met 05/2016 processos de fermentação alcoólica com reciclo de
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Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais
Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol
MeT 05/2016
Processos de Fermentação Alcoólica com Reciclo de Células
Celina Kiyomi Yamakawa
Jairo Silvestre Moura Leal
Jonas Nolasco Junior
Carlos Eduardo Vaz Rossell
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RESUMO
O desenvolvimento da pesquisa em fermentação alcoólica com reciclo
de células envolvem as etapas de propagação celular, formulação do substrato
e a fermentação alcoólica propriamente dita. Todas essas etapas devem ser bem
delineadas para alcançar resultados reprodutivos e conclusivos em relação ao
efeito das variáveis estudadas. Neste memorial técnico são apresentados os
métodos bases para pesquisa, desenvolvimento e validação de processos.
Palavras-chave: fermentação alcoólica, protocolo, batelada, batelada alimentada
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SUMÁRIO
RESUMO............................................................................................................ 2
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................ 4
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................ 5
3 MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................... 6
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS .......................................................................... 15
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 16
4
1 INTRODUÇÃO
A pesquisa aplicada ao desenvolvimento e validação de uma nova
tecnologia em fermentação alcoólica é testada primeiramente em bancada para
reproduzir condições similares à um processo industrial, cujo objetivo é testar a
robustez e estabilidade de um novo processo ou novo produto, nova cepa ou
novo micro-organismo, e também desenvolver soluções de desengargalamentos
técnicos. As configurações empregadas em experimentos de bancada
dependem da maturidade do produto ou do processo. São eleitas
preferencialmente sistema batelada e batelada alimentada, entretanto, não se
exclui a configuração contínua.
A fermentação em batelada pura tem sido aplicada para obter dados
cinéticos fundamentais para analisar o comportamento do micro-organismo
frente à ampliação de escala, tensão de cisalhamento, inibições por substrato,
células ou produtos. Essas primeiras informações norteiam a configuração do
processo. Quando essas informações são conhecidas, o objeto de pesquisa é
testado na configuração batelada alimentada em que altas produtividades e
conversões são alcançadas.
O Laboratório de Fermentação Alcoólica pertencente ao grupo de
Biotecnologia de Processamento de Biomassa (BPB) da Divisão de
Processamento de Biomassa (Proc) do CTBE tem adotado protocolos
experimentais padrões para a pesquisa e desenvolvimento de novos processos
biotecnológicos. Assim, este memorial técnico tem por objetivo apresentar
protocolos experimentais padrões de cultivo de Saccharomyces cerevisiae, de
fermentação alcoólica em batelada e em batelada alimentada e as técnicas
analíticas de acompanhamento de processos.
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2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Há inúmeras referências sobre a quantidade necessária para avaliar o
desempenho de um processo de fermentação alcoólica com reciclo de células.
Andrade et al. (2013) realizaram estudo cinético de fermentação alcoólica em
batelada com reciclo de células com substrato a partir de licor hidrolisado
celulósico de bagaço e melaço de cana de açúcar em 7 fermentações
sucessivas. O rendimento fermentativo estabilizou a partir do 4° ciclo, entretanto
a produtividade específica de etanol oscilou entre 1,75 a 2,25 a partir do 2° ciclo.
Silva et al. (2015) validaram a produção de licor hidrolisado celulósico de bagaço
de cana de açúcar em 5 sucessivas fermentações alcoólica em batelada com
reciclo de células enriquecendo o licor com extrato de levedura e KH2PO4. A
produtividade específica de etanol aumentou conforme o reciclo, sendo no 1°
ciclo de 1,94 g/L.h e no último ciclo de 5,81 g/L.h. O rendimento fermentativo
oscilou entre 85% e 88%. Rivera et al. (2013) propuseram um procedimento para
estimar os parâmetros cinéticos utilizando dados de 3 sucessivas fermentações
alcoólica em batelada alimentada com reciclo de células com caldo de cana de
açúcar. Exceto o primeiro ciclo, as duas fermentações seguintes apresentaram
perfis semelhantes de substrato, células e etanol. Marques & Serra (2004)
realizaram estudo de reciclagem de células em batelada com melaço de cana
de açúcar em baixa e alta concentração. O rendimento fermentativo foi
praticamente igual a partir do 4° ciclo no meio de baixa concentração de
açúcares diferentemente das fermentações com alta concentração de açúcares
em que houve uma variação do rendimento fermentativo.
