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I
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
Desenvolvimento e validação de metodologia para determinação de resíduos de pesticidas no estipe de coqueiro (Cocos nucifera L.), utilizando as técnicas de MSPD e HPLC-DAD
JORDANA ALVES FERREIRA
São Cristóvão, SE 2012
II
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
JORDANA ALVES FERREIRA
Desenvolvimento e validação de metodologia para determinação de resíduos de pesticidas no estipe de coqueiro (Cocos nucifera L.), utilizando as técnicas de MSPD e HPLC-DAD
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química, da Universidade Federal de Sergipe, como um dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Química.
Orientador: Prof. Dr. Sandro Navickiene
São Cristóvão, SE 2012
III
“Mesmo que só não se possa fazer muito, cada um possa pegar um pouco de sabedoria. Ainda que, modesto e insuficiente, desperto o sonho do homem de alcançar a verdade. Por essas pequenas luzes em nossas trevas são por onde veremos pouco a pouco, os esboços desse grande projeto que dá forma ao universo. Eu estou entre aqueles que pensam que por esse motivo, a ciência tem grande beleza e com sua força espiritual, limpará algum dia este mundo de seus males, sua ignorância, pobreza, doenças, guerras e mágoas. Procurem a clara luz da verdade. Procurem estradas novas e desconhecidas mesmo quando a vista dos homens veja mais longe que agora. A maravilha divina nunca nos falhará. Cada época tem seu próprio sonho. Deixe então, os sonhos de ontem. Você toma a tocha do conhecimento e construa o palácio do futuro”.
Marie Curie - Madame Curie, 1943.
IV
“Nada no mundo se compara à persistência. Nem o talento; não há nada mais comum do que homens malsucedidos e com talento. Nem a genialidade; a
existência de gênios não recompensados é quase um provérbio. Nem a educação; o mundo está cheio de negligenciados educados. A persistência e determinação
são, por si sós, onipotentes. O slogan "não desista" já salvou e sempre salvará os problemas da raça humana.”
Calvin Coolidge
V
Agradecimentos
A Deus por ser meu Refúgio e Fortaleza em todos os momentos de minha vida. Pelas grandes oportunidades que Ele me proporciona.
Ao orientador prof. Dr. Sandro Navickiene pela prestimosa orientação, pelo seu profundo amor ao trabalho e exemplo de profissional responsável. A paciência, conselhos, conversas, discussões e sugestões foram elementos fundamentais nesses dois anos de convivência. A “arte da cromatografia” foi me apresentada de forma tão agradável, que a cada ideia que nos surgiu no decorrer desta pesquisa, nos proporcionou através de nossos estudos e criatividade um trabalho inédito na literatura. Agradeço as horas de leituras gastas neste trabalho. E principalmente, gostaria de agradecer por sempre me estimular o exercício de leitura e estudo para o resto da vida. Sandro, muito obrigada!
A minha amiga carioca Dulce Reinoso, “swing sangue bom” que sempre me cativa e incentiva.
Aos professores doutores que dedicaram o tempo construindo conhecimento na pós-graduação Rennan Araújo, Elisângela Passos, Marcelo Alexandre, Ricardo Freire e Luciane Romão, Alberto Wisniewski e Lisiane Freitas. E principalmente, professor Dr. Haroldo Dórea pela simpatia e sorriso fácil sempre.
Aos colegas de pós-graduação Débora, Marcos, Hugo, Paloma e Tamires que foram importantes no convívio quanto às discussões e opiniões nos diversos trabalhos que apresentamos. E em especial, Michel que foi formidável quanto a minha adaptação na UFS e sempre disposto em ajudar! Obrigada!!
Aos colegas do LCP Luís Fabrício, Érica, Luana, Jandyson, Fernanda, Vitória foi muito bom e fácil conviver com vocês. Tornaram essa tarefa menos árdua. Não tenham dúvidas.
As colegas Nicaellen, Vanessa e Cibelle sem vocês o mestrado não teria sido tão humorado e produtivo. Vocês são imprescindíveis!!
Ao amigo Dr. Wilson Aragão pela apresentação aos pesquisadores da Embrapa. Aos pesquisadores da Embrapa Dra. Joana, Dra. Viviane e Dr. Frederico pela disposição e sugestões ao trabalho.
Aos funcionários, Carina (secretária) e Fábio (bibliotecário) pela competência e generosidade.
Aos meus pais Antonio e Marta pelo incentivo. Meu adorável primo Thiago que sempre está do meu lado. Não há distância que nos separam.
E por fim, Cristina, pela convivência, paciência e amor incondicional.
VI
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................. VIII
LISTA DE TABELAS ................................................................................................ X
LISTA DE ABREVIATURAS OU SIGLAS ............................................................... XI
RESUMO............................................................................................................... XIII
ABSTRACT ........................................................................................................... XIV
1 INTRODUÇÃO. .................................................................................................... 15
2 OBJETIVOS ......................................................................................................... 17
2.1 Objetivo Geral ................................................................................................... 17
2.2 Objetivo Específico ............................................................................................ 17
3 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................ 18
3.1 Importância da cultura do coqueiro ................................................................... 18
3.2 Coco - Características morfológicas e fisiológicas.......... .......... .......... ............21
3.2.1 Principais pragas em coqueiros .................................................................... 29
3.3 Pesticidas .......................................................................................................... 33
3.3.1 Posicionamento de pesticidas nas plantas ..................................................... 35
3.4 Pesticidas selecionados para o estudo ............................................................. 36
3.5 Técnicas de extração para determinação de pesticidas .................................... 39
3.6 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência........................................................... 42
3.7 Trabalhos relacionados à extração de pesticidas em coco ............................... 43
4. PARTE EXPERIMENTAL .................................................................................... 46
4.1 Material.............................................................................................................. 46
4.2 Padrões Analíticos e reagentes químicos ......................................................... 46
4.3 Equipamentos ................................................................................................... 46
4.4 Limpeza de vidraria ........................................................................................... 46
4.5 Preparo da solução padrão dos pesticidas para análise ................................... 47
4.6 Preparação do estipe ........................................................................................ 47
4.6.1 Fortificação das amostras e procedimento de extração por MSPD ......... 48
4.7 Condições cromatográficas de análise .............................................................. 48
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................... 50
5.1 Escolha dos pesticidas ...................................................................................... 50
5.2 Otimização das condições cromatográficas ...................................................... 50
VII
5.3 Otimização das condições de extração ............................................................. 59
5.3.1 Ensaios para otimização das condições de extração de pesticida na matriz
estipe ....................................................................................................................... 59
5.4 Validação do método MSPD para o estipe por HPLC-DAD .............................. 65
5.4.1 Linearidade ..................................................................................................... 65
5.4.2 Seletividade .................................................................................................... 68
5.4.3 Exatidão e Precisão........................................................................................ 69
5.4.4 Limite de detecção (LD) e Limite de Quantificação (LQ) ................................ 71
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................. 73
7 PERSPECTIVAS DO TRABALHO ....................................................................... 74
8 REFERÊNCIAS ................................................................................................... 75
VIII
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Coqueiro variedade Anão.................................................................. 19
Figura 2: Coqueiro variedade Gigante.............................................................. 19
Figura 3: Híbrido de Coqueiro Gigante e Anão................................................. 19
Figura 4: Representação esquemática do caule e raiz em monocotiledônea... 22
Figura 5: Secção transversal da parte basal do estipe do coqueiro................. 24
Figura 6: Corte transversal do estipe em três zonas......................................... 26
Figura 7: Esquema representando a densidade do estipe............................... 26
Figura 8: Estipe com resinose........................................................................... 31
Figura 9: Estipe com resinose e sob do Broca-do-olho.................................... 31
Figura 10: Representação das etapas do procedimento MSPD....................... 44
Figura 11: Esquema da estrutura da fase estacionária da coluna.................... 52
Figura 12: Cromatogramas referentes aos pesticidas analisados em três proporções de solventes (acetonitrila: água) na modalidade isocrática obtido por HPLC-DAD na concentração de 10 µg mL-1 ...............................................
53
Figura 13: Perfil cromatográfico do carbofurano............................................... 54
Figura 14: Perfil cromatográfico do carbofurano............................................... 54
Figura 15: Perfil cromatográfico do β-Ciflutrina................................................. 55
Figura 16: Perfil cromatográfico do β-Ciflutrina................................................. 55
Figura 17: Perfil cromatográfico do difenoconazol............................................ 56
Figura 18: Perfil cromatográfico do difenoconazol............................................ 56
Figura 19: Perfil cromatográfico do espirodiclofeno.......................................... 57
Figura 20: Perfil cromatográfico do espirodiclofeno.......................................... 57
Figura 21: Perfil cromatográfico do tiofanato metílico.......................................
58
IX
Figura 22: Perfil cromatográfico do tiofanato metílico....................................... 58
Figura 23: Perfil cromatográfico obtido por HPLC-DAD referentes aos pesticidas selecionados em solvente acetonitrila:água (65:35 v/v)...................
59
Figura 24: Cromatogramas referentes à eficiência dos adsorventes homogeneizados com o estipe e eluídos em DCM por HPLC-DAD....................................................................................................................
60
Figura 25: Cromatogramas referentes aos pesticidas eluídos em ciclohexano-acetona (80:20 v/v) e analisados por HPLC-DAD....................................................................................................................
61 Figura 26: Avaliação dos diferentes volumes e utilização de coluna auxiliar na extração de pesticidas utilizando a técnica MSPD (Nível de fortificação 2,0 µg g-1).................................................................................................................
62
Figura 27: Avaliação da otimização dos diferentes volumes e massa de adsorvente e matriz na extração de pesticidas utilizando a técnica MSPD. (Nível de fortificação 2,0 µg g-1).........................................................................
63
Figura 28: Avaliação da otimização dos diferentes volumes e massa de adsorvente e matriz na extração de pesticidas utilizando a técnica MSPD. (Nível de fortificação 0,05 µg g-1).......................................................................
64 Figura 29: Curvas analíticas obtidas no solvente acetonitrila e analisados por HPLC-DAD.........................................................................................................
68
Figura 30: Cromatogramas obtidos por HPLC-UV/DAD avaliando a seletividade........................................................................................................
70
X
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Características entre as variedades anã, híbrida e gigante.............. 20
Tabela 2. Principais pragas e doenças em coqueiros....................................... 32
Tabela 3. Características gerais dos pesticidas selecionados para este estudo.................................................................................................................
37
Tabela 4. Propriedades físico-química dos pesticidas selecionados................ 38
Tabela 5. Pesticida e seus produtos de transformação..................................... 39
Tabela 6. Determinação de pesticidas na matriz de coco................................
43
Tabela 7. Diluição dos solventes utilizados na solubilização dos pesticidas..... Tabela 8. Programação da fase móvel no modo gradiente do HPLC-DAD......
47
50
Tabela 9. Fases estacionárias na otimização das condições de análise.......... 51
Tabela 10. Otimização para a extração de pesticida em estipe........................ 63 Tabela 11. Dados da equação da reta, linearidade, intervalo de concentração do método MSPD desenvolvido.........................................................................
66 Tabela 12. Eficiência da recuperação (n=3) e desvio padrão relativo (RSD%) em três níveis de concentrações dos pesticidas estudados em estipe.............
70 Tabela 13. Eficiência da precisão da metodologia intra-dias no nível de fortificação de 0,5 (µg g-1) dos pesticidas estudados em estipe........................
71 Tabela 14. Limite de detecção e quantificação dos pesticidas usando a técnica de extração MSPD e HPLC-DAD..........................................................
72
XI
LISTA DE ABREVIATURAS OU SIGLAS
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
C18 – Fase sólida à base de sílica modificada com gupos octildecil
C8 – Fase sólida à base de sílica modificada com grupos octil
CV – Coeficiente de variação
DCM – Diclorometano
EMBRAPA/CPATC – Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Tabuleiros
Costeiros
FAO – Organização das Nações Unidas de Agricultura e Alimentos
GC-ECD (Gas chromatograph with an electron-capture detector) – Cromatografia
a gás com detector de captura de elétrons.
GC-MS/SIM (Gas chromatograph-mass spectrometry with selected ion monitoring)
– Cromatografia a gás acoplado à espectrometria de massas com íon monitorado
GC-TSD – Cromatografia a gás com detector termoiônico seletivo (Gas
chromatograph with thermionic sensitive detection)
HPLC-DAD – Cromatografia líquida de alta eficiência com detector com arranjo de
diodos (High performance liquid chromatograph with diode array detector)
HPLC-UV – Cromatografia líquida de alta eficiência com detector de ultravioleta
(High performance liquid chromatograph with an ultraviolet detector)
IBAMA – Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Renováveis
IUPAC – União Internacional de Química Pura e Aplicada (Internation Union of
Pure and Applied Chemistry)
Kow – Coeficiente de partição octanol:água
LD – Limite de detecção
LLE – Extração líquido-líquido (Liquid–Liquid Extraction)
LMR – Limite máximo de resíduos
LPME – Microextração fase líquida (Liquid-Phase Microextraction)
LQ – Limite de quantificação
XII
MSPD – Dispersão de matriz em fase sólida (Matrix Solid Phase Dispersion)
P. D – Ponto de degradação
PARA - Programa Nacional de Monitoramento de Resíduos de Agrotóxicos em
Alimentos
pKa – Constante de dissociação
PLE – Extração com líquido pressurizado (Pressurized Liquid Extraction)
RP-HPLC – Cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (reversed-
phase high-performance liquid chromatography)
RSD – Desvio padrão relativo
SBSE – Extração por agitação com barra de sorção (Stir Bar Sorptive Extraction)
SEM - Microscopia Eletrônica de Varredura (Scanning Electron Microscopy)
SINDAG - Sindicato Nacional da Indústria de Produtos para Defesa Agrícola
SPE – Extração em fase sólida (Solid Phase Exctration)
SPME - Microextração em fase sólida (Solid-Phase Microextraction)
UV-Vis – Ultravioleta visível
XIII
RESUMO
A cultura do coqueiro está sujeita ao ataque de pragas e doenças causando
prejuízos aos produtores. Em função disso, a aplicação de pesticidas é ainda uma
das práticas mais utilizadas para o controle destas pragas. No entanto, não existem
trabalhos que comprovam a eficácia para este tipo de controle. Desta forma, este
trabalho propõe o desenvolvimento de metodologia utilizando a técnica de
dispersão da matriz em fase sólida (MSPD) e cromatografia líquida de alta
eficiência com detector de arranjo de diodos (HPLC-DAD), para o estudo dos
pesticidas (carbofurano, β-ciflutrina, difenoconazol, espirodiclofeno e tiofanato
metílico) aplicados no estipe que podem contaminar o fruto, o principal produto
consumido do coqueiro. A metodologia desenvolvida para o estipe por MSPD
utilizou Florisil® como adsorvente e 40 mL de ciclohexano:acetona na proporção
(80:20, v/v) como solvente de eluição. Para os níveis de concentração de 0,05; 0,5;
1,0 e 2,0 µg g-1, os valores médios de recuperação variaram na faixa de 57,5 a
114,3% e os coeficientes de variação de 1,2 a 19,2%. A linearidade variou de
0,9974 a 0,9996 considerando a faixa de 0,04 a 20 µg mL-1. E os valores de limites
de detecção e quantificação variaram entre 0,02 a 0,5 µg g-1. Assim, a metodologia
é eficiente para o estudo de pesticidas aplicados no estipe.
