analise de proteomas_o despertar da era pós-genômica

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PESQUISA O despertar da era pós-genômica AN`LISE DE PROTEOMAS Wagner Fontes Professor Adjunto e Pesquisador do CBSP CBSP - Centro Brasileiro de Serviços e Pesquisas em Proteinas Laboratório de Bioquímica e Química de Proteínas Departamento de Biologia Celular Universidade de Brasília [email protected] Carlos AndrØ Ornelas Ricart Professor Adjunto e Pesquisador do CBSP CBSP - Centro Brasileiro de Serviços e Pesquisas em Proteinas Laboratório de Bioquímica e Química de Proteínas Departamento de Biologia Celular Universidade de Brasília [email protected] Fotos cedidas pelos autores Marcelo Valle de Sousa Professor Adjunto e Coordenador do CBSP CBSP - Centro Brasileiro de Serviços e Pesquisas em Proteinas Laboratório de Bioquímica e Química de Proteínas Departamento de Biologia Celular Universidade de Brasília [email protected] roteínas sªo polímeros de aminoÆ- cidos resultantes da traduçªo das informaçıes genØticas contida no DNA das cØlulas. O termo proteína vem do grego proteios e significa a mais importante. De fato, as prote- ínas compıem um conjunto de mo- lØculas indispensÆveis para todos os seres vivos do planeta. Elas sªo as biomolØculas mais abundantes e ocorrem em grande diversidade, podendo agir como enzimas, anticorpos, hormônios, componentes es- truturais, receptores celulares, etc. Devido a essa diversidade de funçıes, as proteínas exercem papel fundamental em quase to- dos os fenômenos biológicos, como produ- çªo de energia, defesa imunológica, con- traçªo muscular, atividade neuroquímica e reproduçªo. Do ponto de vista comercial, bilhıes de dólares sªo gerados anualmente por indœstrias que trabalham com proteí- nas, como as farmacŒuticas e alimentícias. JÆ se discute atØ o uso de proteínas em eletrônica e computaçªo de maneira roti- neira no futuro. Genomas e Proteomas Nos œltimos vinte anos, a Bioquímica sofreu uma verdadeira revoluçªo, princi- palmente devido aos espetaculares avan- ços na Ærea de Biologia Molecular, que vem disponibilizando uma incrível gama de informaçıes moleculares sobre os sistemas biológicos. Destaca-se a enorme quantida- de de sequŒncias de DNA fornecida pelos projetos de sequenciamento total de geno- mas. Hoje jÆ sªo conhecidas as sequŒncias completas dos genomas de microorganis- mos como Haemophilus influenza, Myco- plasma genitalium, Escherichia coli e Sa- charomyces cerevisiae. Espera-se, para o começo do próximo sØculo, a sequŒncia total do genoma humano. A partir das sequŒncias de DNA dos genes, pode-se deduzir a sequŒncia de aminoÆcidos das proteínas por eles codifi- cadas. Essa informaçªo Ø de grande impor- tância, jÆ que a sequŒncia de aminoÆcidos de uma proteína (ou estrutura primÆria) Ø a característica primordial que define sua forma e funçªo. Por outro lado, o sequen- ciamento de genes revela muito pouco sobre como as proteínas de um organismo operam individualmente ou em conjunto para exercer suas funçıes. AlØm disso, sabe-se que, após serem sintetizadas, as proteínas podem sofrer importantes modi- ficaçıes chamadas pós-traducionais, como glicosilaçıes e fosforilaçıes. Tais informa- çıes nªo podem ser retiradas exclusiva- mente da sequŒncia dos genes, havendo necessidade de estudos diretos das prote- Figura 1-Eletroforese bidimensional. O gel de IPG Ø incubado com a soluçªo contendo a amostra e, posteriormente, submetido a um campo elØtrico para a focalizaçªo isoelØtrica ou primeira dimensªo. As proteínas focalizadas sªo, entªo, submetidas a uma segunda dimensªo, que as separarÆ de acordo com suas massas moleculares. Após coloraçªo, o perfil bidimensional pode ser visualizado. 12 Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento

