Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de Pernambuco

Departamento Acadêmico de Sistemas, Processos e Controles Industriais - DACI

Processos Biotecnológicos Industriais

ANÁLISE TECNOLOGICA DA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA

Aldo Henrique Francisco da Silva ReisGabriela Sá Lucena da SilvaGildelayne Medeiros da Silva Marcos Gomes da Silva JuniorPlinio Antoninho de Freitas Sulamita Cristina Vera Cruz

Recife 04 Outubro de 2016

Sumário

1. INTRODUÇÃO......................................................................................................................32. MATERIAIS UTILIZADOS..................................................................................................4

2.1 Microorganismo:...............................................................................................................42.2 Materiais:..........................................................................................................................42.3 Soluções:...........................................................................................................................42.4 Equipamentos:...................................................................................................................5

3. METODOS.............................................................................................................................65. RESULTADOS E DISCUSSÕES..........................................................................................8

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1. INTRODUÇÃO

A fermentação é um processo de liberação de energia que ocorre sem a participação do

oxigênio (processo anaeróbio). A fermentação compreende um conjunto de reações

enzimaticamente controladas, através das quais uma molécula orgânica é degradada em

compostos mais simples, liberando energia. A glicose é uma das substâncias mais empregadas

pelos microrganismos como ponto de partida na fermentação. [1]

Esse tipo de fermentação é realizado por diversos microrganismos, destacando-se os

chamados “fungos de cerveja”, da espécie Saccharomyces cerevisiae. O homem utiliza os

dois produtos dessa fermentação: o álcool etílico empregado há milênios na fabricação de

bebidas alcoólicas (vinhos, cervejas, cachaças etc.), e o gás carbônico importante na

fabricação do pão, um dos mais tradicionais alimentos da humanidade. Mais recentemente

tem-se utilizado esses fungos para a produção industrial de álcool combustível. [1]

A aula pratica teve como objetivo, desenvolver experimentalmente e acompanhar um

processo de fermentação alcoólica, utilizando como matéria prima o caldo de cana e como

microrganismo fermentador levedura comercial.

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2. MATERIAIS UTILIZADOS

2.1 Microorganismo:

2 (dois) Saches Levedura comercial (Saccharomyces cerevisae) da marca Dona Benta.

2.2 Materiais:

Balões volumétricos de 200 ml; Bastão de vidro; Béqueres; Erlenmeyer; Frasco de com tampa rosqueada; Pipetas volumétricas de 20 e 25 ml; Provetas; Buretas; Mangueira

2.3 Soluções:

Caldo de cana; NaOH 24%; NaOH 0,025 N; HCl 6 N; Nitrato de cálcio Fehling A Fehling B Água destilada; Fenolftaleína 1%; Azul de metileno 1%.

2.4 Equipamentos:

Banho-maria à 60°C; Ebuliômetro; Phmetro ; Chapa aquecedora; densimetro; Régua de correlação; Termômetro.

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3. METODOS (A pratica foi realizada em dois dias).

Primeiro dia: Primeiramente, com o auxilio de algodão, 500 ml de caldo foi filtrado para

retirar restos de bagaço e colocado em um erlenmeyer de 1000 mL sendo homogeneizado

com um bastão. Em seguida foi determinado o Brix (percentagem em peso de sólidos em uma

solução), enchendo uma proveta com a amostra, e imergindo cuidadosamente o densimetro,

até o ponto de afloramento, tomando o cuidado de não molhar a haste acima deste ponto.

Aguardou-se algum tempo para que o densímetro não se encoste à parede da proveta,

posteriormente foi feita a leitura do Brix que deu 24, então foi necessário realizar uma

diluição para atingir o Brix desejado de 15.

Para a Determinação de Açúcares redutores Totais (ART), usamos o método de Lane –

Eynon foi transferido 25 mL do mosto para um balão volumétrico de 200mL; completou o

volume com água à aferição do balão e homogeneizou bem; Pipetou-se 20mL deste caldo

diluído para outro balão volumétrico de 200mL.

Em seguida foi feito o processo analítico, em que foi adicionado aproximadamente 50

mL de água destilada; em seguida, aqueceu em Banho Maria até 65ºC e foi adicionado um

termômetro para controle da temperatura; ao retirar do banho - Maria e adicionou 10 mL de

solução de HCl 6N. Deixamos esfriar espontaneamente até a temperatura ambiente (repouso

de aproximadamente 30min.); Para a neutralização, foi utilizado uma solução de NaOH a 24%

uma solução alcoólica de fenoftaleína a 1% como indicador. Posteriormente resfriamos em

água corrente até temperatura ambiente e completamos o volume a aferição do balão com

água destilada.