Palavras-chave: pesticidas; estipe; MSPD; Cocos nucifera L; HPLC-DAD.
XIV
ABSTRACT
The coconut is subject to attack by pests and diseases causing losses to
producers. As a result, the application of pesticides is still one of the most
commonly used practices to control these pests. However, there are studies
that demonstrate the efficacy of this type of control. Therefore, this paper
proposes the development of methodology using the dispersion technique of
matrix solid phase (MSPD) and high performance liquid chromatography with
diode array detector (HPLC-DAD) for the study of pesticides (carbofuran, β-
cyfluthrin, difenoconazole, spirodiclofen and thiophanate methyl) applied in the
stem that can contaminate the fruit, the principal product of coconuts
consumed. The methodology developed by the stem MSPD used as Florisil®
adsorbent and 40 mL of cyclohexane: acetone in a proportion (80:20, v/v) as
eluting solvent. For concentrations of 0.05, 0.5, 1.0 and 2.0 µg g-1, the mean
recovery in a range from 57.5 to 114.3% and the coefficient of variation of a 2 to
19.2%. Linearity ranged from 0.9974 to 0.9996 considering the range 0.04 to 20
µg mL-1. And the threshold values for detection and quantification ranged from
0.02 to 0.5 µg g-1. Thus, the method is efficient for the study of pesticide applied
to the stem.
Keywords: pesticides; stem; MSPD; Cocos nucifera L; HPLC-DAD
15
1. INTRODUÇÃO
O coqueiro (Cocos Nucifera L.) é uma das principais frutíferas tropicais
cultivadas no mundo. De origem asiática, é cultivada em mais de 80 países. No
Brasil, a cocoicultura se concentra na região Nordeste, sendo a faixa litorânea
representante de quase toda a produção, pois apresenta condições climáticas
favoráveis ao desenvolvimento dessa palmácea. Além disso, é uma importante
fonte de renda e de alimento para a população, já que tudo é aproveitado: raízes,
folhas, estipe, inflorescência, seiva, palmito e principalmente, o fruto. Destaca-se
a produção de água-de-coco, leite de coco, fibras e coco ralado (SANTOS et al,
2003; VALE et al., 2004). A produção de cocos é liderada pela Bahia, seguida de
Sergipe e Ceará. Em 2009, Sergipe teve uma área de 42.000 hectares, com uma
produção de mais de 270.000 mil frutos, e uma produtividade de 6,64 mil
frutos/hectare (MARTINS & JESUS JÚNIOR, 2011).
Em condições ideais agroecológicos, o coqueiro tipo gigante pode atingir
uma vida útil de aproximadamente 60 a 80 anos com uma produção de 60 a 80
frutos/pé/ano. Em todas as fases de desenvolvimento dos órgãos vitais dessa
planta (folhas, flores, fruto e estipe) podem ocorrer abortamento, atraso no
desenvolvimento, queda prematura, retardo na reprodução e baixa
produtividade/produção, em decorrência da ação de diferentes pragas, que se
não controladas podem levar a planta à morte (FERREIRA, 2009). Dentre elas
destacam-se a broco-do-estipe, traça das flores, lagarta-das-folhas, e doenças
como a resinose e o anel vermelho. Para manter sua rentabilidade elevada os
produtores que empregam práticas convencionais em seus coqueiros se utilizam
de um grande número de defensivos químicos no combate a essas pragas
(FERREIRA, 2002).
Os pesticidas podem permanecer na superfície das plantas após a
aplicação ou mesmo serem absorvidos ou translocados para tecidos distantes do
local da deposição (REIS & BRESOLIN, 2007). O consumo excessivo de
pesticidas gera preocupações com relação aos impactos ao meio ambiente e à
16
saúde humana (ZELIGER, 2011). Para a cultura do coqueiro, a Agência de
Vigilância Sanitária (ANVISA) estabelece normas para garantir a qualidade dos
produtos, seus componentes e afins, tendo em vista, a saúde do consumidor
(COSTA, 2002). Adicionalmente Ferreira (2009), afirma que não há a fiscalização
no controle do uso apropriado de pesticidas na cocoicultura. Grandes partes
destas aplicações de pesticidas são feitos no estipe e não há estudos sobre a
eficiência deste emprego.
Diante disso, este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento e
validação de um procedimento analítico utilizando MSPD e HPLC-DAD para a
determinação de resíduos de pesticidas em estipe. Logo, os parâmetros de
extração, como adsorvente e solvente de eluição foram testados a fim de
melhorar a recuperação e sensibilidade para os cinco pesticidas analisados. Os
resultados foram obtidos através da otimização que incluem escolha do
adsorvente, eluição do solvente, volume de eluição do solvente e proporção do
adsorvente e amostra.
17
2. OBJETIVOS
2.1 – Objetivo Geral
Desenvolver e validar uma metodologia para a determinação de resíduos
de pesticidas no estipe, utilizando as técnicas de dispersão de matriz em fase
sólida (MSPD) e cromatografia líquida com detector espectrofotométrico com
arranjo de diodos (HPLC-DAD).
2.2 - Objetivos Específicos
� Selecionar os pesticidas utilizados para o controle de pragas do
coqueiro;
� Obter as condições otimizadas de análise dos pesticidas
selecionados pela técnica de cromatografia líquida de alta eficiência com
detector espectrofotométrico com arranjo de diodos (HPLC-DAD);
� Desenvolver metodologia analítica para determinação de resíduos
de pesticidas em amostras de estipe por MSPD;
� Validar a metodologia analítica.
18
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1 – Importância da cultura do coqueiro
O coqueiro propagou-se na zona intertropical do globo terrestre e sua
origem ainda não é conhecida. No Brasil, dados históricos evidenciam que a
introdução do coqueiro gigante no Brasil foi efetuada pela colonização portuguesa
em 1553. Foram matrizes procedentes da Ilha de Cabo Verde, e distribuídas no
litoral baiano, daí a denominação de coco-da-baía. O coqueiro, variedade anã, foi
introduzido no Brasil por Artur Neiva e Miguel Calmon, quando regressavam em
1921, de uma viagem ao oriente. Noticiam ainda que em 1925, o coqueiro anão
foi introduzido no Brasil, com as primeiras mudas desembarcadas no Rio de
Janeiro. Já outros autores afirmam que a origem do coqueiro anão é
desconhecida. Estudos apontam que seu crescimento e precocidade decorrem de
uma mutação da variedade gigante, e que provavelmente surgiu pela primeira vez
em Java ou Sumatra, na Oceania (CABOIM NETO, 2002; RIBEIRO, 2009;
SIQUEIRA et al, 2002). No século XIX, com a chegada dos europeus no Pacífico,
o óleo do coco foi o primeiro óleo vegetal a ser comercializado no mundo (CHAN
& ELEVITCH, 2006).
O coqueiro é uma planta da divisão Espermatófita, classe Angiosperma,
sub-classe Monocotiledônea, de ordem Principes (Arecales), família Palmae, tribo
Cocoidae, gênero Cocos e espécie Cocos nucifera L. É uma planta arbórea com
copa densa e elegante, altura em torno de 25 m (variedade gigante). A planta é
monóica (órgãos masculinos e femininos na mesma planta). Com tufo de folhas
(30-35) bem verdes na extremidade, caule indiviso chamado estipe ou espique e
raiz fasciculada. Folha constituída de pecíolo curto e por vários pseudo-folíolos,
com 1-2 anos de vida e 6 m de comprimento. Inflorescência axilar em forma de
cacho com flores femininas globosas. O fruto é uma drupa com parte dura
(endocarpo), camada fibrosa (mesocarpo) e casca lisa (epiderme). Na sua parte
interna encontra-se a “água-de-coco e a amêndoa. O fruto também é conhecido
como noz-semente e semente. As variedades de coqueiro são anão –
representado por tipos com frutos verdes, vermelhos e amarelos, tem
autofecundação e frutos destinados ao consumo de água-de-coco; gigante –
19
também chamado de típico, é predominante, tem altura, polinização cruzada, fruto
verde, cocos destinados à industrialização; e o híbrido – proveniente do
cruzamento natural ou artificial entre gigante e anão (SIQUEIRA et al., 2002;
SEAGRI, 2010; ARAGÃO, W., 2002; LOIOLA et al., 2008; SANTOS et al., 2003).
As Figuras 1, 2 e 3 apresentam os coqueiros mais destinados ao plantio, a
variedade Anão e variedade Gigante e Híbrido.
Figura 1 – Coqueiro variedade Anão Figura 2 – Coqueiro variedade Gigante Fonte:(Martins & Jesus Júnior, 2011) Fonte: (Martins & Jesus Júnior, 2011)
Figura 3 – Híbrido de Coqueiro Gigante e Anão
Fonte: (Martins & Jesus Júnior, 2011).
A Tabela 1 apresenta as principais características botânicas existentes
entres as variedades Anão, Gigante e Híbrido.
20
Tabela 1 - Características entre as variedades anã, híbrida e gigante
Característica Anã Híbrida Gigante
Início Floração (anos) 2 a 3 3 a 4 5 a 7 Vida Útil (anos) 30 a 40 50 a 60 60 a 80 Tamanho do Fruto Pequeno Intermediário/Grande Grande Crescimento Lento Intermediário Rápido Altura (m) 8 a 10 20 35 Produção (fruto/ano) 130 a 150 120 a 150 60 a 80 Peso Fruto (g) 900 1200 1400 Peso Noz (g) 550 800 700
Peso Albúmen (g) 250 400 350 Exigência Edafoclimática
Muito Exigente Exigente Rústico
Destino Produção Água Agroindústria/ Culinária/Água
Agroindústria/ Culinária
Fonte: ARAGÃO et al., (2002)
Para o cultivo da palmácea, o coqueiro necessidade de certas exigências
climáticas, como (a) Temperatura, aproximadamente 27°C, demandando um clima
quente, sem grandes variações de temperatura para o melhor crescimento e
produção. (b) Umidade relativa superior a 60%. (c) Distribuição das chuvas é o
fator que mais importantes no desenvolvimento do coqueiro. (d) Planta altamente
exigente em luz. (e) Ventos fracos e moderados beneficiam o desenvolvimento do
coqueiro por aumentarem sua transpiração, e logo, a absorção de nutrientes e
água pelas raízes (FONTES et al., 2002).
O coqueiro é classificado como uma das plantas oleaginosas mais
importantes do mundo (LORENZI, 2002). Dentre os produtos de maior importância
comercial temos: polpa, fibra, óleo e água-de-coco (COSTA et al., 2005). Nota-se
que a exploração comercial do coqueiro tem crescido nos últimos anos, e em
concordância, há a evolução tecnológica e o avanço de técnicas de cultivo
adequadas possibilitaram em agroecossistemas frágeis, melhores condições de
trabalho aos pequenos produtores em diversas regiões do mundo. Haja vista que,
essas explorações restringem cerca de 90 países, devido às condições ideais
como solos arenosos, umidade adequada, boa precipitação e radiação solar
(MARTINS & JESUS JÚNIOR, 2011).
21
A estrutura botânica do coco é constituída por um fruto do coqueiro, seco
simples, classificado como drupa. Quando completamente desenvolvido apresenta
exocarpo ou epicarpo, mesocarpo, endocarpo, tegumento e albume. A água-de-
coco é conhecida como endosperma líquido, preenchendo toda parte interna do
fruto, com função de nutrir a nova planta quando germinada (FERREIRA NETO,
2005; GOMES & PRADO, 2007).
3.2 – Características morfológicas e fisiológicas
Após a germinação da semente, o coqueiro passará pelo novo estágio de
vida. O desenvolvimento do embrião se inicia com o processo de diferenciação dos
tecidos e definem suas formas e funções que os tornam resistente e nutritiva
(REIS, 2004). Os tecidos vegetais se originam dos meristemas que é o tecido que
origina novas células de qualquer tipo de célula especializada do corpo vegetal. Já
no início do desenvolvimento vegetal podem ser observados o meristema apical
caulinar (caule) e meristema apical radicular (raiz). Os tecidos vegetais formam três
importantes sistemas de tecido: (a) sistema de revestimento (epiderme, proteção);
(b) sistema vascular (condução de seiva, xilema e floema); (c) sistema fundamental
(sustentação, preenchimento, fotossíntese). O sistema vascular é envolvido pelo
sistema fundamental e o sistema dérmico reveste a planta. (GLÓRIA &
GUERREIRO, 2006).
(a) Sistema de revestimento: É a epiderme, e está em contato com o
ambiente, sujeita a modificações estruturais, impedindo a ação dos choques
mecânicos e a invasão de patógenos, restringindo a perda de água. Realiza trocas
gasosas, absorve água e sais minerais, protege contra a ação da radiação solar
(ALQUINI et al., 2006).
(b) Sistema vascular: Os feixes vasculares liberolenhosos são
distribuídos desordenadamente. São tecidos contínuos de todos os órgãos das
plantas vasculares responsáveis pelo: (1) xilema, transporte de água e solutos à
longa distância, armazenamento de nutrientes e suporte mecânico, formado
principalmente por elementos condutores, fibras e células parenquimáticas
(COSTA et al., 2006). (2) Floema é responsável pela condução de materiais
inorgânicos e orgânicas, como água, carboidratos na forma de sacarose,
22
substâncias nitrogenada como aminoácidos e amidas, lipídios, ácidos orgânicos,
ácidos nucléicos, substâncias reguladoras de crescimento, vitaminas e íons
inorgânicos (MACHADO & GUERREIRO, 2006).
(c) Sistema fundamental: São representados pelos tecidos celulares
como: (1) parênquima que pode desempenhar atividades essenciais na planta
como fotossíntese, reserva, transporte, secreção e excreção. Suas células
compõem celulose, hemicelulose e substâncias pécticas e distingue em três
subdivisões: preenchimento, clorofiliano e de reserva. (2) Colênquima, possibilita o
crescimento de órgão ou do tecido e função de sustentação até atingir a
maturidade. É constituído por celulose, água (60% do peso) e substância pécticas.
(3) Esclerênquima é um tecido de sustentação presente nas camadas mais
internas e periféricas dos órgãos primários e secundários da planta. Pode funcionar
como camada protetora ao redor do caule, sementes e frutos imaturos evitando
que insetos e animais se alimentem. Na parte secundária é composta por celulose,
substâncias pécticas, hemicelulose e aproximadamente 35% de lignina (SCATENA
& DIAS, 2006). A Figura 4 apresenta um esquema das partes do estipe e raiz em
monocotiledôneas.
Figura 4 – Representação esquemática do caule e raiz em monocotiledônea. No caule, o floema (1) e o xilema (2) estão juntos formando feixes; na raiz, estão alternados formando cordões. Nas
monocotiledôneas, o caule possui os feixes vasculares desorganizados; a raiz apresenta medula (3). O periciclo (4) delimita externamente o cilindro vascular.
Fonte: (GLÓRIA & GUERREIRO, 2006).
Estipe, espique ou estípite é o caule ou tronco de diferentes espécies de
palmeiras que apresenta variadas formas, tamanhos, volumes e texturas,
23
terminando em um meristema apical, onde ocorre o ponto de crescimento da
planta, que é responsável pelo surgimento das folhas. Diferente das árvores, o
estipe não engrossa com o passar do tempo, pois a maioria dessas espécies
alcança o diâmetro máximo antes que comece a crescer em altura. Os anéis
externos são cicatrizes provenientes do desprendimento das bainhas e permitem
calcular sua idade. A textura e forma do estipe define a característica marcante da
família (SODRÉ, 2005).
