no projeto, em especial agradeo por ter conhecido uma pessoa to maravilhosa como minha amiga Helena, que foi uma companhia maravilhosa, onde marcamos um lao de amizade eterno, agradeo a Global Garbage por me incentivar e apoiar no projeto e em especial ao visionrio Fabiano Prado Barreto, aos Capites de Areia e a populao das vilas litorneas que nos receberam de braos abertos. Agradeo ao Laboratrio de Oceanografia Qumica e Ecotoxicologia (LOQUE eu que dei esse nome) da UNIMONTE, por ser um espao to aconchegante (rsss) para que eu desenvolvesse os meus ensaios e me descobrisse como cientista, agradeo a Raquel que sempre me ajudou e uma amiga muito especial, e a todos os que fizeram seus TCC e Monografia de Ps no lab. e ajudaram a construir este sonho (Da (Aiii Dai) , Van (Cheia de Marra), Helena (Caiu formol no meu olho), Josemberg (Doutor), Daiana et al. (DBO e DQO), Michele, et. al. (Bilogas loucas), Tbata (Surfactante), Dani M. (Power Ponte), Dani B. (A Tampa do dessecador ta quebrada de novo), Luiz (210 amostras LOUCO). Agradeo ao professor Denis Abessa da UNESP e ao aluno de Doutorado Lucas que me ensinaram e tiraram algumas dvidas sobre Ecotox. Agradeo a H2O por ter me apoiado em muitos testes e por ter sempre acreditado em mim e no meu trabalho. Agradeo a CPEA pela oportunidade de trabalhar em uma empresa to sria e qualificada, onde eu aprendi muito e pude utilizar muito dos meus conhecimentos adquiridos na minha graduao. E aos amigos que fiz e jamais esquecerei. todos meus amigos e parentes que contriburam de alguma forma para o trmino do trabalho. EPGRAFE O mestre da vida faz pouca distino entre o seu trabalho e o seu lazer. Ele simplesmente persegue sua viso de excelncia em tudo o que faz, deixando para os outros a deciso de saber se est trabalhando ou se divertindo. Mas ele sabe que est sempre fazendo as duas coisas simultaneamente. Buda RESUMO Neste trabalho, a toxicidade aguda e crnica de uma mistura dos produtos qumicos presentes no light-stick e gua foram testados. O light-stick usado em atividades de pesca para a captura do espadarte. Os tubos foram recolhidos nas praias da Costa dos Coqueiros - BA, Brasil, no perodo de 14 a 31 de julho de 2007. O mtodo utilizado foi o teste de toxicidade aguda com Artemia sp., teste de toxicidade aguda com Lytechinus variegatus e o teste de toxicidade crnica de curta-durao onde embries de ourios-do-mar Echinometra lucunter e Lytechinus variegatus foram expostos a uma soluo de sobrenadante formado a partir de uma mistura de gua do mar e o light-stick de colorao laranja. O valor da CL50- 24h e 48h para Artemia sp. foram de 0,28% e 0,14%, respectivamente, a CE50 ~ 40 minutos para L. variegatus foi 0,014%, a CE50 - 36 h para E. lucunter foi 0,062% e a CE50 - 24h para L. variegatus foi 0,028% , ou seja, a mistura qumica presente no light-stick potencialmente txica. Com a TIE (Toxicity Identification Evaluation) foi possvel a identificao do perxido de hidrognio e dos hidrocarbonetos policclicos aromticos (HPAs), como os responsveis pela toxicidade. Ento, como esses sinalizadores so comumente usados para a pesca, h perigo em potencial na sua eliminao no mar aberto. Palavras-chaves: Light-stick, Lixo Marinho, Ecotoxicologia. ABSTRACT In this work, the acute and chronic toxicity of a mixture of light-stick chemicals and water was tested. The light-stick is used in fishery activities to catch swordfish. The tubes were collected on the beaches of the Costa dos Coqueiros - BA, Brazil, in the period from 14th to 31st July 2007. The method used was toxicity test wich Artemia sp., acute test wich Lytechinus variegatus and a short chronic toxicity test where embryos of the sea urchins Echinometra lucunter and Lytechinus variegatus were exposed to a stock solution consisting of the supernatant formed from a mixture of sea water and the orange-colored light-stick chemical. The value of LC50-24h and 48h to Artemia sp. were 0,28% and 0,14%, respectively, the EC50 ~40 minutes to L. variegatus was 0,014%, the EC50 36 h to E. lucunter was 0.062% and the EC50 - 24h to L. variegatus was 0.028%, i.e., the chemical mix present in the light-stick is potentially toxic. With the TIE (Toxicity Identification Evaluation) was possible identification the hydrogen peroxide and the Polycyclic Aromatic Hydrocarbonates (PAHs) how the responsable for the toxicity. So, as these flags are commonly used for fishing there is potential danger in their disposal in the open ocean. Keywords: Light-stick, Marine Litter and Ecotoxicology. LISTA DE FIGURAS FIGURA 01 LIGHT-STICKS ENCONTRADOS NA COSTA DOS COQUEIROS, BA .................... 25 FIGURA 02 PREPARAO DA SOLUO ESTOQUE 100%. .............................................. 27 FIGURA 03 EXEMPLAR DE ARTEMIA SP. FASE METANUPLIO. ........................................ 28 FIGURA 04 EXTRAO DOS GAMETAS UTILIZANDO CHOQUE ELTRICO A 35V ................. 31 FIGURA 05 FMEA DE L. VARIEGATUS LIBERANDO OS VULOS ...................................... 32 FIGURA 06 EXTRAO DOS ESPERMATOZIDES ........................................................... 32 FIGURA 07 CMARA DE CONTAGEM DOS VULOS, OVOS E EMBRIES ............................ 33 FIGURA 08 ADIO DE 100 L DE SOLUO ESPERMTICA AOS FRASCOS-TESTE............ 33 FIGURA 09 FINALIZAO DO ENSAIO COM PRESERVAO DOS OVOS. ............................. 34 FIGURA 10 DEMONSTRAO DE VULO DE L. VARIEGATUS E OVO. ................................ 34 FIGURA 11 ESQUEMA DE DILUIES PARA A PRODUO DA CARTA-CONTROLE. .............. 35 FIGURA 12 DEMONSTRAO DA PLUTEUS DE E. LUCUNTER NORMAL E ANORMAL ............ 37 FIGURA 13 EXEMPLARES DE E. LUCUNTER INDUZIDOS COM CHOQUE ELTRICO .............. 37 FIGURA 14 REPRESENTAO DAS MANIPULAES NA FASE I DO TIE ............................. 39 FIGURA 15 CARTA-CONTROLE ARTEMIA SP. EXPOSTO AO DSS. ................................. 41 FIGURA 16 CARTA-CONTROLE LYTECHINUS VARIEGATUS - SULFATO DE COBRE .......... 41 FIGURA 17 TESTES DSS - DESENVOLVIMENTO EMBRIO-LARVAL DE OURIO-DO-MAR ...... 42 FIGURA 18 CL E/OU CE 50% PARA TESTES COM DIFERENTES ORGANISMOS .................. 43 FIGURA 19 RESULTADOS DA FASE I DO TIE.. ............................................................... 44 LISTA DE TABELAS TABELA 01 RESUMO DAS CONDIES GERAIS DE MANUTENO E DOS TESTES DE TOXICIDADE COM L. VARIEGATUS ................................................................................... 35 11 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS PCB bifenilas policloradas HPA - hidrocarbonetos policclicos aromticos DDT dicloro-difenil-tricloroetano DSS dodecil sulfonato de sdio Cu - cobre EDTA cido etilenodiaminotetractico pH potencial hidrogeninico ATP adenosina tri-fosfato USEPA United States Environmental Protection Agency CETESB Companhia Ambiental do Estado de So Paulo CE50 Concentrao Letal a 50% dos organismos CL50 Concentrao Efetiva a 50% dos organismos CENO Concentrao de Efeito no observado CEO Concentrao de Efeito observado SE 100% - Soluo Estoque a 100% TIE Toxicity Identification Evaluation HPLC- High Precision Liquid Cromatography GC-MS Cromatgrafo a Gs acoplado a um Espectrmetro de Massa 12 ...................................................................................................................................... SUMRIO 1. INTRODUO ...................................................................................................... 13 1.1 POLUIO AQUTICA .............................................................................................. 13 1.2 ECOTOXICOLOGIA .................................................................................................. 15 1.3 LIXO MARINHO ....................................................................................................... 22 1.4 LIGHT-STICK .......................................................................................................... 24 2. JUSTIFICATIVA .................................................................................................... 25 3. OBJETIVO ............................................................................................................. 26 3.1 OBJETIVOS ESPECFICOS ........................................................................................ 26 4. METODOLOGIA .................................................................................................... 27 4.1. COLETA DOS LIGHT-STICKS .................................................................................... 27 4.2. LAVAGEM DE VIDRARIAS ........................................................................................ 27 4.3. EXTRAO DA FRAO SOBRENADANTE ................................................................. 27 4.4. PREPARAO DA DILUIO DO LIGHT-STICK EM SOLVENTE ETANOL ........................... 28 4.5. TESTE DE TOXICIDADE AGUDA COM ARTEMIA SP. ..................................................... 28 4.6. TESTE DE TOXICIDADE AGUDA E CRNICA COM OURIOS-DO-MAR ............................. 30 4.7. TIE (TOXICITY IDENTIFICATION EVALUATION) FASE I ............................................. 