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INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA - INPAUNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS - UFAM
PROGRAMA INTEGRADO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA TROPICAL ERECURSOS NATURAIS - PIPG / BTRN
BIBLIOTECA 00 iCPA
ANALISES CÍTOGENETÍCAS EM Anopheles albitarsis(DIPTERA, CULICIDAE) DE ÍRANDUBA E COARI (AM) EILHA COMPRIDA (SP)
Ivanildo Pereira dos Santos Jr.
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Manaus - AM2005
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INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA - INPAUNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS - UFAM
PROGRAMA INTEGRADO DE PÓS-GRADUAÇAO EM BIOLOGIA TROPICAL ERECURSOS NATURAIS - PIPG / BTRN
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ANÁLISÈi^ CITOGENÉtlGAS EM^nopfie/es a/bfta/^te(DIPTEI^ CÜLICIDÀÈ) DE II^N E COARI (AM) EILHA COMPRIDA (SP)
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Ivanildo Pereira dos Santos Jr.
Orientador: Míriam Silva Rafael
Co-Orientador: Wanderii Pedro Tadel
Dissertação apresentada aoPrograma de Pós-Graduaçâoem Genética, Conservação eBiologia Evolutiva doConvênio INPA / UFAM, comoparte dos requisitos paraobtenção do titulo de Mestreem Ciências Biológicas.
Manaus - AM
2005
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S237a Santos Júnior, Ivanildo Pereira dosAnálises citogenéticas em Anopheles albitarsis
(Diptera, Culicldae) de Iranduba e Coari (AM) e IlhaComprida (SP)/Ivanildo dos Santos Júnior.—/Manaus : s. n./ 2005.
39 p.: il.
1. FISH. 2. Banda C. 3. Cromossomos sexuafs.4. Anopheles albitarsis. 5. Malária.
CDD 574.873223
SINOPSE
Populações de Anopheles albitarsis de Ilha Comprida (SP) eIranduba e Coari (AM) foram analisadas citogeneticamente quantoao seu cariótipo, localização dos blocos de heterocromatinaconstitutiva por melo de Bandeamento C, e localização dos genesde DNAr pela técnica de hibridização In situ flourescente (FISH).
Palavras-chave: Anopheles, Anopheles albitarsis, complexo deespécies, cariótipo. Banda C, FISH, malária.
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AGRADECIMENTOS
Q Ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia — IMPA e à Universidade Federal^ do Amazonas - UFAM, pela oportunidade de realizar o Curso de Pós-
Graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva.I
Q A Dra. Míriam Silva Rafael, minha orientadora, pelos ensinamentos e apoioQ fornecidos para a minha formação científica.
^ Ao Dr. Wanderli Pedro Tadei, meu co-oríentador, pelo apoio fornecido para aminha formação científica.
O X^ A Dra. Eliana Feldberg, Coordenadora do Curso de Pós-Graduação em Genética,^ Conservação e Biologia Evolutiva, pelos ensinamentos e amizade.
^ A Dra. Maria Anice Salium, do Departamento de Biologia da Faculdade de Saúde^ Pública da USP, pelo grande auxílio às coletas das amostras de Anopheles^ albitarsis em Ilha Comprida, SP.
Q A Dra. Shirley Maria Recco-Pimentel, do Departamento de Biologia Celular -IB daUnicamp, São Paulo, pelo fornecimento do clone de DNAr indispensável para arealização da técnica de hibridização in situ fluorescente.
QAo corpo docente e discente do GCBEV - Genética, Conservação e Biologia
Evolutiva, pela amizade e apoio dispensados durante a realização destetrabalho.
3A Msc. Jacqueline da Silva Batista, que disponibilizou o Laboratório de Biologia
Molecular do IMPA para extração do DNA plasmidial.
^ > A equipe técnica do Laboratório de Vetores de Malária e Dengue do Centro dePesquisas em Ciências da Saúde do IMPA, pela ajuda nas coletas de campo eno Insetário, bem como pela amizade.
Ao Erasmo Pinheiro, pela diagramação das microfotografias desta Dissertação.
A Fundação de Amparo á Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) - ProjetoPIPT - 15138 / 03 e bolsa de estudo do POSGRAD e ao Ministério da Ciência
^ ̂ e Tecnologia (MCT), programa POSGRAD - PPI 3680/MCT,^ ^ PIATAM/CTPETRO, que financiaram a execução do presente trabalho.
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9 SUMÁRIO:a0 Ficha catalográfica III^ Agradecimentos IV^ Lista de Figuras VIIQ Lista de Tabelas VIII0 Resumo IX_ Abstract X
0 1. INTRODUÇÃO
O1.1 Malária e gênero Anopheles 11.2 Estudos citogenéticos em Anopheles 21.3 Heterocromatina e bandeamento C 4
0 1.3.1 Heterocromatina constitutiva^ 1.3.2 Bandeamento C 5^ 1.4 Hibridizaçâo In situ fluorescente (FISH) ^6
1.5 Anopheles albitarsis 7
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2. OBJETIVOS 10
3. MATERIAL E MÉTODOS3
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.1 Coleta e manutenção dos espécimes 113.2 Preparações citológicas 12
3 3.2.1 Preparações dos cromossomos mitóticos 123.2.2 Coloração com Giemsa 133.2.3 Bandeamento C 13
^ 3.3 Análise morfométrica dos cromossomos 133.3.1 Microfotografias 133.3.2 Medidas cromossômicas 133.3.3 Análise estatística.., 14
3.4 Hibridizaçâo In s/fu fluorescente 14f ̂ 3.4.1 Obtenção e marcação do fragmento de DNA (sonda) 14'V>
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3.4.2 Hibridizaçâo e lavagem 143.4.3 Detecção dos sinais fluorescentes 153.4.4 Microfotografias 15
4. RESULTADOS4.1 Morfometria do cariótipo de Anopheles albitarsis 164.2 Bandeamento C 194.3 FISH 21
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5. DISCUSSÃO5.1 Morfometria do carlótipo 245.2 Bandeamento 0 255.3 RSH 27
6. CONCLUSÃO 30
7. REFERÊNCIAS BIBLÍOGRÁFICAS 31
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O lista de figuras9^ Figura 01: Locais de coleta no Estado do Amazonas 11
9 Figura 02: Local de coleta no Estado de São Paulo 11O^ Figura 03: Cariótipo de A. albitarsis de Ilha Comprida 16
Q Figura 04: Cariótipo de A. albitarsis de Iranduba 17
Figura 05: Cariótipo de A. albitarsis de Coari 17
^ Figura 06: Metáfase de gânglios cerebrais de larvas de quarto ̂ tádlo de A.Q albitarsis de Ilha Comprida, submetida ao método do barfaeamento
9 ̂ 20Figura 07: Metáfase de gânglios cerebrais de larvas de quarto estádio de A.