O estipe é tropicamente adaptado para sobreviver e resistir à ação de ventos
fortes que o flexiona ao invés de quebrar. Sua estrutura tubular resultante da
densidade de seu córtex e intercaladas fibras vasculares, formando uma espessa
barreira exterior em torno do núcleo que sofre uma compressão sem fraturar
quando o vento os flexiona. Além das propriedades vitais de conduzir seiva e sais
minerais para a planta, o estipe maduro torna-se uma madeira valiosa utilizada na
construção e no fabrico de materiais ornamentais (NAIR, 2010).
A característica primordial anatômica do estipe é a estrutura cônica lenhosa
consistindo numerosos feixes vasculares dispersos dentro do tecido. O diâmetro
dos feixes vasculares diminui a partir da base para o topo e para as partes
periféricas. A densidade dos feixes vasculares aumenta do núcleo para a periferia e
da base para a parte superior. A área dos feixes vasculares e da fibra são maiores
nas partes externas que nas partes internas no cilindro central. O número de
camadas da parede secundária nas fibras das células do tronco é menor que nas
fibras das células das posições correspondentes do núcleo do tronco estreito. E
neste processo de crescimento que é formado a célula do xilema em unidades e o
floema para fora. As fibras possuem o longo ciclo de vida da palmeira, tendo a
capacidade de produzir novas camadas de células da parede adicionais
secundárias à medida que o coqueiro amadurece. Esta é a explicação para a
rigidez e densidade do estipe. O padrão do espessamento lateral em
monocotiledôneas não é compreendido devido à grande variação dentro da sub-
classe (KUO-HUANG et al., 2004). Uma característica importante do coqueiro é o
comprimento do estipe, pois apresenta variabilidade genética em trabalhos de
melhoramento genético (LOILA et al., 2008).
24
As fibras são encontradas nas formas de feixes em diferentes partes do
corpo primário da planta e tem como função principal sustentar as partes do
vegetal que não se alongam mais e podem fazer parte do xilema ou do floema.
Assim, podem armazenar amido, óleos, resinas e cristais, suprindo período de
eventuais estresses (SCATENA & DIAS, 2006). A Figura 5 apresenta uma secção
transversal da parte basal do estipe do coqueiro, destacando a densidade, os
feixes vasculares, a parte externa e interna do estipe e fibras das paredes
secundárias em camadas no córtex e a orientação dos feixes vasculares.
Figura 5. (a) Parte de secção transversal do estipe de coqueiro Cocos nucifera L.. (a) A densidade dos feixes vasculares aumentou significativamente a partir do núcleo para a periferia. (b) Os feixes
vasculares no córtex, (c) feixes vasculares na parte externa central do estipe, e (d) feixes vasculares na parte interna central do estipe. (e) Secção transversal de células de fibra por SEM (Scanning
Electron Microscopy) Microscopia Eletrônica de Varredura que mostram uma parede secundária em camadas das fibras no córtex. (f) Secção transversal das células da fibra por SEM (Microscopia
Eletrônica de Varredura) mostrando através dos pontos 3 e 4 camadas das paredes secundárias das fibras na parte exterior central do estipe. Escala = 0,3 mm (b, c, d), 6 mM (e), e 10 uM (F). (h)
Parte de uma prancha diametral radial do estipe mostrando a orientação de feixes vasculares. Fonte: Kuo-Huang et al. (2004).
25
A Figura 6 mostra um corte transversal no estipe indicando três distintas
zonas. A Figura 7 ilustra um corte de uma secção transversal e ao longo da altura
da haste que o estipe é classificado sua densidade entre leve e pesada devido à
sua heterogeneidade.
Figura 6. Corte transversal em três zonas: Figura 7. Esquema representando a densidade (D) dérmica; (S)sub-cutânea e (C) zona central. do estipe. A: (baixa densidade); B: média Fonte: Oduor & Githiomi (2010) densidade e C: alta densidade. Fonte: Oduor & Githiomi (2010)
As propriedades físicas do estipe estão ligadas à umidade, densidade e
contração. A umidade está relacionada com o aumento da altura do caule e diminui
a partir do núcleo para o córtex. A densidade está vinculada ao peso e a contração
à estabilidade do teor de umidade do ponto de saturação da fibra do estipe
(ARANCON JUNIOR, 1997).
O estipe é um material de densidade heterogênea, e sua variabilidade
estrutural e química pode dificultar a extração de extrativos por solventes, devido
principalmente a sua permeabilidade e densidade. Além disso, sua complexidade
quanto à composição química podem dificultar a purificação e caracterização de
seus constituintes. Os principais elementos químicos existentes na composição
química do caule são: carbono, oxigênio, hidrogênio e o nitrogênio. Por sua vez, as
principais substâncias macromoleculares constituintes da parede celular são:
polioses (hemiceluloses), celuloses, extrativos e lignina (KLOCK et al., 2005). O
quadro esquemático abaixo apresenta a composição química da madeira:
26
Fonte adaptada: (KLOCK et al.,2005).
A composição química do estipe do coqueiro é caracterizada por pentosanas
(22,9%), lignina (25,1%) e holocelulose (66,7%) (ARANCON JUNIOR, 1997). Já
para KHALIL et al., (2006) a composição química é distribuída nos seguintes
valores porcentuais: holocelulose (56,3%); �-celulose (44,2%), cinzas (2,2%),
lignina (32,8%) e extrativos (6,4%) (KHALIL et al., 2006). Os extrativos da madeira
são formados por compostos químicos que representam apenas uma pequena
parte da madeira. Pode ser removido por solventes ou ácidos as substâncias:
aromáticas, alifáticas, nitrogenadas, glicosídeos, terpenos, esteroides e
carboidratos entre outros. Porém, são fatores importantes para as propriedades
físicas das madeiras (KLOCK et al., 2005; SEBIO-PUÑAL et al., 2012).
A holocelulose é um dos componentes majoritários no estipe. É formado
pela soma de carboidratos presentes na fibra compostas por hemicelulose e
celulose. É constituída pela fração total de polissacarídeo de biomassas em
extratos livres. (RABEMANOLONTSOA & SAKA, 2012). Segundo Klock et al.,
(2005), holocelulose é o termo indicado para produto obtido depois da remoção da
lignina da madeira. Para Sebio-Puñal et al., (2012), a holocelulose é a combinação
de hemicelulose (misturas de polissacarídeos ou polioses) e celulose (polímero
glucano). A hemicelulose e lignina são amorfas, enquanto a celulose é altamente
cristalina. Conforme Tomczak et al., (2007), as fibras celulósicas possuem níveis
de orientação em que as moléculas se encaixam muito próximas, chamadas de
regiões cristalinas e são pontos que um solvente apresenta dificuldade de
Madeira
Matéria
Orgânica
Matéria Inorgânica Polissacarídeos Lignina
Celulose Polioses Cinzas Extrativos
Substâncias
macromoleculares
Substância de baixa
massa molecular
27
penetração. Em contraste, em regiões amorfas são suscetível à penetração de
solvente.
Segundo Atkins & Jones (2006), o que mantêm as árvores de pé são as
fortes interações intermoleculares constituídas por ligações de hidrogênio
existentes entre as moléculas de celulose, em forma de fita. Caso isso não
ocorresse, as árvores cairiam. Para Tomczak et al., (2007), a celulose é composta
apenas de glicose, enquanto as hemicelulose são composta por açúcares que
formam várias estruturas poliméricas, podendo ligar a porção de lignina ou
celulose. As polioses são divididas em hexosanas e pentosanas. Adicionalmente
Marabezi (2009), as polioses são unidades de açúcares. Os polímeros formados
pela condensação de pentoses formam as pentosanas, que não apresenta
composto químico definido, mas uma classe de compostos poliméricos com
componentes contendo propriedades características. Segundo Scatena & Dias
(2006), a lignina fornece um revestimento estável, é inerte e evita os ataques
biológicos, químicos e físicos, formada pela polimerização de vários álcoois, como
o sinaptil, coniferil e p-coumaril. Conforme Klock et al., (2005), as ligninas são a
fração não-carboidrato da madeira livre de extrativos, difíceis de caracterizar e
extremamente complexas.
As propriedades dos materiais celulósicos são determinados pelo grau de
polimerização da celulose. Portanto, celuloses com cadeias longas são
denominadas de �-celulose. Celulose com graus de polimerização menores é
denominado de β-celulose, seguido pela hemicelulose (TOMCZAK et al., 2007).
Para Klock et al. (2005), �-celulose é um termo dado por Cross e Bevan em 1912
para a celulose da madeira que é insolúvel numa solução concentrada de NaOH.
O sistema radicular do coqueiro é fasciculado, e surge da base do seu
tronco. Possui raízes primárias (mais grossas) que são responsáveis pela
capacidade de absorção de nutrientes e água, e principalmente, a função de
fixação da planta no solo. As raízes secundárias partem das primárias, de onde
originam as terciárias e destas as radicelas, medindo de 1 a 3 mm de diâmetro e
são as principais raízes de absorção do coqueiro (MIRANDA et al., 2003). As folhas
formam a coroa da palmeira e são aspectos importantes, pois influencia a forma e
28
o comportamento da coroa em diferentes fases da vida da palmeira. A folhagem
quando surge, também chamada de fronde, emerge verticalmente a partir do único
ponto de crescimento e quando compactada em conjunto há a falta de clorofila que
se transforma à medida que se as folhas se desdobram em ângulos de arranjo em
torno do eixe da haste (NAIR, 2010).
O produto mais comercializado do coqueiro é a fruto e tudo pode ser
aproveitado, principalmente a água-de-coco. É formada como uma estratégia
ecofisiológica do coqueiro, pois, em períodos de eventuais estresses ambientais, o
coqueiro armazena substâncias nutritivas para serem utilizadas como mecanismo
de sobrevivência da espécie na nutrição do embrião durante a germinação das
sementes ou da plântula (ARAGÃO et al., 2005).
A água-de-coco é um líquido rico em nutrientes, solução ligeiramente ácida,
contendo sais, proteínas, gorduras neutras, açúcares e vitaminas, além de ter
substâncias promotoras do crescimento (fitormônios) e algum fosfolipídeo (MA et
al., 2008; DEBMANDAL & MANDAL, 2011). É caracterizada por ser uma solução
estéril, contendo mais de 90% de água. A composição dos aminoácidos da água-
de-coco é semelhante à do leite. Em países que apresentam déficit nutricional
elevado, a água-de-coco é empregada para substituir proteínas, vitaminas e
minerais (CARVALHO et al., 2006; SILVA et al., 2006), utilizada como solução de
hidratação oral consumida diariamente como suplemento protéico. Em outras
situações, foi empregada como soro fisiológico através de uma reidratação por via
intravenosa e reposição eletrolítica (VIGLIAR et al., 2006).
Há pouco tempo, o consumo de água-de-coco era associado ao lazer e às
férias nas praias do litoral nordestino. Ultimamente, a esses conceitos foram
associados outros valores, como: saúde, vida saudável e atividade física (SILVA,
2008). Estudos compararam a composição química da água-de-coco aos chás,
refrigerantes com e sem gás, bebidas isotônicas e solução de reidratação oral. A
água-de-coco compete no mercado de bebidas isotônicas e de refrigerantes
(VIGLIAR, 2006).
Associado a essa ideia de consumo contribuíram também com a
descentralização do cultivo, processamento industrial, exportações e pelas
29
alternativas disponíveis no mercado. Para o consumo da água-de-coco, é
necessária a extração do líquido localizado no interior do fruto. As opções de
consumo podem ser classificadas em dois grandes grupos: (a) “in natura” – a água-
de-coco é consumida diretamente no fruto e (b) envasado – a água-de-coco é
processada industrialmente e acondicionada em embalagem (SILVA, 2008). O
consumo de água-de-coco tem aumentado de forma expressiva, cerca de 500
milhões de litros, sendo que 7% são exportados. A grande dificuldade de
exportadores e envasadores é quanto à estocagem, o que implicou estudos
tecnológicos de engenharia e controle no processo quanto à qualidade (ABREU &
FARIA, 2007).
Na medicina, os pacientes desidratados ou os atletas com exaustão física
fazem uso da água-de-coco para reposição de potássio. Na Biotecnologia é usada
na conservação de sêmen de caprino, ovino, suíno e aves, na indução de
diferenciação de células entre outras aplicações (ARAGÃO et al., 2005). Ainda, há
o uso em outras áreas como a nutrição, que juntos totalizam de 100 a 350 milhões
de litros por ano, com taxa de crescimento anual de aproximadamente de 20%
(MARTINS & JESUS JÚNIOR, 2011).
3.2.1 – Principais pragas em coqueiros
No Brasil, a produtividade média do coqueiro é consequência de vários
fatores, como o plantio de variedades adequadas, distribuição regular de chuvas, o
manejo da cultura, e, também, ocorrência de pragas e doenças (GASPAROTTO et
al, 2005). O controle recomendado para a doença sugere a retirada das áreas
lecionadas do estipe, seguida de tratamento com o pesticida e a cobertura da área
tratada é realizada com alcatrão vegetal ou piche (FERREIRA et al., 2010).
Uma das doenças que afeta a produtividade do coqueiro é denominada
resinose, causada pelo fungo, o fitopatógeno Thielaviopsis paradoxa, cujo
anamorfo do ascomiceto é Ceratocystis paradoxa (De Seynes) Moreau. No Brasil,
em 2004 foi registrada a ocorrência deste fungo e a manifestação da doença tem
se disseminado aumentando o número de coqueiros infectados e de focos nas
propriedades a cada ano. No Brasil, pela observação da sintomatologia confirmada
pela exsudação da seiva que escorre pelo estipe do coqueiro, essa doença foi
30
chamada de resinose. Em outros países esta doença é denominada “stem
bleedind”, que significa “sangramento do caule” (HARRISON & JONES, 2003). As
plantas doentes apresentam exsudação de seiva no estipe e encurtamento das
folhas novas. Através da dissecação do tecido vegetal foram examinadas lesões
necróticas nas raízes e a presença de lesões amarronzadas na região interna do
tronco e analisado no Laboratório de Fitopatologia da Embrapa Tabuleiros
Costeiros. Plantas sadias, quando inoculadas, tiveram desenvolvimento de lesões,
demonstrando a patogenicidade do fungo isolado (WARWICK et al., 2004;
WARWICK & PASSOS, 2009).
A partir de 2004, a produção brasileira de coco passa por dificuldades devido
à ocorrência da resinose no estipe, cuja ação está causando sérios prejuízos aos
produtores. O fungo envolvido com a resinose atua no bloqueio dos vasos
condutores de seiva, podendo sobreviver por longos períodos no solo e nos restos
de culturas em decomposição, causando infecção de ferimentos e das fissuras
naturais de crescimento do tronco. Atribui-se à ocorrência da resinose à fragilidade
da planta após fatores estressantes, tais como: severas chuvas seguidas de
estresse hídrico, desequilíbrio nutricional, excesso de salinidade, e ao oportunismo
devido à ocorrência de outras doenças ou pragas que enfraquecem as plantas e
permitem a ação do fungo. Os principais sintomas da doença é o aparecimento de
uma exsudação de um líquido marrom-avermelhado que escorre através de
rachaduras no tronco (ponto de infecção do patógeno), que com o tempo exposto
ao ar, pode secar o líquido da coloração avermelhado passando a escurecer. Além
do crescimento foliar reduzido, diminuição na produção e em alguns casos, após
quatros meses, à morte das plantas infectadas (CARVALHO et al., 2011; NELSON,
2005).