38 4.8. ANLISES ESTATSTICAS ........................................................................................ 40 5. RESULTADOS ...................................................................................................... 40 5.1 SUBSTNCIAS DE REFERNCIA E CARTAS-CONTROLE ............................................... 40 5.2 TESTES COM LIGHT-STICK ....................................................................................... 42 6. DISCUSSO ......................................................................................................... 45 7. CONSIDERAES FINAIS .................................................................................. 46 8. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ...................................................................... 50 13 1. INTRODUO 1.1 Poluio Aqutica O impacto ambiental segundo a Legislao Brasileira qualquer alterao das propriedades fsicas, qumicas e biolgicas do meio ambiente causada por qualquer forma de matria ou energia resultante das atividades humanas que, direta ou indiretamente afetam: I- a sade, a segurana e o bem estar da populao; II- as atividade sociais e econmicas; III- a biota; IV- as condies estticas e sanitrias do meio ambiente; e V- a qualidade dos recursos ambientais segundo a Resoluo CONAMA 001 de 23/01/1986 (RANZANI-PAIVA et al. 2004). A viso antropocntrica da sociedade ocasionou na falta de desenvolvimento sustentvel provocado pelo uso abusivo dos recursos naturais sem a preocupao com as futuras geraes. Efeitos adversos da explorao inadequada do ambiente tornaram-se mais pronunciantes durante o sculo XX, com o crescimento populacional e o desenvolvimento econmico. As conseqncias desse desenvolvimento descontrolado foram demonstradas com acidentes ambientais que geraram problemas a sade pblica. Os episdios catastrficos de contaminao por mercrio, cdmio, bifenilas poli-clorados (PCBs) e intoxicao de Minamata e Niigata, Japo, 1953 e 1964, respectivamente, e em Seveso, Itlia em 1976 deram incio a preocupao com o despejo de efluentes. No Brasil efeitos de poluio foram observados em Cubato, com a contaminao das guas e sedimento causando efeitos deletrios a biota aqutica (ABESSA, 2002). A responsabilidade para com o destino de efluentes proveniente do crescimento urbano e industrial iniciou-se tardiamente em todos os lugares do mundo. Somente aps a ocorrncia de srios acidentes ambientais, os pases passaram a desenvolver legislaes que obrigassem as empresas industriais e comerciais a tratarem seus resduos de forma a no comprometer ou alterar a qualidade do corpo receptor (ZAGATTO & BERTOLETTI, 2008). Os problemas ambientais introduzidos pelo desenvolvimento industrial e tecnolgico foram parcialmente resolvidos pelas naes industrializadas, por vrias tcnicas e caminhos alternativos. O uso de grandes bancos de dados sobre problemas ambientais, produzidos pelas instituies de pesquisa e universidades, 14 o aumento do uso da cincia da computao para entender as interaes ecolgicas e vrios nveis, a simulao ecolgica e outros tipos de modelagem, e a incorporao princpios ecolgicos na legislao ambiental so alguns dos exemplos (BADAR-PEDROSO, 1993). O lanamento de dejetos nos corpos hdricos se d principalmente pela: falta ou mau funcionamento de estaes municipais e industriais de tratamento de efluentes; no lanamento descontrolado de dejetos oriundos da produo em massa de animais (aqicultura); na ausncia de aterros sanitrios impermeabilizados; na contaminao de grandes reas por resduos qumicos da indstria e do comrcio, enterrados ou depositados clandestinamente; na aplicao indevida e quase sempre excessiva de agrotxicos, alm de produtos proibidos; na ocupao de mananciais; na minerao desordenada e excessiva em calhas de rios; na destruio de matas ciliares; na inexistncia ou ineficincia de programas de conscientizao e educao ambiental; na falta de uma poltica eficiente de gerenciamento de recursos hdricos; na falta da aplicao do comprimento das leis existentes sobre os recursos hdricos, alm da falta de conscientizao da populao em relao ao despejo de dejetos slidos nos rios, praias e oceano aberto em atividades tursticas e pesca (KNIE & LOPES, 2004). As substncias quando so despejados no ambiente aqutico sofrem inmeros processos de transformao, os principais so a hidrlise, a fotlise, a complexao e a biodegradao Esses processos so importantes porque determinam persistncia dos contaminantes no ambiente (COSTA et al., 2008). Quando estes compostos persistem no ambiente acabam sendo absorvidos pela biota, que sofrer os efeitos adversos provocados pela acumulao destes compostos em clulas e tecidos. Dentre os efeitos bioqumicos e fisiolgicos provocados pelos agentes txicos podem-se observar: interferncia na produo de ATP; modificaes na permeabilidade das membranas celulares; inibio competitiva reversvel ou irreversvel de enzimas; distrbios no metabolismo de lipdios, podendo resultar em alteraes hepticas; alteraes nos sistemas enzimticos microssomais, os quais so responsveis pela biotransformao de xenobiontes; alterao na estrutura ou na atividade de enzimas que participam de processos reguladores, comprometendo a sntese e liberao de hormnios, bem como reduzindo a velocidade de crescimento dos organismos; distrbios no 15 metabolismo de carboidratos e distrbios no processo respiratrio pela inibio do transporte de eltrons e da fosforilao oxidativa (CONNELL & MILLER, 1984). Alguns rgos como Environment Canada e Environmental Protection Agency dos Estados Unidos (U.S. EPA), e de padronizao, como American Society for Testing and Materials (ASTM), Organisation for Economic Cooperation and Development (OECD), Association of Analytical Communities (AOAC) e International Organization for Standardization (ISO) tem como objetivo o desenvolvimento de protocolos de testes de toxicidade que permitam definir limiares de toxicidade permissveis com nveis de incerteza aceitveis e que sirvam de guia para as entidades reguladoras para a tomada de decises. Onde estes nveis servem de base para a fiscalizao em programas de monitoramento da qualidade dos ecossistemas (SOUSA, 2002; COSTA et al., 2008). 1.2 Ecotoxicologia O conceito de Ecotoxicologia foi proposto por Blaise em 1984, que significa a juno da ecologia com a toxicologia e, portanto estuda os efeitos dos poluentes aos organismos e como esses interagem em seus habitats. Esta uma cincia multidisciplinar, que se faz necessria a compreenso da Biologia, Ecologia, Qumica, Bioqumica, Fisiologia, Estatstico, Oceanografia, Limnologia, Toxicologia, etc. Tendo como base as anlises estatsticas para a comprovao dos dados em diferentes condies ambientais (RAND, 1995). Os primeiros testes de toxicidade com efluentes industriais foram realizados entre 1863 e 1917, porm somente na dcada de 1930 foram implementados alguns testes de toxicidade aguda com organismos aquticos, com o objetivo de estabelecer a toxicidade de substncias qumicas e despejos lquidos. Os vrios estudos realizados na dcada de 1940 recomendavam o uso de testes com peixes para avaliar a toxicidade de efluentes lquidos. Os estudos mostraram que algumas espcies de peixes eram mais sensveis a alguns agentes qumicos, sendo ento desenvolvidos estudos com espcies mais sensveis de importncia ecolgica e econmica representativos do ecossistema aqutico, fazendo com que houvesse diferena na sensibilidade das espcies (ZAGATTO & BERTOLETTI, 2008). 16 Uma diversidade de organismos-teste foi utilizada nos anos 50 e 60 nos laboratrios lderes de diversos pases, alguns esto sendo usados at hoje em laboratrios de todo mundo. Os critrios para a deciso das mesmas espcies foram as boas experincias com seu manuseio e a sua importncia na cadeia alimentar, assim como sua ampla disseminao e fcil disponibilidade. Esses organismos pertencem as bactrias: Pseudomonas putida, e a partir do final dos anos 70, as fotobactrias Vibrio fisheri, as algas Scenedesmus subspicatus e Selenastrum capricornutum, os microcrustceos Daphnia magna e Ceriodaphnia dubia, e peixes como Danio rerio, Pimephales promelas, Leuciscus idus ou Poecilia reticulata, dentre outros (KNIE & LOPES, 2004). Na dcada de 70 mtodos mais sofisticados para cultivo de organismos em laboratrio foram desenvolvidos, assim como a procura por organismos mais sensveis, a utilizao da fase larval e ovos dos peixes fizeram com que fosse possvel avaliar a toxicidade crnica dos elementos qumicos e de amostras ambientais, verificando o retardamento no desenvolvimento e crescimento larval e taxa de reproduo, diferentemente dos testes agudos que verificam a mortalidade dos indivduos (DOMINGUES & BERTOLETTI, 2008). No Brasil, algumas atividades com testes de toxicidade foram desenvolvidas nas dcadas de 70 e 80, porm foi na dcada de 90 que essa rea de estudo se consolidou, com a criao de diversos grupos de pesquisa, a elaborao de procedimentos e normas tcnicas (ABESSA, 2002). A Companhia de Tecnologia e Saneamento Ambiental do Estado de So Paulo-CETESB foi quem deu incio aos ensaios e padronizaes de ensaios ecotoxicolgicos no Brasil (VEIGA &VITAL, 2002). Deste modo, a realizao de ensaios de toxicidade tem sido includa em programas de monitoramento, constituindo uma das anlises indispensveis no controle de fontes de poluio. J que as anlises qumicas no so capazes de determinar quais substncias e em que concentrao afetam os sistemas biolgicos, no so suficientes para avaliar o risco ambiental dos contaminantes. No entanto, os testes de toxicidade no substituem as anlises qumicas tradicionais. Por isso as anlises qumicas identificam e quantificam as concentraes das substncias txicas, os testes de toxicidade avaliam o efeito dessas substncias sobre a biota. (COSTA et al., 2008). 