tÉcnicas imunolÓgicas parte 1. imunodiagnÓstico: diagnóstico laboratorial por meio de técnicas...

TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS

Parte 1

IMUNODIAGNÓSTICO: Diagnóstico laboratorial por meio de técnicas

imunológicas.

Busca: Anticorpo ou Antígeno no organismo do paciente por meio de ensaios de Precipitação, Aglutinação, Fixação de complemento, Neutralização ou Imunoensaios que utilizam sinalizadores da interação Ag-Ac com conjugados ligantes, como Imunofluorescência, Radioimunoensaio, Imunoenzimáticos, Imunofluorimétricos e Quimioluminiscência

Outros testes: Hipersensibilidade a Antígenos: Reações intradérmicas e percutâneas.

INTERAÇÕES ANTÍGENO-ANTICORPO

Afinidade = Forças de atração e de repulsão

Ab

Ag

Alta afinidade

Ab

Ag

Baixa Afinidade

AFINIDADE DE INTERAÇÃO• Força da interação entre um único epitopoantigênico e um único sítio de combinação com

o antígeno

[Ag] + [Ac ] [Ag-Ac]

KA= [Ag-Ac] ([Ag] + [Ac])

KA

KA= Constante intrínseca de associação

Reatividade Cruzada

• Quando os antígenos são estruturalmenterelacionados podendo ocorrer a reatividade de um anticorpo com outro epitopo antigênico.

Anti-A Ab

Ag A

Anti-A Ab

Ag B

Epitopo compartilhado

Anti-A Ab

Ag C

Epitopo similar

Reações Cruzadas

FORÇAS QUE ATUAM NAS INTERAÇÕES FORÇAS QUE ATUAM NAS INTERAÇÕES ANTÍGENO/ANTICORPOANTÍGENO/ANTICORPO

Atua em moléculas não polares facilitando a aproximação, os choques moleculares e as ligações.

Moléculas que apresentam grupos laterais iônicos de cargas opostas que se atraem fortalecendo a interação Ag-Ac.

Forças fracas que ocorrem devido à proximidade física entre as moléculas.

A mais fraca das ligações. Ocorrem entre o núcleo de um átomo e a nuvem de elétrons de outro formando dipolos que se atraem.

Avidez• São as forças totais de interação entre um

antígeno com o anticorpo

Keq = 104

Afinidade

106

Avidez

1010

Avidez

Metodologias que utilizam reagentes não marcados:

•Precipitação

•Aglutinação

•Hemólise (Fixação de Complemento)

Metodologias que utilizam reagentes marcados•Radioimunoensaios

•ELISA

•Imunofluorescência

•Western Blotting

•Citometria de Fluxo

IMUNOPRECIPITAÇÃO

Zona de equivalência: Ag-Ac se ligam equimolarmente formando uma rede estável.

Excesso de antígeno: Os complexos podem ser dissolvidos quando há excesso de Ag pois o Ac fica livre para se ligar a novos Ag adicionados diminuindo a formação de complexos insolúveis.

Excesso de Ac: Ocorre redução de imunocomplexos pois todo o Ag está precipitado e fica Ac livre no sobrenadante.Pró-Zona

IMUNODIFUSÃO

Imunodifusão radial (Mancini)

• Interpretação– Diâmetro do anel é

proporcional à concentração do Ag

• Quantitativo– Níveis de Ig

• Método– Anticorpo no gel– Antígeno no poço

Ag Concentração

Dia

met

er2

AgAgAgAg

Ac no gel

Imunoeletroforese/Precipitação• Método

– Antígenos são separados por eletroforese

• Interpretação– Arco de precipitina representa a interação Ag-AC

Ag-+

Ag

Ab

Ag

Ab

– Anticorpo é colocado num corte no ágar

Imunoeletroforese/Precipitação

Agglutinação/Hemaglutinação

• Definição - testes que possuem como alvo um antígeno de natureza particulada– Aglutinina/hemaglutinina

+

• Teste de aglutinação qualitativa– Ag ou Ac

AGLUTINAÇÃOAGLUTINAÇÃO

Aglutinação/Hemaglutinação

• Teste de aglutinação quantitativa– Título

– Pró-zona1/

2

1/4

1/8

1/16

1/32

1/64

1/12

8

1/25

6

1/51

2

1/10

24

Pos

.

Neg

.

Titer

64

8

512

<2

32

128

32

4

Patient

1

2

3

4

5

6

7

8

Fixação do Complemento

– Antígeno misturado com o soro teste – Complemento é adicionado– Eritrócitos recobertos com anticorpo são adicionados– A quantidade de lise é determinada

Ag

Patient’sserum

Ag No Ag

Ag

• Metodologia

INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO: TESTE DE GRAVIDEZ

AGLUTINAÇÃO EM LÁTEX: FATOR REUMATÓIDE

Fator Reumatóide: Anticorpos que reconhecem epítopos presentes na fração cristalizável (Fc) da molécula de IgG. A maioria destes Acs são da classe IgM porém pode-se encontrar também Acs IgA e IgG.

Teste: Visualização de aglutinação das partículas de látex revestidas pelo antígeno (no caso IgG humana ou de coelho)

Interpretação: Igs com atividade FR estão presentes em pequena quantidade e com baixa avidez no soro de amior parte das pessoas. No caso de artrite reumatóide surge uma alta quantidade de FR de alta afinidade

Causas virais HBV, HCV, Mononucleose, influenza, AIDS, pós vacinação

Doenças auto-imunes Artrite Reumatóide, Lúpus Eritematoseo sistêmico, Esclerose sistêmica, polimiosite, dermatomiosite, síndrome de Sjörgren, cirrose biliar, hepatite auto-imune, etc

Neoplasias Após irradiação ou quimioterapia

Infecções bacterianas Tuberculose, sífilis, hanseníase, salmonelose, endocardite bacteriana subaguda, brucelose, borreliose

Doenças parasitárias Malária, esquistossomose, filariose, tripanossomíase

Enfermidades em que o encontro de Fator Reumatóide é comum