Foi preparado o licor de Fehling, que posteriormente foi titulado com a solução anterior.

Para sua preparação foi adicionado, em um erlenmeyer de 500 mL, 5 mL de solução de

Fehling A e 5 mL de solução de Fehling B. Para realizar a titulação foi necessário ambientar a

bureta de 50 mL com a solução que sofreu a inversão da sacarose e a aferiu.

Com o auxílio de uma chapa aquecedora, colocamos o erlenmeyer, que continha o licor

de Fehling, e fizemos a titulação. Primeiramente, abrimos a válvula e deixamos cair 10 mL da

amostra e esperamos até o ponto de ebulição. Manteve a ebulição por aproximadamente 2

minutos e em seguida foi colocado 2 a 3 gotas de azul de metileno a 1% no erlenmeyer e por

fim foi feito a titulação e anotamos o volume gasto.

Para a acidez sulfúrica (indica a quantidade total de ácido, expressos em ácido sulfúrico,

presente na solução), primeiramente foi transferido 25 mL do mosto para um balão

volumétrico de 200 mL e foi completado com água à aferição do balão e se fez a

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homogeneização. Para o procedimento analítico do mesmo, foi transferido 20 mL da amostra

preparada para um erlenmeyer de 200 mL e adicionamos ± 50 mL de água destilada junto a

três gotas de solução alcoólica de fenolftaleína a 1%. Ambientamos a bureta com um pouco

de solução 0,025N de hidróxido de sódio e a enchemos. Fizemos a titulação e anotamos

volume gasto de NaOH 0,025N. Fizemos em triplicata.

Para a fermentação, foi transferido 300ml de mosto para um kitasato de 1000 mL, foi

adicionado os dois saches de fermento biológico, acoplamos uma mangueira e introduzimos

em um frasco que continha hidróxido de cálcio, e deixamos descansar por 24h.

Segundo dia: Foram feitos os mesmos procedimentos, Brix, pH, e acidez sulfúrica, mas

dessa vez com o caldo já fermentado, não foi determinado os açucares redutores totais pois os

açúcares presentes já foram consumidas na glicólise e transformada em etanol e subprodutos.

Por ultimo foi feito teor alcoólico, colocando 50 mL da amostra fermentada, que foi

separada antes dos procedimentos anteriores, no ebuliometro (figura 1) sob a chama. Ao

entrar em ebulição foi verificada o seu ponto de ebulição e comparar na régua de correlação

onde será dado o teor em graus Gay-Lussac (GL).

Figura 1 - Ebuliômetro

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4. RESULTADOS E DISCUSSÕES

Pimeiro dia: O caldo de cana teve um pH 5 e um Brix em 24°. Como não está nos

parâmetros adequados (14 – 18°) tivemos que fazer uma diluição para 15°, utilizando a

seguinte fórmula:

C1 x V1 = C2 x V2

Onde:

C1: Concentração inicial

V1: Volume da amostra

C2: Concentração desejada

V2: Volume que queremos descobrir

24 x 300 = 15 x V2

V2 = 480 mL

Com isso verificamos que era preciso adicionar 180 mL de água destilada.

Na titulação para encontrar o total de ácido presente na amostra, expresso em acidez

sulfúrica, gastamos 1,5 mL de NaOH 0,025N. Com esse resultado, calculamos o teor da

acidez, usando regra de três:

NaOH 1N _____________ 49g H2SO4

1 ml de NaOH 0,025N_____________ x

x = 49 x 0,025 / 1000 = 1,225 / 1000g H2SO4

1 ml NaOH 0,025N _____________ 1,225 / 1000 g H2SO4

Vg ml NaOH 0,025N _____________ y

y = Vg x 1,225 / 1000g H2SO4

20 ml amostra _____________ vg x 1,225 / 1000

200ml amostra _____________ z

z = 200 / 20 x Vg x 1,225 / 1000 z = Vg x 1,225 / 100

25ml _____________ Vg x 1,225 / 100

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100ml _____________ w

w = Vg x 100 x 1,225 /100 w = Vg x 0,049g de H2SO4

Acidez do Mosto = Vg x 0,049g de H2SO4

Onde:

Vg = Volume gasto na titulação

Acidez do Mosto = 1,5 x 0,049g de H2SO4 = 0,0735g

Para os Açucares Redutores Totais (ART), utilizamos 35 mL de solução com sacarose

invertida, onde ocorreu a precipitação do óxido cúprico, havendo assim, a mudança de

coloração do azul para o marrom tijolo. Para a medição do teor dos açúcares totais, fizemos

regras de três:

Vg ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ 0,05g de glicose

200ml ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ x

x = 200 x 0,05g / Vg x = 10 / Vg

25ml ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ 10 / Vg

200ml ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ y

y = 200 x (10/Vg) / 25 y = 80 / Vg

25ml ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ 80 / Vg

100ml ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ z

z = 100 x (80/Vg) / 25

z = ART % mosto = 320 / Vg

Onde:

Vg: Volume gasto

z: Teor de ART na amostra

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z = 320 / 35 = 9,14%

Como utilizamos o método de Lane – Eynon, então, se fez necessário o licor de Fehling.

Entretanto, como o caldo da cana, na sua matéria – prima é a sacarose e como o Fehling não

reage a esse composto, por não ser um açúcar redutor, então se deve fazer a sua hidrolise.

Para isso, utilizou 10 mL HCl que é um catalisador inespecífico, ou seja, quebra qualquer tipo

de ligação glicosídica, até que os produtos finais sejam monossacarídeos acompanhado de um

aquecimento até 65°. A titulação na chapa quente se deve ao fato que, como o óxido cúprico

reage facilmente com o O2 do ar, então é necessário que o licor esteja em constante

aquecimento (Figura 2).

Segundo dia: No segundo dia, com a amostra já fermentada, o pH diminuiu e foi para

3,9 e o Brix foi zero, pois quando ocorre a formação do vinho, o Brix é zero ou negativo,

devido ao consumo de açucares pela levedura.

O gás carbônico obtido no processo indica o início da reação de fermentação e expulsa o

oxigênio do ar presente, inicialmente, no interior do sistema, evitando dessa maneira a

formação de ácido acético, o que daria à bebida um gosto ruim. O borbulhamento do gás na

solução de Ca(OH)2 provoca a formação de um precipitado branco de carbonato de cálcio, o

CaCO3 :

      CO2(g)  +  Ca(OH)2(aq)  →  CaCO3(s)  +  H2O(l)

Para a acidez sulfúrica, fio gasto o volume médio de 8,5 mL de NaOH 0,025 N e, fazendo

os mesmos cálculos do primeiro dia, encontramos o valor da acidez de 0,416 g.

Para o teor alcoólico, em 94,5 °C houve a estabilização e verificando a régua de

correlação, encontramos o teor alcoólico, que foi de 8,1° Gay-Lussac.

Para verificarmos o teor alcoólico, é necessário que haja fermentação. A fermentação

alcoólica é um processo em que uma levedura realiza um caminho longo até a produção do

Figura: 2

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etanol. Primeiramente, as leveduras secretam invertase, para que a sacarose da cana hidrolise

e forme glicose e frutose. Essa glicose servirá para a formação de piruvato, através da

glicólise. Com o piruvato, as leveduras fazem a fermentação alcoólica e formam etanol e do

CO2 em forma de gás. Porém, na glicólise e na própria fermentação, existem os subprodutos

produzidos nas reações que são: Glicerol (figura 3), ácido acético (figura 4), acetoína (figura

5), 2,3 butanodiol (figura 6), ácido lático (figura 7), ácido succinico (figura 8).

Figura 3: Formação do subproduto glicerol

Figura 4: Formação do subproduto ácido acético

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Figura 5: Formação do subproduto acetoína

Figura 6: Formação do subproduto 2,3 butanodiol

Figura 7: Formação do ácido lático

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Figura 8: Formação do subproduto ácido succionico.

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5. CONCLUSÃO

Contudo vemos que a fermentação alcoólica é um processo complexo, que começa na

hidrolise da sacarose e segue até a formação do etanol, e para que isso aconteça de forma

eficientemente, procedimentos devem ser feitos para analisar a qualidade do produto, como

fazer a análise da acidez que deve ser inferior a 0,8 gramas, do ART, que está ligado ao tempo

em que a cana foi colhida e moída, deve está entre 13 a 17,5% que no caldo analisado foi

obtido um valor inferior ao mínimo, e verificar também o teor alcoólico que o caldo pode

oferecer que deve está entre 7° a 9°, sendo nesta analise o caldo analisado, apresentou

resultado satisfatório.

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6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] Fermentação, Só Biologia. Disponível em http://www.sobiologia.com.br/conteudos/bioquimica/bioquimica3.php Acessado em 15 de Outubro de 2016 ás 14:20.

[2] Materiais disponibilizados pelo professora Cristina Maria do Nascimento.

Experimentos realizados no Laboratório de Microbiologia do IFPE.