No Platô de Neópolis, (Neópolis-SE), mais de 79% dos coqueirais são
formados pelo coqueiro anão-verde. Por se tratar de um material genético mais
homogêneo, tem demonstrado maior suscetibilidade às doenças em geral
(FONTES & WANDERLEY, 2006). Não existem relatos de produtos químicos
capazes de curar a resinose em plantas com sintomas avançados da doença ou
evitar sua dispersão na planta. Portanto, recomenda-se atualmente a erradicação
mecânica e, a queima para a destruição das plantas severamente infestadas,
31
retirando o máximo de raízes, evitando a propagação da doença, principalmente
pelo vetor da doença, o inseto broco-do-olho (Rhynchophorus palmarum) (PARRA
et al., 2003). A broca-do-olho é hospedeiro natural nas palmeiras (Arecaceae), pois
é sua fonte de alimento e realiza seu ciclo de vida (FENWICK, 1962). As figuras 8
e 9 apresentam o estipe infectado com resinose e a infestação de outra praga,
Broca-do-olho.
Figura 8 – Estipe com resinose Figura 9 – Estipe com resinose e o Broca-do-olho do coqueiro. Fonte: Ferreira et al., (2007) Fonte: Ferreira et al., (2007)
Segundo Griffith (1968) (1987), na área da coroa do estipe os adultos são
frequentemente localizados e as fêmeas fazem perfurações na porção mais macia
para ovipositar e se alimentar. Já foi comprovado que a broca-do-olho está
envolvida na dispersão de outra doença letal ao coqueiro, denominada “anel-
vermelho” (GERBER & GIBLIN-DAVIS, 1990; MORALES & CHINCHILLA, 1990).
Em plantas que apresentam esses sintomas são frequentemente encontrados
outros coleópteros, como Xyleborus spp., Rhinostomus barbirostris e
Parisoschoenus obesulus, e carecem ser pesquisados em relação à
transmissibilidade do patógeno. As áreas de produção de cocoicultura de Sergipe,
Bahia e Paraíba estão severamente infectadas por T. Paradoxa e apresentam uma
alta infestação de R. Barbirostris. Isso indica uma possível interação praga x
patógeno quanto à propagação da doença (FERREIRA et al., 2007).
Com a implantação do projeto de fruticultura irrigada, a cultura do coco anão
foi fixada numa área de 7,5 m² em Platô de Neópolis, situado no Baixo São
Francisco em Sergipe. Em 2005, foram contabilizados 30.310 plantas, das quais
25.811 está em produção e 4.499 não produzem frutos, com 2.930,270 frutos/ano.
32
Após, o ataque do patógeno T. paradoxa a produção caiu para 2.794,790
frutos/ano, uma perda considerável de 4% (CINTRA et al., 2009; MEDEIROS,
2010).
Os surtos de pragas em coqueiros em coqueiros são favorecidas por
múltiplos fatores, tais como: (a) emissão contínua e mensal de inflorescências que
dão origem aos cachos dos frutos; (b) produção contínua e mensal de folhas e a
permanência prolongada dessas estruturas vegetais na planta; (c) e o não
sincronismo das emissões florais dentro da plantação, o que torna o coqueiro
bastante suscetível à ação de diversas espécies-pragas. Associados a esses
fatores os surtos são também favorecidos pela utilização indiscriminada de um
grande número de pesticidas no combate as pragas (FERREIRA & MICHEREFF
FILHO, 2002). As principais pragas e doenças que atacam a cultura do coqueiro
estão apresentados na Tabela 2.
Tabela 2. Principais pragas e doenças em coqueiros
Pragas Nome científico Broca-do-olho-do-coqueiro ou bicudo Rhynchophorus palmarum Linnaeus Broca-do-estipe, broca-do-tronco rhina Rhinostomusbarbirostris Fabricius Broca-do-pecíolo ou broca-da-ráquis foliar
Amerrhinus ynca Sahlberg
Broca-da-coroa-foliar; broca-do-dendezeiro
Eupalamides daedalus Cramer
Lagarta-das-folhas Brassolis sophorae Linnaeus Barata-do-coqueiro ou falsa-barata-do-coqueiro
Coraliomela brunnea Thumberg
Traça das flores e frutos novos Hyalospila ptychis Dyar Gorgulho-das-flores-e-dos-cocos-novos Parisoschoenus obesulus Casey
Ácaro-da-necrose-do-coqueiro Aceria guerreronis Keifer Ácaro da mancha-anelar do coqueiro Amrineus cocofolius Flechtmann
Pragas secundárias
Cochonilha transparente Aspidiotus destructor Signoret Pulgão-preto-do-coqueiro Cerataphis lataniae Boisduval Raspador-do-folíolo Delocrania cossyphoides Guérin
Broca-do-bulbo Strategus aloeus Linnaeus
Doenças
Resinose Anel vermelho Rhadinaphelenchus cocophilus Helmintosporiose Drechslera incurvata Murcha de Fitomonas Protozoário Phitomonas sp. Lixa Sphaerodothis acrocomiae – Lixa grande
Phyllachora torrendiella – Lixa pequena Queima das folhas Botryosphaeria cocogena
Fonte: Ferreira & Michereff Filho (2002); Costa et al., (2005).
33
Em todas as fases de desenvolvimento dos órgãos vitais do coqueiro, como
folhas, flores, fruto e estipe, podem ocorrer abortamento, atraso no
desenvolvimento, queda prematura, retardo na reprodução, baixa
produtividade/produção, sofrendo várias ações de diferentes espécies-pragas, que
se não tratadas levam à morte da planta (FERREIRA, 2009). Somam-se 37 países
que desenvolvem Pesquisa e Desenvolvimento (P&D) para o aprimoramento,
proteção e avanços nos processos tecnológicos da espécie, contendo instituições
governamentais, não-governamentais e sem fins lucrativos. No Brasil, destaca-se a
Embrapa Tabuleiros Costeiros (CPATC) em Aracaju/SE como referência e líder no
desenvolvimento para a cadeia produtiva do coqueiro (NAIR, 2010).
3.3 – Pesticidas
Segundo o Código Internacional de Conduta na Distribuição e Uso de
Pesticidas da FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations, 2006):
“Pesticidas, qualquer substância ou mistura de substâncias destinadas a prevenir, destruir ou controlar qualquer praga, incluindo vetores de doença humana ou animal, as espécies não desejadas de plantas ou animais que causam danos durante ou interferindo com a produção, processamento, armazenamento, transporte ou comercialização de alimentar, produtos agrícolas, madeira e produtos de madeira ou alimentos para animais, ou substâncias que podem ser administrados a animais para controlo de insetos, aracnídeos ou outras pragas em ou sobre os seus corpos. O termo inclui substâncias destinadas para uso como um regulador de crescimento da planta, desfolhantes dessecante, ou o agente para o desbaste de frutos ou prevenir a queda prematura de frutos, e as substâncias aplicadas a culturas, quer antes ou depois da colheita para proteger o produto de degradação durante o armazenamento e transporte.”
“Resíduos significam quaisquer substâncias mencionadas ou em produtos alimentares, produtos agrícolas ou ração animal resultante da utilização de um pesticida. O termo inclui quaisquer derivados de um pesticida, tais como produtos de conversão, metabólitos, produtos de reação e impurezas considerados de importância toxicológica. O "resíduo de pesticidas" termo inclui resíduos de fontes desconhecidas ou inevitável (por exemplo, ambientais), bem como utilizações conhecidas da substância química.”
34
Estes compostos podem ser classificados conforme o uso, modo de ação e
estrutura química (WARE & WHITACRE, 2004), indicando a sua eficiência no
controle de doenças e pragas que atacam as culturas agrícolas. Seu
comportamento é orientado por processos de transformação, retenção e transporte
(PESSOA et al., 2004).
O uso de pesticidas tem como meta o controle de doenças e pragas que
preocupam em decorrência dos impactos no meio ambiente e na saúde humana
(DEHGHANI et al., 2012). Desta forma, existem vários métodos de pulverizar o
pesticida, tais como: (a) Pulverizador costal (MOZAFFARI et al., 2010) (b) Trator
com pulverizador hidráulico (YASIN, 2012), (c) Avião pulverizador (WANG et al.,
2012). Com a eficiência dos métodos de pulverização, estudos são realizados para
a eficiência do tamanho, concentração de princípio ativo, que é a parte biológica
ativa do pesticida e, quantidade de gotas a serem pulverizadas (BRETTHAUER et
al., 2011). Essas pulverizações quando aplicados em grande quantidade, em áreas
bastante extensas, são dispersos e podem ter persistência no meio ambiente
(WANG et al., 2012). Os impactos ambientais trazem a contaminação do ar, a
percolação de resíduos de pesticidas nos lençois freáticos e aquíferos e confere
uma questão de saúde pública e interferência na cadeira alimentar (FOO &
HAMEED, 2010). Além de apresentar efeitos adversos de curto e longo prazo
sobre os trabalhadores agrícolas que fazem a exposição por contato dérmico,
ingestão e inalação de pesticidas (LESMES-FABIAN et al., 2012).
Os pesticidas químicos são compostos ativos e em concentração elevada
possuem toxicidade para espécies-alvo. Desta forma, os pesticidas incluem o
emprego químico: inseticidas, fungicidas, rodenticidas, conservantes de madeira,
herbicidas. É comum a exposição humana em níveis elevados de pesticida nos
ambientes profissionais e como resíduos em alimentos. Essa exposição pode
resultar efeitos agudos e tardios, incluindo: doença de Parkinson, leucemia,
linfomas e câncer no estômago, sarcomas de tecidos moles e do cérebro
(BOLOGNESI & MERLO, 2011). Para o domínio da exposição da saúde humana
frente aos resíduos de pesticidas presentes em alimentos, foi criada a agência com
programa monitoramento de resíduos que estabelecem os limites máximos de
resíduos (LMR) de pesticidas em alimentos. No Brasil, destaca-se a Agência
35
Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), que é responsável pelo Programa
Nacional de Monitoramento de Resíduos de Agrotóxicos em Alimentos (PARA)
(ANVISA, 2011; TIRADO et al., 2010). Conforme o Sindicato Nacional da Indústria
de Produtos para Defesa Agrícola (SINDAG) (2010), para que um defensivo seja
utilizado pelo agricultor é necessário que seja registrado. É um rigoroso processo,
envolvendo a aprovação pelos Ministérios da Agricultura, da Saúde (ANVISA) e do
Meio Ambiente (IBAMA).
A população tem se preocupado com a contaminação ambiental, exigindo
alimentos isentos de resíduos de pesticidas. O mercado vem oferecendo produtos
agrícolas com selo de produto orgânico que significa, sem o uso de pesticidas, ou
produzidos em sistemas em que os pesticidas foram utilizados corretamente
(FERREIRA, 2009). O Brasil carece de informações sobre intoxicações por
pesticidas, devido à ingestão acidental ou intencional e o uso seguro de pesticidas
durantes atividades ocupacionais (CALDAS, 2011). A falta de fiscalização, o
contrabando/falsificação e o comércio ilegal de pesticidas preocupam vários
segmentos da população brasileira. Produtores atraídos por economia adquirem
produtos genéricos oriundos de países como a China, Índia, tendo o Paraguai
como porta de entrada na América do Sul (DORFMAN & REKOWSKY, 2011).
Segundo o SINDAG (2010), o desenvolvimento de um novo pesticida, inicia-
se com 200.000 moléculas e um investimento de US$ 300 milhões. Para que um
novo pesticida seja lançado no mercado são necessários aproximadamente 12
anos de pesquisa, envolvendo as áreas de Química, Biologia, Agronomia,
Toxicologia e Meio Ambiente. De acordo com Bolognesi & Merlo (2011), antes da
comercialização, os pesticidas são regulamentados conforme suas propriedades de
comportamento físico-químicas, ecotoxicológicas, toxicológicas e são avaliados o
destino por agências internacionais e governamentais, de forma a certificar as
normas de segurança.
3.3.1 – Posicionamento de pesticidas nas plantas
Os pesticidas podem ser classificados com relação ao seu posicionamento
na planta. São considerados, como: (a) tópicos, imóveis ou não sistêmicos, os
36
pesticidas que não são absorvidos ou translocados, permanecendo na superfície
da planta onde foram depositados. (b) Mesostêmicos são pesticidas que
apresentam afinidade com a superfície foliar podendo ser absorvidos e formar um
depósito na superfície do órgão suscetível. (c) Loco-sistêmicos, de profundidade ou
translaminares são pesticidas translocados a distâncias pequenas a partir do ponto
de deposição. (d) Sistêmicos ou móveis são pesticidas que são absorvidos e
translocados pelo sistema condutor da planta via xilema e/ou floema. Estes têm a
habilidade de serem redistribuídos dentro dos órgãos a serem tratados (REIS &
BRESOLIN, 2007).
3.4 – Pesticidas selecionados para o estudo
A seleção dos pesticidas para este trabalho foi feita em consonância com os
pesquisadores da Empresa Brasileira de Agricultura e Pecuária (EMBRAPA) -
Tabuleiros Costeiros, Aracaju-SE. Esta instituição trabalha com a cocoicultura e
está diretamente associada à pesquisa desta matriz e com produtores,
apresentando vários trabalhos no combate a pragas e doenças, que tem emprego
intensivo no cultivo de coco no Estado de Sergipe.
A Tabela 3 relaciona os pesticidas selecionados para este estudo,
apresentando uma classificação de acordo com o grupo químico, posicionamento
em planta, toxicidade, e limite máximo de resíduos (LMRs) para a cultura do
coqueiro, fórmula química e estrutura molecular dos pesticidas. As caracteristícas
gerais das propriedades fisico-químicas dos pesticidas selecionados relacionados
ao meio ambiente são apresentados na Tabela 4.
37
Tabela 3. Características gerais dos pesticidas selecionados para este estudo Pesticida Emprego/
Grupo Químico Posicionamento
em plantas Toxici-dade1
LMR2
(µg g-1) Estrutura Química Fórmula
Química Absorção máxima UV-
Vis³ (L mol-1
cm-1
)
Carbofurano Inseticida, nematicida/ Carbamato
Sistêmico I -
O CH3
CH3
OCONHCH3
C12H15NO3 - Solução neutra: 276nm, 290 nm. - Solução básica e ácida: Não significa diferença no espectro.
β-Ciflutrina Inseticida/ Piretróide
Não sistêmico II -
C22H18Cl2FNO3 Não absorve acima
de 290nm
Difenoconazol Fungicida/ Triazol Sistêmico I 0,1
O
OCH 3
ClO
Cl
CH 2
N
N
N
C19H17Cl2N3O3 - Ácido: 215nm, 235nm, 275nm;
-Neutro: 215nm, 235nm, 275nm;
-Alcalina: 220nm, 235nm, 275nm
Espirodiclofeno Acaricida/ Cetoenol
Não sistêmico III 0,05
Cl
Cl
O
OO
C
O
C
CH3
CH3
CH2CH3
C21H24Cl2O4
- Solução neutra 201nm
- Não absorve 300-
400nm;
Tiofanato metílico Fungicida/ Benzimidazol
Sistêmico III - NHCSNHCO 2CH 3
NHCSNHCO 2CH 3
C12H14N4O4S2 305nm
1Classe toxicológica: I – extremamente tóxico, faixa vermelha; II – altamente tóxico, faixa amarela; III – medianamente tóxico, faixa azul; IV – pouco tóxico, faixa verde. 2Limite Máximo de Resíduos em coco. Fonte: ANVISA (2011); ³IUPAC (2011).