Q aibitarsis de Iranduba, submetida ao método do bandeamento
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9 Figura 08: Metáfase de gânglios cerebrais de larvas de quarto estádio de A.albitarsis de Coari, submetida ao método do bandeamento
o ̂ 20
Figura 09: FISH em A. albitarsis de IlhaO Comprida 21
O^ Figura 10: FISH em fêmea de A. aibitarsis de IlhaComprida 21
Figura 11: FISH em macho de A. albitarsis deIranduba 22
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oFigura 12: FISH em fêmea de A. albitarsis deIranduba 22
^ Figura 13: FISH em macho de A. albitarsis def Coari 23
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Figura 14: FISH em A. albitarsis deCoari 23
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LISTA DE TABELAS
Tabela 01: Medições cromossômicas de A. albitarsis de IlhaComprida 18
Tabela 02: Medições cromossômicas de A. albitarsis deIranduba 18
Tabela 03: Medições cromossômicas de A. albitarsis deCoari 19
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RESUMO
OQ o presente estudo forneceu dados sobre o cariótipo, bandeamento C e as regiões^ organizadoras nucieolares (NORs) do complexo Anopheles albitarsis9 {Nyssorhynchus) albitarsis sensu lato de Iranduba e Coari (AM) e de Ilha0 Comprida (SP). Este complexo de espécies tem sido incriminado como vetor de0 malária e apresenta um controvertido status taxonômico. É formado por quatro^ espécies crípticas: A. albitarsis, Anopheles marajoara, Anopheles deaneorum eCl uma quarta espécie a ser descrita. Amostras de A. albitarsis foram capturadas e(13 as larvas, ao atingirem o 4°. estádio, foram usadas para as preparações das
lâminas e submetidas às técnicas de coloração com Glemsa, bandeamento C e^ FISH. As técnicas de coloração com Glemsa e bandeamento C têm sido úteis paraCl identificar espécies crípticas do gênero Anopheles. A. albitarsis moqjrou cariótipo0 2n=6 para as populações analisadas. Blocos de heterocromatln^ òOnstitutiva^ foram evidenciados nos centrômeros do par acrocêntrico (XX), cromossomo
puntiforme (Y), autossomos e mostraram variação Intraespecífica. Um métodousado para identificar as regiões organizadoras nucieolares (NORs) é a
Cl hibridização in situ fluorescente (FISH), e que tem sido útil para o estudo das0 funções e evolução do genoma. A FISH mostrou que os sinais fluorescentes
mapearam a região perlcentromérlca dos cromossomos sexuais (XX/XY) e umacoincidência com o número e a localização de blocos de heterocromatina
O constitutiva, previamente revelados pela técnica de Bandeamento C. Embora não0 tenham sido detectadas variações Interespecíficas no número e localização dos
loci 45S, um pollmorflsmo de tamanho na região organizadora de nucléolos foiobservado entre os homólogos das três populações. A estabilidade das NORs
C> observada no complexo albitarsis é caracterizado pela presença desses sítiosagrupados e conservados em um único par de cromossomos desses mosquitos.Este trabalho contribuiu para a organização e compreensão da estrutura eevolução do genoma do complexo de espécies de A. albitarsis dessas trêslocalidades, duas na região central da bacia amazônica e uma do sudestebrasileiro.
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O ABSTRACT
0Q. The present study provided data about the karyotype, C-banding and the nucleolarorganizar reglons (NORs) of the Anopheles (Nysssorhynchus) albitarsis sensu lato
^ complex from Iranduba and Coari (AM) and Ilha Comprida (SP). This species^ complex has been inoriminated as a malaria vector and presente a controvertedQ taxonomic status. It is formed by four sibling species: A. albitarsis, Anopheles
marajoara, Anopheles deaneorum and a fourth species yet to be described.^ Samples of A. albitarsis were collected and the larvae, upon reaching 4'*^ state of
development, were used to prepare the slides who went through Giemsa color, C-banding and FISH techniques. The Giemsa color and the C-banding assays havebeen usefui to identify sibling species af Anopheles. A. a/ò/fars/s showed karyotype2n=6 to ali three analised populations. The C-banding technjgue showed
0 heterochromatic blocks in the centromeres of the acrocentric pair ()wJ^'*puntiform0 chromosome (Y), autosomes and intraespecific variation of the heterochromatic
blocks. A usefui method to identify the nucleolar organizer regions (NORs) is thefluorescence in situ hybridization (FISH), which has been used to study the
(5 genome's functions and structure. The FISH demonstrated that the fluorescent0 signals mapped the pericentromeric region of the sexual chromosomes (XX/XY)^ and showed a coincidence with the number and location of constitutivo^ heterochromatin blocks previousiy revealed by C-banding technique. Although0 interespecific yariations in number and location of the 45S loci has not been0 detected, a size polimorfism in the nucleolar organizing region was observed
among the homologs from the three populations. The stability of NORs verified inthe albitarsis complex is caracterized by the presence of these clustered and
O conserved sites in a unique pair of chromosomes in these mosquitoes. This workhas contributed to the organization and understanding of the chromosomal
X structure and genome evolution of the A. albitarsis species complex from thesethree localities, two from the central region of the brazilian Amazon basin and onefrom the brazilian southeast.
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1. INTRODUÇÃO
1.1 Malária e o gênero Anopheles
A malária ocorre na África, Ásia e Américas e permanece como a mais
prevalente doença no mundo. Segundo a Organização Mundial da Saúde, metade
da população mundial vive em áreas maiarígenas, onde contraem a doença de
300 a 500 milhões de pessoas e destas, cerca de 1,4 a 2,6 milhões morrem
anualmente (WHO, 1995). Aproximadamente 500.000 casos, principalmente na
bacia amazônica (99%), têm sido reportados anualmente durante a última década,
a maioria deles nos Estados do Amazonas e Pará (Fundação NacionSf de Saúde -
FNS / FUNASA, 2000).
As espécies do gênero Anopheles têm papel relevante na transmissão da
malária. O gênero Anopheles pertence à subfamília Anophelinae e compreende os
subgêneros Nyssorhynchus, Kerteszia, Stethomyia, Lophopodomyla e Anopheles.
Com aproximadamente 500 espécies identificadas, pode ser encontrado em todos
os continentes exceto na Antártida (Krzywinski & Besansky, 2003). No Brasil são
encontradas 54 espécies, e as envolvidas na transmissão de malária pertencem
aos subgêneros Nyssorhynchus e Kerteszia (Deane, 1986; Consoli & Lourenço De
Oliveira, 1994). O principal transmissor da malária no país é o Anopheles
(Nyssorhynchus) darlingi, que é também o maior vetor antropofiiico e endofágico
das Américas (Foote & Cook, 1959), como mostram os testes de Ensaios
Imunoenzimáticos, ELISA (Tadei & Thatcher, 2000).
Entre os anofeíinos brasileiros, 33 são encontrados na Amazônia, com
alguns de importância epidemiològica. Na Amazônia há características
geográficas e ecológicas altamente favoráveis á interação dos plasmódios
falciparum, vivax e malarie com vetores anofélicos (Tadei et ai, 1998). Um dos
principais fatores que concorrem para os altos índices da doença na região é o
impacto causado pelas modificações ambientais, levando ao desequilíbrio do
habitat natural do mosquito, que passa a utilizar o homem como sua fonte de
alimento, aumentando assim o grau de incidência de infecção por esses
plasmódios (Tadei et ai, 1998).
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mC%^ Estudos em anofelinos na Europa e África mostraram que muitas espécies^ com extensas distribuições geográficas contêm populações isoladas com pouca
Q diferenciação ecológica, cromossômica ou mesmo morfológica. CruzamentosQf entre estas populações freqüentemente mostram o isolamento reprodutivo, sendo
então consideradas complexos de espécies (Kreutzer et ai, 1976). Complexos de
O espécies crípticas são grupos de espécies relacionadas cuja diferenciação por
0 características morfológicas é freqüentemente difícil (Coilins & Paskewitz, 1996).0 Muitos anofelinos neotropicais formam complexos de espécies. A elucidação^ taxonômica destes complexos se reflete na epidemiologia da transmissão da
malária e em último grau, no seu controle (Rosa-Freitas et ai, 1998).^
00 1.2 Estudos citogenéticos em Anopheles
0 A citogenética é uma ferramenta muito importante no reconhecimento de
complexos de espécies, pois possibilita identificar o papel de cada uma na
transmissão da malária humana (Tadei, 1980). O valor prático da citogenética em
mosquitos cresceu em anos recentes, a partir do primeiro registro de espécies
crípticas no complexo Anopheles maculipennis, o maior vetor da malária na
Europa. A. maculipennis não era uma única espécie, como se supunha
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o inicialmente, mas sim um complexo de várias espécies com caracteresmorfológicos idênticos. Esta descoberta, em combinação com demonstrações das
diferenças entre as espécies quanto à ecologia e preferências por hospedeiros,
resolveram questões a respeito do fenômeno do "anofelismo sem malária" na
Europa (Coilins & Paskewitz, 1996) e demonstraram a importância da citogenética
na identificação dos membros de complexos de espécies e no estudo das relações
evolutivas dentro deste complexo (White et al, 1974).
Outro avanço em estudos da citogenética de mosquitos veio com a
identificação dos membros do complexo Anopheles gambiae na África. Depois daí
^ ̂ descoberta inicial de que o A. gambiae é constituído de pelo menos três espécies
incompatíveis reprodutivamente, nomeadas A, B e 0, foi demonstrado que o
^ padrão de bandeamento do cromossomo X na espécie A diferia do padrão naespécie B. As diferenças específicas nos padrões de bandeamento cromossômico
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foram utilizadas como características taxonômicas para identificar cada espécie
desse compiexo (Wtiite etal., 1974).