17 1.2.1 Organismo-teste Uma espcie pode ser utilizada em testes de toxicidade quando ela apresenta alta sensibilidade a uma diversidade de agentes qumicos. Sua sensibilidade deve ser relativamente constante, de maneira que possibilite a obteno de resultados precisos, garantindo, assim, boa repetibilidade e reprodutibilidade dos resultados. Portanto so necessrios conhecimentos sobre a biologia da espcie, como reproduo, hbitos alimentares, fisiologia e comportamento, tanto para o cultivo quanto para a realizao dos testes. Uma espcie recomendada para padronizao de testes quando ela de fcil manuteno e cultivo em laboratrio. O uso de espcies de pequeno porte e ciclo de vida no muito longo se mostra ideal aos estudos ecotoxicolgicos em laboratrio. Dentre estes esto os cladceros, misidceos, coppodes, anfpodas e artmias e outros cujo cultivo em laboratrio est bem estabelecido e no apresentam muita dificuldade para sua manuteno (RAND, 1995; ABNT, 2004; DOMINGUES & BERTOLETTI, 2008). Organismos que possuem fase embrionria larval-planctnica vm sendo comumente utilizadas em ensaios ecotoxicolgicos, so estes: ourios-do-mar, mexilhes e ostras A Artemia sp. um microcustceo encontrado ao longo dos cinco continentes. Tem como habitat natural lagos de guas salgadas e salinas, adaptada para a sobrevivncia em guas que sofrem marcantes variaes, devido s estaes do ano. A ampla distribuio e facilidade de obteno de seus cistos fazem com que o gnero Artemia tenha sido usado em testes de toxicidade para a ampla variedade de produtos como pesticidas, petroqumicos, dispersantes, metais pesados, metablicos de microorganismos, e produtos carcinognicos, desde a dcada de 1950. No Brasil estes testes foram inicialmente utilizados pela Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental do Estado de So Paulo (CETESB) em meados da dcada de 1980 para a avaliao da toxicidade aguda de substncias, sendo a norma (CETESB LO5. O21) publicada em 1987. At a dcada de 90 as artmias foram comumente utilizadas em ensaios ecotoxicolgicos com amostras lquidas, devido sua ampla distribuio geogrfica e sua facilidade de cultivo. Atualmente estes microcrustceos vm sendo substitudos por organismos como misidceos e coppodes que apresentam maior sensibilidade a uma variedade de contaminantes (VEIGA & VITAL, 2002). 18 Os gametas e embries de ourios-do-mar tm sido bastante utilizados em testes de toxicidade devido sua sensibilidade, fcil coleta e manuseio, alm de fornecer resultados de fcil interpretao e bastante reproduzveis (NIPPER et. al 1993). Alm disso, o amplo conhecimento de seu desenvolvimento embrionrio faz do ourio-do-mar um excelente indicador biolgico. Teste com gametas e embries de ourios-do-mar foram padronizados por USEPA, 1991 e pela Environment Canada,1992. No Brasil, a CETESB, 1990 e 1992 adaptou os testes com ourios-do-mar para espcies que ocorrem na costa brasileira. Dentre as espcies de ourio-do-mar, Lytechinus variegatus e Echinometra lucunter tem sido as mais utilizadas em ensaios ecotoxicolgicos no Brasil (MASTROTI, 2002). A espcie Lytechinus variegatus (Lamarck, 1816) est inserido na famlia Toxopneustidae, possui carapaa esverdeada, achatada inferiormente, espinhos apresentando cores que variam desde verde prpura arroxeado. Sua dieta alimentar consiste em macro-algas, encontrado onde as mesmas esto presentes em abundncia, possuem o comportamento caracterstico de recobrirem-se com detritos vegetais, pequenas conchas, etc. Os animais podem ser encontrados desde a zona entre mars at cerca de 20 m de profundidade. bastante comum na regio do Caribe e na costa Atlntica da Amrica do Sul, ocorrendo desde a Carolina do Norte (EUA) at a Costa Sudeste do Brasil (ABNT, 2003). A espcie Echinometra lucunter (Linnaeus, 1758) est inserida na famlia Echinometridae tm corpo globoso e simetria radial, seus espinhos so mveis de tamanho variado e sua colorao varia do preto ao roxo. Alimenta-se raspando com os dentes algas e outros organismos fixos no substrato. Ocorre em guas tropicais e temperadas do oceano Atlntico, geralmente entre o limite da baixa-mar at 45 metros de profundidade, sendo encontrados predominantemente em ambientes expostos a guas turbulentas (TAVARES, 2004). A utilizao de ourio-do-mar foi estabelecida por diversos pesquisadores que investigaram os efeitos de metais em sua fertilizao e desenvolvimento, na dcada de 1920 a 1930. A fase da fecundao e do desenvolvimento embrio-larval, geralmente so crticas, para o crescimento normal desses animais e sensveis para detectar efeitos da poluio em ecossistemas marinhos (NIPPER et. al 1993). 19 1.2.2 Sistema de Teste Existem trs tipos de sistema para testes de toxicidade: esttico, semi-esttico e de fluxo contnuo. Para realizao deste estudo foi utilizado o sistema esttico, que o tipo de teste com o qual no feita a troca da soluo-teste no perodo de exposio. Este sistema recomendado para testes com substncias estveis, quando o teste feito em curto perodo de exposio, ou quando a espcie utilizada possui tamanho reduzido, o que impossibilitaria o uso do fluxo contnuo, por possvel suco dos espcimes (ZAGATTO & BERTOLETTI, 2008). 1.2.3 Teste Agudo O ensaio de toxicidade aguda definido como aquele que avalia os efeitos rpidos sofridos pelos organismos expostos ao agente qumico, em curto perodo de tempo, geralmente de 24 96h. Devido facilidade de execuo, curta durao e baixo custo, os ensaios de toxicidade aguda foram os primeiros a serem desenvolvidos e, por esse motivo constituem a base de dados ecotoxicolgicos. Nestes ensaios geralmente so avaliados a mortalidade ou a efetividade que pode verificar imobilidade ou algum tipo de comportamento apresentado pelos organismos (BIRGE et al. 1985). Segundo a CETESB (1990), o efeito agudo definido como sendo uma resposta severa e com rapidez dos organismos aquticos a um estmulo que pode se manifestar num perodo de at 96 horas, causando quase sempre a letalidade, sendo que pode ocorrer em a alguns micro-crustceos a imobilidade. Os testes de toxicidade aguda avaliam o efeito de substncias qumicas isoladas ou em misturas, como em efluentes e guas receptoras contaminadas. Nesses ensaios, normalmente, procura se estimar a concentrao - teste que causa efeito a 50% da populao exposta, durante um perodo de tempo determinado (24, 48, 72, 96 horas). Tal concentrao corresponde CE ou CL50 (Concentrao Efetiva ou Concentrao Letal Mediana), obtidas a partir de dados quantais (dicotmicos, binomiais, binrios), como nmero de vivos e de mortos (BURATINI; BERTOLETTI ; ZAGATTO, 2004). 20 De acordo com a Resoluo CONAMA 357/05, no captulo III, Seo II, em ambientes marinhos, pertencentes classe II, no pode ser verificado a ocorrncia de efeito txico agudo em organismos. 1.2.4 Teste crnico Os testes crnicos avaliam os possveis efeitos adversos de uma amostra ou elemento qumico sob condies de longo tempo de exposio a concentraes subletais (RAND, 1995). Os ensaios crnicos expem o organismo-teste ao agente potencialmente txico durante todo seu ciclo de vida, incluindo estgios sensveis como juventude, crescimento, maturidade sexual e reproduo. O resultado expresso em Concentrao de Efeito No Observado - CENO, sendo esta a mais alta concentrao do agente testada que no provoca efeito quando comparada com o controle; e em Concentrao de Efeito Observado - CEO, a mais baixa concentrao que causa efeito significativo sobre a populao quando comparada ao controle (RAND, 1995). 