38
Tabela 4. Propriedades físico-química dos pesticidas selecionados Pesticida Massa
molecular (g mol-1)
P.D.1 (°C)
V.P.2 (mPa)
Lei Constante de Henry
Pa (m³ mol-1)
Log Kow3
pKa4 (25°C)
Solubilidade em
água (mg L-1)
Solubilidade em solventes orgânicos
20oC (mg L-1)
Carbofurano 221,2
276
8,0x10-2
5,0x10-5
1,8
- 322
N-Heptano – 110 Metanol – 71.700 Acetato de etila – 61.500 Acetona – 105.200
β-Ciflutrina 432,2 210 5,6x10-5 8,10 x 10-3 5,9 - 0,006 Tolueno – 2.000.000 N-Hexano – 10.000 Diclorometano – 200.000
Difenoconazol 406,2 337 3,3x10-5 9,0x10-7 4,36 1,07 15,0 Etanol – 330.000 Acetona – 610.000 Tolueno – 500.000 N-Hexano – 3.400
Espirodiclofeno 411,3
-
3,0x10-4
2,00x10-2
5,83
- 0,05
N-Heptano – 20.000 Acetato de etila – 250.000 Xileno – 250.000 Diclorometano – 250.000
Tiofanato metílico 342,3
165
8,8x10-3
8,1x10-5
1,45
7,28
20
Acetato de etila – 8.400 N-hexano 0,47 Metanol – 7.800 Xileno – 110
1 – Ponto de Degradação; 2 – Vapor de Pressão ; 3 – Log Kow: Logaritmo do coeficiente de partição octanol:água, pH 7 e 20°C (< 2,7 = Baixa bioacumulação; 2,7 – 3 = Moderada; > 3,0 = Alta); 4 – Constante de Dissociação; Constante de Henry: > 100 = Volátil; 0,1 - 100 = Moderamente Volátil; Solubilidade em água: <= 50 = Baixa 50 - 500 = Moderada > 500 = Alta;
Fonte: IUPAC (2011).
39
Os pesticidas podem sofrer metabolização realizados em estudos animal,
vegetal e destino ambiental, podendo formar compostos mais tóxicos e mais
persistentes (VIDAL et al., 2009). O β-ciflutrina é uma mistura de quatro
diastereômeros. E o tempo de retenção em HPLC aumenta do diastereômero I a
IV, e suas porcentagens são expressas como soma em (FAO, 1999). A Tabela 5
apresenta os pesticidas selecionados para este trabalho destacados em negrito
que sofrem e os seus produtos de transformação.
Tabela 5. Pesticida e seus produtos de transformação
Pesticida Produto de transformação
Carbofurano 3-hidroxicarbofurano 3-cetocarbofurano 3-hidroxicarbofurano
β-ciflutrina Diastereômeros I (1R,3R,αR + 1S,3S,αS = 1:1; cis) Diastereômeros II (1R,3R,αS + 1S,3S,αR = 1:1; cis) Diastereômeros III (1R,3S,αR + 1S,3R,αS = 1:1; trans) Diastereômeros IV (1R,3S,αR + 1S,3R,αS = 1:1; trans)
Difenoconazol 1,2,4-triazol 2-amino-3-(1,2,4]triazol)-1-il-propionico 1,2,4-trizol-1-il-acético 1,2,4-triazol-1-il-lactico 2-cloro-4-(4-clorofenoxi-)benzoico 2-cloro-4-(4-cloro-fenoxi)-ácido benzoico éster metílico 1 - (2-cloro-4-(4-cloro-fenoxi)-fenil) -2 - (1,2,4-triazol)-1-il-etanona 2-cloro-4-(4-clorofenoxi)-fenil-hidroxiacético hidroxi-difenoconazol
Espirodiclofeno 2,4-dicloro-mandélico éster glucosil-ciclo-hexil 2,4-dicloro-mandélico éster glucosil-ciclo-hexil 2,4-dicloro-mandélico glucósido ácido 2,4-dicloro-mandélico ciclohexilo éster 2,4-diclorobenzóico
Tiofanato-metílico 2-aminobenzimidazol Carbendazim
Fonte: (VIDAL et al, 2009; FAO, 2007).
3.5 - Técnicas de extração para determinação de pesticidas
A extração de pesticidas é uma etapa crítica, pois a seleção da técnica de
extração na etapa de análise de resíduos de pesticidas e seus produtos de
degradação dependem tanto do analito, como da natureza da amostra (GILBERT-
LÓPEZ et al., 2009). Para a análise desses compostos podem ser empregadas
40
técnicas de extração envolvendo etapas de amostragem, extração e clean-up
(SANTOS et al., 2012). Porém, recentemente a escolha de técnicas de extração
tem sido efetuada no sentido de diminuir os efeitos de impactos de resíduos
ambientais. Por sua vez, têm-se selecionado métodos que permitem a
miniaturização, a redução de consumo de solvente e adsorvente, eliminando
etapas de limpeza e pré-concentração, bem como, a melhoria na eficiência de
extração e seletividade, diminuindo o tempo e o custo da análise (DAWIDOWICZ &
RADO, 2010).
O procedimento analítico para determinação de resíduos de pesticidas pode
se resumir em três etapas básicas: (a) Amostragem, que deve representar a matriz;
(b) Preparo da amostra, extração dos analitos da matriz e remoção de
interferentes; e (c) Análise instrumental dos analitos (RIDGWAY et al., 2007). Em
alguns casos, o isolamento de analitos pode tornar extremamente difícil para o
analista em caráter de complexidade de algumas matrizes (ORACZ et al., 2011).
Desta forma, existem várias técnicas de extração para análise de pesticidas,
como: extração líquido-líquido (LLE, Liquid–Liquid Extraction), extração com líquido
pressurizado (PLE, Pressurized Liquid Extraction) (LEE et al., 2008), extração por
agitação com barra de sorção (SBSE - Stir Bar Sorptive Extraction) (LI et al., 2012),
microextração fase líquida (LPME, Liquid-Phase Microextraction)
(LAMBROPOULOU & ALBANIS, 2007), extração em fase sólida (SPE, Solid Phase
Exctration) (XANG et al., 2011), microextração em fase sólida (SPME, Solid-Phase
Microextraction) (RIANAWATI & BALASUBRAMANIAN, 2009), e dispersão de
matriz em fase sólida (MSPD - Matrix Solid Phase Dispersion) (QI, 2010).
Desenvolvida em 1989 por Barker e seus colaboradores, a Dispersão de
Matriz em Fase Sólida contribuiu para a extração de analitos de matrizes sólidas ou
semi-sólidas. No procedimento, é utilizado um suporte sólido com várias funções:
(a) abrasivo; (b) adsorvente de compostos da matriz; (c) facilitar o empacotamento
do material homogeneizado na coluna ou cartucho e (d) permitir o fracionamento
da amostra (CAPRIOTTI et al., 2010). As principais vantagens deste método são:
(1) o protocolo analítico é simples e rápido, (2) a formação de emulsão é eliminada,
(3) o consumo de solvente é reduzido, (4) a eficiência da extração do analito é
conduzida quando a amostra é exposta ao solvente. E a principal desvantagem é a
41
dificuldade em automatizar a técnica (GILBERT-LÓPEZ et al., 2009). Para
Wilkowska & Biziuk (2011), as vantagens associadas a esta técnica são: análise
relativamente de baixo custo; equipamento simples; pequena quantidade de
solvente de eluição.
A técnica utiliza o adsorvente como um abrasivo através de uma força
mecânica empregada na homogeneização com a ruptura da estrutura da amostra.
E o solvente auxilia na interrupção completa dos analitos na extração (JIN et al.,
2012). Esta técnica é uma tentativa de minimizar a formação de emulsão, e reduzir
a quantidade de solventes, comparativamente às técnicas clássicas como extração
líquido-líquido (LLE), que utiliza maiores quantidades de amostra e solventes
(GAUJAC et al., 2012). As etapas operacionais durante o processo de extração em
MSPD são condicionados por fatores como: estado físico das amostras,
concentração e propriedades dos analitos, interferências da amostra, combinação
adequada de adsorvente e solvente (RUBERT et al., 2011).
MSPD pode ser utilizada como técnica alternativa de extração, remoção de
interferentes e eluição da amostra numa mesma etapa, reduzindo a contaminação
da amostra. Já foi aplicada para o isolamento de uma variedade de analitos, como:
drogas, pesticidas, bifenilas policloradas, surfactantes em diferentes matrizes de
alimentos, amostras ambientais e biológicas (TURIEL & MARTÍN-ESTEBAN,
2010). A Figura 10 representa as principais etapas do procedimento MSPD.
Figura 10 – Representação das etapas do procedimento MSPD Fonte adaptada: (Liu et al., 2011).
42
3.6 – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Na cromatografia, a amostra é distribuída entre duas fases. Uma fase é
estacionária enquanto a outra fase é móvel. A fase estacionária é um material
sólido poroso de superfície-ativa. Um equipamento de cromatografia líquida é
composto por um reservatório de solvente, linha de transferência com filtro, sistema
de bombeamento, sistema de injeção, coluna, detector e registrador de dados. A
coluna é uma das partes mais importantes, pois é onde se realiza a separação. É
bastante comum utilizar mais de um solvente na fase móvel, sendo necessário um
controlador e um misturador. Para o gerenciamento do sistema, um computador
com um software apropriado pode ser usado para a obtenção dos dados (MEYER,
2004).
Em cromatografia líquida em fase reversa (RP-HPLC), a fase estacionária é
apolar como C8 e C18. Os solventes mais usados são água, metanol ou
acetonitrila (PERES, 2002). Alterando a composição da fase móvel, os coeficientes
de distribuição são afetados, alterando os fatores de retenção dos analitos. Um dos
principais desafios é efetuar a melhor escolha de fase móvel em função dos
compostos a serem separados. É essencial que os solventes não absorvam na
faixa de trabalho do detector UV-Vis, pois pode influenciar a intensidade da
absorção das espécies detectadas (ROUESSAC & ROUESSAC, 2007).
O detector de ultra-violeta (UV) é o detector mais comum em HPLC devido
sua boa seletividade, sensibilidade e faixa linear. Não é destrutivo e pode empregar
em sistema de análise em modo gradiente. Opera numa faixa de 190 a 350 nm e
na faixa do visível (Vis) 350 a 700 nm, recebendo o nome de detector UV/Vis
(GILBY, 2007). O detector de arranjo de diodos (DAD, Diode Array Detector) é um
detector espectrofotométrico, e apresenta como ferramenta alto desempenho na
determinação e identificação de compostos, uma vez que detêm a aquisição on-line
de varredura dos espectros UV simultaneamente. Esta é a grande vantagem de um
sistema de detecção com DAD em relação ao UV/Vis, que limita a análise em um
único comprimento de onda. Desta forma, é possível escolher o espectro com a
melhor separação e identificação do analito pelo seu tempo de retenção e máxima
43
absorbância (YU et al., 2012). Além da possibilidade de obter a pureza dos picos e
de sobreposição de cromatogramas (COLLINS et al., 2006).
3.7 – Trabalhos relacionados à extração de pesticida em coco
Não existem relatos na literatura de métodos para extração de pesticida em
estipe ou outro tipo de caule. Porém, existem alguns trabalhos na literatura que
descrevem métodos para determinação de resíduos de pesticidas em derivados do
coco, e estão apresentados na Tabela 6.
Tabela 6. Determinação de pesticidas na matriz de coco
Técnica de Extração
Técnica Instrumental
Matriz Fase Sólida/
Extração
Fase Sólida/ Separação
Pesticida LMRs1
(mg kg-1) Referência
SPE
HPLC-UV
Água-de-coco
C18
Sílica gel esférica com C18
Captana 0,02
Brito et al., (2002)
Clorotalonil 0,01
Carbendazim 0,1
Lufenuron -
Diafentiuron -
LLE GC – TSD
GC-ECD
-
ZB-1701 (14%
cianopropil-fenil 86% dimetilpolisiloxano)
Endossulfan 0,05
Captana 0,02
Tetradifona -
Triclorfon -
DB-5 (5% fenil 95%
dimetilpolisiloxano)
Malationa -
Paration metílico 0,02
Monocrotofós -
SPE HPLC-UV Água-de-
coco
C18 C18
Carbofurano - Ogawa et al.,
(2006) 3-Hidroxicarbofurano -
MSPD GC-MS,SIM
Polpa de coco
(Albumen sólido)
C18 e Florisil®
como coluna auxiliar
DB-5ms (5%fenil:95% polidimetilsiloxano)
Dimetoato 0,02
Silva et al., (2008)
Malationa -
Lufenuron -
Carbofurano -
3-Hidroxicarbofurano -
Tiabendazol 0,05
Difenoconazol -
Triclorfon -
MSPD HPLC-UV Água-de-
coco liofilizada
C18 C18 com um grupo
fenila
Lufenuron -
Santos et al., (2012)4 Bifentrina 0,05
Teflubenzuron
-
1. LMR – Limite máximo de resíduos em coco. Fonte: IUPAC (2011).
44
Brito et al., (2002), utilizaram dois métodos de extração, SPE e LLE, e três
técnicas instrumentais, HPLC-UV, GC–TSD e GC-ECD para determinar 12
pesticidas em água-de-coco. No primeiro procedimento foi utilizado um cartucho de
SPE contendo fase estacionária C18 e metanol como solvente de eluição para os
pesticidas: captana, carbendazim, clorotalonil, lufenuron e diafentiuron. A técnica
instrumental utilizada foi o HPLC usando um detector UV em 254 nm, empregando
metanol e água como fase móvel na proporção (70:30, v/v) num fluxo de 0,7 mL
min-1, com uma coluna RP18 conectada à coluna de guarda com a mesma fase,
numa corrida de 38 min. As amostras foram fortificadas em diferentes níveis de
concentração que variaram entre 0,5-12,0 mg kg-1. As recuperações variaram entre
70-105% e o desvio padrão relativo (RSD%), 6,9-11.0%. Para a segunda técnica
de extração (LLE) foi utilizada 10 mL de hexano-diclorometano (1:1 v/v) e 2 g de
cloreto de sódio, adicionados a 10 mL de água-de-coco, extraídos durante 15 min
num agitador mecânico. O extrato concentrado foi dissolvido em acetado de etila e
uma alíquota de 1 mL analisou 7 pesticidas (endosulfan, captana, tetradifona,
triclorfon, malationa, parationa metílico e monocrotofós em GC-ECD e CG-TSD. As
amostras fortificadas variaram em níveis de concentração de 0,01-2,0 mg kg-1. As
recuperações variaram 71-109% e o RSD variou 1,4-11,5%. A precisão e exatidão
para os dois métodos foram consideradas adequadas para a validação do método,
assim como, o método apresentou boa linearidade e coeficiente de correlação foi
satisfatório para os pesticidas.