Portanto, o número de reciclos de células dependerá do objeto do
estudo. Em geral para um levantamento preliminar de avaliação de um novo
meio ou nova cepa recomenda-se 5 a 6 ciclos que representação 4 e 5 reciclos
de células. Já para validar um novo processo e/ ou micro-organismo em termos
de robustez, produtividade, reprodutibilidade, recomenda-se no mínimo 10 ciclos
que representarão 9 reciclos. Independentemente da quantidade de reciclos é
fundamental o acompanhamento e análise de cada fermentação através de
técnicas analíticas rápidas e simples para facilitar a tomada de decisão sobre a
continuidade ou finalização dos experimentos.
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O processo em batelada é caracterizado pela transferência do meio ao
biorreator em uma única vez seguida de inoculação do micro-organismo. É uma
maneira simples e largamente utilizada em laboratório e industrialmente. No
processo contínuo há suplementação contínua de meio ao biorreator e uma
retirada contínua dos produtos, subprodutos e células. Após um determinado
tempo, as concentrações de substrato, produtos e células se mantêm
constantes. O processo contínuo fornece condições constantes para o
crescimento celular e a formação de produtos dentro de um padrão de qualidade.
O processo em batelada alimentada, substrato e nutrientes são continuamente
ou semi-continuamente alimentados enquanto que o produto é removido
intermitentemente é usualmente empregada para superar a inibição por produto
ou repressão catabólita e dessa maneira, melhorar a produtividade (Shuler &
Kargi, 1992).
O processo industrial brasileiro para produção de etanol combustível por
fermentação de caldo e melaço de cana de açúcar com reciclo de células é
predominantemente conduzido em batelada alimentada e poucas em processo
contínuo (Andrietta et al. 2011). A fermentação em batelada alimentada com
reciclo de células é também chamada de fermentação Melle-Boinot uma vez que
este foi baseado no processo desenvolvido pela Usina Melle e por Fimin Boinot
em 1936 (Patente US2230318A). O processo Melle-Boinot permitiu aumentar a
produtividade e rendimento da fermentação por meio da alta densidade celular,
alimentação gradativa de substrato que minimizaram inibições e dessa forma,
reduziu o tempo total de fermentação. Além disso, o reciclo de células eliminou
a demanda de açúcares e nutrientes somente para propagação celular.
3 MATERIAIS E MÉTODOS
O experimento de fermentação alcoólica pode ser dividido nas seguintes
etapas:
Propagação celular;
Formulação do substrato;
Fermentação alcóolica.
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Neste item são apresentados os protocolos básicos de propagação
celular, formulação do substrato e fermentação alcoólica.
3.1 Propagação celular
A propagação celular inicia com a transferência da cultura pura estoque,
armazenada em criogenia em glicerol ou em placa ou em tubo slant em meio de
cultura sólido, para um meio líquido YPD formulado de acordo com a Tabela 1
denominado de pré-inoculo.
Tabela 1. Formulação do pré-inoculo
Reagentes Concentração (g/L)
Extrato de levedura 10,00 Bacto peptona 20,00 Glicose 20,00
Extrato de levedura e bacto peptona estão no estado sólidos e são
autoclavados a 121°C/ 15 minutos com quantidade de água correspondente. A
solução de glicose é preparada separadamente a aproximadamente 500 g/L e
esterilizada em autoclave. Usualmente o pré-inoculo é preparado em frasco
Erlenmeyer de 1 L com 200 mL de volume útil. As quantidades dos reagentes
correspondentes estão apresentadas na Tabela 2.