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Analise de Proteomas

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Page 1: Analise de Proteomas_O Despertar Da Era Pós-genômica

PESQUISA

O despertar da era pós-genômica

ANÁLISE DEPROTEOMAS

Wagner FontesProfessor Adjunto e Pesquisador do CBSPCBSP - Centro Brasileiro de Serviços e Pesquisas emProteinasLaboratório de Bioquímica e Química de ProteínasDepartamento de Biologia CelularUniversidade de Brasí[email protected]

Carlos André Ornelas RicartProfessor Adjunto e Pesquisador do CBSPCBSP - Centro Brasileiro de Serviços e Pesquisas emProteinasLaboratório de Bioquímica e Química de ProteínasDepartamento de Biologia CelularUniversidade de Brasí[email protected] cedidas pelos autores

Marcelo Valle de SousaProfessor Adjunto e Coordenador do CBSPCBSP - Centro Brasileiro de Serviços e Pesquisas emProteinasLaboratório de Bioquímica e Química de ProteínasDepartamento de Biologia CelularUniversidade de Brasí[email protected]

roteínas são polímeros de aminoá-cidos resultantes da tradução dasinformações genéticas contida noDNA das células. O termo proteínavem do grego proteios e significa �amais importante�. De fato, as prote-ínas compõem um conjunto de mo-

léculas indispensáveis para todos os seresvivos do planeta. Elas são as biomoléculasmais abundantes e ocorrem em grandediversidade, podendo agir como enzimas,anticorpos, hormônios, componentes es-truturais, receptores celulares, etc. Devidoa essa diversidade de funções, as proteínasexercem papel fundamental em quase to-dos os fenômenos biológicos, como produ-ção de energia, defesa imunológica, con-tração muscular, atividade neuroquímica ereprodução. Do ponto de vista comercial,bilhões de dólares são gerados anualmentepor indústrias que trabalham com proteí-nas, como as farmacêuticas e alimentícias.Já se discute até o uso de proteínas emeletrônica e computação de maneira roti-neira no futuro.

Genomas e Proteomas

Nos últimos vinte anos, a Bioquímicasofreu uma verdadeira revolução, princi-palmente devido aos espetaculares avan-ços na área de Biologia Molecular, que vemdisponibilizando uma incrível gama deinformações moleculares sobre os sistemasbiológicos. Destaca-se a enorme quantida-de de sequências de DNA fornecida pelosprojetos de sequenciamento total de geno-mas. Hoje já são conhecidas as sequênciascompletas dos genomas de microorganis-mos como Haemophilus influenza, Myco-plasma genitalium, Escherichia coli e Sa-charomyces cerevisiae. Espera-se, para ocomeço do próximo século, a sequênciatotal do genoma humano.

A partir das sequências de DNA dosgenes, pode-se deduzir a sequência deaminoácidos das proteínas por eles codifi-

cadas. Essa informação é de grande impor-tância, já que a sequência de aminoácidosde uma proteína (ou estrutura primária) é acaracterística primordial que define suaforma e função. Por outro lado, o sequen-ciamento de genes revela muito poucosobre como as proteínas de um organismooperam individualmente ou em conjuntopara exercer suas funções. Além disso,sabe-se que, após serem sintetizadas, asproteínas podem sofrer importantes modi-ficações chamadas pós-traducionais, comoglicosilações e fosforilações. Tais informa-ções não podem ser retiradas exclusiva-mente da sequência dos genes, havendonecessidade de estudos diretos das prote-

Figura 1-Eletroforese bidimensional.O gel de IPG é incubado com asolução contendo a amostra e,posteriormente, submetido a umcampo elétrico para a focalizaçãoisoelétrica ou primeira dimensão. Asproteínas focalizadas são, então,submetidas a uma segunda dimensão,que as separará de acordo com suasmassas moleculares. Após coloração,o perfil bidimensional pode servisualizado.

