seminário sobre validação 2003

Validação de métodos Validação de métodos cromatográficoscromatográficos

Mestranda: ADRIANA ELIAS PIRES

Orientadora: CLÁUDIA CARDOSO 

Departamento de Química – UFMS

Campo Grande – MS, 2003

SINAIS

OBJETIVO DO MÉTODO?

RESULTADOS PRETENDIDOS?

MATRIZES DE AMOSTRAS?

POSSÍVEIS INTERFERENTES?

NÍVEIS DE EXATIDÃO, PRECISÃO, SENSIBILIDADE, LD REQUERIDOS?

PLANEJAMENTO DE METODOLOGIA

SELEÇÃO DA MATRIZ

DETERMINAÇÃO DAS SUBSTÂNCIAS DE INTERESSE

DETERMINAÇÃO DO SOLVENTE EXTRATOR, VOLUME DE SOLVENTE, MODO DE

EXTRAÇÃO E TEMPO DE EXTRAÇÃO (n>3)

RECUPERAÇÃO 4 CONC. EM TRIPLICATA

MONITORAMENTO POR CLAE:

CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS;

CURVA DE CALIBRAÇÃO

VALIDAÇÃO

QUALIFICAÇÃO DO EQUIPAMENTO ANALÍTICO

ESTABILIDADE DAS SOLUÇÕES ANALÍTICAS ICH

TESTE DE ADEQUAÇÃO DO SISTEMA

Processo que fornece uma evidência documentada de que o método é confiável dentro de uma determinada faixa de aplicação que o analito será analisado.

VALIDAÇÃO

VALIDAÇÃO

Assegura credibilidade às medidas obtidas.

Requisito indispensável para publicação de novas metodologias.

Permite que a transferência de um método entre laboratórios ocorra da forma mais satisfatória.

Guias da US Food and Drug Administration (FDA)Reviewer guidance, Validation of chromatographic methods

guideline for submitting samples and analytical data for methods validation

guidance for industry: analytical procedures and methods validation

guidance for industry: bioanalytical method validation

US Pharmacopeia 24

Internacional Conference on Harmonization (ICH)Q2A Texto on validation of analytical methods

Q2B Validation of analytical procedures: methodology

No BRASIL: Agência Nacional de Vigilância Sanitária.

RE nº899, de 29 de maio de 2003.

ESTRUTURA PARA VALIDAÇÃO DE MÉTODOS

PARÂMETROS DE

VALIDAÇÃO

ESPECIFICIDADE

EXATIDÃO

PRECISÃO

LINEARIDADE

FAIXA DE APLICAÇÃO

LIMITE DE DETECÇÃO

LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO

ROBUSTEZ

ESPECIFICIDADE

Capacidade de um método de diferenciar um composto em presença de outros componentes da amostra (impurezas, intermediários de síntese, excipientes, produtos de degradação e componentes da matriz).

Potenciais interferentes ⇒ ESTRESSE

Especificidade x Seletividade

EXATIDÃO

Grau de concordância ou compatibilidade entre o valor médio dos resultados e o valor de referência aceito.

Exatidão X Acurácia

Exatidão = Conc. média experimental X 100% ANVISA

Conc. aceita

4 CAMINHOS:

1. Análise de amostra de concentração conhecida (padrão de referência) e comparação dos dados com o valor verdadeiro.

2. Comparação dos dados do método novo com os de uma metodologia bem caracterizada de exatidão estabelecida.

3. Recuperação de quantidades conhecidas de analito adicionadas à matrizes brancas.

4. Recuperação de quantidades conhecidas de analito adicionadas à matrizes com o analito.

EXATIDÃO

ICH, ANVISA, USP

EXATIDÃO

Nº DE DETERMINAÇÕES:

Três concentrações em triplicata: 80, 100 e 120% da concentração teórica da amostra. ANVISA, ICH

Recuperação para resíduos: Três concentrações: 1L OQ, 2 LOQ e 10 LOQ.GARP

CRITÉRIOS DE ACEITAÇÃO:Amostras, inclusive produtos farmacêuticos: 100 2%

Impurezas: 0,1% absoluto ou 10% relativoJ.of Chromatography A, 987 (2003) 57

Resíduos: 70 a 120%GARP

Análises bioanalíticas: 15%, sendo no LQ 20%.ANVISA, FDA, ICH

Traços 100ppb 60 a 110%J. Liq. Chrom. & Rel. Technol., 19 (5) 737-757, 1996.