Ogawa et al., (2006), desenvolveram um método para determinar 3-
hidroxicarbofurano e carbofurano em água-de-coco. Foi utilizado o procedimento
de extração SPE contendo C18 e acetonitrila como solvente de eluição. A análise
instrumental foi HPLC-UV em 275 nm, numa corrida de 25 min, usando
água:acetonitrila em modo gradiente, com um fluxo de 1,0 mL min-1. As amostras
foram fortificadas em diferentes níveis de concentração (0,01-2,5 mg mL-1). As
recuperações variaram de 81 a 95% e RSD variou entre 1,6-12,5%. Os limite de
detecção variaram de 0,008-0,01 mg mL-1.
Silva et al., (2008), desenvolveram uma metodologia para a polpa-do-coco
(albúmen sólido) para 8 pesticidas (dimetoato, malationa, lufenuro, carbofurano, 3-
hidroxicarbofurano, tiabendazol, difenoconazol, triclorfon). Foi empregado a técnica
45
de dispersão de matriz em fase sólida (MSPD) usando C18 como adsorvente e
Florisil® co-coluna e acetonitrila com n-hexano como solvente de eluição. As
condições cromatográficas foram seguidas por GC/MS (SIM) numa corrida de 50
min. O método foi validado usando diferentes níveis de concentração (0,25-1,0 mg
kg-1). As recuperações variaram entre 70,1-98,7%, com exceção o lufenuron e
difenoconazol que variaram respectivamente, 47,2% e 48,2%. O desvio padrão
relativo variou entre 2,7-14,7%. Os limites de detecção variaram 0,02-0,17 mg kg-1
e os limites de quantificação variou entre 0,15-0,25 mg kg-1.
Santos et al., (2012) desenvolveram um método para a água-de-coco
liofilizada, usando como técnica de extração (MSPD) para 3 pesticidas
(teflubenzuron, lufenuron e bifentrila), empregando 0,5 g de amostra, 2,5 g de C18
como adsorvente dispersante e 20 mL de acetonitrila como solvente para eluição.
O método validado utilizando 3 níveis de concentração (0,25; 0,5 e 1,0 mg kg-1). As
recuperações variaram entre 74-116% e o RSD variou 0,4-9,4%. Os limites de
detecção variaram 0,04-0,05 mg kg-1 e o limite de quantificação foi de 0,1 mg kg-1.
46
4 – PARTE EXPERIMENTAL 4.1 – Material
Béquer (100 mL), balão volumétrico (1; 5; 10 e 25 mL), proveta (10 a 25 mL),
vial (1;5;10 e 50 mL), balão de fundo redondo (50 mL), seringa de polietileno (20
mL), papel filtro quantitativo filtração média, (Merck, Alemanha), membrana filtrante
nylon-66, 0,45 µm (Varian, Walnut Creck, CA, EUA), micropipetas de volumes 100-
1000 µL (Boeco Pipette), lã de vidro, vidro de relógio, bastão de vidro, espátula,
pinça, cadinho, pistilo, seringa de vidro, pipeta Pasteur e filtro de seringa (0,45 µm
– nylon).
4.2 – Padrões Analíticos e reagentes químicos
Acetonitrila, diclorometano, acetona e ciclohexano grau HPLC foram
adquiridos da Tedia (Fairfield, OH, EUA); Florisil® (100–200 Mesh; J.T.Baker,
Phillipsburg, NJ, USA), alumina neutra (Macherey-Nagel, Alemanha); C18 (Agilent
Technologies, USA) e Sílica (70-230 Mesh; Silica Flash® G60, (Silicycle, Quebec,
Canadá). Padrões certificados com pureza superior a 95%.
4.3 – Equipamentos
Balança analítica (Sartorius TE214S), evaporador rotatório (Fisatom 802D),
sistema para SPE Vacuum Manifold (Varian, Walnut Creck, CA, EUA),
cromatógrafo líquido de alta eficiência com detector espectrofotométrico com
arranjo de fotodiodos modelo Prominence (Shimadzu, Quioto, Japão), Milli-Q SP
Reagent Water System (Millipore, Bedford, MA, EUA), MA – 80 Macro moinho de
rotor vertical com facas móveis e fixas, tipo Wiley (Marconi, Piracicaba, SP,
Brasil).
4.4 – Limpeza da vidraria
A limpeza das vidrarias utilizadas no procedimento de extração e na
preparação das soluções padrão consistiu em deixar de molho em detergente
Extran 10% por 24 horas. Depois foi enxaguada em água corrente para retirar o
excesso de detergente e foram novamente enxaguadas com água destilada e
47
secas em estufa. Em seguida, as vidrarias foram tampadas com papel alumínio e
guardadas em armário.
4.5 – Preparo das soluções padrão dos pesticidas para análise
Inicialmente, preparou-se as soluções estoques a partir da dissolução de
quantidade do padrão certificado de cada pesticida em acetonitrila ou metanol em
concentração acima de 100 µg mL-1 e, posteriormente, foram armazenadas em
freezer a -17°C. A partir das soluções padrões estoque foram preparadas as
soluções intermediárias em acetonitrila, resultando em concentrações de 10 µg mL-
1 e alíquotas de cada solução intermediária foram diluídas em acetonitrila. Os
pesticidas diluídos em diclorometano foram secos em um leve fluxo de nitrogênio e
o resíduo retomado em 1 mL de acetonitrila. A Tabela 7 apresenta a diluição dos
solventes utilizados na solubilização dos pesticidas.
Tabela 7. Diluição dos solventes utilizados na solubilização dos pesticidas
Pesticida Solvente de Diluição
Carbofurano Metanol β-Ciflutrina Diclorometano
Difenoconazol Metanol Espirodiclofeno Diclorometano
Tiofanato metílico Metanol
4.6 – Coleta e Preparação das amostras
As amostras foram provenientes da EMBRAPA – Tabuleiros Costeiros
(Aracaju/SE) em coqueiros sem sintomas de pragas e doenças. A amostra de
estipe foram obtidas a partir de uma incisão superficial em forma de “V”, feita
com o auxílio de um facão, na altura de 1 metro do solo. Em seguida, foram
misturadas, até obter uma quantidade de 400 g, e encaminhadas ao laboratório
e secar ao ar livre. A amostra foi triturada utilizando um moinho de facas de aço
inoxidável, tipo Wiley e peneirada. Após a homogeneização foi armazenada em
frasco de vidro com tampa rosqueável de polietileno, e utilizada no período de
abril de 2011 a maio de 2012.
48
4.6.1 – Fortificação das Amostras e Procedimento de extração por MSPD
Nos ensaios de recuperação foi realizada com 2,0 g de estipe e fortificada na
concentração de 0,05 µg g-1, considerando a possibilidade de que a matriz nesta
concentração de fortificação não seja homogênea e levaria problemas na
recuperação. Para o procedimento de extração para as concentrações de 0,5; 1,0 e
2,0 µg g-1 foram utilizados 0,5 g de estipe. As amostras foram fortificadas com 500
µL da solução dos pesticidas e repousaram por 30 min. Esse tempo foi necessário
para a evaporação total do solvente e fixação dos pesticidas no estipe. As análises
foram feitas em quintuplicata para cada nível de fortificação.
Foram pesados 2,0 g de estipe e homogeneizados com 1,6 g de Florisil®, e
proporcionalmente para as demais concentrações (0,5; 1,0 e 2,0 µg g-1) foram
pesados 0,5 g de estipe e homogeneizados com 0,4 g de Florisil® durante 2 min. A
coluna de MSPD utilizada foi uma seringa de polietileno de 20 mL, que foi
empacotada com lã de vidro, que serviu como base de sustentação. O
homogeneizado foi transferido para coluna, e colocado outra superfície de lã de
vidro. A eluição foi realizada sob vácuo com 40 mL de ciclohexano-acetona (4:1v/v)
para os ensaios de concentração de 0,05 µg g-1 e 20 mL de ciclohexano-acetona
(4:1v/v) para as demais concentrações. O eluato foi concentrado em 2 mL num
evaporador rotatório (100 rpm, 55 ºC), e seco em fluxo de nitrogênio. O resíduo foi
retomado em acetonitrila e levado ao ultrassom para a homogeneização por
aproximadamente 30 s. O extrato foi filtrado e uma alíquota de 20 µL foi analisada
por HPLC-DAD.
4.7 – Condições Cromatográficas de Análise
As condições cromatográficas foram otimizadas em um cromatógrafo líquido
modelo Prominence da marca Shimadzu (Quioto, Japão) constituído pelos
seguintes módulos: desgaseificador (modelo DGU-20A3), detector UV-Visível com
arranjo de fotodiodos (modelo SPD-M20A), sistema binário de bombeamento
(modelo LC-20AT), injetor automático (modelo SIL-20A) e um módulo de
comunicação (CBM-20A), utilizando uma coluna analítica Synergi 4 µ RP-80A (250
x 4,60 mm) com as características polar, conectada a uma coluna de guarda (4
49
µm/4x3,0 mm) com mesmas características, marca Phenomenex (Torrance, CA,
EUA) e software de gerenciamento LCSolution.
A fase móvel foi composta por eluição isocrática acetonitrila:água (65:35,
v/v). O volume de injeção foi de 20 µL (extrato) e temperatura de análise foi
ambiente, o fluxo de injeção foi de 0,8 mL min-1 e comprimento de onda
selecionado para o monitoramento dos pesticidas foi de 200 nm.
50
5 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
A metodologia para a extração de pesticidas foi desenvolvida utilizando a
técnica de dispersão de matriz em fase sólida considerando o estado físico sólido
da matriz. O procedimento consistiu em homogeneizar a matriz com o adsorvente,
transferindo-o para uma coluna de polietileno e eluindo os resíduos com solvente
apropriado. O eluato das extrações foi analisado em HPLC-DAD.
5.1 – Escolha dos pesticidas
O critério para a seleção dos pesticidas foi a pesquisa de campo realizada
pelos pesquisadores da Embrapa que foram informados pelos agricultores da
utilização destes pesticidas (carbofurano, β-ciflutrina, difenoconazol,
espirodiclofeno e tiofanato metílico) na cultura do coqueiro.
5.2 – Otimização das condições cromatográficas
Foram realizados testes com as soluções padrão individuais dos pesticidas,
as quais foram analisadas no HPLC-DAD para a avaliação da resposta dos
pesticidas, a fim de avaliar os tempos de retenção dos analitos, e a adequação da
fase estacionária e fase móvel.
As soluções dos padrões individuais dos pesticidas foram testadas em
diferentes fases estacionárias, considerando eluição em modo gradiente descrita
na Tabela 8. Foram utilizados os solventes acetonitrila e água.
Tabela 8. Programação da fase móvel no modo gradiente do HPLC-DAD
Tempo (min) Acetonitrila (%) 0,01 90
5 90 15 85 25 80 30 75 32 70 34 60 36 70 40 80 45 85 50 90 60 90
51
O propósito inicial da programação da fase móvel em modo gradiente foi um
teste inicial para obtenção do processo de otimização. Essa etapa da otimização
tem como objetivo obter informações com relação a: (a) comportamento e resposta
de cada pesticida frente ao sistema cromatográfico, (b) obtenção do tempo de
retenção para viabilizar a análise simultânea dos pesticidas e (c) obtenção de pico
simétrico para cada analito. A Tabela 9 corresponde às fases estacionárias
testadas neste trabalho.
Tabela 9. Fases estacionárias na otimização das condições de análise Coluna Marca Tamanho da
partícula/Dimensão da coluna
Luna C18(2) 100A Phenomenex 3 µm /100x3,00 mm
Synergi – RP-80A Coluna de Guarda Polar-RP
Phenomenex 4 µm/250x4,6 mm 4 µm/4x3,0 mm
Microsorb-MV 100-5/C18 Varian 5 µm/250x4,6 mm Microsorb-MV 100-5/C8 Varian 5 µm/250x4,6 mm
A partícula empregada como fase estacionária possui grande área
superficial. O tamanho da partícula está relacionado com a velocidade de
transferência entre as fases móvel e estacionária, resultando na eficiência de fluxos
e velocidades. As dimensões da coluna são dadas pelo comprimento e o diâmetro
interno. Atualmente, com o desenvolvimento de colunas eficientes há uma
tendência de diminuição do tamanho da partícula, menor comprimento e diminuição
do diâmetro interno da coluna caracterizando melhor economia na fase móvel, uma
vez que os fluxos ideais diminuem e queda de pressão na coluna (LANÇAS, 2009).
A coluna selecionada foi a Synergi– RP-80A. Esta coluna possui em sua
estrutura um grupo fenil ligado ao éter em uma cadeia alquila ligada a superfície da
sílica, contendo um recobrimento final de característica polar, sendo adequado
para analisar compostos de caráter polar e aromáticos, como representa a Figura
11.
52
Figura 11 – Esquema da estrutura da fase estacionária da coluna
Fonte: Catálogo Phenomenex
A coluna Synergi– RP-80A respondeu de forma satisfatória para todos os
pesticidas. A fim de estabelecer uma proporção ideal entre a água e acetonitrila
foram realizados testes na modalidade isocrática. O objetivo foi avaliar a
possibilidade do uso do modo isocrático na análise simultânea dos pesticidas em
um tempo razoável de análise. Para tanto, foram testadas três possibilidades de
mistura acetonitrila e água: (a) 70:30; (b) 65:35 e (c) 60:40 (v/v). Após os testes, foi
constatado que os pesticidas responderam satisfatoriamente a proporção 65:35,
pois em 70:30 houve co-eluição do tiofanato-metílico e carbofurano e em 60:40 não
foi satisfatório. A acetonitrila é um solvente muito usado para desenvolvimento de
métodos de cromatografia de fase reversa, pois não absorve na região de 195 a
220 nm do espectro, apresenta menor viscosidade em relação à água, sendo
miscível (PATTO et al., 2009).
A Figura 12 apresenta os cromatogramas nas três proporções de solvente
(acetonitrila:água) na modalidade isocrática. As Figuras 13 à 22 apresentam os
cromatogramas dos pesticidas, referente a: a) representação individual, b) gráfico
3D, c) pureza do pico e d) perfil do pico em diferentes comprimentos de onda e os
respectivos tempos de retenção.
53
Proporção modalidade isocrática (v/v)
Cromatogramas
70:30
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0 42.5 min-50
-25
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
275
300
mAU254nm,4nm (1.00)
2.59
2/166
4
3.68
4/327
09
3.969
/879
1
5.506
/551
1
7.491
/593
9
8.214
/334
8
8.97
5/391
446
7
18.849
/580
4
20.651/11
637
21.309
/274
783
24.830/96
90
25.425/10
91
29.910
/209
7
30.882/16
051
31.372/69
008
4
32.30
1/249
3
33.366/19
962
94
34.629/49
707
35.157/50
0835
.392
/396
9 35.58
6/85
56
36.300/95
137
37.131/16
702
37.569/59
076
38.232/15
256
38.544
/339
66
39.45
4/116
68
40.036/332
3
40.342/763
8
42.070
/152
9
65:35
7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 min
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
850
900
mAU200nm4nm (1.00)
5.52
65.80
9
11.270
22.93
7
28.482
29.761
60:40
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0 42.5 min
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
275
300
325
350
375
400
mAU254nm,4nm (1.00)
2.62
2/279
76
2.73
9/97
367
4.62
7/59
544
4.86
5/45
966
6.41
5/39
7174
36.68
9/27
988
7.61
3/240
56
11.815
/199
701
12.445
/866
2412
.747
/521
99
13.419
/100
95
15.467
/276
323
37.458/71
106
0
40.588
/133
58
Figura 12. Cromatogramas referentes aos pesticidas analisados em três proporções de solventes (acetonitrila: água) na modalidade isocrática obtido por HPLC-DAD na concentração de 10 µg mL-1.