1.2.5 Substncias de Referncia Segundo o Environment Canada (1990) a habilidade de uma substncia de referncia realmente detectar lotes de organismos debilitados, ou geneticamente diferentes, ainda pouco comprovada experimentalmente. Assim, segundo essa instituio, o objetivo dos ensaios ecotoxicolgicos com substncias de referncia avaliar a repetibilidade do mtodo analtico em um determinado Substncias de referncia so utilizadas para avaliar as condies de sensibilidade dos organismos-teste, sejam eles provenientes do campo ou at mesmo os cultivados no laboratrio. Com testes utilizando substncias de referncia, possvel obter resultados comparveis, ou seja, que apresentam boa repetibilidade e reprodutibilidade, podendo assim avaliar variaes sazonais dos organismos em resposta a um determinado reagente (ZAGATTO & BERTOLETTI, 2008). Para que seja padronizada uma substncia de referncia necessrio que ela siga os seguintes preceitos (ENVIRONMENT CANADA, 1990): 21 - ser solvel em gua; - ser estvel (no voltil, no transformvel e no biodegradvel); - ser de fcil anlise analtica; - ser um contaminante ambiental; - estar disponvel no mercado com alto grau de pureza; - ter alta toxicidade em gua; - ter toxicidade consistente; - ter toxicidade no especfica; - ter dados ecotoxicolgicos bsicos disponveis; - no seja perigosa para o manuseio pelos tcnicos. O dicromato de potssio uma das substncias de referncia mais utilizadas em ensaios ecotoxicolgicos, no entanto, trata-se de um composto corrosivo, facilmente absorvido pela pele e carcinognico. Nesse sentido, fica evidente a inconvenincia de se utilizar essa substncia quer pelo aspecto da segurana dos tcnicos bem como pela sua introduo contnua no ambiente. O sulfato de cobre uma substncia de referncia muito utilizada em testes de toxicidade, porm apresenta algumas caractersticas que podem interferir nos bioensaios como: sua precipitao com a presena de compostos orgnicos e inorgnicos na gua; conseqentemente, a dureza e o pH influenciam na toxicidade do cobre. Outros compostos freqentemente utilizadas como substncia de referncia para testes de toxicidade pode-se citar: DSS, sulfato de zinco, fenol, nitrato de prata, cloreto de sdio, cloreto de potssio, entre outros (ZAGATTO & BERTOLETTI, 2008). Neste estudo as substncias de referncia utilizadas para a verificao da sensibilidade dos lotes foram: DSS (dodecil sulfonato de sdio), sulfato de cobre e sulfato de zinco. 22 1.2.6 Carta Controle Aps a obteno dos resultados dos testes com substncia de referncia se constri uma carta-controle, tendo por finalidade estabelecer uma faixa de aceitao dos valores obtidos atravs do clculo estatstico da concentrao letal - CL50, sendo assim a mesma apresenta a sensibilidade dos organismos substncia de referncia (ZAGATTO & BERTOLETTI, 2008). Para a construo da carta controle necessrio um mnimo de 20 testes com substncia de referncia a fim de calcular o valor mdio, o desvio-padro e o coeficiente de variao. Caso no seja possvel efetivar a realizao dos 20 resultados de ensaio, deve ser calculada a mdia provisria tendo, no mnimo, cinco testes para publicao da carta controle apresentando a faixa de sensibilidade dos organismos. Aps o calculo da mdia da CE (concentrao efetiva), pode-se encontrar o desvio-padro superior e inferior, que so descritos na carta-controle atravs de linhas perpendiculares ao eixo que apresenta os resultados dos ensaios de toxicidade. Para melhor confiabilidade dos resultados no devem ser considerados os testes cujo coeficiente de variao seja superior a 30% (ABNT, 2003). 1.3 Lixo marinho Dentre os problemas com poluio marinha se destaca o lixo marinho, ou seja, partculas/dejetos slidos (plstico, papel, madeira, vidro, isopor, borracha e outros) despejadas ou que vo parar nos oceano, sendo o lixo um dos principais responsveis pela poluio das guas, especialmente em regies costeiras. O plstico, devido sua alta utilizao em produtos comerciais o material mais encontrado nas praias quando coletado lixo marinho, causando inmeros efeitos deletrios a biota. O lixo marinho afeta uma infinidade de organismos da fauna aqutica. Sendo quantificadas 267 espcies de animais marinhos em todo o mundo, incluindo 86% de todas as espcies de tartarugas marinhas, 44% de todas as espcies de aves marinhas e 43% de todas as espcies de mamferos marinhos, alm de muitas espcies de peixes e crustceos, que sofrem com a presena destes resduos slidos nas guas e praias (MASCARENHAS et. al, 2004). 23 Os resduos slidos no ambiente marinho foram reconhecidos como um problema ambiental apenas recentemente. Durante dcadas, a eliminao de resduos no era mais que uma poltica municipal, pois, aparentemente, os restos dispostos no ambiente marinho simplesmente desapareceriam. Onde no se sabia que os plsticos (e outros produtos como nylon, poliestireno, borracha, etc.) seriam um dos mais importantes poluentes ambientais do sculo XXI (IVAR DO SUL & COSTA, 2007). Duas das principais caractersticas que tornam os plsticos to teis so: o seu peso leve e durabilidade, porm este material no possui um descarte e tratamento adequado o que faz dele uma grande ameaa ambiental. Estes so facilmente transportados a longas distncias das reas de origem e se acumulam nos oceanos, onde causam uma variedade de impactos ambientais e econmicos (THOMPSON et al., 2009; UNEP, 2005). O plstico quebra lentamente atravs de uma combinao de fotodegradao de oxidao e desgaste mecnico (ANDRADY, 2003). Estes podem permanecer nos oceanos por dcadas quando livres de exposio da radiao UV e da ao de ondas, uma vez que podem estar recobertos por sedimento ou em reas abrigadas da luz e da energia dos ventos. Dado o impacto do lixo plstico, um esforo considervel tem sido feito para remover resduos de plstico e outros resduos persistentes no ambiente. Esta remoo pode ocorrer antes de entrar no mar, atravs do recolhimento de lixo e sistemas de rastreio de guas residuais, e posteriormente, atravs de coletas de lixo das praias, no fundo do mar ou em oceano aberto (PICHEL et al., 2007). No entanto, a soluo mais eficiente e rentvel o de reduzir a liberao de plstico no ambiente em primeiro lugar. As medidas tomadas para atingir esse objetivo incluem a educao ambiental, atravs da conscientizao da populao e das indstrias, e a legislao. A ONG Global Garbage patrocinada pela Light House Foundation vem desenvolvendo atividades socioambientais com a populao e coleta de lixo marinho no litoral da Bahia, onde o foco dos estudos da ONG a coleta de lixo internacional encontrado nas praias, que possivelmente chegaram at a costa Brasileira atravs das correntes ocenicas. O lixo internacional identificado pelo cdigo de barras que especfico da origem de cada pas, dentre inmeros 24 utenslios inusitados encontrados pelos coletores, chamados Capites de Areia, jovens nativos que trabalham para a organizao, esto alguns materiais que so de extrema importncia ambiental, so: os nibs (pellets), partculas que vem sendo estudadas por grupos de pesquisa no mundo, devido sua alta taxa de adsoro de PCBs, DDT e HPAs, alm de sua ingesto por aves marinhas; e os light-sticks que so o tema do presente estudo. 1.4 Light-stick Dentre os diversos petrechos de pesca que so utilizados no Brasil se destaca o espinhel de superfcie, sua utilizao teve incio no ano de 1956 na regio nordeste pelos atuneiros japoneses (AZEVEDO et al., 1999). O petrecho utilizado atualmente consiste em uma linha principal chamada linha mestra constituda de nilon monofilamento, e que so acopladas linhas secundrias contendo os anzis, onde podem ser utilizadas iscas especficas para cada tipo de captura, como por exemplo, o espadarte Xiphias gladius, que capturado em guas superficiais atravs do light-stick (Figura 1), atrator luminoso para pescas noturnas (AMORIM & ARFELLI, 1984; AMORIM et al., 1998). Inmeros anzis contendo light-sticks so lanados no mar em pescas de espinhel, onde acidentalmente estes sinalizadores acabam parando no mar e/ou nas praias, podendo muitas vezes abrir e extravasar o lquido contido no atrator. O light-stick emite luz por at 48 horas, atravs de uma reao de quimioluminescncia entre dois compostos que esto separados por uma ampola de vidro e quando o tubo dobrado a ampola se quebra causando a mistura de um ster oxalato (derivados de triclorosalicilato) com perxido de hidrognio, processo catalisado por hidrocarbonetos policclicos aromticos fluorescentes (9,10- difenilantraceno, perileno, rubreno), reao que ocorre em um solvente muito viscoso (geralmente di-n-butilftalato) (STEVANI & BAADER, 1999). 25 Figura 1. Light-sticks encontrados na Costa dos Coqueiros, BA. Foto: Fabiano Barreto. Alm do problema causado na captura acidental de tartarugas marinhas (WANG et al. 2007), os light-sticks so liberados nos oceanos onde podem ficar circulando pelos mares como resduo slido e acabar sendo ingeridos por algumas aves marinhas ou at mesmo alguns peixes causando obstruo gastrointestinal e outras srias complicaes hormonais e reprodutivas (SHAW & MAPES, 1979; WEHLE & COLEMAN, 1983; FURNESS, 1985; AZZARELLO & VLEET, 1987), porm tambm podem chegar at as praias e a populao local por falta de instruo acaba usando o lquido contido no tubo como bronzeador, e para a cura de enfermidades como reumatismo, vitiligo e micoses. Os atratores muitas vezes abrem na gua e afetam a biota marinha, devido liberao de inmeros contaminantes presentes em sua constituio. Na bibliografia a toxicidade do lquido contido nos atratores foi avaliada em ratos Winstar (IVAR DO SUL, et al. 2007) e atravs de ensaios com citotoxicidade (BAGATTINI et al., 2006), porm com organismos marinhos existe apenas testes com toxicidade aguda e taxa de ecloso de cistos de artmia (PINHO et al., 2009). 