100ppb 80 a 100%

1ppm 70 a 120%

PRECISÃO

Avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma série de medidas do método.

CV = DP x 100 ICH, ANVISA

CMD

onde, CV é o coeficiente de variação, DP é o desvio padrão e CMD, a concentração média determinada.

PRECISÃO

1. REPETITIVIDADE:

Expressa precisão entre os resultados de medidas do mesmo método para a mesma amostra, no mesmo laboratório, pelo mesmo operador usando mesmo equipamento em um curto intervalo de tempo.

Nº DE DETERMINAÇÕES:

3 concentrações em triplicata contemplando intervalo linear ou 6 determinações a 100% da concentração teórica da amostra. ICH, ANVISA, J.Chromatogr.A 987 (2003) 57

Análises bioanalíticas: 3 concentrações em quintuplicata. ICH, ANVISA, J.Chromatogr.A 987 (2003) 57

Precisão do instrumento: 10 injeções de uma solução de amostra. FDA

PRECISÃO: 1. REPETITIVIDADE

CRITÉRIOS DE ACEITAÇÃO:

DOSEAMENTO: 2%; precisão do instrumento 1% J.Chromatogr.A 987 (2003) 57

IMPUREZAS: 5% no LQ; precisão do instrumento 10% no LQ. J.Chromatogr.A 987 (2003) 57

RESÍDUOS: 20% GARP

PRECISÃO

2. PRECISÃO INTERMEDIÁRIA:

Expressa a precisão dos resultados obtidos usando o mesmo laboratório, mas em dias diferentes, com analistas diferentes e/ ou equipamentos diferentes.

Um mínimo de 2 dias diferentes com analistas diferentes. ANVISA

Uso de amostras autênticas é indicado. ICH

PRECISÃO

3. REPRODUTIVIDADE:

Expressa a precisão dos resultados obtidos pelo mesmo método e mesma amostra, por diferentes operadores, usando diferentes equipamentos em diferentes laboratórios. Estudos colaborativos, geralmente

aplicados à padronização de metodologia analítica, por exemplo, para inclusão em farmacopéias. ICH, ANVISA

ALGUNS CRITÉRIOS DE ACEITAÇÃO:± 2% do valor do laboratório primário;

J.Chromatog.A 987 (2003) 57

não se admite valores acima de 5%.ANVISA

Análises bioanalíticas: 15%, sendo no LQ, 20%.ANVISA,FDA

LINEARIDADE & FAIXA DE VARIAÇÃO

Linearidade é a habilidade do método produzir resultados diretamente proporcionais à concentração do analito numa dada faixa de variação.

Faixa de variação é o intervalo entre o maior e o menor níveis de analito que demonstra ser determinado com precisão, exatidão e linearidade usando o método como descrito.

LINEARIDADE & FAIXA DE VARIAÇÃO

80 a 120% da concentração teórica do teste; ICH, ANVISA,

FDA

Impurezas: desde o nível esperado até 120% do limite máximo especificado. Em toxicologia os limites devem se adequar às quantidades a serem controladas; ICH, ANVISA, FDA

Resíduos: ½ a 5 LOQ. GARP

Testes de uniformidade de conteúdo: 70 a 130%; ICH, ANVISA

Ensaios de dissolução: 20% em relação à faixa de variação do teste. ICH, ANVISA

Nº DE DETERMINAÇÕES:

Cinco concentrações em replicata (n>2), ANVISA,,ICH nas seguintes faixas mínimas de variação:

LINEARIDADE & FAIXA DE VARIAÇÃO

A linearidade pode ser demonstrada pelo exame visual do gráfico que relaciona os sinais obtidos na análise e a concentração do analito.

A equação da reta é definida por:

y = ax + b onde: y= resposta; x= concentração; a = coeficiente angular (inclinação/sensibilidade); b = coeficiente linear (intersecção no eixo y qdo x=0)

0 20 40 60 80 100

0

50000

100000

150000

200000

Área

Concentração

Curva de calibração: padrão externo relaciona a resposta do aparelho com a massa do analito sem levar em conta a matriz.