Não foi possível concluir o desenvolvimento e validação do método para o
carbosulfano neste trabalho, pois houve a degradação deste composto.
Co-eluição – Tiofanato metílico e Carbofurano
Tiofanato-metílico
Carbofurano
Espirodiclofeno
Carbosulfano
Β-Ciflutrina
Difenoconazol
Espirodiclofeno
54
a)
5.6 5.7 5.8 5.9 6.0 6.1 6.2 6.3 min
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
850
900
mAU200nm,4nm (1.00)
5.79
5
b) Figura 13 – Perfil cromatográfico do carbofurano a) individual, tempo de retenção: 5,795 min; b) gráfico 3D;
5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 6.0 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 min
-0.025
0.000
0.025
0.050
0.075
0.100
0.125
0.150
0.175
0.200
0.225
0.250
0.275
0.300
0.325
0.350
0.375
0.400
0.425
0.450
0.475
0.500
0.525
0.550
0.575
0.600
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
150
160
170
180
190
200
210
220
230
240
mAUPeak
Zero LinePurity Curve
5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 6.0 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 min-50
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
850
900
950
1000
mAU
225nm220nm215nm210nm205nm200nm195nm190nm
c) d)
Figura 14 - Perfil cromatográfico do carbofurano d) pureza do pico; d) picos em diferentes comprimentos de ondas .
55
28.5 29.0 29.5 30.0 30.5 31.0 31.5 32.0 32.5 33.0 33.5 34.0 34.5 min
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
mAU200nm,4nm (1.00)
31.5
99
a)
b)
Figura 15 – Perfil cromatográfico do β-Ciflutrina a) individual, tempo de retenção: 31,599 min; b) gráfico 3D;
25.25 25.50 25.75 26.00 26.25 26.50 26.75 27.00 27.25 27.50 27.75 28.00 28.25 min-0.05
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
0.55
0.60
0.65
0.70
0.75
0.80
0.85
0.90
0.95
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
22.5
25.0
27.5
30.0
32.5
35.0
37.5
40.0
42.5
45.0
47.5
50.0
52.5
55.0
57.5
mAUPeak
Zero LinePurity Curve
25.25 25.50 25.75 26.00 26.25 26.50 26.75 27.00 27.25 27.50 27.75 28.00 28.25 min
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
mAU
225nm220nm215nm210nm205nm200nm195nm190nm
c) d)
Figura 16 - Perfil cromatográfico do β-Ciflutrina: d) pureza do pico; d) picos em diferentes comprimentos de ondas.
56
10.75 11.00 11.25 11.50 11.75 12.00 12.25 12.50 min
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225mAU
200nm,4nm (1.00)
11.2
49
a) b)
Figura 17 – Perfil cromatográfico do difenoconazol: a) individual, tempo de retenção: 11,249min; b) gráfico 3D;
10.8 10.9 11.0 11.1 11.2 11.3 11.4 11.5 11.6 11.7 11.8 11.9 12.0 12.1 min
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
0.55
0.60
0.65
0.70
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
150
160
170
mAUPeak
Zero LinePurity Curve
10.8 10.9 11.0 11.1 11.2 11.3 11.4 11.5 11.6 11.7 11.8 11.9 12.0 12.1 min
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
150
160
170
180
190
200
210
220
230
mAU
225nm220nm215nm210nm205nm200nm195nm190nm
c) d)
Figura 18 - Perfil cromatográfico do difenoconazol: d) pureza do pico; d) picos em diferentes comprimentos de ondas.
57
21.50 21.75 22.00 22.25 22.50 22.75 23.00 23.25 23.50 23.75 24.00 24.25 24.50min
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
105
110
mAU200nm,4nm (1.00)
22.8
00
a) b)
Figura 19 – Perfil cromatográfico do espirodiclofeno: a) individual, tempo de retenção: 22,800 min; b) gráfico 3D;
22.25 22.50 22.75 23.00 23.25 23.50 23.75 min
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
0.55
0.60
0.65
0.70
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
40.0
45.0
50.0
55.0
60.0
65.0
70.0
mAUPeak
Zero LinePurity Curve
22.25 22.50 22.75 23.00 23.25 23.50 23.75 min
-10
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
105
110
115
mAU
225nm220nm215nm210nm205nm200nm195nm190nm
c) d)
Figura 20 - c) Perfil cromatográfico do espirodiclofeno: d) pureza do pico; d) picos em diferentes comprimentos de ondas.
58
1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 min
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
mAU200nm,4nm (1.00)
5.51
1
a) b)
Figura 21 – Perfil cromatográfico do tiofanato metílico: a) individual, tempo de retenção: 5,511 min; b) gráfico 3D;
5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 6.0 6.1 6.2 6.3 min
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
0.55
0.60
0.65
0.70
0.75
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
mAUPeak
Zero LinePurity Curve
5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 6.0 6.1 6.2 6.3 6.4min
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
mAU
225nm220nm215nm210nm205nm200nm195nm190nm
c) d) Figura 22 - Perfil cromatográfico do tiofanato metílico: d) pureza do pico; d) picos em diferentes comprimentos de ondas.
59
A Figura 23 apresenta o conjunto dos perfis cromatográficos dos pesticidas
selecionados em acetonitrila:água (65:35 v/v).
Figura 23 – Perfil cromatográfico obtido por HPLC-DAD referentes aos pesticidas selecionados em solvente acetonitrila:água (65:35 v/v).
5.3 – Otimização das Condições de Extração 5.3.1 – Ensaios para otimização das condições de extração de pesticida na
matriz estipe
No desenvolvimento da metodologia utilizando a técnica de dispersão da
matriz em fase sólida para determinação de pesticidas em estipe, foram testados
os adsorventes C18, Florisil®, alumina neutra e sílica. Partindo-se de uma
quantidade de 0,5 g de estipe, 0,5 g de adsorvente, o homogeneizado foi eluído
com 20 mL de diclorometano (DCM), que foi o solvente escolhido para o teste
inicial, porque foi utilizado como solvente de diluição do espirodiclofeno e β-
ciflutrina. Na execução do procedimento houve a preocupação em se padronizar a
aplicação de força manual na homogeneização, forma de empacotamento na
coluna de polietileno e vazão na eluição.
60
De acordo com os resultados apresentados na Figura 24, é possível
verificar que os ensaios realizados foram satisfatórios com Florisil®, pois permite
a extração dos 5 compostos.
Adsorvente Cromatogramas
Florisil®
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0 42.5-7.5
-5.0
-2.5
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
22.5
25.0
27.5
30.0
32.5
35.0
37.5
40.0
42.5
45.0
47.5
mAU254nm,4nm (1.00)
2.252/11255 2.478/2398
3.052/2773
3.312/3826
4.198/2527
4.973/2178 5.825/76430 6.235/4403
6.614/3995
8.398/2203
9.207/4914
13.219/16412
19.963/7399
24.612/9617
26.087/15463
28.343/26901
30.321/58818
30.837/3738
31.484/18880
33.746/171887
34.425/24690
34.962/17384
37.491/8453
38.235/9728
38.860/3753
39.733/1011
40.679/15236
41.077/1242
41.683/701195
Sílica
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0 42.5
-2.5
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
22.5
25.0
27.5
30.0
mAU254nm,4nm (1.00)
2.637/214
542.933/506
0
3.302
/38273.488/2004
3.79
8/42
153.974/2257
4.104/1469 4
.267/1308
5.029/220
8
5.337/10545
7.374/46287
7.69
1/48
59
11.911/24
77
20.168/6207
21.033
/384
7
27.934/4175
30.004/2073
33.200/4238
34.960/6613
36.665
/473
71
37.655/495
42
38.240
/8480
39.194/19418
2
40.260/656
287
41.632/14595
42.053/2639
C18
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0 42.5
-2
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
mAU254nm,4nm (1.00)
2.830/17569 2.997/6126
3.232/1367
4.189/2697
4.351/3871
4.632/2140
5.489/5141
7.002/3550
8.139/37799
8.401/69842
9.403/4522
10.424/13323
13.181/18456
24.325/12479
25.902/22941
28.296/11188
29.136/27511
34.055/12667
34.408/9458
35.180/236209
35.622/42500
37.280/1120
37.848/11566
38.570/7942
39.891/131013
40.990/28522
41.488/8694
41.919/3027
42.474/41690
42.718/30565
Alumina
Neutra
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0 42.5
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
9.5
10.0
mAU254nm,4nm (1.00)
2.894/1005 3.
097/5280
3.661/1492
4.469/1057
5.022/1373
5.129/26995.269/1452
5.359/4045
5.925/14096.037/1411
6.261/1429
6.712/5431
8.858/2339
10.353/25166
10.803/54821
14.453/1132
14.651/2864
33.792/8467
34.087/16478
38.629/2144
39.683/2289
40.203/11057
40.655/20333
41.484/94584
42.656/9244
Figura 24. Cromatogramas referentes à eficiência dos adsorventes homogeneizados com o estipe e eluídos em DCM por HPLC-DAD na concentração de 10 µg mL-1
Tiofanato-metílico
Carbofurano
Difenoconazol
Espirodiclofeno β-Ciflutrina
Tiofanato-metílico
Difenoconazol
Espirodiclofeno Carbosulfano
Carbofurano
Difenoconazol B-Ciflutrina
Carbofurano
Difenoconazol
61
A utilização de Florisil® como adsorvente foi satisfatória e nos testes de
fortificação, foram homogeneizados 0,5 g de estipe e 0,5 g de Florisil®. Nesta
etapa, foram testadas duas possibilidades de solvente (a) DCM e (b)
ciclohexano:acetona (80:20 v/v), considerando um volume de 20 mL para cada
teste de eluição dos pesticidas. Em função dos resultados apresentados na
Figura 25, o ciclohexano-acetona (80:20) foi selecionado como solvente de
eluição, pois eluiu satisfatoriamente os pesticidas. Porém o perfil do extrato
branco apresentou interferentes nos tempos de retenção de todos pesticidas,
diferentemente do DCM que co-eluiu o carbofurano e tiofanato metílico. Além
disso, o DCM não reportou os experimentos, como apresentou os resultados de
ciclohexano:acetona (80:20 v/v).
Extratos Cromatograma
Extrato do
Branco
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 min
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
mAU270nm,4nm (1.00)
1.545
/4411
2.12
9/579
2
2.52
0/2
963
3.08
3/222
9 3.39
0/120
53
3.63
2/402
16 3.
841/2
7782
4.03
7/2
5138
4.32
5/514
684.455
/787
50
4.71
5/306
05
5.23
0/265
555.55
1/281
98
5.847
/2038
2 6.09
7/790
56.34
7/651
46.
601/288
03
7.03
9/3
3976
7.69
8/398
54
8.06
9/2
1248
8.743
/157
28
9.52
5/477
18
9.93
5/2
2744
10.853/149
958
11.232/12
154
11.999
/519
93
12.967/19
529
13.877/16
019
14.843/
3943
15.279/526
7
16.402/26
05
22.766/
70884
28.583/
3696
Extrato do
Fortificado
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 min
-2
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
mAU270nm,4nm (1.00)
2.14
1/8683
2.53
8/339
42.639
/126
7
3.115
/650
03.39
4/38
626
3.634
/114
692
3.84
4/8001
34.035
/496
49
4.33
4/9247
5
4.459
/106
424
4.725
/636
25
5.06
0/518
38
5.45
8/2340
715.75
0/107
078
6.05
9/41
079
6.602
/661
97
7.02
9/6397
4
7.47
7/133
05
7.82
3/8186
98.094
/400
91
8.74
8/3978
9
9.56
6/8546
4
10.388
/902
20
10.901/21
546
8
12.054/53
627
12.988
/326
0
13.925/101
89
14.880/35
50
15.387/21
230
15.947/23
92
16.442/16
44
20.754/34
499
4
22.062/184
85
22.828/13
531
9
24.561/40
756
27.39
6/34
931
28.633/24
901
Figura 25. Cromatogramas referentes aos pesticidas eluídos em ciclohexano-acetona (80:20 v/v) e analisados por HPLC-DAD.
1.Tiofanato metílico
2.Carbofurano 3.Difenoconazol
4.Espirodiclofeno
5.β-Ciflutrina
62
A partir deste resultado, a Figura 26 apresenta uma avaliação da
alteração na otimização no volume de solvente (20 e 15 mL), juntamente com a
adição de uma coluna auxiliar com 1 g de alumina neutra. Este teste de limpeza
do extrato foi baseado na estimativa de reduzir a quantidade de interferentes.
0
20
40
60
80
100
120
15 mL
20 mL
1 g Alumina
neutra
Figura 26 - Avaliação dos diferentes volumes e utilização de coluna auxiliar na extração
de pesticidas utilizando a técnica MSPD (Nível de fortificação 2,0 µg g-1).
No teste da diminuição de volume de solvente (15 mL), os resultados de
recuperação foram baixos para os pesticidas. A utilização da alumina neutra como
coluna auxiliar também não foi satisfatório, pois apresentou baixos valores de
recuperação, além de não extrair o tiofanato metílico. Desta forma, o volume de 20
mL para a determinação dos cinco pesticidas foi adequado, o qual permitiu valores
de recuperação na faixa de 63-112%.
Na otimização foram avaliados três parâmetros: (a) quantidade de estipe, (b)
quantidade de adsorvente Florisil® e (c) volume de solvente (ciclohexano:acetona)
de forma a obter uma extração eficiente com um menor consumo de solvente, sem
a etapa de limpeza dos extratos. A Figura 27 apresenta o gráfico com os valores de
recuperação percentual dos pesticidas considerando os da Tabela 10.
Re
cup
era
ção
(%
)
63
Tabela 10. Otimização para a extração de pesticida em estipe
Massa de estipe (g)
Massa de adsorvente (g)
Volume de solvente (mL)
Experimento
0,5
0,5 20 1
0,4 20 2
0,4 15 3
0
20
40
60
80
100
120
1
2
3
Figura 27 – Avaliação da otimização dos diferentes volumes e massa de adsorvente e
matriz na extração de pesticidas utilizando a técnica MSPD. (Nível de fortificação 2,0 µg g-1).
Os resultados dos testes de recuperações apresentados na Figura 27
evidenciaram que os valores de recuperação obtidos para a condição 2, com 0,5 g
de estipe, 0,4 g de adsorvente e 20 mL de solvente, corresponderam aos
percentuais de recuperação mais satisfatórios (63-108%). Para Ribani et al., (2004)
a ANVISA estabelece recuperações satisfatórias no intervalo de 50-120% para
amostras complexas.
A legislação brasileira (ANVISA) estabelece que o LMR para o
espirodiclofeno é de 0,05 µg g-1 na matriz de coco. Para o desenvolvimento desta
metodologia, o estipe foi forticada com solução padrão contendo os pesticidas
nesta concentração. Como a concentração é baixa, foi aumentada
proporcionalmente a massa do estipe de 0,5 g e de adsorvente de 0,4 g para 2,0 g
de estipe e 1,6 g de adsorvente. O resultado deste teste está representado na
Figura 28.