Tabela 2. Quantidade dos reagentes para 200 mL
Reagentes Quantidade Unidade
Extrato de levedura 2,000 g Bacto peptona 4,000 g Solução de glicose a 500 g/L 8,000 mL Água 192,000 mL
A solução de glicose e a cultura estoque são transferidos ao frasco estéril
sob o fluxo laminar e em seguida é incubado em um shaker orbital a 250 rpm e
temperatura entre 30 e 34°C durante 24 horas. Essas condições são variáveis e
dependem da cepa do micro-organismo. Se a cultura estoque estiver em placa
ou slant são transferidas 3 alçadas para o meio líquido.
Em seguida 10% do volume do pré-inoculo é transferido à um novo meio
chamado inoculo que é um meio similar ou idêntico ao meio de propagação da
fase seguinte. O meio inoculo contêm açúcares, sais, proteínas que fornecerão
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os nutrientes para a multiplicação celular. A Tabela 3 mostra uma formulação
típica. As soluções termosensíveis, ureia e DAP, são filtradas em membranas de
0,45 ou 0,22 micra. Os sais, extrato de levedura e água são autoclavadas juntas
a 121°C/ 15 min. O substrato convencional de processos industriais de etanol
por via bioquímica é preparado com melaço e caldo de cana de açúcar.
Usualmente formula-se com 79% de ART (açúcar redutor total) proveniente do
caldo/ xarope e o restante do melaço. O xarope é de difícil estoque uma vez que
é suscetível a contaminação, uma boa alternativa é o uso de açúcar cristal
comercial. Para isso é necessário preparar uma calda previamente. O inoculo é
incubado nas mesmas condições do pré-inoculo, mas em um tempo menor entre
6 a 12 horas.
Tabela 3. Formulação do inoculo
Reagentes Concentração Un.
Ureia (NH2)2CO 5,00 g/ L
DAP (NH4)2HPO4 1,10 g/L
Sulfato de magnésio (MgSO4.7H2O) 1,00 g/ L
Sulfato de zinco (ZnSO4. 7H2O) 5,00 mg/ L
Substrato- ART 80,00 g/ L
Extrato de levedura 5,00 g/ L
A propagação celular pode ser realizada em um fermentador de 2 L (New
Brunswick, EUA), apresentado na Figura 1, para atingir a massa necessária para
fermentação em alta densidade celular. A propagação começa em batelada
seguida de batelada alimentada de maneira a manter a concentração de ART
abaixo de 20 g/L para favorecer a via metabólica aeróbia da levedura. A vazão
é medida através de uma balança semi-analítica (4) instalado sob o frasco de
alimentação de substrato (3) e um cronômetro digital. Pela diferença de duas
medidas de massa dividido pelo tempo cronometrado têm-se a vazão em g/min.
e este é correlacionado com a rotação da bomba peristáltica (5). O vaso do
fermentador (2) é montado com sondas de pH e oxigênio dissolvido e esterilizado
com água potável a 121°C/ 30 min, seguindo o protocolo de operação padrão do
equipamento CTBE-ME-014/11 rev.00. Após a calibração da sonda de DO, as
soluções de sais, açúcares e o inoculo são transferidos ao vaso. O controle da
temperatura e DO é realizado através da torre de controle do fermentador (1).
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Figura 1. Set up experimental de uma propagação de levedura
Em um fermentador de 2 L o volume inicial da batelada é de 800 mL e o
volume a ser alimentado é de 1.200 mL. A formulação dos dois meios é igual
exceto pela quantidade de açúcares. O meio batelada possui 50 g/L e o meio da
batelada alimentada possui 150 g/L. A Tabela 4 apresenta a formulação do meio
de propagação celular em fermentador. O inoculo obtido na etapa anterior em
frascos é centrifugado e o pellet é diluído em água estéril até o volume total de
50 mL e transferido à um frasco mariote para inocular. A temperatura é ajustada
entre 30 e 34°C e os parâmetros de agitação de vazão de ar são controlados de
forma a manter o DO acima de 30% por controle em cascata ou ajuste manual.
Tabela 4. Formulação do meio de propagação
Reagentes Concentração Un.