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Page 2: Analise de Proteomas_O Despertar Da Era Pós-genômica

ínas. Do mesmo modo, o estudo do geno-ma não permite saber que proteínas estãoexpressas realmente em uma determinadacélula em um dado momento. Dentro dessecontexto, torna-se importante o estudo emlarga escala das proteínas por meio deprojetos de análise de proteomas.

PROTEOMA é um termo relativamentenovo, que significa o conjunto de PROTE-ínas expressas por um genOMA. O genomade um organismo, como por exemplo o deum ser humano, é praticamente constante,independente de qual das diferentes célu-las (excetuando-se óvulos e espermatozói-des) está sendo analisada ou de variaçõesno meio ambiente. Por outro lado, o prote-oma de um neurônio será bastante diferen-te do proteoma de um linfócito do mesmoindivíduo, já que as diferenças morfológi-cas e funcionais entre as duas células sãoreflexo do conjunto de proteínas produzi-das por cada uma. O mesmo tipo de célulapode apresentar diferentes proteomas emresposta a estímulos externos como a ação

de drogas, poluiçâo ou mesmo estressenervoso. O proteoma é, portanto, o resul-tado da expressão de um conjunto degenes e das modificações pós-traducionaisdas proteínas produzidas em resposta acondições ambientais definidas.

Métodos Utilizados

Nos projetos de proteomas, um dosobjetivos primários é separar e visualizar omáximo de proteínas possível de umafonte, permitindo que sejam catalogadascomputacionalmente e estudadas por téc-nicas analíticas. Atualmente a eletroforesebidimensional em gel de poliacrilamida é ométodo mais eficiente de separação simul-tânea de centenas ou milhares de proteínas(Figuras 1 e 2). Pode-se dizer que a eletro-forese bidimensional é o �coração� daanálise de proteomas. Em qualquer tipo deseparação eletroforética, moléculas quepossuam cargas, migram sob a influênciade um campo elétrico. A velocidade demigração dependerá de fatores como tama-nho, forma e carga elétrica. No caso daeletroforese bidimensional, as proteínassão submetidas a dois processos (duasdimensões) consecutivos de separaçãobaseados em propriedades diferentes dasproteínas. Assim, durante a primeira di-mensão, denominada focalização isoelétri-ca (IEF), as proteínas são separadas em umgel de poliacrilamida que forma um gradi-ente de pH e migram até atingirem umaposição estacionária onde possuam cargalíquida zero (ponto isoelétrico).

Na segunda dimensão, as proteínasseparadas pela IEF são submetidas a umaeletroforese desnaturante em gel de polia-crilamida que separa as proteínas de acor-do com suas massas moleculares. Como osparâmetros usados na primeira dimensão(ponto isoelétrico) e na segunda dimensão(massa molecular) são independentes, umagrande resolução é atingida. Mais de 8.000proteínas podem ser separadas em umúnico gel bidimensional. A eletroforesebidimensional foi desenvolvida há mais de20 anos, porém seu uso em análise deproteomas esteve limitado até há poucotempo devido à baixa reprodutibilidadedos géis obtidos e à inexistência de méto-dos sensíveis o bastante para identificar asproteínas separadas. O surgimento da téc-nica de gradientes imobilizados de pH(IPG) permitiu uma reprodutibilidade mui-to maior nos géis bidimensionais, enquan-to que avanços recentes nas técnicas demicrossequenciamento automático e es-pectrometria de massa de proteínas permi-tiram que proteínas em quantidades daordem de fentomoles (10-15 Mol) pudessemser identificadas.

A identificação de uma proteína é muito

facilitada se sua sequência for conhecida eestiver depositada em bancos de dados desequências, os quais podem ser acessadosvia Internet. A sequência parcial de amino-ácidos proveniente de uma mancha da ele-troforese bidimensional pode ser usada parafazer uma busca nos bancos de dados eidentificar a proteína. Uma abordagem aindamais moderna e sensível faz uso da espectro-metria de massa de proteínas.