LINEARIDADE & FAIXA DE VARIAÇÃO

Rev. Brasileira de Toxicologia. 11 (1) (1998) 1 e Q.B.Cass; A.L.G. Degani. Desenvolvimento de métodos por HPLC: fundamentos, estratégias e validação.

0 20 40 60 80 100 0

50000

100000

150000

200000

250000

Área

Concentração

Curva de calibração: padrão interno cuja medida permite comparação relativa com o analito, sem interferir com a resposta deste.

LINEARIDADE & FAIXA DE VARIAÇÃO

Padrão interno: retenção próxima, boa resolução em relação ao analito, alta pureza e estabilidade.

Rev. Brasileira de Toxicologia. 11 (1) (1998) 1 e Q.B.Cass; A.L.G. Degani. Desenvolvimento de métodos por HPLC: fundamentos, estratégias e validação.

0 20 40 60 80 100

0

50000

100000

150000

200000

Y

X

Y = A. analito

A. p.interno

X = C. analito

Curva de calibração com adição do analito à matriz elimina a interferência da matriz e outras etapas do método.

LINEARIDADE & FAIXA DE VARIAÇÃO

Rev. Brasileira de Toxicologia. 11 (1) (1998) 1 e Q.B.Cass; A.L.G. Degani. Desenvolvimento de métodos por HPLC: fundamentos, estratégias e validação.

Intersecção no eixo y = qtde de analito na amostra.

Quando há Impossibilidade de matriz branca.

0 20 40 60 80 100 0

500

1000

1500

2000

2500

Área

Concentração

LINEARIDADE & FAIXA DE VARIAÇÃO

REGRESSÃO LINEAR (método dos mínimos quadrados) : é uma forma de estimar qual a melhor reta que passa pelos pontos obtidos experimentalmente.

0 5 10 15 20

0

5

10

15

20

y=-0,15+0,88x

r=0,9981

Área

Concentração

LINEARIDADE & FAIXA DE VARIAÇÃO

COEFICIENTE DE CORRELAÇÃO (r) : expressa a relação de x e y na curva, onde os valores ideais são 1 e –1.

CRITÉRIO MÍNIMO ACEITÁVEL:

= 0,99 ANVISA ; 0,999 FDA

COEFICIENTE DE DETERMINAÇÃO (R) : r 2

0 20 40 60 80 100

0

50000

100000

150000

200000

y=-19,72+198,66x

r=0,9998

Área

Concentração

LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO (LQ)

É a menor quantidade do analito em uma amostra que pode ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis sob as condições experimentais estabelecidas.

LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO

FORMAS DE DETERMINAÇÃO:

1. BASEADA NA AVALIAÇÃO VISUAL: métodos não instrumentais. ICH, ANVISA

ex. CCD, Titulação, Mudança de cor.

2. BASEADA NA RELAÇÃO SINAL-RUÍDO: procedimentos analíticos que exibem ruído de linha de base. Relação sinal-ruído típica é 10:1.ICH, ANVISA, FDA, USP

LQ: FORMAS DE DETERMINAÇÃO

3. BASEADA NO DESVIO PADRÃO DA RESPOSTA E NA INCLINAÇÃO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO. ICH,

ANVISA

LQ: FORMAS DE DETERMINAÇÃO

LQ = 10 DP

S

onde DP é o desvio padrão da resposta e S é a inclinação da curva de calibração.

LIMITE DE DETECÇÃO (LD)

É a menor quantidade do analito em uma amostra que pode ser detectado, porém não necessariamente quantificado, sob as condições experimentais estabelecidas.

LIMITE DE DETEÇÃO

FORMAS DE DETERMINAÇÃO:

1. BASEADA NA AVALIAÇÃO VISUAL ICH, ANVISA

2. BASEADA NA RELAÇÃO SINAL-RUÍDO. Relação sinal-ruído típica é 2 ou 3:1. ICH, ANVISA, FDA, USP

3. BASEADA NO DESVIO PADRÃO DA RESPOSTA E NA INCLINAÇÃO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO, ICH, ANVISA, USP

LD = 3,3 DP ICH, USP ou LD = 3 DP ANVISA

S S

ROBUSTEZ

Um método robusto tem a capacidade de não ser afetado por uma pequena e deliberada modificação em seus parâmetros.