Até os anos 50, apenas dois compiexos de espécies de Anopheles eram
^ contiecidos, o A. macullpennis na Europa e o A. gambiae na África. Atualmente,
<3 diversos complexos de espécies crípticas de Anopheles são conhecidos e0 evidências acumuiativas sugerem que a maioria dos mais importantes vetores de
Cl malária podem ser membros de complexos (Coilins & Paskewitz, 1996).A descoberta de espécies crípticas com diferentes potenciais como vetores
levou a uma expansão dos métodos de identificação, incluindo estudos em
cromossomos politênicos e, mais recentemente, estudos de variação de
isoenzimas e métodos de hibridização In situ com DNA (Munstermann & Conn,
0 1997).(§ Inversões cromossômicas em espécies de mosquitos geralmente indicam
O processos de especiação (Krzywinski & Besansky, 2003). Espécies^ morfologicamente semelhantes podem ser separadas pela análise do padrão de
bandas das inversões fixadas nos cromossomos politênicos (White, 1973; 1980).Estudos de inversões cromossômicas revelaram a heterogeneidade genética no
complexo A. gambiae (Delia Torre et ai., 2002), e contribuíram para a identificação
das sete espécies crípticas: A. gambiae, Anopheies arabiensis, Anopheles meias,
0 Anopheies merus, Anopheies bwambae, Anopheies quadriannuiatus e A.
quadríannuiatus espécie B.
Estudos citogenéticos em cromossomos mitóticos são importantes para acompreensão da citotaxonomia e evolução de mosquitos, como por exemplo, no
^ complexo Anopheies dirus, do sudeste da Asia (Baimai, 1984).O
Na família Culicidae o número diplóide é 2n=6 cromossomos, sendo um parmetacêntrico (II), um par submetacêntrico (III) e um par de cromossomos sexuais
/ > que pode ser heteromórfico nos machos (XY) e homomórfico (XX) nas fêmeas(White, 1980; Rai & Black, 1999), exceto em Chagasia bathana da subfamília
Anophelinae, que apresenta 2n=8 cromossomos (Kreutzer, 1978).
Considerando os cromossomos sexuais, algumas espécies do gênero
Anopheies possuem heterossomos puntiformes, como por exemplo, em machos
de Anopheies quadrímacuiatus e Anopheies aquasaiis (Frizzi & Ricciardi,1955),
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Anopheles cruzii (Ramírez, 1989), A. darlingi e Anopheles nuneztovari (Rafael &
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0^ Tadel, 1998). Nas fêmeas de A. darlingi e cruzii o par sexual (XX) é acrocêntrico e^ em nuneztovari é submetacêntricx). Nesta última espécie, as fêmeas apresentam
polimorfismo quanto ao tamanho do cromossomo X (Rafael & Tadei, 1998, 2000).
0 Dentre os anofelinos brasileiros, possuem um par de autossomos
O submetacêntricos (III) e um par metacêntrico (II) as seguintes espécies: A. darlingi,Anopheles noroestensis, Anopheles argyritarsis, A. aquasalis, A. nuneztovari
(Schreiber & Guedes, 1959, 1961; Rafael & Tadei, 1998), A. cruzii e Anopheles
bellator (Ramírez, 1989).
No continente sul americano, as principais espécies transpiissoras da
^ malária humana pertencem ao subgênero Nyssorhynchus. Muitos desses grupos0 são complexos de espécies, pois exibem divergência morfológica mínima, o que
(3 torna difícil a sua identificação. Por isso, essas espécies têm sido estudadas sob
O diversos aspectos: citogenética, morfologia, sistemática molecular, ecologia ecomportamento; visando a identificação correta daquelas envolvidas na
transmissão da malária (Wilkerson et. al., 1995a; Tadei etal., 1998).
1.3 Heterocromatina constitutiva e bandeamento C
O 1.3.1 Heterocromatina constitutiva
Um outro aspecto importante em termos evolutivos tem sido a análise da
^ ̂ heterocromatina de mosquitos. Há dois tipos de organização da heterocromatinanuclear: um que apresenta estados de condensação, dependendo do tipo celular
ou do estágio do ciclo celular - a heterocromatina facultativa; e o outro que está' V- ^
em estado condensado em todas as fases do ciclo celular, conhecido como
f heterocromatina constitutiva. A heterocromatina constitutiva representa o conteúdo
^ > de DNA altamente repetitivo (Bianchi, 1978).
O termo heterocromatina foi descrito por Heitz (1928), quando observou
' ̂ que cromossomos inteiros ou fragmentos permaneciam condensados em núcleosinterfásicos no ciclo de divisão celular mitótico. Mais tarde, Weitz (1985) observou
que a organização cromatínica na intérfase apresenta duas conformações: densa
ou condensada. Para este autor, essa distinção mostra os diferentes modos de
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d^ condensação, resultantes da associação do DNA com proteínas cromossomais.^ A heterocromatina é transcricionalmente inativa. Estudos radiográficos(j, demonstraram que a síntese de RNA acontece somente no estado difuso ou
(f disperso, enquanto a cromatina condensada é transcricionalmente inativa (Ris &
d Korenberg, 1979).
d 1.3.2 Bandeamento C
Análises de regiões heterocromáticas constitutivas (Banda C) são um
requisito importante para o estudo da organização de cariótipos e da estrutura e
evolução cromossômica de animais e plantas (Sumner, 1990). 7^ técnica de
bandeamento C tem sido uma ferramenta muito útil para a detecção citológica de
/j; regiões heterocromáticas constitutivas (Rafael & Tadei, 2000). Este método foi
d' proposto inicialmente por Arrighi & Hsu (1971) e modificado por Sumner (1972),
® que usou hidróxido de bário no lugar de hidróxido de sódio. Durante esteprocedimento, o DNA é fragmentado e progressivamente eliminado do
cromossomo. Entretanto, o DNA da heterocromatina constitutiva é menos extraído
^ durante este processo do que o restante do DNA - DNA da eucromatina (Bianchi,1978), restando ao final apenas a heterocromatina.
Estudos de padrões de bandeamento C em cromossomos mitóticos e
meióticos têm fornecido informações sobre a variação intra e interespecífica, e se
^ constituem em excelente ferramenta para identificar complexos de espécies no
^ gênero Anopheles (Baimai, 1998). Variações intra-específicas envolvendoheterocromatina constitutiva em cromossomos mitóticos é um fenômeno comum
em muitos mosquitos (White, 1980). A aplicação do método de bandeamento C
^ em espécies de Anopheles tem permitido distinguir espécies crípticas com basena quantidade e distribuição de blocos de heterocromatina constitutiva nos
cromossomos mitóticos, principalmente nos sexuais (X e Y) (Baimai, 1984). Em
anofelinos da Amazônia brasileira foram observadas variações intra-individuais e
intrapopulacionais, tanto no padrão quanto na distribuição de Banda C,
' ̂ principalmente, nas regiões pericentroméricas do par sexual (XX/XY) e dos
autossomos (Rafael & Tadei, 2000).
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ttd0̂ 1.4 Hibridízação in situ fluorescente (FISH)^ Considerando a análise de cromossomos mitóticos em nível molecular, da^ década de 60 até o presente, ampliaram-se os estudos da evolução(jl cromossômica. Esses estudos tiveram início com a hibridizaçâo citológica deO seqüências de RNA ribossômico e DNA (Ritossa & Spiegelman, 1965) e,0 posteriormente, surgiu a técnica de hibridizaçâo in situ (ISH), descrita por Gall &0 Pardue (1969).