A espectrometria de massa é uma meto-dologia que permite a determinação damassa molecular de compostos com altíssi-ma precisão. Apenas no início da década de80, a espectrometria de massa começou a sermais aplicada em determinações de massasmoleculares de proteínas. Com o desenvol-vimento de equipamentos cada vez maisespecializados para proteínas (Figura 3), aespectrometria de massa tornou-se ferra-menta revolucionária na química de proteí-nas moderna. A espectrometria de massavem permitindo a identificação de proteínaspor uma metodologia denominada �peptidemass fingerprinting� (Figura 4). Esta meto-dologia é baseada na digestão da proteína aser identificada por uma enzima proteolítica(por exemplo, a tripsina) produzindo frag-mentos denominados peptídios. As massasdesses peptídios são então determinadascom grande acuidade (0,1-0,5 Da) por es-pectrometria de massa. As massas obtidasformam uma espécie de impressão digital(�peptide mass fingerprinting�) da proteína.Softwares especiais permitem comparar o�peptide mass fingerprinting� da proteínaque queremos identificar com os geradosteoricamente para todas as sequências deproteínas presentes nos bancos de dados. Sea sequência da proteína problema estiver nobanco de dados ela será imediatamenteidentificada.

A espectrometria de massa também podeser usada para sequenciar pequenas regiõesdos peptídios. O uso das pequenas sequên-cias obtidas em conjunto com as informa-ções de massas moleculares constitui umapoderosa técnica de identificação de prote-ínas conhecida como �sequence tag�.

Os dados de análise de proteomas sãoarmazenados na forma de Mapas de Refe-rência ou Mapas de Proteomas, os quais sãoobtidos por �scanning� dos géis bidimensi-onais corados e análise das imagens pormeio de programas especiais. Assim, a posi-ção das manchas e a intensidade dos sinaissão calculadas para quantificação, determi-nação de ponto isoelétrico e massa molecu-lar. Os Mapas de Proteomas indicam tam-bém a descrição das proteínas já identifica-das pelas técnicas descritas anteriormente.Uma lista de Mapas de Proteomas estádisponível na WWW no sítio WORLD-2DPA-GE no endereço URL: http://expasy.hcuge.ch/ch2d/2d-index.html.

Figura 3-Espectrômetro de massa dotipo electrospray triple-quadrupole,dedicado ao estudo de proteínas eproteomas.

Figura 2-Equipamento deeletroforese bidimensional.

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Aplicações Biotecnológicas

A existência de Mapas de Proteomasdisponíveis na Internet permite que pes-quisadores de todo o mundo, trabalhandoem diversos assuntos envolvendo expres-são de proteínas, tais como efeito de fárma-cos, condições patológicas, diferenciaçãocelular, comparação de variedades da mes-ma espécie e respostas celulares a estímu-los externos diversos, possam identificarmais facilmente as proteínas expressas oureprimidas, precisando para isso apenasobter o perfil bidimensional das proteínasde seu sistema nas mesmas condições dosMapas de Referência disponíveis.

Hoje, já se vislumbra uma enorme gamade aplicações a partir do conhecimentodetalhado dos proteomas, principalmenteem medicina, agropecuária e biotecnolo-gia. Por exemplo, a comparação de expres-são de cepas patogênicas e não patogêni-cas de microorganismos pode ajudar nodesenvolvimento de métodos diagnósticose de agentes terapêuticos. A análise deproteomas acoplada à técnicas de �kno-ckout� de genes pode demonstrar os efei-tos metabólicos da proteína nocauteada everificar se outros genes são co-regulados.De fato, mais de 1000 proteínas já foram

classificadas em conjuntos de proteínas co-estimuladas (�stimulons�) ou co-reguladas(�regulons�). Torna-se, portanto, muitoimportante o emprego da análise de prote-omas no estudo do efeito de fármacossobre células para verificar que proteínassão afetadas além da proteína-alvo. Outrapossibilidade da análise de proteomas é acomparação de tecidos humanos normais edoentes. No caso de câncer, várias proteí-nas marcadoras já foram identificadas poranálise de proteomas.