Ureia (NH2)2CO 5,00 g/ L
DAP (NH4)2HPO4 1,10 g/L
Sulfato de magnésio (MgSO4.7H2O) 1,00 g/ L
Sulfato de zinco (ZnSO4. 7H2O) 5,00 mg/ L
Substrato – ART 50,00 g/ L
(2)
(1)
(5)
(3)
(4)
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A alimentação do meio inicia-se normalmente após 1 hora em que os
açúcares já estão abaixo de 20 g/L e quando observa-se o turvamento do meio.
A vazão é ajustada de acordo com a taxa de consumo de açúcares, mas também
pode-se adotar uma alimentação linear de forma a manter a limitação em ART.
O tempo total de propagação é entre 20 e 24 horas.
Os valores típicos de velocidade máxima específica de crescimento
(max) na fase exponencial é entre 0,30 a 0,45 h-1 e na fase estacionária é entre
0,10 a 0,15 h-1.
O meio fermentado, após a finalização da propagação, é bombeado
frasco schott que serviu de alimentação. Antes desse procedimento é necessário
aumentar a vazão de ar em 1,0 L/min para evitar a sucção do ar através do
condensador e resfriar o meio entre 15 °C e 20 °C para evitar a formação de
vácuo durante a centrifugação. Em seguida, de forma estéril, no fluxo laminar, o
meio fermentado é dividido em dois frascos de centrífuga de 1 L estéril ou
sanitizado para centrifugação em uma centrífuga Avanti J-26 XP (Beckman
Coulter, EUA) com rotor JLA-9100 a 8.000 rpm (13225,3 x g) durante 20 minutos.
Em seguida, o sobrenadante é descartado e o pellet é diluído em água no volume
requerido para compor a solução de leveduras comumente chamada de pé de
cuba, da fermentação alcoólica. Caso o tempo para o início da fermentação
alcoólica superar 20 dias, recomenda-se o armazenamento no refrigerador em
solução salina com 1% de peptona.
Figura 2. Imagem de Saccharomyces cerevisiae em microscópio óptico com lente objetiva de 40x
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As análises recomendadas durante a propagação são açúcares, etanol,
absorbância a 600 nm, e microscopia óptica. A Figura 2 mostra uma microscopia
típica com uma lente objetiva de 40x, de levedura Saccharomyces cerevisiae
durante a propagação celular, nota-se a presença de brotos na maioria das
células adultas.
3.2 Formulação do substrato
O substrato ou comumente chamado de mosto nas usinas, para
fermentação alcoólica pode ser formulado em diferentes concentrações e
proporções de caldo e melaço de cana de açúcar. Também pode ser sintético a
partir de sais, minerais e outros açúcares. Outras matérias primas também
podem são utilizadas para compor o mosto, por exemplo, licor celulósico de
bagaço de cana de açúcar. Em todos os casos recomenda-se um tratamento
físico-químico e de forma separada no caso de formulações de diferentes fontes
de açúcar ou proteínas para evitar reações indesejáveis durante a esterilização.
Basicamente um tratamento físico-químico do substrato ocorre com a
adição de ácido fosfórico, H3PO4 a 85%, adição de leite de cal até atingir pH de
6,4, seguido de aquecimento até 95°C e então adição de polímero não-iônico.
Em seguida mantém em repouso para a formação de flocos seguida de
resfriamento e separação por centrifugação ou decantação. O tratamento físico-
químico visa formar flocos para agregar os sólidos suspensos que possam
decantar a uma velocidade satisfatória, fornecer condições de temperatura, pH
e concentração de íons que maximizam a precipitação das impurezas solúveis e
enfim produzir um meio clarificado de alta qualidade com mínima turbidez e baixa
concentração de cálcio. A função do H3PO4 é remover corantes e parte dos
coloides. O leite de cal somado ao aquecimento induzem a precipitação de
fosfato de cálcio, sais de ácidos orgânicos, proteínas desnaturadas, gorduras,
ceras e gomas. O polímero adicionado no final do processo tem por objetivo
formar cadeias longas de massa molecular alta para arrastar as impurezas
(Coopersucar, 1987). As quantidades de ácido fosfórico e polímero são
determinadas previamente em um teste de bancada inicial.