A aplicação da técnica de hibridizaçâo In situ em cromossomos politênicoscomeçou em 1970, com a localização de seqüências de DNA nppetitiyo emDrosophiia e em outros dípteros. Estes experimentos incluíram sondas com
0 seqüências como RNAr e DNAr (Jones & Robertson, 1970; Pardue et ai, 1970).0 O aparecimento da clonagem molecular de DNA, em meados dos anos 70,0 combinado ao desenvolvimento de técnicas de detecção de sondas não-0 radioativas (Szabo et ai, 1977), permitiu a localização de seqüências de cópia^ única em praticamente qualquer tipo de cromossomo. Essas técnicas foram
desenvolvidas primeiramente em cromossomos politênicos, que, dada sua0^ estrutura peculiar, permitem uma visualização mais fácil dos resultados de umay^ hibridizaçâo (Stocker & Amabis, 2002).Cy Com o recente desenvolvimento da biologia molecular em mosquitos, a0 técnica de hibridizaçâo in sütu tornou-se uma ferramenta poderosa para o
desenvolvimento de mapas físicos e genéticos tanto em cromossomos politênicosquanto em cromossomos metafásicos, por meio de sondas, principalmente de
DNA repetitivo (Marchi & Pili, 1994).^ O DNA ribossômico apresenta seqüências medianamente repetitivas. São
genes conservados nos cromossomos sexuais da maioria dos insetos e possuem
regiões que diferem entre espécies e mesmo em espécies estreitamenterelacionadas (Cross & Dover, 1987). Como em todos os eucariotos, os genes deRNAr 18S, 5.8S e 28S são agrupados formando unidades repetidas em tandemcentenas de vezes e separadas por espaçadores externos não transcritos (Marchi&Pili, 1994).
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^ Em culicídeos tem sido registrada uma coincidência entre aheterocromatina constitutiva e as regiões organizadoras nucleolares (NORs). Nas
^ regiões organizadoras de nuòléolos localizam-se os genes responsáveis pela■0 síntese de RNA ribossômico, que são úteis ao diagnóstico de espécies de
diversos mosquitos. Estas regiões foram identificadas citogeneticamente em0 vários organismos por meio da impregnação pelo nitrato de prata (Sumner, 1990).0 Esta técnica, porém, não tem fornecido resultados satisfatórios para NORs em
anofelinos, especialmente quando comparada com a localização de genes RNArem seus cromossomos por hibridização in situ fluorescente ("FISH - fluorescence
^ in situ hybridization") (Rafael et ai., 2003). >^ Genes para o RNAr 18S e 28S marcados radioativamente foram utilizados(jf como sonda, pelo método de ISH, e permitiram o mapeamento dos cromossomos(J mitóticos de gânglios cerebrais de mosquitos de oito gêneros das subfamílias0 Culicinae e Anophelinae, procedentes dos Estados Unidos da América (Kumar &^ Rai, 1990). Posteriormente, fragmentos de RNAr 18S e 28S biotinilados foram^ usados como sonda, por meio do método de hibridização In situ fluorescente, para
mapear as NORs dos cromossomos sexuais de 15 espécies de mosquitos das^ subfamílias Culicinae e Anophelinae (Marchi & Pili, 1994), da Itália, Estados
Unidos e Uganda. A partir dos sinais das sondas de RNAr 18S e 28S, os autores> detectaram in situ esses genes na heterocromatina constitutiva ou em volta dela,^ bem como aberrações cromossômicas, cujas observações permitiram o estudo9 das funções e evolução do genoma.
Considerando os anofelinos sul americanos, Rafael et ai. (2003)padronizaram a técnica de FISH em cromossomos mitóticos e politênicos de A.darlingl e A. nuneztovari, de Manaus e Novo Airão (AM) e Macapá (AP) edemonstraram atividades da região organizadora nucleolar nos cromossomossexuais mitóticos e politênicos desses mosquitos.
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1.5 Anopheles albitarsis
Um grupo de mosquitos que apresenta um controvertido status taxonômicoé o A. (Nyssorhynchus) albitarsis sensu lato (Lynch-Arribálzaga, 1878). A.
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albitarsis pertence à série argyritarsis do subgênero Nyssorhynchus e apresenta
ampla distribuição geográfica na região neotropical, estendendo-se do nordeste da
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^ Argentina e outros países da América do Sul até a América Central, onde atinge o0 Panamá, Costa Rica, Honduras e Guatemala (Gaivão & Damasceno, 1942;
Forattini, 1962; Arruda et aL, 1986).
i3 A. albitarsis é, geralmente, abundante em áreas onde ocorre a transmissão
^ de malária (Kreutzer et ai., 1976), e tem sido incriminado como vetor primário em^ algumas áreas da Amazônia brasileira, como mostram os testes imunoenzimáticos
(ELISA), que detectaram alta densidade de esporozoítos da malária nesses
mosquitos (Tadei et ai., 1993; Póvoa et ai., 2001; Silva Vasconcelos ̂ aL, 2002).
0 Considerando a diferenciação de populações de A aibitarsis por meio de(I estudos citogenéticos, Kreutzer et ai. (1976) analisaram os cromossomos
politênicos de populações do Brasil, Venezuela e Colômbia. Essas populações
0 não apresentaram diferenças morfológicas, mas com a análise dos cromossomos
politênicos, esses autores identificaram as espécies BI, B2 e C por inversões
diferentes nos autossomos e, principalmente, no cromossomo X. Apesar desses
dados, estudos citogenéticos em A. albitarsis sensu lato ainda são escassos.
^ Nos últimos anos, estudos para diferenciação de populações de A. albitarsiscom diversos marcadores tais como análises de isoenzimas (Steiner et ai, 1982;
> Narang & Seawright, 1993), hibridação (Klein et ai, 1991), morfologia, isoenzimas
e comportamento (Rosa-Freitas et ai, 1990) e RAPD-PCR (Wilkerson et ai,
1995a). Nesses estudos foram identificadas até três espécies crípticas de A.
aibitaris. As análises populacionais de A. albitarsis por Wilkerson et ai (1995b) em
quatro populações da Venezuela, ampliaram esses dados, com a confirmação do
status de quatro espécies crípticas de A. albitarsis, denominadas A, B, C e D. A
espécie A foi identificada como A. aibitarsis sensu stricto, a espécie B ainda não
") foi descrita, a espécie C é A. marajoara Gaivão e Damasceno e a espécie D é A.
> deaneorum Rosa-Freitas. Dentre as espécies desse complexo, A. deaneorum é a
única que apresenta características morfologicamente diferentes das demais.
Mesmo assim, o papel das espécies desse complexo na transmissão da malária
^ ainda não está bem definido, exceto A. marajoara que foi reconhecida como
^ principal vetor do Plasmodium vivax, tanto em populações imigrantes quanto em
indígenas no Estado do Amapá, sendo esta a primeira vez em que esta espécie foi
incriminada como vetor primário de malária (Conn et a/., 2002).
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& ̂ .^ A. marajoara sensu lato foi descrita por Linthicum, que se baseou^ principalmente em exemplares da Ilha de Marajó (PA), Brasil. O autor incluiu todos
Cl os espécimes que estudou, da Costa Rica ao Brasil, sob o nome de A. marajoara,d exceto A. albitarsis s.s., demonstrando, então, que se tratava de um complexo de
Cl espécies (Wilkerson et ai, 1995b).® Diante do exposto, o complexo A. albitarsis precisa ser melhor estudado^ citogeneticamente, para caracterização da sua variabilidade cromossômica e de^ seu sfaft/s taxonômico. ,
0 Este trabalho constitui a primeira análise citogenética do complexo A.0 albitarsis, por meio de bandeamento 0 e FISH, visando compreender a sua
d organização e estrutura cromossômica, úteis para as medidas de controle desses
® mosquitos de importância epidemiològica na transmissão da malária na Amazônia.
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<12. OBJETIVOS
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d 2.1 Geral
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(9 Caracterizar a organização dos cromossomos do complexo A. albitarsis dos(J municípios de Iranduba e Coari (AM) e Ilha Comprida (SP).Cl
2.2 Específicos
® 1. Determinar o cariótipo do complexo A. albitarsis. " • .0a
a2. Estudar comparativamente o complemento mitótico de espécies do
complexo A. albitarsis, por meio de medidas morfométricas.
a^ 3. Localizar as regiões de heterocromatina constitutiva no conjuntoríi cromossômico, utilizando a técnica de banda C.