2. JUSTIFICATIVA Tendo em vista a problemtica causada pelos light-sticks para a populao litornea da Costa dos Coqueiros e outras regies da Bahia; e os possveis efeitos adversos biota aqutica quando o lquido contido nos tubos extravasa na coluna dgua e nas praias, se torna necessrio o conhecimento dos efeitos e em qual magnitude eles afetam o ecossistema aqutico, a fim de criar medidas corretivas para a soluo deste problema de poluio ambiental e sade pblica. 26 3. OBJETIVO Avaliar e identificar a toxicidade aguda e crnica do lquido contido no (light-stick) sinalizador de colorao laranja. 3.1 Objetivos especficos Desenvolver cartas-controle de sensibilidade com diferentes organismos marinhos a fim de avaliar a sensibilidade dos lotes utilizados nos ensaios definitivos com light-stick; Desenvolver metodologias de teste de toxicidade com light-stick, por este conter lquido imiscvel, utilizando a frao sobrenadante e/ou um solvente orgnico (Etanol); Avaliar a toxicidade aguda do light-stick para o microcrustce Artemia sp.- utilizando a frao sobrenadante; Avaliar a toxicidade aguda do light-stick na fecundao do ourio-do-mar Lytechinus variegatus - utilizando a frao sobrenadante; Avaliar a toxicidade crnica de curta-durao do light-stick no desenvolvimento embrio-larval dos ourios-do-mar Lytechinus variegatus e Echinometra lucunter - utilizando a frao sobrenadante (L. variegatus e E. lucunter) e com Etanol como solvente (L. variegatus); Comparar a sensibilidade dos diferentes testes de toxicidade, para verificar o organismo e o tipo de teste mais sensvel ao light-stick; Utilizar da tcnica do TIE Toxicity Identification Evaluation (fase I) para verificar os principais grupos de compostos que causam a toxicidade do light-stick na frao sobrenadante. 27 4. METODOLOGIA 4.1. Coleta dos Light-sticks As coletas foram realizadas atravs de uma caminhada cientfica de 14 a 31 de Julho de 2007, por aproximadamente 200 km nas praias da Costa dos Coqueiros, BA, onde foram coletados cerca de 2.554 tubos sendo que cerca de 34% estavam abertos, e 63% possuam a colorao laranja. 4.2. Lavagem de Vidrarias As vidrarias utilizadas na execuo dos testes como: bqueres, bales volumtricos, pipetas Pasteur, etc. foram previamente mantidas em cido ntrico 10% por um perodo de 24h, e lavadas com gua de torneira por 3 vezes e com gua destilada por mais 3 vezes. 4.3. Extrao da Frao Sobrenadante Os tubos foram abertos e por ser parcialmente insolvel em gua e mais denso, devido ao solvente di-n-butilftalato, foi desenvolvida uma metodologia para simular a disponibilizao dos compostos para a coluna dgua, sendo extrada segundo a Figura 2 uma frao aquosa (Sobrenadante) que esteve em contato com o light-stick, que representa a soluo estoque 100% (v/v) (SE 100%). Figura 2. Preparao da soluo estoque 100% (SE100%). 1 e 2- homogeneizado do leo com gua do mar controle com salinidade de 35 (proporo 1:1); 3- separao em centrfuga (1 minuto) a 3.500 RPM. 28 4.4. Preparao da diluio do Light-stick em solvente Etanol Por ser insolvel em gua foi desenvolvida uma metodologia para o lquido contido no light-stick, onde este foi dissolvido em soluo de gua do mar (salinidade= 35) a 5% (v/v) de etanol, a partir desta soluo estoque foram preparadas as diluies para a execuo dos testes de toxicidade crnica de curta durao com embries de ourio-do-mar da espcie Lytechinus variegatus, que sero descritos posteriormente. Para que no houvesse interpretao errnea devido a toxicidade do solvente utilizado foram feitos controles com gua do mar e em concentraes de 5, 2.5 e 1% de Etanol, caso este fosse txico em concentraes abaixo 1%, o teste seria cancelado uma vez que o Etanol causaria um falso positivo na verificao da toxidade do light-stick. 4.5. Teste de toxicidade aguda com Artemia sp. O ensaios de toxicidade aguda com Artemia sp., que esto descritos a seguir foram baseados em metodologia adaptada de Veiga & Vital (2002). 4.5.1 Cultivo e Testes com Artemia sp. A artmia pertence ao filo Arthropoda (ps articulados), classe Crustcea, subclasse Branchiopoda (ps com brnquias) ordem Anostraca (sem carapaa), famlia Artemidae e ao gnero Artemia - Leach, 1819 Figura 3. A reproduo ocorre tanto sexualmente (com copulao), quanto partenogeneticamente (sem copulao). Em condies ambientais de estresse no h fertilizao, e o desenvolvimento embrionrio inicia-se, to logo os ovos chegam cmara uterina, por um processo determinado partenognese (VEIGA & VITAL, 2002). Figura 3. Exemplar de Artemia sp. fase metanuplio. 29 Os ovos encapsulados, denominados cistos, possuem forma bicncava com dimetro mdio de 200 a 300 m. Esses ovos so eclodidos a partir do rompimento da membrana de ecloso atravs da combinao de luz, oxignio e umidade, liberando o nuplio para nadar ativamente. Durante as primeiras 24 horas, o nuplio consome o vitelo (camada que envolve seu corpo) como fonte de alimento e, por esta razo, o processo de alimentao por filtrao no ocorre, permitindo que o organismo encontre-se mais protegido da presena de possveis contaminantes presentes no meio (SORGELOOS et al., 1978). Dentre essas fases as melhores para se realizar os testes toxicolgicos so metanuplio II e III, uma vez que, nestas fases, os organismos j iniciaram a atividade de filtrao, possibilitando o contato do epitlio do trato digestivo com o meio externo, estando, portanto mais sensveis diminuindo assim a variabilidade do teste. (SORGELOS et al., 1978). Os cistos de Artemia sp. utilizados provm de procedncia conhecida, obtidos em indstrias salineiras, de Macau (RN) e isentos de contaminantes. Onde apresentaram taxa de ecloso superior a 70%. 4.5.2. Preparo da amostra para teste O sobrenadante do light-stick foi diludo em gua do mar natural, com a ausncia de contaminantes e procedncia garantida, essa gua foi coletada na Laje de Santos, Santos, SP. Para que a sobrevivncia dos organismos no controle fosse de 90% no mnimo. O Light-stick foi diludo nas concentraes-teste apropriadas em balo volumtrico, e transferidas 10 ml das solues para os bqueres de 30 ml. Para minimizar perdas por evaporao estes foram dispostos numa bandeja e cobertos. Cada concentrao foi testada, no mnimo, em triplicata. Foi determinado o pH em todas as amostras e em pelo menos duas concentraes-teste para controlar as condies bsicas de exposio dos organismos e subsidiar a interpretao dos resultados. 30 4.5.3. Carta-controle Para verificar a sensibilidade dos lotes de ecloso foram desenvolvidos ensaios com substncia de referncia Dodecil Sulfonato de Sdio (DSS) nas seguintes concentraes: 16; 21; 27; 35 e 43 mg/L. Para a produo da carta-controle foram desenvolvidos 20 testes e calculados a mdia (CL50-24h) e os limites superior e inferior de sensibilidade. 4.5.4. Teste definitivo Os testes definitivos foram realizados usando como referncia as concentraes fornecidas nos testes preliminares. Foram testadas no mnimo cinco concentraes (0,2; 0,3; 0,5; 0,7 e 2%). Frascos-testes de controle foram preparados com 10 ml de gua de diluio e dez organismos na fase larval II-III com o auxlio de uma pipeta Pasteur de ponta arredondada e larga. Os frascos de testes e os de controle foram incubados a 25 1C por 48 horas, na ausncia de luz. O efeito observado foi a letalidade dos indivduos, sendo assim aps o perodo de 24 e 48h foram feitas contagens de mortos e vivos para que fosse calculado o CL50 24 e 48h. 4.6. Teste de toxicidade aguda e crnica com ourios-do-mar 4.6.1. Metodologia e controle de teste A metodologia para realizao dos testes de toxicidade aguda de ourio-do-mar Lytechinus variegatus, Lamarck (1816), foi empregada seguindo os critrios adotados por Mastroti (2002) com modificaes. Os ensaios toxicidade crnica de curta durao com desenvolvimento embrio-larval de ourio-do-mar Lytechinus variegatus e Echinometra lucunter seguiram metodologia adaptada de Prsperi & Arajo (2002); Foram coletados atravs de mergulho livre entre 15 a 20 exemplares adultos, na Ilha das Palmas e So Sebastio. Os organismos foram mantidos em tanque com gua do mar. Os parmetros fsico-qumicos tais como salinidade, oxignio dissolvido, amnia, temperatura e os procedimentos quanto alimentao foram controlados periodicamente. 31 4.6.2. Extrao dos gametas Para cada teste foram utilizados aproximadamente 3 fmeas e 3 machos com finalidade de aumentar a variabilidade gentica. A liberao dos gametas foi provocada atravs da utilizao de circuitos eltricos de corrente alternada, com transformador de 35 V (PRSPERI & ARAUJO, 2002) na regio aboral conforme Figura 4, prximo aos gonporos do organismo, ou com a injeo de 5 ml de KCl 0,5M na superfcie oral dos indivduos. Como os mesmos no apresentam dimorfismo sexual externo, a identificao feita pela colorao. As fmeas liberam os gametas na cor alaranjada e os machos na colorao branca. Figura 4. Extrao dos gametas utilizando choque eltrico a 35V. Aps a liberao dos vulos cada fmea foi colocada com a parte aboral voltada para baixo em frascos contendo gua do mar (Figura 5), para deposio dos vulos, por aproximadamente 15 minutos, com o fim de evitar a liberao de vulos imaturos. Em seguida, foi filtrado o contedo dos frascos em malha de 350m e reunidos em bquer de 1000 mL. Acrescentou-se gua de diluio, elevando-se o volume para 600 mL, aguardando a decantao dos vulos e em seguida descartando os sobrenadantes. Este processo de lavagem repetido 3 vezes. 