Situação no Brasil

Projetos de análise de proteomas estãosendo considerados altamente estratégicosneste momento em que se inicia a �Era Pós-Genômica� e estão recebendo pesadosapoios de governos de países como Esta-dos Unidos, Dinamarca, França, Alemanha,Inglaterra, Japão e Austrália. Centros paraanálise de proteomas foram ou estão sendocriados nesses países. Países emergentescomo Coréia do Sul, Taiwan, Índia, Áfricado Sul e outros já estão também realizandofinanciamentos de projetos proteômicos.

No Brasil, apesar do próprio conceitode proteomas ser pouco conhecido pelacomunidade científica e órgãos financiado-res, projetos proteômicos começam a serrealizados no Laboratório de Bioquímica eQuímica de Proteínas/Centro Brasileiro deServiços e Pesquisas em Proteínas da Uni-versidade (CBSP/LBQP) da Universidadede Brasília (UnB). O CBSP/LBQP vem-sededicando nos últimos anos à identificaçãode proteínas por análise de aminoácidos,sequenciamento automático e espectrome-tria de massa, tendo adquirido o �know-how� necessário para trabalhos em proteo-mas. Atualmente, estão sendo iniciadosprojetos de análise de proteomas do vene-no da aranha marrom (Loxoceles), em cola-boração com a Dra. Katia Barbaro, doInstituto Butantan, e da jararaca da Amazô-nia (Bothrops atrox), em colaboração como Dr. Paulo Buhrnhein e o pesquisadorJorge Luis López Lozano, do Instituto deMedicina Tropical de Manaus (Figura 5).Essas pesquisas, cujos financiamentos es-tão sendo solicitados junto a programas deapoio científico e tecnológico nacionais,objetivam a comparação de proteomas devenenos de populações com diferentestoxidades e a identificação de proteínas deinteresse biotecnológico e farmacológico.Outro projeto do LBQP/CBSP é a análise deproteomas de leucócitos humanos após otrauma, em colaboração com o Dr. BelchorFontes, do Hospital das Clínicas de SãoPaulo. Após o trauma, até mesmo em casospouco graves, alguns pacientes desenvol-vem falência múltipla de órgãos, chegandoà morte quase sempre. Assim, leucócitos de

Figura 4-Identificação deproteínas por espectrometria demassa. Uma mancha protéica deum gel bidimensional (1) écortada e transferida para umtubo onde sofre digestãoproteolítica (2). Os peptídiosresultantes são separados de saise outras micromoléculas (3) eaplicados no espectrômetro demassa (4). As massas dospeptídios são usadas para fazerbuscas em bancos de dados pormétodos computacionais,resultando na identificação daproteína (5).

Figura 5- Aplicação da análise deproteomas no estudo comparativode venenos. A gravidade dosacidentes ofídicos causados porserpentes do gênero Bothropsatrox das regiões de Manaus e daFronteira Brasil-Colômbia sãodiferentes. O mesmo ocorre comdiferentes espécies de aranhas dogênero Loxosceles. O estudocomparativo desses proteomaspode levar à identificação deproteínas de interessebiotecnológico e farmacológico.

pacientes com e sem falência múltipla deórgãos pós-trauma serão comparados anível de proteomas, com o objetivo deidentificar marcadores moleculares relaci-onados com essa condição. Diversas ou-tras idéias já estão sendo discutidas paranovos projetos. Até mesmo coordenado-res de projetos genoma nacionais já de-monstram grande interesse em interagircom a equipe do LBQP/CBSP em futurostrabalhos pós-genômicos.

A análise de proteomas possui muitasoutras aplicações além das citadas nesteartigo e a demanda de trabalhos nessaárea certamente crescerá exponencialmen-te no Brasil nos próximos anos. O atendi-mento dessa demanda vai depender mui-to do apoio continuado a grupos depesquisa em proteínas e proteomas.

Referências BibliográficasWestermeier, R. (1997). Electrophoresis inpractice. VCH, Germany.Roepstorff, P. (1997). Mass spectrometryin protein studies from genome to function.Current Opinion in Biotechnology 8: 6-13.Wilkins, M.R., Williams, K.,L., Appel, R.D.and Hochstrasser, D. (Eds.) (1997).Proteome research: new frontiers infunctional genomics. Springer-Verlag,Germany.

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