0(y 4. Mapear e analisar as regiões organizadoras nucleolares (NORs) e sua
0 associação com a heterocromatina constitutiva em células de gânglios0 cerebrais pelo método de hibridização in situ fluorescente (FISH).0
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3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Coleta e manutenção dos espécimes
As amostras de mosquitos para análise foram coletadas nos municípios de
Ilha Comprida (24°42.75'S, 47''31.6'W), no Estado de São Paulo e em Iranduba e
Coari, no Estado do Amazonas (Figuras 1 e 2, respectivamente).
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Figura 1: Locais de coleta em Iranduba e Coari, no Estado do Amazonas.
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Figura 2: Local de coleta em Ilha Comprida, no Estado de Sâo Paulo.
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Os exemplares foram capturados durante o repasto sangüíneo, com o uso
^ de iscas humanas, lanternas e capturadores manuais, e então transferidos para0 copos de plástico, tampados com tecido de malha fina (filó) e presos nas bordas
por elástico. No centro do tecido foi aberto um orifício para colocação e retirada
dos espécimes. Após a coleta, os espécimes foram transportados no interior de
copos em caixa de isopor ao Laboratório de Malária e Dengue da Coordenação do
® Centro de Pesquisas em Ciências da Saúde (CPCS) do IMPA. A umidade nointerior desta caixa foi mantidaicom o uso de papel-toalha umedecido.
No laboratório, foi realizada a identificação taxonômica d(^ jespécimes
coletados, de acordo com as chaves de Forattini (1962), Gorham et al. (1967) e
0 Faran & Linthicum (1981). Foram observadas durante a identificação as fêmeas, os
(% ovos postos, as larvas de 4°. estádio e os adultos emergentes.
<% Os espécimes coletados foram colocados para ovoposição em coposindividuais tampados com filós presos por elástico. Após a ovoposição, os ovos
foram transferidos para copos plásticos, contendo água limpa, onde permaneceram
até a eclosão das larvas. Posteriormente, as larvas foram transferidas para cubas
esmaltadas e alimentadas com farinha de peixe, pó de fígado e gérmen de trigo,
conforme procedimento de rotina deste laboratório, até a emergência do adulto.
íj? 3.2 Preparações citológícas
Psra a preparação de lâminas, foram obtidos gânglios cerebrais de larvas
em 4®. estádio, de acordo com a técnica de espalhamento de Imai et al. (1988).3.2.1 Preparação dos cromossomos mitóticos
Os gânglios cerebrais foram dissecados e transferidos para cubetas com
solução hipotônica e colchicina a 0,1% em solução de citrato de sódio a 1%, por
período não inferior a 30 minutos. Após este período, os gânglios foram retirados da
solução e colocados sobre lâminas para microscopia. Gotas de fixador I (1,5ml de
etanol; 1,5ml de ácido acético e 2ml de água destilada) foram adicionadas ao
material. Em seguida, após dissociação dos gânglios com microestiletes, foram
adicionadas gotas de fixador II (Iml de etanol e Iml de ácido acético) e, logo após,
gotas de fixador III (ácido acético glacial). As lâminas foram, então, colocadas para
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secar à temperatura ambiente. O material foi analisado sob estereomicroscópio e
guardado na geladeira, para posterior utilização em colorações convencionais,
bandeamento C e técnica de FISH.(9
0 3.2.2 Coloração com Giemsa
(jf Após a preparação das lâminas, os cromossomos foram corados para
(§ montagem do cariótipo. A coloração foi feita com Giemsa - tampão fosfato a 8%
pH 6,8, por 20 minutos. Após lavadas em água destilada, as lâminas foram postas
para secar á temperatura ambiente.
3.2.3 Bandeamento 0
A técnica de Banda 0 utilizada foi a de Sumner (1972). As lâjninas foram
0 mergulhadas em solução de HCI a 0,2N por um período de três minutos. A seguir,0 lavadas em água destilada e mergulhadas em solução de BaOHa (hidróxido de
bário) a 5% pré-aquecido em banho-maria, à temperatura de 57°C, por 9 minutos.
Após serem banhadas em HCI a 0,2N, as lâminas foram lavadas em água
destilada e incubadas em solução salina 2xSSC (NaCI 0,3M, citrato de sódio a
® 0,03M, pH 6,8), à 57°C, por 9 minutos. As lâminas foram então submetidas àcoloração em Giemsa - tampão fosfato a 8% pH 6,8, por 20 minutos, lavadas em
^ água destilada e postas para secar à temperatura ambiente.
3.3 Análise morfométrica dos cromossomos
3.3.1 MIcrofotografias
Os cromossomos mitóticos foram analisados e fotografados em microscópio
^ de contraste de fase Axioplan Zeizz. As microfotografias foram obtidas comobjetiva de imersâo lOOx e optovar 1x, 1,26x e 1,6x. As películas foram reveladas
com revelador Kodak Dektol e os negativos copiados em papel Kodabromide Print.
3.3.2 Medidas cromossômicas
As medidas foram feitas em cromossomos mitóticos, a partir das
microfotografias com contornos nítidos, com o auxílio de um paquímetro digital. Os
pares cromossômicos foram numerados de I a III, segundo a nomenclatura usual
para culicídeos, sendo o par I o menor e o par III o maior do complemento (Ral,
^ 1963). As medidas foram feitas do centrômero até às extremidades dos braçoscromossômicos. Foram calculados a razão de braço (RB = Braço Maior / Braço
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Menor) e o tamanho relativo (TR% = Tamanho Absoluto de cada cromossomo x
100 / Tamanho Total dos cromossomos do complemento haplóide), segundo
Beçak (1967). A classificação dos cromossomos foi feita de acordo com Levan et
al. (1964).
3.3.3 Análise estatística
Foi realizada a partir dos dados morfométricos dos cromossomos,
utilizando-se ANOVA (Analysis of Varíance), que analisou variações dentro e/ou
entre as amostras. Os resultados foram mensurados em escala intervalar ou de
razões, obtendo-se assim dados estatísticos para as amostras de A. albitarsis
estudadas. .
3.4 Hibrldizaçâo in situ fluorescente - FISH
Esta técnica, descrita por Viegas - Pequignot (1992), foi usada para
mapeamento físico dos cromossomos de A. albitarsis.
3.4.1 Obtenção e marcação do fragmento de DNA (sonda)
Foi utilizado o DNA recombinante {pDm 238) como sonda que consiste no
plasmídeo pBR 322, que contém uma unidade completa de repetição do DNAr de
Drosophiia meianogaster inserido no sítio EcoRI. Esta unidade inclui os genes
28S, 18S, 5,8S e 2S e as regiões espaçadoras ITS, IGS e ETS. O clone que está
inserido na bactéria E.coH foi extraído com o uso do kit Concert Rapid Piasmid
Miniprep System (GIBCO). O DNA plasmidial foi marcado e purificado de acordo
com as instruções do fabricante do kit.
3.4.2 HIbrídIzação e lavagem
O pré-tratamento das lâminas consistiu na desnaturação dos cromossomos.
150pl de RNAse (lOOpg/ml) foram adicionados a cada lâmina, que foram cobertas
com laminula de vidro 24x50cm e incubadas por 1 hora à 37®C. As lâminas foram
então mergulhadas em solução de 2xSSC, desidratadas em bateria de etanol
(50%, 75% e absoluto) e secas à temperatura ambiente.
A seguir procedeu-se a desnaturação do DNA cromossoma! em solução de
formamida a 70%, à 70®C, por 2 minutos, lavagem com 2xSSC gelado por mais 2
minutos e nova desidratação com bateria de etanol (50%, 75% e absoluto) por 2
minutos. Após isto, a sonda foi desnaturada em banho-maria com água em
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ebulição por 10 minutos e adicionada às lâminas, colocando-se lOpl de sonda porárea de hibridização e cobrindo-as com lamínula, medindo 24x24cm.
As lâminas foram transferidas para câmara úmida previamente aquecida a
37°C, para hibridização em cerca de 36 horas. A seguir, as lâminas foram lavadas
em 2 banhos de 2 minutos cada em solução de formamida a 50%, e 2 banhos de
2 minutos em 2xSSC, à temperatura de 37®C.
3.4.3 Detecção dos sinais fiuorescentes
As lâminas foram lavadas em solução de PBT (0.1% de tween 20 e PBS) eforam acrescentados lOOpl de anti-biotina (3:500 v/v em PBT). Logo após foram
incubadas em placa de Petri umedecida com PBS, por 45 minutos.