Re
cup
era
ção
(%
)
64
0
20
40
60
80
100
120
140
Carbofurano Difenoconazol Espirodiclofeno
20 mL
40mL
Figura 28. Avaliação da otimização dos diferentes volumes e massa de adsorvente e matriz na
extração de pesticidas utilizando a técnica MSPD. (Nível de fortificação 0,05 µg g-1).
Para este nível de concentração foram obtidos resultados satisfatórios para
apenas para o carbofurano, difenoconazol e espirodiclofeno, os demais pesticidas
não foram detectados para este nível de fortificação. Foram testados dois volumes
(20 mL e 40 mL) para a eluição dos pesticidas na proporção 80:20 de
ciclohexano:acetona. Por sua vez, o volume de 40 mL apresentou melhores valores
de recuperação (68-120%).
Dos pesticidas selecionados para o desenvolvimento desta metodologia, o
espirodiclofeno apresenta o menor nível de concentração que a legislação exige
em relação aos demais pesticidas deste trabalho. Desta forma, os ensaios
realizados para a otimização da extração por MSPD ficou determinada com 40 mL
de ciclohexano:acetona na proporção (80:20 v/v) e 2,0 g de estipe e 1,6 g de
Florisil®.
As polaridades do adsorvente e do solvente são fatores importantes na
eficiência do procedimento de extração pela técnica de dispersão de matriz em
fase sólida (SANTOS et al., 2012). O Florisil® é um adsorvente com características
polares (CAPRIOTTI et al., 2010), é um silicato de magnésio com propriedades
básicas que permitem eluição seletiva de compostos baseados em força de
eluição. O ciclohexano é apolar e a acetona é um solvente polar aprótico, seja
mistura na proporção 4:1, permitiu extrair os pesticidas da amostra de estipe
(LANÇAS, 2009).
Re
cup
era
ção
(%
)
65
Por estas razões, o Florisil® e o ciclohexano:acetona na proporção (80:20
v/v) foi um sistema adequado para a determinação de carbofurano, β-ciflutrina,
difenoconazol, espirodiclofeno e tiofanato-metílico em estipe.
5.4. VALIDAÇÃO DO MÉTODO MSPD PARA O ESTIPE POR HPLC-DAD
A etapa de validação de uma metodologia indica que os resultados obtidos
com a metodologia são confiáveis e desta forma, pode ser adotado na rotina do
laboratório, com os parâmetros de exatidão, precisão, linearidade e limites de
detecção e quantificação (RIBANI et al., 2004; BRITO et al., 2003).
5.4.1 – Linearidade
A linearidade é a resposta obtida em função da concentração do analito, a
qual deve ser estudada em um intervalo de concentração apropriado (LANÇAS,
2009). A linearidade proporciona uma faixa de aplicação capaz de fornecer
resultados referentes relacionando a área e a concentração de um analito, sendo
expressa com uma equação da reta (y = ax + b) chamada de curva analítica.
Através de uma regressão linear, os coeficientes de regressão (a e b) permitem
calcular o coeficiente de correlação (r). Estes cálculos estimam a qualidade da
curva seja valores mais próximo a 1,0, garantindo uma menor incerteza dos
coeficientes e menor dispersão dos pontos experimentais (RIBANI et al., 2004).
A linearidade foi comprovada nos resultados da curva analítica com valores
que variaram de sete a nove níveis de concentração dos pesticidas em acetonitrila,
como mostram as Figuras 29 e 30. A linearidade foi avaliada pela curva analítica
preparada no solvente acetonitrila nas concentrações de 0,04; 0,1; 0,2; 0,4 e 1,0;
2,0; 10, 15 e 20 µg mL-1 em triplicata (Brito et al., 2003). A Tabela 11 apresenta as
equações de reta, coeficientes de correlação e o intervalo de concentração dos
pesticidas. E as Figura 29 apresentam as curvas analíticas dos pesticidas
estudados.
66
Tabela 11. Dados da equação da reta, linearidade, intervalo de concentração do método MSPD
Pesticidas Equação da reta Coeficiente de correlação
(r)
Intervalo de concentração
(µg mL-1) Carbofurano y=5,5x + 388193,1 0,9993 0,04-15
β-Ciflutrina y=3,1x – 123516,2 0,9974 0,1-15
Difenoconazol y=1,7x + 349040,9 0,9989 0,04-15
Espirodiclofeno y=188443,8x - 24681,5 0,9996 0,04-20
Tiofanato metílico y=3,6x – 98005,1 0,9991 0,04-20
Figura 29 – Curvas analíticas obtidas no solvente acetonitrila e analisados por HPLC-DAD: a) Carbofurano e b) β-ciflutrina.
a)
b)
67
Continuação Figura 29 - Curvas analíticas obtidas no solvente acetonitrila e analisados por HPLC-DAD: a) difenoconazol; b) espirodiclofeno; c) tiofanato-metílico.
a)
b)
c)
68
5.4.2 –Seletividade
A seletividade é a capacidade de análise de compostos em presença de
interferentes (RIBANI et al., 2004). A seletividade foi realizada através da
detecção de compostos avaliados por cromatogramas do extrato controle e do
extrato fortificado (BRITO et al., 2003). A Figura 30 mostra a seletividade para os
cinco pesticidas selecionados em cromatogramas por HPLC-DAD.
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 min0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
100000
110000uV
Solução Fortificada 0,5 µg g-1 Solução de comparação 0,5 µg g-1 Branco do extrato
Figura 30. Cromatogramas obtidos por HPLC-UV/DAD avaliando a seletividade por de 1 –Tiofanato metílico; 2 –Carbofurano e 3 –.Difenoconazol; 4 – Espirodiclofeno; 5 – β-Ciflutrina. A, B, C e D – regiões de registro dos pesticidas.
A seletividade foi avaliada comparando-se a presença de compostos no
cromatograma do branco do estipe com um padrão. Desta forma, foi possível
verificar que no cromatograma do branco da amostra do estipe é uma amostra com
compostos interferentes nos tempos de retenção dos analitos, com essa avaliação
mostra que as condições não foram totalmente seletivas. O pesticida pode ser
influenciado pela natureza de amostras complexas, como frutas, óleos, vegetais e
tipo de co-extrativos (polaridade, volatilidade, tamanho das moléculas, lipídios,
1
2
3
5
4
A
B
C
D
69
pigmentos, resina da planta), e pode originar o efeito de matriz ou dificuldades na
extração com baixa recuperação em análises cromatográficas (PINHO et al., 2009).
5.4.3. Exatidão e Precisão
A exatidão estima o grau de concordância entre os resultados individuais
encontrados em um determinado ensaio e um valor de referência. Uma das formas
de avaliar a exatidão de um método é através dos ensaios de recuperação. A
exatidão está sempre associada aos valores de precisão. A precisão de um método
representa a dispersão de resultados entre ensaios independentes, repetidos de
uma mesma amostra, amostras semelhantes ou padrões em condições definidas e
pode ser expressa por expressa como desvio padrão relativo (RSD) ou coeficiente
de variação (CV%) (BANDARKAR & KHATTAB, 2012; RIBANI et al., 2004;
LANÇAS, 2004).
A exatidão foi avaliada pelo estudo de recuperação realizado com a
fortificação da amostra de estipe. As respostas das áreas foram comparadas
com a solução de comparação. A precisão foi expressa como a estimativa do
desvio padrão relativo (RSD). Para Ribani et al. ( 2004) em metodologias de
análise traço, os intervalos aceitáveis de recuperação geralmente estão entre 70
e 120%, com precisão (RSD) de até ± 20%. Contudo, dependendo da
complexidade da amostra, este valor pode ser de 50 a 120% com precisão de
até ± 15%.
Foi verificada a precisão intra-dia nas concentrações de 0,5 µg g-1 feita
por análise de amostras e verificado a precisão em inter-dias consecutivos.
A Tabela 12 apresenta a eficiência da recuperação e desvio padrão relativo
entre 3 e 4 níveis de concentração (0,05; 0,5; 1,0 e 2,0 µg g-1) dos pesticidas
estudados em estipe.
70
Tabela 12. Eficiência da recuperação (n=3) e desvio padrão relativo (RSD%) em diferentes níveis de concentração dos pesticidas estudados em estipe
Pesticida Nível de Fortificação (µg g-1)
Recuperação média (%)
RSD (%)
Carbofurano 0,05 0,5 1,0 2,0
103,5 89,7 114,3 100,3
6,1 9,5 10,9 8,6
β-Ciflutrina 0,5 1,0 2,0
75,0 88,4 87,0
13,4 11,0 14,6
Difenoconazol 0,05 0,5 1,0 2,0
64,7 80,3 82,6 100,0
11,5 13,2 12,5 16,5
Espirodiclofeno 0,05 0,5 1,0 2,0
94,6 77,0 84,6 88,0
19,2 14,1 13,5 15,9
Tiofanato metílico
0,5 1,0 2,0
70,4 84,5 57,5
10,6 9,3 1,2
A variação dos valores da recuperação média dos pesticidas em amostras de
estipe nas concentrações de 0,05; 0,5; 1,0 e 2,0 µg g-1 variam de 57,5 a 114,3% e o
desvio padrão relativo variaram de 1,2 a 19,2%. A concentração de 0,05 µg g-1 foi
satisfatória para os pesticidas difenoconazol, espirodiclofeno e carbofurano, pois
apresentou recuperações aceitáveis. A tabela 13 apresenta a precisão entre dias no
nível de concentração 0,5 µg g-1.
71
Tabela 13. Eficiência da precisão da metodologia intra-dias no nível de fortificação de 0,5 (µg g-1) dos pesticidas estudados em estipe Pesticida Nível de
Fortificação (µg g-1) Dias Recuperação
média (%) RSD (%)
CV (%)
Carbofurano 0,5
1 2 3 4
84 87 85 85
1,7 0,8 3,3 4,5
2,1 0,9 3,9 5,3
β-Ciflutrina 0,5
1 2 3 4
95 84 88 88
15,0 7,2 1,4 1,2
15,8 8,6 1,6 1,4
Difenoconazol 0,5
1 2 3 4
88 81 88 82
6,1 7,3 1,7 9,0
6,9 9,0 1,9 11,0
Espirodiclofeno 0,5
1 2 3 4
108 92
109 91
11,0 4,5 15,0 9,6
10,2 4,9 13,7 10,5
Tiofanato metílico
0,5
1 2 3 4
73 69 64 61
2,2 1,0 2,4 2,6
3,0 1,5 3,7 4,3
A variação dos valores da recuperação média dos pesticidas em amostras de
estipe no nível de concentração de 0,5 µg g-1 variaram de 61 a 109%, o desvio
padrão relativo variaram de 0,8 a 15% e o coeficiente de variação variou de 0,9 a
15,8 %. Os valores encontrados de precisão e exatidão são consideravéis aceitáveis
para matriz complexa.
5.4.4 – Limite de Detecção (LD) e Limite de Quantificação (LQ)
O limite de detecção é a menor concentração que o analito pode ser
detectado, mas não necessariamente quantificado (BRITO et al., 2003).
Adicionalmente Thier & Zeumer (1987), o limite de detecção é considerado quando
o valor da concentração do composto encontrado na matriz é menor ou igual ao
valor do limite de quantificação. Para IMOTO & FREITAS (2008) os LD e LQ
obedecem a testes limites que especificam se o pesticida na amostra está no valor
determinado expresso em mg kg-1. No procedimento de validação da metodologia
de qualquer pesticida, os níveis de LQ e LD exigem um número de amostras
72
fortificadas devam ser analisados próximo ao nível de concentração desejado, em
que seja possível quantificá-los.
O limite de quantificação corresponde à menor quantidade de um analito que
pode ser quantificada com exatidão e com fidelidade determinada (LANÇAS, 2009).
Ainda segundo Thier & Zeumer (1987), o limite de quantificação representa o
menor valor da concentração de um composto nas amostras desde que atenda aos
seguintes requisitos: 1) os valores de recuperação forem iguais ou maiores do que
70%; 1) LQ ser maior do que ou igual ao LD; 3) o coeficiente de variação ser igual
ou menor que 20%.
Desta forma, o limite de detecção foi calculado pelos menores níveis de
concentração (0,05 e 0,5 µg g-1), assim como o limite de quantificação. Na Tabela
14 encontram os valores dos limites de detecção e limite de quantificação da
metodologia para a matriz.
Tabela 14. Limite de detecção e quantificação dos pesticidas usando a
técnica de extração MSPD e HPLC-DAD Pesticida LD (µg g-1) LQ (µg g-1)
Carbofurano 0,03 0,05
β-Ciflutrina 0,3 0,5
Difenoconazol 0,03 0,05
Espirodiclofeno 0,02 0,05
Tiofanato metílico 0,2 0,5
Os limites de detecção obtidos para os pesticidas carbofurano, β-ciflutrina,
difenoconazol, espirodiclofeno e tiofanato metílico no desenvolvimento da
metodologia variaram entre 0,02 a 0,3 µg g-1. Não há relatos na literatura de LD e
LQ que utilizaram o emprego das técnicas de MSPD e HPLC-DAD em estipe.
73
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Neste trabalho foi desenvolvido uma metodologia eficiente para a
determinação simultânea dos pesticidas: carbofurano, β-ciflutrina, difenoconazol,
espirodiclofeno e tiofanato metílico em estipe, utilizando as técnicas de MSPD e
HPLC-DAD.
A metodologia proposta por MSPD com a utilização de 1,6 g de Florisil®
como dispersante em 2,0 g de amostra de estipe, utilizando 40 mL de ciclohexano-
acetona (80:20 v/v) mostrou-se eficiente na extração dos resíduos de carbofurano,
β-ciflutrina, difenoconazol, espirodiclofeno e tiofanato metílico, sem a etapa de
limpeza.
Após a otimização do procedimento de extração, foi efetuada a validação de
metodologia para análise de pesticidas no estipe. Para tanto, foram avaliados os
parâmetros: linearidade da curva analítica, seletividade, precisão, exatidão, limite
de detecção e limite de quantificação. Os valores de recuperação variaram de 57,5
a 114,3% com precisão entre 1,2 a 19,2% para os valores de concentração entre
0,05-2,0 µg g-1. A linearidade 0,9951 a 0,9999 num intervalo de concentração de
0,04-20 µg mL-1. Os limites de detecção foram de 0,02 a 0,3 µg g-1 e limite de
quantificação foi de 0,05 e 0,5 µg g-1.
74
7. PERSPECTIVAS DO TRABALHO
Realizar testes em condições de campo para estudar a translocação dos
respectivos pesticidas no estipe do coqueiro.
75
8. REFERÊNCIAS ABREU, L. F; FARIA, J, A, F. Influência da temperatura e do ácido ascórbico sobre a estabilidade físico-química e atividade enzimática da água de coco (Cocos nucifera L.) acondicionada assepticamente. Revista Ciência e Tecnologia de Alimentos, v. 27 (2), p.226-232, abr.-jun. 2007. AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA (ANVISA). Disponível em:<http://portal.anvisa.gov.br/wps/portal/anvisa/anvisa/home/agrotoxicotoxicologia>. Acessado em: 13/10/2011
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