Após o tratamento físico-químico, o mosto é dividido em frascos
Erlenmeyer na quantidade necessária para cada fermentação para ser
esterilizado a 121°C ou de acordo com o procedimento experimental. O tempo
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de esterilização dependerá da concentração do mosto e do volume. Recomenda-
se usar no máximo 50% do volume total do frasco para permitir uma troca térmica
efetiva.
O cálculo da concentração de ART no mosto é definido em função da
concentração de etanol final desejado e da conversão aproximada de substrato
à etanol (YP/S). Assim são necessários definir os principais parâmetros listados a
seguir:
Concentração de etanol final: a faixa típica industrial é entre 67 g/L (8,5%
v/v) e 75 g/L (9,5% v/v), mas há usinas que operam acima desse valor e há
linhas de pesquisas para obter vinhos de alto teor alcoólico (15%v/v) devido
às inúmeras vantagens. Para esse cálculo é necessário considerar o etanol
que é reciclado juntamente com a suspensão celular após o tratamento de
células (pé de cuba);
Taxa de reciclo (R): relação da quantidade de pé de cuba sobre soma de pé
de cuba e mosto. O valor usual é de 0,3 no processo batelada alimentada,
ou seja, 1/3 do volume total do fermentador é dedicado ao pé de cuba e 2/3
do fermentador é para o mosto;
Conversão aproximada (YP/S): conversão de açúcares fermentescíveis a
etanol. O valor teórico estequiométrico é de 0,511 g/ g. Comumente
adotamos o valor de 0,46 g/g que corresponde a um rendimento de 90%
para considerar o desvio de substrato para crescimento e manutenção
celular, produção de ácidos orgânicos, glicerol e outros subprodutos;
Concentração de células (X): tipicamente o processo Melle-Bonoit opera
com 10% (v/v) ou cerca de 30 g/ L (base seca). Portanto, com uma taxa de
reciclo de 0,3, a concentração do pé de cuba deve ser de 90 g/ L para atingir
30 g/ L após o término da alimentação de mosto. Tipicamente a relação de
base seca para base úmida é de 3. Essa relação pode alterar em função da
cepa de levedura e das condições de fermentação.
É apresentado um exemplo para ilustrar o cálculo para definir a
concentração do mosto.
Teor alcoólico do vinho final: 9,5 °GL ou 75 g/L;
Taxa de reciclo (R): 0,3;
Conversão aproximada (YP/S): 0,46;
Concentração de células (X): 10% (v/v) ou 30 g/L.
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O volume útil do fermentador é de 2,1 L. Assim, a quantidade de pé de
cuba corresponderá a 700 g e a quantidade de mosto será de 1633 g. A
quantidade final será de aproximadamente 2.100 g descontando quantidade de
CO2 liberado e a quantidade de perda por amostragem considerando 15 g em 5
amostragens.
Quantidade de CO2 produzido = Etanol produzido x 0,956.
Etanol produzido = massa de ART x 0,46 + massa de pé de cuba x
concentração de etanol no pé de cuba/ densidade.
Estimativa da concentração de etanol no pé de cuba = concentração de
etanol no vinho final x massa úmida de células/ massa de pé de cuba => 75
g/ L x 189 g / 700 g = 20,25 g/ L.
A quantidade de ART necessário obtém através do cálculo interativo, por
exemplo com o solver do Excel, considerando as restrições de taxa de reciclo
e volume final.
Figura 3. Exemplo de cálculo no Excel
Dessa forma, a quantidade de mosto necessário é de 2.177,2 g a 217,46
g/L.
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3.3 Fermentação alcoólica
A diferença da fermentação alcoólica em batelada e batelada alimentada
é a maneira que ocorre a transferência de substrato. Em ambos os casos a
suspensão de células estará no fermentador previamente. No caso da batelada
alimentada, após o tratamento celular, todo mosto é bombeado de uma só vez.
Já na batelada alimentada, o mosto é bombeado gradativamente.
Figura 4. Diagrama de blocos de fermentação alcoólica com reciclo de células
A Figura 4 apresenta esquematicamente o processo base de
fermentação alcoólica com reciclo de células. A fermentação alcoólica inicia com
a transferência primeiramente da suspensão celular ao fermentador e em
seguida transfere-se o substrato previamente formulado, tratado e esterilizado.