As lâminas foram novamente lavadas em PBT. Após acrescentado o anti-
goat IgG-FITC (1:100 v/v em PBT), as lâminas foram cobertas com lamínula
24x24cm e incubadas em placa de Petri umedecida com PBS por 45 minutos.
As lamínulas foram retiradas e coradas com lOOpl de iodeto de propídio
(2|jg/ml) em cada lâmina. Em seguida, as lâminas foram lavadas em 1x PBS e
acrescentados 13pl de PPD em cada uma e cobertas com lamínulas para seremfotografadas posteriormente.
3.4.4 Microfotografias
Microfotografias dos cromossomos foram obtidas em microscópio de luzcom campo claro e contraste de fase Axioplan Zeizz, com objetiva lOOx e ocular
projectiva 10x/25, utilizando-se filme em cores AGFA pius, ASA 400.
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4. RESULTADOS
Foram preparadas um total de 90 lâminas, 30 para cada experimento
realizado e sendo 10 indivíduos de cada localidade (Ilha Comprida, Iranduba e
Coari). Este número limitado de lâminas deveu-se à escassez de massa
ganglionar com placas metafásicas das larvas desses mosquitos.
4.1 Morfometria do cariótipo de Anopheles albitarsis
A partir de 206 metáfases, sendo 87 de Ilha Comprida, 61 de Iranduba e 58
de Coari, A. albitarsis apresentou cariótipo metafásico comum ao gênero com 2n=6,
para as três populações analisadas. Nos autossomos o par maior é
submetacêntrico e o intermediário metacêntrico. O par sexual é homomórfico nas
fêmeas (XX) e heteromórfico nos machos (XY). Os pares cromossômicos foram
numerados em par sexual (I) e pares autossômicos (II e III), segundo Rai (1963).
As Figuras 3, 4 e 5 mostram as metáfases de A. albitarsis e a montagem de
cariótipo de Ilha Comprida, Iranduba e Coari, respectivamente. O par sexual é
formado por um X acrocêntrico e um Y puntiforme.
Figura 3: Cariótipo de A. albitarsis de Ilha Comprida. Preparação a partir de gânglios cerebrais delarvas de 4°. estádio, obtida pela técnica de espalhamento. A: metáfase de macho. B: montagem docariótipo. C: metáfase de fêmea. D: montagem do cariótipo. Escala: 10 pm.
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Figura 4: Cariõtipo de A. albitarsis de Iranduba. Preparação a partir de gânglios cerebrais delarvas de 4°. estádio, obtida pela técnica de espalhamento. A: metáfase de fêmea. B:montagem do cariótipo. Escala: 10 pm.
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Figura 5: Cariótipo de A. albitarsis de Coari. Preparação a partir de gânglios cerebrais delarvas de 4°. estádio, obtida pela técnica de espalhamento. A: metáfase de macho. B:montagem do cariótipo. Escala: 10 pm.
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Uma característica observada nos cromossomos de A. albitarsis do
presente trabalho foi o emparelhamento somático na metáfase (Figuras 3, 4 e 5).
Estes dados corroboram os achados por Traut et al. (1990) para dípteros,
culicídeos (Hunter Jr. & Hartberg,1986), A. cruzii (Ramirez & Dessen, 1994) e A.
darlingieA. nuneztovari {Rafael &Tadei, 1998).
As medidas cromossômicas foram feitas a partir de fotografias dos
cromossomos de gânglios cerebrais. Os dados de biometria dos cromossomos
mitóticos de A. albitarsis para as três populações analisadas constam nas tabelas
1, 2 e 3, respectivamente.
Tabela 1: Medições cromossômicas (X± S) de A. albitarsis de 10 Indivíduos de Ilha Comprida, SP.Classificação de Levan et ai., 1964.
Cromossomos Comprimento
em pm
Razão de Braço Tamanho
relativo (%)
Classificação
X 1,62 ±0.41 - 13,4 ±2,59 Acrocêntrico
Y 1,31 ±0,22 - 10,65 ±1,71 Puntiforme
II 4,38 ±1,02 1,09 ±0,03 38,57 ± 2,23 Metacêntrico
III 5,41 ±1,02 1,35 ±0,06 48,02 ±2,19 Submetacêntríco
Comprimento total do genoma haplóide: 11,41 ± 2,45
Tabela 2: Medições cromossômicas (X ± 8) de A. albitarsis de 10 Indivíduos de Iranduba, AM.Classificação de Levan et ai, 1964.
Cromossomos Comprimento
em pm
Razão de
Braço
Tamanho
relativo (%)
Classificação
X 1,93 ±0,3 - 13,1 ± 1,28 Acrocêntrico
Y 1,4 ±0,28 - 10,34 ±3,1 Puntiforme
II 5,29 ±1,11 1,05 ±0,04 38,99 ±1,84 Metacêntrico
III 6,5 ±1,34 1,18 ±0,07 47,82 ± 2,74 Submetacêntríco
Comprimento total do genoma haplóide: 13,73 ± 2,76.
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Tabela 3: Medições cromossômicas (X ± S) de A. albitarsis de 10 indivíduos de Coari, AM.Classificação de Levan et al., 1964.
Cromossomos Comprimento
em pm
Razão de Braço Tamanho
relativo (%)
Classificaçâo
X 1,94 ±0,42 - 11,1 ±0,62 Acrocêntrico
Y 1,05 ±0,13 - 10,65 ±1.7 Puntiforme
II 6,43 ±1,75 1,09 ±0,03 40.17 ±1,62 Metacêntrico
III 7.78 ± 2,01 1,28 ±0,04 48,73 ±1,24 Submetacêntrico
Em todas as tabelas, as medidas foram obtidas de dez espécimes de
progênies diferentes. O tamanho relativo dos autossomos e do cromossomo X foi
calculado em função do tamanho do genoma hapíóide. O tamanho relativo do
cromossomo Y foi calculado em relação ao tamanho médio do cromossomo X. Na
população de Coari as medidas de comprimento e as razões de braços foram
maiores que nas populações de Iranduba e Ilha Comprida.
O tamanho relativo dos'cromossomos das três populações foi comparado
por análise de variância (ANOVA) e o teste estatístico escolhido foi o teste t. Nos
autossomos, o valor de t não foi significativo para o par 111 (t=2, 30; GL=19;
P>0,05) e também para o par II (t=2, 30; GL=19; P>0,05). Em relação aos sexuais,
o valor de t não foi significativo para o cromossomo X (t=2, 30; GL=19; P>0,05).
4.2 Bandeamento 0
Nas três populações analisadas, foram observadas bandas centroméricas
nos autossomos de 209 núcleos metafásicos, sendo 88 de Ilha Comprida, 69 de
Iranduba e 52 de Coari. O cromossomo X também apresentou banda
centromérica, enquanto o Y mostrou-se totalmente heterocromático. As Figuras 6,7 e 8 mostram o padrão de bandeamento observado em A. albitarsis para as
populações estudadas.
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Figura 6: Metáfase de gânglios cerebrais de larvas de quarto estádio de A. albitarsis de IlhaComprida, submetida ao método do bandeamento C. A: metáfase de macho, mostrando amarcação centromérica no X e o Y totalmente heterocromático. B: metáfase de fêmea,mostrando a marcação centromérica nos cromossomos X. Escala: 10 pm.
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íFigura 7: Metáfase de gânglios cerebrais de larvasde quarto estádio de A. albitarsis de Iranduba,submetida ao método do bandeamento C.
Marcações centroméricas nos autossomos (setaslongas) e no par sexual (setas curtas). Escala: 10pm.
Figura 8: Metáfase de gânglios cerebrais de larvasde quarto estádio de A. albitarsis de Coari,submetida ao método do bandeamento C.
Marcações centroméricas no par sexual (setascurtas). Escala: 10 pm.
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4.3 FISH
A técnica de FISH mostrou que os sinais fluorescentes marcaram a região
pericentromérica dos cromossomos X e o cromossomo Y foi total a parcialmente
marcado em 172 núcleos metafásicos, sendo 65 de Ilha Comprida, 59 de Iranduba
e 48 de Coari. Nessas amostras, os corpúsculos nucleoiares dos núcleos
interfásicos também foram marcados pela sonda de DNAr.