32 Figura 5. Fmea de L. variegatus liberando os vulos. Com o auxlio da pipeta automtica, foi retirada uma amostra de vulos, para anlise em microscpio com o intuito de verificar o estgio de maturao e possveis anomalias. Os espermas de cada indivduo foram coletados com a pipeta automtica diretamente dos gonporos, evitando que estes entrassem em contato com a gua do mar at o incio dos experimentos, sendo colocados em um bquer de 10 mL, mantido sobre gelo (Figura 6), com o fim de que o mesmo no entre em atividade antes do contato com o vulo. Figura 6. Extrao dos espermatozides (E. lucunter), armazenamento sobre gelo. A soluo espermtica foi obtida a partir da diluio de 0,5 mL de esperma em 24,5 ml de gua do mar, misturando-se para dissoluo dos grumos e ativao dos espermatozides. Para contagem dos vulos, foi retirado 10l da soluo de vulos, e preenchido com gua do mar at formar 1mL, na cmara de Sedgewick-Rafter (Figura 7). Dessa forma foi contado no microscpio ptico 3 sub-amostras de 1 mL da qual obteve-se a mdia de vulos/ml. 33 Figura 7. Cmara de contagem dos vulos, ovos e embries de ourio-do-mar. 4.6.3. Teste agudo com gametas de L. variegatus. Utilizando a pipeta automtica, acrescenta-se a cada frasco teste 100l da soluo de espermatozides, iniciando assim o perodo de 20 minutos de exposio s concentraes (Figura 8). Figura 8. Adio de 100 l de soluo espermtica aos frascos-teste. A quantidade de soluo de vulo deve conter 2000 vulos/mL, sendo que a quantidade mxima de soluo de vulo dispostas nos frascos no excedeu a 100l para no diluir a amostra. Aps 20 minutos acrescentou-se os vulos, os frascos foram levemente agitados por 20 minutos com a finalidade de facilitar a fecundao. Em seguida o teste foi encerrado, transferindo o contedo de cada rplica para frascos devidamente identificados, contendo formol a 4% tamponada com brax (borato de sdio) conforme Figura 9. Onde posteriormente foram contadas em microscpio ptico. 34 Figura 9. Finalizao do ensaio com preservao dos ovos em formol tamponado. O efeito observado a formao da membrana de fecundao (Figura 10) nos vulos aps a fertilizao. Este teste chamado de agudo, uma vez que avalia a sobrevivncia e mobilidade do esperma em chegar e fecundar o vulo aps um perodo de exposio ao contaminante. O espermatozide por atrao bioqumica percorre o caminho em direo ao gradiente de hormnio que determina o local onde o vulo se encontra. Quando h contaminantes que atrapalhem ou interfiram nos sinais qumicos, ou mesmo causem a letalidade dos gametas masculinos, estes no tm a capacidade de encontrar o vulo, ou mesmo penetrar na membrana vitelnica, concretizando assim o processo de fecundao com a entrada de gua entre a membrana plasmtica e vitelnica como controle da polispermia. Figura 10. Demonstrao de vulo de L. variegatus (esquerda) e ovo (direita). As concentraes utilizadas no teste com o sobrenadante extrado do light-stick foram determinadas aps um teste preliminar, portanto as concentraes do teste definitivo foram: 0,002; 0,003; 0,005; 0,01 e 0,02%. Um resumo das condies de manuteno e teste com gametas de ourio-do-mar da espcie L. variegatus est descrito na tabela 1. 35 Tabela 1. Resumo das condies gerais de manuteno e dos testes de toxicidade com L. variegatus (PROSPERI; ARAUJO, 2002 com modificaes). Condies-teste Recomendaes gua de diluio gua do mar natural Temperatura 25 +/- 2C Salinidade 34 +/- 2 Tamanho do frasco-teste > 10 mL Volume da soluo-teste 10 mL N de solues-teste Mnimo de 5 e 1 controle N de rplicas por concentrao Mnimo de 3 para todas as solues Durao do teste 40 minutos Efeito observado Gametas no fecundados Critrio de aceitao do teste Mnimo de 70% de fecundao no controle Expresso do Resultado CE50; 40 min 4.6.3. Carta-controle Lytechinus variegatus lote: Ilha das Palmas/SP. A substncia de referncia utilizada neste estudo foi o cobre. Para a realizao dos testes foi preparada uma soluo estoque de 1000 ppm. Para determinao dos valores das concentraes-teste foi feito um ensaio preliminar para estabelecer um intervalo de solues-teste a ser utilizado no ensaio definitivo. Para o preparo das diluies das amostras emprega-se a razo 10, estabelecendo ao final do ensaio a faixa de concentrao que causa impedimento da fecundao de 50% das clulas de ourio-do-mar. Dessa forma, a partir do ensaio preliminar extraiu-se 5 concentraes-testes: 0,2; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0 mg/L Cu Figura 11. Figura 3: Procedimento adotado para obteno das concentraes. Figura 11. Esquema de diluies para a execuo dos ensaios com substncia de referncia para a produo da carta-controle. Fonte: Helena Costi Rosa. 36 Foram utilizado 3 rplicas para cada concentrao. Seguido de um controle contendo gua do mar, para a comparao dos resultados obtidos. Em cada frasco teste, foram adicionadas 10 ml da soluo. Aps a execuo de 10 testes foram calculados a mdia (CE50~40 min.) e os limites superior e inferior de sensibilidade. 4.6.3. Teste crnico com embries de L. variegatus e E. lucunter. Para provocar fecundao e expor os ovos as concentraes de light-stick, foi adicionado cerca de 2 ml de soluo espermtica em um bquer de 600ml contendo os vulos, esta soluo foi agitada e aguardou-se um perodo de 15 minutos para que ocorresse a fecundao. Aps esse perodo foram feitas contagens em cmaras de Sedgewick-Rafter para verificar porcentagem de fecundao que deveria ser superior 80%, aps certificar que os ovos estavam saudveis pelo seu arredondamento e alta taxa de fecundao foi adicionada cerca de 400 ovos por frasco teste, em um volume de no mximo 100 l para no diluir as concentraes. Para cada concentrao utilizou-se de 3 rplicas, e um controle com gua do mar natural da Laje de Santos, isenta de contaminantes, com salinidade 34. Os embries foram deixados em exposio por 24-28 h no caso do L. variegatus e 36-40 h no caso do E. lucunter, tempo necessrio para que os embries atingissem o estgio de larva pluteus. O teste foi mantido com temperatura constante de 25 2C e foto-perodo de 12h/12h. As concentraes utilizadas para os ensaios crnicos foram de 0.002, 0.003, 0.01, 0.02, 0.1 e 1.0% (CESAR-RIBEIRO & PALANCH-HANS in press). Aps ter atingindo o estgio pluteus, o contedo de cada tubo foi transferido para frascos de plsticos contendo 100l de formol tamponada com brax (borato de sdio). Para a leitura do teste em microscpio, foram analisadas sub-amostras de 1 ml, observando os 100 primeiros organismos. Sendo assim, os embries que atingiram o estgio de larva pluteus so considerados bem desenvolvidos, j aqueles que apresentaram retardamento no crescimento ou alteraes morfolgicas so considerados no desenvolvidos (Figura 12). 37 Figura 12. Demonstrao da larva pluteus de E. lucunter normal (esquerda) e anormal com mutaes (direita). Aps a execuo dos ensaios os organismos, cuja induo de liberao gamtica foi feita com choque eltrico, eram mantidos no laboratrio e separados entre machos e fmeas (Figura 13) para execuo de outros ensaios, onde eram mantidos a temperatura controlada no laboratrio e alimentados com Ulva sp., alfaces e cenouras. Os organismos que eram induzidos por choque osmtico, devido ao grande estresse causado muitas vezes no sobreviviam, sendo ento refrigerados gradativamente para a reduo do metabolismo e posterior morte. Figura 13. Exemplares de E. lucunter induzidos com choque eltrico aguardando a liberao dos gametas para separar entre machos e fmeas. 4.6.3.1. Teste com substncia de referncia Foram desenvolvidos testes com substncia de referncia em cada espcie testada para verificar a sensibilidade dos lotes, sendo utilizado DSS (dodecil sulfato de sdio) para o teste com desenvolvimento embrio-larval de L. variegatus e E. lucunter. Nas seguintes concentraes: 0,1; 0,5; 1; 2,5; e 5 mg/L DSS. 38 4.6.3.2. Teste com Light-stick diludo em Etanol Aps um teste preliminar foram extradas as concentraes-teste e foi desenvolvido um ensaio definitivo, o qual teve durao de 24 horas, sendo preparadas 4 rplicas para cada concentrao, as concentraes escolhidas foram 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005 e 0.0001% de light-stick diludo em Etanol. Para que no houvesse interpretao errnea devido toxicidade do solvente utilizado (etanol), como j dito foram feitos controles com gua do mar limpa e em concentraes de 5, 2.5 e 1% de etanol. O efeito observado para verificao da toxicidade foi o retardamento e/ou deformao das larvas pluteus do ourio-do-mar. Embora no ambiente quando os tubos abrem no exista um solvente como o Etanol, ou outros muitas vezes utilizados (ex.: DMSO), importante que sejam avaliados os efeitos causados quando o lquido entra em contato com a gua e se houvesse uma diluio completa, porm no possvel utilizar o teste com solvente como base para explicar a toxicidade no ambiente aqutico, pois apenas parte dos contaminantes tm afinidade com a gua e so estes que causaro os efeitos deletrios a biota. 