Durante a fermentação há exaustão de CO2 pelo condensador, assim espera-se
que o peso final do vinho seja menor que a soma da massa do que entrou,
suspensão celular e substrato. Durante a exaustão dos gases há arraste de
componentes voláteis que representam cerca de 1 a 2% de etanol produzido.
Após o término da fermentação, o meio fermentado chamado de vinho é
centrifugado. O meio fermentador isento de células é descartado ou destilado. É
interessante fixar a massa úmida de pellet para iniciar a próxima fermentação
com aproximadamente a mesma quantidade de células iniciais. Após ajustar a
quantidade de biomassa úmida, acrescenta-se água potável estéril para diluir o
pellet e transferir de volta ao fermentador. O tratamento ácido é realizado no
mesmo vaso de fermentador. Se a próxima fermentação não começar
imediatamente, a suspensão celular deve ser mantido refrigerado a 10°C e
aerado para manter a pressão positiva no biorreator. Assim a fermentação
seguinte inicia com o ajuste da temperatura e tratamento ácido.
Fermentação alcoólica
CentrifugaçãoTratamento
ácido
VinhoCreme de levedura
Vinho delevurado
Água
Ácido
Pé de cuba
Mosto
CO2
V.C.
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O balanço mássico para calcular rendimento fermentativo, produtividade
de etanol e de células é realizado no volume de controle em destaque (V. C.).
As massas de suspensão celular, substrato e meio fermentador são medidas por
peso em balança semi-analítica e a massa de CO2 liberado é calculado
indiretamente em função da quantidade de etanol produzido. Os componentes
são analisados por cromatografia líquida de alta performance (HPLC). A
determinação da concentração de células é realizada por gravimetria. A
densidade de cada corrente é consultada em tabelas que correlacionam com a
quantidade de sólidos solúveis (°Brix) ou medidas.
Durante a fermentação são realizadas análises de monitoramento por
meio de espectroscopia de infravermelho com curvas calibradas de sacarose,
açúcares redutores (glicose e frutose) e etanol. A concentração celular é
monitorada por análise de absorbância a 600 nm e também por analisador on
line de capacitância. Outras técnicas podem ser aplicadas para controlar e
monitorar o desenvolvimento de processos de fermentação alcoólica.
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS
É fundamental um protocolo experimental base para o desenvolvimento
da pesquisa em fermentação alcoólica seja em batelada, batelada alimentada
ou contínua e validação de novos processos.
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
De Andrade, R.R. et al., 2013. Kinetics of ethanol production from sugarcane bagasse enzymatic hydrolysate concentrated with molasses under cell recycle. Bioresource Technology, 130, pp.351–359.
Andrietta, M., Andrietta SR & Stupiello, E., 2011. Bioethanol what has Brazil learned about yeasts inhabiting the ethanol production processes from sugar cane? , pp.67–84. Available at: http://cdn.intechopen.com/pdfs-wm/20057.pdf.
Rivera, C. E. et al., 2013. A Procedure for Estimation of Fermentation Kinetic Parameters in Fed-Batch Bioethanol Production Process with Cell Recycle. Chemical Engineering Transactions, 32, pp.1369–1374.
Coopersucar, Cooperativa de produtores de cana, açúcar e álcool do estado de São Paulo (1987): Fermentação. São Paulo.
Marques, T.A. & Serra, G.E., 2004. Estudo da reciclagem de células na produção biológica de etanol. Ciência e Tecnologia de Alimentos, 24(4), pp.532–535.
Boinot, F. & Melle,1936. Process for carrying out industrial alcoholic fermentations. Patent US2230318A.
Silva, V.F.N. et al., 2015. Using of cell recycle batch fermentations to validate a setup for cellulosic ethanol production. Journal of Chemical Technology & Biotechnology, (February), p.n/a–n/a. Available at: http://doi.wiley.com/10.1002/jctb.4778.
Shuler, M. & Kargi, F., 1992. Bioprocess Engineering: Basic concepts. Prentice Hall, ISBN 0-13-478215-1.
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