Nas Figuras 9A, B e 10A, verificou-se marcações fluorescentes evidentes
nos cromossomos sexuais de Ilha Comprida (SP). Nas figuras 10A e 10B,
respectivamente, os corpúsculos nucleoiares foram fortemente mapeados e a
metáfase corada com iodeto de propídeo, sem os sinais fluorescentes, para efeito
de comparação.
Figura 9: FISH em A. albitarsis de Ilha Comprida. A: metáfase de fêmea. B: metáfase de macho.Barra = 10 um
Figura 10: FISH em fêmea de A. albitarsis de Ilha Comprida. A: cromossomos sexuais ecorpúsculos nucleoiares mapeados pelos genes de DNAr. B: metáfase contra corada com oiodeto de propídeo. Barra = 10 pm.
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As Figuras 11 e 12 mostram cístrons de RNAr nos cromossomos da
população de Iranduba (AM). Esses sinais são visíveis nos pares sexuais e as
mesmas metáfases contra coradas com o iodeto de propídeo.
Figura 11: FISH em macho de A. albitarsis de Iranduba. A: cromossomos sexuais ecorpúsculos nucleolares mapeados pelos genes de DNAr. B: metáfase contra corada com oiodeto de propídeo. Barra = 10 pm.
Figura 12: FISH em fêmea de A. albitarsis de Iranduba. A: cromossomos sexuais e corpúsculosnucleolares mapeados pelos genes de DNAr. B: metáfase contra corada com o iodeto de propídeo.Barra = 10 pm.
As Figuras 13 e 14 evidenciam a sonda de DNAr da técnica de FISH com a
população de Coari.
Em 13A, os sinais fluorescentes localizam-se no centrômero do par sexual
(XY). Em 13B, tem-se a mesma metáfase, corada com o iodeto de propídeo, sem
os sinais fluorescentes. Na figura 14A, os cístrons ribossomais localizam-se na
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região pericentromérica do par sexual (XX). Em 14B, os sinais foram observados
no centrômero do cromossomo X e o Y foi totalmente marcado.
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Figura 13: FISH em macho de A. albitarsis de Coari. A: cromossomos sexuais ecorpúsculos nucleolares mapeados pelos genes de DNAr (cabeça de seta). B: metáfasecontra corada com o iodeto de propídeo. Barra = 10 pm.
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Figura 14: FISH em A. albitarsis de Coari. A: metáfase de fêmea. B; metáfase de macho ecorpúsculos nucleolares mapeados pelos genes de DNAr (cabeça de seta). Barra = 10 pm.
Embora a FISH não tenha revelado variação interespecífica no número elocalização dos loci 45S, um heteromorfismo de tamanho dos sinais fluorescentes
foi detectado entre os pares sexuais homólogos (Figuras 9A e 9B, 10A, 12A, 14Ae 148).
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5. DISCUSSÃO
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9 5.1 Morfometria dos cariótipos
O presente estudo realizado nas três populações analisadas mostrou que,
em concordância com os dados verificados em outros anofelinos sul americanos,
o complemento cromossômico de A albitarsis foi 2n = 6 (Kreutzer et al., 1976;
^ Rafael & Tadei, 1998). O par autossômico maior (III) foi submetacêntrico e o par^ menor (II), metacêntrico. Quanto ao par sexual, o X mostrou-se acrocêntrico e o Y,
% puntiforme. Trata-se de um complemento mitótico bastante semelhante aos das
9 espécies do subgênero Nyssorhynchusià descritas, que incluem o*A''5aríingh A.9 nuneztovarí (Rafael & Tadei, 1998), A. aquasalis, A. noroestensis, A. argyrítarsis,® A. strodei e A. albimanus (Schreiber & Guedes, 1959, 1961). Estes autores
detectaram também variação morfológica no cromossomo X das referidas
espécies, que se mostraram acrocêntrico em A. darlingi e A. argyrítarsis,metacêntrico em A. aquasalis e A. noroestensis (Schreiber & Guedes, 1959,
'p 1961), e submetacêntrico em A. nuneztovarí (Rafael & Tadei, 1998).
9 O número cromossômico de A. albitarsis confirma os registros da literaturapara a maioria das espécies do gênero Anopheles, que apresenta cariótipoconservado, com exceção de Chagasia bathana, da subfamília Anophelinae, quepossui 2n = 8 cromossomos (Kreutzer, 1978).
A morfologia cromossômica do A. albitarsis mostrou-se similar, ainda, à deA. (Kerstezia) cruzii descrito por Ramírez (1989), que detectou cariótipo 2n = 6 empopulações de São Paulo, no sudeste brasileiro, com um cromossomo X
acrocêntrico, assim como para A. darlingi de Macapá (AP) e Manaus (AM) (Rafael& Tadei, 1998).
Conforme a literatura, o gênero Anopheles, ao qual pertence o complexoalbitarsis, abriga espécies com número diplóide igual a 6 (Kreutzer, 1978). Ocariótipo dos locais analisados não apresentou variação quanto ao númerocromossômico ou à estrutura geral. Estes resultados indicam uma estabilidade no
seu cariótipo, o que lhes permitiu colonizar os países ao longo de sua distribuição
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geográfica sem sofrer especiação. O mesmo não é verificado em Chagasis
® bathana, cuja variação no número de cromossomos é 8.H
O fato do presente estudo não ter revelado variação cromossômica quanto
^ 30 número diplóide no complexo albitarsis nas três localidades estudadas podem indicar que a pressão seletiva esteja atuando apenas em nível gênico./IH Comparando-se as medidas morfométricas de A. albitarsis de Ilha
Comprida, Iranduba e Coari, foi observado que as médias dos autossomos nas
0 três localidades foram diferentes. As maiores médias para os três pares decromossomos foram verificadas na população de Coari. O tamanho médio do
cromossomo X também mostrou variações, sendo o menor obse^dP em Ilha
Comprida. Os tamanhos relativos dos cromossomos autossômicos e sexuais
^ comparados pelo teste t não mostraram diferenças significativas entre as trêsH populações estudadas.
# Considerando-se as espécies do gênero Anopheles, os dados da literatura# demonstram variação quanto ao tamanho médio dos cromossomos mitóticos (Rai# & Craig, 1961; Kitzmiller, 1963; Rafael & Tadei, 1998). No caso das medidas
morfométricas dos cromossomos metafásicos de A. albitarsis, estas variaçõesintraindividuais e intrapopulacionais observadas se devem ao grau decondensação cromossômica diferente entre as metáfases analisadas do complexoA. albitarsis de Ilha Comprida, Iranduba e Coari.
5.2 Bandeamento 0
Os estudos de padrão de bandeamento C em cariótipos metafásicos deanofelínos servem para identificar espécies crfpticas, principalmente quanto àsdiferenças na quantidade e distribuição da heterocromatina constitutiva nos
cromossomos X e Y (Rafael et ai, 2003). Trabalhos recentes em identificação de
espécies crípticas fizeram uso do método de bandeamento C em anofelínos
orientais do complexo dirus da Tailândia (Baimai, 1988; Baimai et ai, 1994, 1996,1998).
Em dípteros, a heterocromatina constitutiva pode estar presente em até60% do comprimento do cromossomo X (Baimai, 1998). Espécies orientais deAnopheles têm apresentado variações no conteúdo de heterocromatina
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constitutiva em seus cromossomos mitóticos, principalmente nos pares sexuais, e
por isso estes cromossomos apresentam diferentes morfologias e tamanhos
(Baimai et ai, 1996; Baimai, 1998).
O padrão de bandeamento C verificado nas três populações de A. albitarsis
IP estudadas foi similar, como tem sido observado para espécies crípticas de
H Anopheles do complexo A. dirus do sudeste da Ásia (Baimai et ai, 1996) e
Anopheles maculatus, da Indonésia e Malásia (Baimai, 1998). Considerando o
complexo A. albitarsis do presente estudo, o bandeamento 0 mostrou os
autossomos com variação de tamanho e posição dos blocos de heterocromatina
constitutiva nas regiões centromérica e intersticial. Marcações int«§tjciais nos
autossomos foram observadas, mas em quantidade pouco significativa (1% de 10
H lâminas) nas populações de Ilha Comprida e Iranduba, respectivamente. Em Coari
9 essas variações não ocorrerqm. Os pares sexuais (XX / XY) foram marcados
# especialmente nos centrômeros com variação de tamanho. O cromossomo Y
mostrou-se totalmente heterocromático.