4.7. TIE (Toxicity Identification Evaluation) Fase I A TIE (Toxicity Identification Evaluation) ou como chamada algumas vezes no Brasil AIT (Avaliao e Identificao da Toxicidade) tem como objetivo isolar e identificar as substncias txicas responsveis pela toxicidade de efluentes, corpos d'gua, guas intersticiais e sedimentos, sendo parte integrante dos protocolos de reduo de toxicidade. Mtodos TIE combinam a quantificao da toxicidade com a identificao e confirmao de uma ou mais substncias e/ou classe de substncias responsveis pela toxicidade total de uma amostra. A fase I tem como objetivo caracterizar a natureza fsico-qumica dos compostos da amostra responsveis pela sua toxicidade, atravs de manipulaes ou tratamentos qumicos e de testes de toxicidade. Fraes dessa amostra podem ser submetidas aos seguintes tratamentos fsico-qumicos: ajustes de pH, o qual pode afetar a especiao de substncias, como S2-, CN- e NH4+; adio de agente quelante, o qual se complexa a ons metlicos, como Cu2+, Cd2+ e Zn2+; extrao em fase slida com coluna C18, a qual remove compostos orgnicos apolares, como 39 pesticidas e COVs (Compostos Orgnicos Volteis); adio de tiossulfato de sdio, o qual reduz espcies oxidantes, tais como Cl2 e Cr(VI); filtrao, a qual remove partculas suspensas e substncias cuja solubilidade afetada pelo pH do meio; e outros. Testes de toxicidade aqutica so realizados antes e aps cada manipulao, o que permite avaliar a eficcia de cada tratamento e obter informao sobre a natureza das substncias txicas. Aps a fase I, fica claramente definida a classe ou classes de substncias responsveis pela toxicidade total da amostra. A identificao de substncias txicas um passo fundamental para compreender as causas da toxicidade de amostras complexas, bem como para remov-las ou reduzir suas concentraes para nveis aceitveis. (COSTA et al. 2008). Para avaliar os possveis compostos que causam o efeito txico dos light-sticks, foi aplicado fase I do TIE (Toxicity Identification Evaluation). A metodologia utilizada nas manipulaes foi desenvolvida segundo Badar-Pedroso (1999), sendo feitos os seguintes procedimentos: adio 30 L de EDTA (2,5% m/v) em cada frasco teste para quelar os metais divalentes, aguardando um perodo de 3 horas antes do incio do ensaio para a completa reao e complexao, adio 50 L de Tiossulfato de Sdio (1,5% m/v) em cada frasco teste para reduo de oxidveis em um perodo de 1 hora, aerao por 1 hora para eliminar compostos volteis, filtrao em membrana de 0,45 m para remover material em suspenso, e adio de 5g Ulva sp. por 60 ml de amostra durante 4 horas a 20C para remoo de compostos nitrogenados, como a amnia (Figura 14). EDTALIGHTSTICK TIOSSULFATO DE SDIO AERAO FILTRAO Ulva sp. Figura 14. Representao esquemtica das manipulaes executadas com Light-stick na fase I do TIE. 40 Para a execuo deste procedimento foi utilizado o teste crnico de curta durao com ourio-do-mar Lytechinus variegatus, conforme j descrito mtodo, uma vez que este respondeu de maneira sensvel aos compostos presentes no light-stick. A concentrao de baseline foi de 0,1% do Sobrenadante, sendo utilizados 4 rplicas por manipulao. 4.8. Anlises Estatsticas Foi utilizado o modelo estatstico Trimmed Spearman-Karber (HAMILTON et al., 1977) para o clculo da CL50 (concentrao letal a 50% dos organismos) e CE50 (concentrao efetiva a 50% dos organismos). Para verificar possveis diferenas mnimas significativas (DMS) nas anlises de varincia pelo teste de Dunnetts e de Tukey foi usado o programa estatstico TOXSTAT 3.5. 5. RESULTADOS 5.1 Substncias de Referncia e Cartas-Controle Conforme a Figura 15, o valor da CL50; 24h estimado pela carta-controle para testes agudos com Artemia sp. quando exposto ao DSS foi de 22,68 5,62 mg/L DSS, sendo possvel comparar com os valores encontrados por VEIGA et al. (1989): 22,0 4,45 mg/L LSS e PRSPERI 1993: 22,05 3,89 mg/L DSS. Os limites de aceitabilidade foram calculados e estiveram entre 11,44 a 33,92 mg/L DSS. O coeficiente de variao da CL50 dos 20 testes foi de 24,78%, ou seja, dentro dos limites recomendados pela ENVIRONMENT CANADA (1992). Demonstrando que o lote de organismos estava em uma faixa de sensibilidade aceitvel e comparvel, demonstrando que os testes executados pelo laboratrio com este organismo possuem repetitibilidade e so confiveis. 41 Figura 15. Carta-Controle Artemia sp. exposto ao DSS (linha central demonstra a mdia e as linhas laterais os limites de aceitabilidade). Na Figura 16 est expressa a carta-controle de sensibilidade do ourio-do-mar Lytechinus variegatus (Ilha das Palmas/SP) a substncia de referncia: Sulfato de Cobre, no teste com gametas. Com os 10 testes executados o valor mdio da CE50 ~ 40 min. foi de 1,49 0,40 mg/L Cu. Os limites de aceitabilidade estiveram entre 0,69 e 2,29 mg/L Cu e o coeficiente de variao foi de 26,88%, ou seja, dentro do estabelecido. Demonstrando novamente repetitibilidade e confiabilidade dos bioensaios com gametas de ourio-do-mar Lytechinus variegatus, coletados nas proximidades da Ilha das Palmas em Santos/SP. Figura 16. Carta-Controle Lytechinus variegatus (teste agudo) - Sulfato de Cobre. (linha central demonstra a mdia e as linhas laterais os limites de aceitabilidade). 42 A Figura 17 demonstra o teste com substncia de referncia DSS para os ensaios crnicos de curta-durao com embries de ourio-do-mar Lytechinus variegatus e Echinometra lucunter. O valor encontrado da CE50-24h para L. variegatus foi de 2,07 mg/L DSS (limites: 1,81 2,36 mg/L DSS) e a CE50-36h para E. lucunter foi de 3,09 mg/L DSS (limites: 2,73 3,5 mg/L DSS), valores comparveis aos encontrados Resgalla & Laitano (2002) que encontrou CE50 em torno de 2,0 - 3 mg/L DSS para as duas espcies avaliadas, o que demonstra que o lote est com sensibilidade comparvel a outros laboratrios, o que valida os ensaios executados com estes organismos. 020406080100Concentrao (mg/L DSS)% Pluteus AnormaisE. lucunter 10 12 17 20 37 85L. variegatus 12 15 20 27 56 950 0,1 0,5 1 2,5 5Figura 17. Testes com substncia de referncia: DSS - Desenvolvimento embrio-larval de ourio-do-mar L. variegatus e E. lucunter. 5.2 Testes com Light-stick Conforme a Figura 18 para o teste com artmia a CL50 24 h e 48 h foi de 0,287% e 0,14%, respectivamente. Para o teste com desenvolvimento embrio-larval de ourio-do-mar E. lucunter a CE50- 36 h foi de 0,062%, para o teste com gametas de ourio-do-mar L. variegatus a CE50 foi de 0,0141%, para o teste com desenvolvimento embrio-larval de L. variegatus a CE50-24 h foi de 0,0285%, conforme encontrado em Cesar-Ribeiro & Palanch-Hans (in press). Demonstrando uma grande capacidade depurativa no ambiente quando o lquido contido no light-stick extravasa, necessitando de medidas corretivas para o seu recolhimento. 43 Atravs da aplicao da fase I do TIE (Figura 19) com as anlises estatsticas do programa TOXSTAT 3.5 foi possvel verificar diferena mnima significativa em relao ao controle de todos os tratamentos pelos testes de Dunnetts e Tukey, porm em comparao ao light-stick os tratamentos de tiossulfato e aerao diferiram significativamente, podendo identificar compostos oxidveis como perxido de hidrognio removidos pelo tiossulfato de sdio e volteis removidos na aerao como alguns HPAs presentes em sua constituio como os possveis responsveis pelos efeitos txicos. Foi possvel observar que o etanol foi txico at a concentrao de 1 %, havendo a necessidade de se excluir algumas concentraes mais elevadas, pois estas podem representar falsos positivos gerados pelo solvente utilizado. Foi feito o clculo da CE50-24h para o light-stick chegando a concentraes de 0,000673 ou 6,73 x 10-4 % variando de 6,51 x 10-4 a 6,95 x 10-4 %. Demonstrado que o lquido contido no light-stick extremamente txico. Figura 18. Concentrao Letal e/ou Efetiva 50% encontrado para testes com diferentes organismos. A- Artemia sp. agudo 24h; B- Artemia sp. agudo 48h; C- Lytechinus variegatus agudo 40 minutos; D- Lytechinus variegatus crnico 24 -28h; E- Echinometra lucunter crnico 36h. 44 Figura 19. Resultados da fase I do TIE com embries (pluteus) de L. variegatus, com os diferentes tratamentos e suas respectivas rplicas (n=4) em comparao ao controle. .45 6. DISCUSSO Atravs dos dados apresentados possvel demonstrar que o lquido contido nos atratores de colorao laranja disponibiliza contaminantes na gua quando abertos e que estes causam efeitos deletrios em todos os bioensaios executados, porm com maior efeito sobre o ourio-roxo L. variegatus que foi espcie mais sensvel aos testes com os atratores tanto no ensaio com desenvolvimento embrio-larval como no teste com gametas (CESAR-RIBEIRO & PALANCH-HANS in press). Atravs da fase I do TIE foi possvel identificar os possveis causadores da toxicidade como os oxidveis e os volteis, havendo a necessidade da execuo das outras fases do TIE para detectar e quantificar os compostos responsveis pelo efeito txico. O perxido de hidrognio que representa cerca de 30% da constituio do light-stick possivelmente foi um dos causadores da toxicidade, devido este ser uma espcie reativa de oxignio (ERO), causa efeitos oxidativos a nvel celular e supramolecular (STOREY, 1996), aumenta a atividade enzimtica das peroxidases que catalisa a reduo dos perxidos (ULIANA et al., 2008), causando um gasto energtico que tem como conseqncia o retardamento do desenvolvimento das larvas pluteus do ourio-do-mar. O efeito crnico do perxido de hidrognio j foi avaliado para cladceros (MEINERTZ et al., 2008) demonstrando sua atividade xenobionte. Compostos como hidrocarbonetos policclicos aromticos (HPAs) presentes na constituio do lquido podem ter sido os responsveis pelo efeito txico, devido sua capacidade sub-carcinognica e mutagnica (BOFFETTA et al., 1997; WHO, 1988), dificultando e interferindo em processos essenciais como replicao, transcrio e traduo, o que pode causar a deformao das larvas, ou at apoptose e necrose celular. A presena de derivados de cido saliclico, que utilizado como antiinflamatrio e analgsico, mas que possui carter antimicrobiano e inseticida (KUBO et al., 1991; STUART et al., 2000), pode ter causado parte do efeito txico, embora esse composto seja parcialmente solvel em gua, demonstrando que 46 no foi totalmente disponibilizado na frao aquosa, pode ter contribudo para a deformao e/ou no desenvolvimento dos embries. O solvente da soluo do light-stick: di-n-butilftalato pode ser apontado como responsvel por grande parte do efeito txico, embora no seja muito solvel em gua, em pequenas concentraes j causa em seres humanos quando em contato com a pele efeitos como irritao, queimaduras e coceiras; no possui carter carcinognico, porm quando ingerido causa irritao no trato gastrointestinal, nuseas, vmitos, diarria, dor de cabea e fraqueza (WILLIANS & BLANCHFIELD, 1975; TOMITA et al., 1977; KAWANO, 1980; SCOTT et al., 1987; ELSISI et al., 1989). Representando um grande alerta a populao local da Costa dos Coqueiros/BA sobre a utilizao do light-stick na pele; como medicamento para a cura de enfermidades; e para os casos de crianas que acabaram ingerindo o lquido do tubo, confundindo com alimento. Em testes com organismos aquticos o di-n-butilftalato demonstra toxicidade elevada no teste de Microtox (TARKPEA et al., 1986), para algas de gua doce e dinoflagelados marinhos (WILSON et al., 1978; YOSHIOKA et al., 1985; O'CONNOR et al., 1989); e para microcrustceos marinhos como misidceos, artmias, anfpodas e coppodas harpacticides (MAYER & SANDERS, 1973; LINDN et al., 1979), representando uma alta capacidade depurativa no ambiente. 7. CONSIDERAES FINAIS A ONG Global Garbage vem desenvolvendo um trabalho de muita importncia com a conscientizao da populao residente nas vilas litorneas do estado da Bahia em relao ao contato com light-stick, uma vez que estes contem xenobiontes capazes de causar srios problemas sade; Os organismos marinhos utilizados nos ensaios responderam de maneira eficiente na identificao da toxicidade uma vez que foram sensveis aos compostos em concentrao baixssimas, podendo-se ressaltar que a utilizao das artmias em ensaios, embora sejam menos sensveis que os ourios possuem um fcil manuseio e cultivo, 47 no tm toxicidade significativamente varivel na carta-controle, expem resultados rpidos, o que auxilia em monitoramentos uma vez que podem ser desenvolvidos ensaios constantemente sem degradar o ambiente coletando organismos de seu habitat, portanto recomenda-se sua utilizao em casos que seja necessrio respostas rpidas, ou que queira-se saber a faixa de concentrao para testes com outros organismos, ou na avaliao de elementos qumicos e/ou extratos vegetais, visto que estes organismos tem respondido bem a esse tipo de ensaio; No entanto os ourios-do-mar responderam melhor que as artmias, com resultados mais precisos, em testes que avaliam efeitos crnicos de deformao das larvas, ou agudos de fertilizao que demonstram maior sensibilidade em monitoramentos e na identificao da toxicidade de elementos, amostras e efluentes. A espcie L. variegatus foi mais sensvel nos ensaios com light-stick em comparao ao E. lucunter, porm no recomendvel generalizar que um ourio mais sensvel que o outro, uma vez que para certos contaminantes o ourio pind E. lucunter responde com mais sensibilidade e repetitibilidade nos ensaios; A contagem de larvas normais e anormais em testes com ourios-do-mar, embora rpida e eficaz, poderia ser modificada por uma metodologia de contagem diferencial, observando em qual fase os organismos se encontram para pontuar os efeitos txicos, uma vez que alguns compostos no to txicos permitem um desenvolvimento da larva, porm retardado, e outros compostos muito txicos no permitem que a larva saia da fase de mrula ou mesmo no permite qualquer clivagem, portanto uma contagem diferencial analisada estatisticamente facilitaria a identificao e avaliao da toxicidade; O uso do teste agudo com gametas de ourio-do-mar, embora no seja muito difundido no Brasil, uma ferramenta importante para monitoramentos e identificao de toxicidade de elementos, efluentes e amostras ambientais, devido rapidez e alta sensibilidade dos ensaios. Embora o E. lucunter no possa ser utilizado neste tipo de 48 ensaio, pela dificuldade de se observar a membrana de fecundao, o ourio L. variegatus pode ser utilizado com grande eficincia. Porm deve se tomar cuidado na execuo de ensaios com espcie citada, visto que esta j entrou na lista de espcies ameaadas de extino, sendo recomendvel o uso de tcnicas menos estressantes de extrao dos gametas para que os organismos possam ser devolvidos para o ambientes e/ou reutilizados aps recuperao; A execuo de ensaios com outras espcies marinhas de outros nveis trficos e comunidades seria importante na complementao deste estudo, como: algas (Skeletonema cf. costatum), misidceos (Mysidopsis gracilis e M. juniae), larvas de mexilhes e ostras (Perna perna e Crassostrea rizophorae, respectivamente), bem como a fertilizao do sedimento com light-stick para ensaios com amostras de sedimento integral com coppodas epibentnicos (Nitokra sp.) e anfpodas (Tiburonella viscana), ou mesmo teste de Ames para verificar mutagenicidade a bactria Salmonella typhimurium. A utilizao de um solvente na identificao da toxicidade do light-stick, embora no represente o real efeito no ambiente, demonstrou uma toxicidade extremamente elevada do light-stick que em concentrao mnimas j causou a deformao e/ou no desenvolvimento das larvas do ourio avaliado. Sendo interessante a utilizao de outros solventes como metanol, acetona e at o dimetilsulfxido (DMSO) muito utilizado como solvente de compostos para testes de toxicidade; Anlises qumicas em HPLC, ou GC-MS seriam importantes na complementao deste estudo, embora j tenham estudos dizendo a composio dos light-sticks, no se sabe o quanto so disponibilizados para a coluna dgua na frao sobrenadante, ou na eluio em etanol e outros solventes, havendo a necessidade da complementao do TIE coma as fases II e III, para que se saiba quais compostos so disponibilizados e quais os efeitos deletrios causados por eles; 49 A fase I do TIE respondeu de maneira satisfatria na identificao dos grupos de compostos causadores da toxicidade, porm seria interessante que fosse utilizado a coluna de C18 para a remoo dos HPAs para verificar se estes foram os principais causadores da toxicidade, e se fosse comprovado tal, j que estes so os catalisadores da reao, poderia ser estudada a possibilidade de mudar a constituio dos light-sticks para outro catalisador menos deletrio ao ambiente. Com a criao de um programa Nacional do Lixo Marinho, ser possvel a captao de investimento para o desenvolvimento de estudos relacionados ao tema, ampliando o nmero de pessoal tcnico-cientfico especializado na rea, trocando informaes sobre mtodos de avaliao, degradao e monitoramento do lixo nas praias a fim de minimizar os efeitos adversos provocados pelos rejeitos slidos (micro e macrolixo) sobre a megafauna, alm do transporte de espcies invasoras transportadas pelo lixo, contaminao por light-sticks, bioacumulao por ingesto de PCBs, DDTs, HPAs e outros aderidos e adsorvidos aos nibs (pellets). Aumentando assim a conscientizao da populao de que o lixo deve ser armazenado e tratado de maneira eficiente, podendo muitas vezes ser reciclado e no despejado em rios e praia, pois dependemos direta e indiretamente dos corpos hdricos seja por lazer, subsistncia, navegao e etc. Portanto necessrio que seja feito o controle do lanamento desses light-sticks nos oceanos, pois quando estes chegam s praias podem causar problemas de intoxicao na populao, havendo a necessidade de projetos de educao ambiental com os nativos para o recolhimento e no utilizao dos atratores, alm de um programa de monitoramento do lixo marinho, para impedir o lanamento desses sinalizadores e outros resduos pelos navios e pela populao nos oceanos, pois estes causam efeitos adversos biota marinha. 50 8. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ABESSA, D. M. S. Avaliao da qualidade de sedimentos do sistema estuarino de Santos, SP, Brasil. Tese de Doutorado. Instituto Oceanogrfico, Universidade de So Paulo. p.01-04, 2002. 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