ROBUSTEZ

Preparo das amostras: estabilidade das soluções analíticas, tempo de extração.

Espectrofotometria: variação do pH da solução, temperatura, diferentes fabricantes de solventes.

Cromatografia Líquida: variação do pH da fase móvel, variação na composição da fase móvel, diferentes lotes ou fabricantes de colunas, temperatura, fluxo da fase móvel.

Cromatografia Gasosa: diferentes lotes ou fabricantes de colunas, temperatura, velocidade do gás de arraste.

Os principais parâmetros que podem resultar em variação na resposta do método

QUAIS OS PARÂMETRO

S DE VALIDAÇÃO REQUERIDO

S???

Características de performance versus tipo de procedimento analítico pela ICH:

Procedimento analítico

Identificação

Testes de impurezas Doseamento

Quantitativo

Ensaios-limite

Exatidão não sim não sim

PrecisãoRepetitividadeP. Intermediária

nãonão

simsim

nãonão

simsim

Especificidade sim sim sim sim

LD não não sim não

LQ não sim não não

Linearidade não sim não sim

Faixa de variação

não sim não sim

Características de performance versus tipo de procedimento analítico pela USP: USP Pharmacopeia 24, 1999

Procedimento

analítico

Principais component

es

Impurezas ou produtos dedegradação

características de

performance(ex.

dissolução)

Identificação

Quantitativo

Ensaios-limite

Exatidão sim sim * * nãoPrecisão sim sim não sim não

Especificidade

sim sim sim * sim

LD não não sim * simLQ não sim não * não

Linearidade não sim não * nãoFaixa de aplicação

sim sim * * não* Pode ser requerido dependendo da natureza do teste.

G.A.Shabir, J.of Chromatography A, 987 (2003) 57

J. Babak; H.M. Nielsen, J.of Chromatogr. A . 996 (2003) 213.

R.C. Prados-Rosales; J.L.L. García; M.D.L. de Castro, J.of Chromatogr. A.993(2003) 121.

M. Lampinen; U. Bondesson; E. Fredriksson; M. Hedeland, J.of Chromatogr. B. 789(2003) 347.

T. Verhaeghe; L. Diels; R.de Vries; M. De Meuder; J.de Jong, J of Chromatogr.B. 789(2003) 337.

C. A. L. Cardoso, N. K. Honda, A. Barison, J. Pharm. Biomed. Anal. 27(2002) 217.

Q.B.Cass; A.L.G. Degani. Desenvolvimento de métodos por HPLC: fundamentos, estratégias e validação. EdUFSCar, São Carlos, 2001.

Apostila do curso: Validação de métodos analíticos realizado por ISOLAB Consultoria e Cursos. C.B.Barros; Y.S.Hirata; N.M.N.Sato; Taboão da Serra, dez. 1997.

ICH Harmonised Tripartite Guideline, Validation of analytical procedures: methodology. Geneva, 1996.

F. Leite. Validação em análise química. ed. Átomo, Campinas, 1996.

A.A.M. Chasin; E.S. Nascimento; L.M. Ribeiro-Neto; M.E.P.B. Siqueira; M.H. Andraus; M.C. Salvadori; N.A.G. Fernícola; R. Gorni; S. Salcedo, Rev. Brasileira de Toxicologia. 11 (1) (1998) 1.

Reviewer Guidance. Validation of Chromatographic Methods. Center for Drug Evaluation and Research, US Food and Drug Administration, Rockville, MD, Nov, 1994.

M.E. Swartz; I.S. Krull, Pharmaceutical Technology, (1998) 12.

D.R. Jenke. Chromatographic method validation: a review of current practices and procedures. II. Guidelines for primary validation parameters. J. Liq. Chrom. & Rel. Technol., 19 (5) 737-757, 1996.

Resolução - RE nº 899, de 29 de maio de 2003.

Guidance for industry. Bioanalytical method validation. US Departament of Health and Human Services, Food and Drug administration, Center for Drug Evaluation and Research and Center for Veterinary Medicine, Rockville, MD, Maio, 2001.

J.K.Taylor (1987) Quality assurance of chemical measurements. 2 ed., Lewis Publishers, Chelsea, 1987.

USP 24 (United States Pharmacopeial Convention, Rockville, MD, 1999)

C.B.Barros, Biológico, 64(2) (2002) 175

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

FIM