Esses padrões de bandeamento C, com marcações centroméricas nos
autossomos e no par sexual, também foram observados em A. darlingi e A.
nuneztovari (Rafael & Tadei, 2000) e A. (Kerteszia) cruzii (Ramírez & Dessen,
1994). No presente estudo, os dados de bandeamento C de A. albitarsis não
ip foram suficientes para incriminar esses mosquitos como complexo de espécies, adl exemplo de estudos citogenétícos realizados nas espécies crípticas dos
0 complexos A. dirus (Baimai et ai, 1996) e A. maculatus (Baimai, 1998).
As diferenças no tamanho dos blocos de heterocromatina constitutiva no
par sexual de A. albitarsis podem ser atribuídas à adição ou perda de parte destes
cromossomos. A adição ou perda de blocos heterocromáticos no gênero
Anopheles tem desempenhado importante papel na evolução destes mosquitos^ (Vasantha et ai, 1982; Baimai et ai, 1996). Estes blocos podem ter se originadoH das diferenças acumuladas durante a sua evolução, conforme observado em A.
gambiae e A. arabiensis (Gatti et ai, 1982) e A. darlingi e A. nuneztovari (Rafael &
Tadei, 2000; Rafael et ai, 2003).
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5.3 FISH
O DNA ribossomal (DNAr), que codifica o RNAr, tem sido muito utilizado em
procedimentos de identificação de espécies de mosquitos. Essa família de genes
apresenta estrutura conhecida em uma grande variedade de eucariotos, incluindo
os insetos. A arquitetura do DNAr e a sua seqüência gênica são altamente
iflf conservadas, o que torna estas seqüências importantes para estudos sistemáticos
® (Munstermann & Conn, 1997). Porém certas regiões do DNAr variam entreespécies relacionadas. Estas regiões, que geralmente ocorrem nos segmentos
espaçadores, são usadas para identificar espécies próximas e como alvo de
^ análises filogenéticas (Coilins & Paskewitz, 1996). ^^ Genes de RNA ribossomal têm sido clonados e analisados em várias^ espécies de mosquitos. No gênero Anopheles as unidades de DNAr se repetem9 entre 400 e 500 vezes por genoma haplóide (Gale & Crampton, 1989).
# A organização do DNAr segue uma estrutura altamente conservada. Osgenes de RNAr 18S, 28S e 5,8S se agrupam formando unidades repetidas em
® tsndem com múltiplas cópias e separadas entre si por espaçadores internos não^ transcritos (IGS). A unidade primária transcrita inclui as subunidades de RNA
ribossomal, um espaçador externo transcrito (ETS) e dois espaçadores internos^ transcritos, ITS1 e ITS2 (Coilins & Paskewitz, 1996). Em A. gambiae, por exemplo,
único locus de DNAr'que consiste de um grande arranjo de unidadesrepetidas (Coilins et ai, 1989). Recentemente, Koekemoer et ai (2002) usaram
9 diferenças de tamanho do espaçador ITS2 para diferenciar espécies do complexoAnopheles funestus, importante vetor de malária na África.
Para caracterizar e localizar as NORs (regiões organizadoras de nucléolo),tem sido utilizado o método de hibridização in situ fluorescente (FISH) ao invés datécnica de impregnação por nitrato de prata (Ag-NOR). A localização das NORspor meio da impregnação por prata não é um bom marcador em dípteros (Bicudo,1982), em espécies de Anopheles e outros mosquitos (Motara et ai, 1985; Rao &Rai, 1987). Este fato ocorre, talvez, devido à inespecificidade de marcação nos
cromossomos e à inativaçâo dos genes para o RNAr durante a divisão celular, na
qual as partículas de prata não conseguem impregnar os sítios de proteínas Ag-
NOR (Rafael, 1996; 2001). Em A. darlingieA. nuneztovari 6a Amazônia brasileira.
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esta autora observou que apenas nos corpúsculos nucleolares dos núcleos
interfásicos ocorreram sinais positivos indicando marcação com prata.
No presente estudo, a técnica de FISH localizou as NORs nos
cromossomos sexuais de A. albitarsis de liha Comprida, Iranduba e Coari,
apresentando cístrons ribossomais fluorescentes nas regiões pericentroméricas
dos cromossomos X e os cromossomos Y foram totalmente mapeados. Estes
resultados corroboram estudos realizados em cromossomos de outros anofelinos
da Amazônia (Rafaei et a/., 2003). Esses autores analisaram amostras de A.
darlingi e A. nuneztovarí de Manaus e Novo Airâo (AM) e Macapá (AP) e
verificaram NOR na região pericentromérica dos cromossomos sexGíaiajde.ambasas espécies, bem como variação íntraindividual quanto à localização dos genes de
RNAr.
As espécies de Anopheles, segundo dados da literatura, têm mostrado
genes de DNAr bastante conservados (Marchi & Pili, 1994; Rafael et ai, 2003).Para esses autores, os loci 45S e 28S ocorrem no par sexual, preferencialmentena região pericentromérica, sugerindo que os genes ribossomais estão presentesem apenas dois cromossomos do genoma destes mosquitos.
O número cromossômico conservado, a localização da banda C (Baimai etai, 1996) e a constância da associação dos genes de DNAr com a
heterocromatina constitutiva do par sexual são aspectos comuns no gêneroAnopheles e outros culicídeos (Rao & Ral, 1987; Marchi & Pili, 1994; Rafael et ai,2003).
Blocos de heterocromatina constitutiva na região centromérica do parsexual de A. darlingi e A. nuneztovarí foram descritos por Rafael & Tadei (2000).
Posteriormente, Rafael et ai (2003) mostraram associação dos blocos deheterocromatina constitutiva com os sítios de DNAr 45S. Esses achados
confirmaram os resultados com a FISH obtidos em A. albitarsis das três
iocalidades analisadas no presente trabalho, e sugerem que a localização da NORé conservada no centrômero de um único par de todos os indivíduos de A.
albitarsis e pode ser uma característica primitiva na subfamília Anophelinae.
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mAlém disso, o bandeamento com a FISH revelou a NOR no complemento
mitótico que não foi observada pelo método de impregnação com o nitrato de
^ prata (dados não mostrados),
^ Embora o método de FISH seja mais qualitativo do que quantitativo, umaIP associação entre o tamanho do sinal de hibridizaçâo e o número de cístrons de
Ip DNAr tem sido demonstrado (Marchi & Pili, 1994; Rafael et ai, 2003). Em A.
9 albitarsis, os sinais fluorescentes dos sítios de DNAr 458 indicam um maior
^ número de repetições do que aqueles com sinais menos intensos.Esses dados revelaram que o número e a posição dos sítios de DNAr
detectados com a sonda pDm 238 - Drosophila melanogaster sãc^arcadoresimportantes para caracterizar e identificar os cromossomos do complexo A.
albitarsis.
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6. CONCLUSÃO
• O canótipo de A.albitarsis, com 2n=6 cromossomos, é conservado, como na
^ matoria dos anofelinos.
m
mH •A técnica de Banda C evidenciou variação intra-específica de blocosheterocromáticos nos pares de autossomos e sexuais de A. albitarsis.
m
# • o método de FISH evidenciou sinais fluorescentes (cístrons ̂ DNAr) dasregiões organizadoras de nucléolo e demonstrou o seu número e localizaçãoao redor da heterocromatina constitutiva (Banda C) do par sexual de A.
albitarsis.
A presença de NOR em cluster nos cromossomos sexuais de A. albitarsis
demonstrou um genoma conservado, como em outras espécies do gêneroAnopheles, subfamília Anophelinae.
I
As diferenças observadas quanto ao cariótipo, Banda C e FISH não foram
significativas para separar as espécies do complexo aibitarsis. Porém, estetrabalho contribuiu para a organização e compreensão da estrutura
cromossômica deste complexo de espécies de duas localidades da regiãocentral da bacia amazônica e uma do sudeste brasileiro.
30
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