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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DE PESQUISA

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA – PIBIC : CNPq, CNPq/AF, UFPA, UFPA/AF, PIBIC/INTERIOR, PRODOUTOR, INTERDISCIPLINAR, ACERVO, PIBIT, EBTT E

FAPESPA

RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO Período: 31/07/2016 a 01/08/2017 (x) PARCIAL ( ) FINAL IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO

Título do Projeto de Pesquisa: Caracterização da dinâmica da biodiversidade microbiana e aperfeiçoamento dos processos metabólicos envolvidos na fermentação do cacau no estado do Pará. Nome do Orientador: Alessandra Santos Lopes Titulação do Orientador: Doutora em Ciência e Tecnologia de Alimentos. Faculdade: Engenharia de Alimentos (FEA). Instituto/Núcleo: Instituto de Tecnologia (ITEC). Laboratório: Laboratório de Processos Biotecnológico (LABIOTEC) Título do Plano de Trabalho: Avaliação do potencial fermentativo de leveduras isoladas da fermentação de cacau amazônico para produção de cerveja. Nome do Bolsista: Felipe de Andrade Maia

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Tipo de Bolsa: ( ) PIBIC/CNPq ( ) PIBIC/CNPq – AF ( ) PIBIC/CNPq- Cota do pesquisador ( x ) PIBIC/UFPA ( ) PIBIC/UFPA – AF ( ) PIBIC/INTERIOR ( ) PIBIC/PRODOUTOR ( ) PIBIC/PRODOUTOR RENOVAÇÃO ( ) PIBIC/FAPESPA ( ) PIBIC/ACERVO ( ) PIBIC/PE-INTERDISCIPLINAR ( ) PIBIC/VOLUNTÁRIO ( ) PIBIC/PIBIT

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1. INTRODUÇÃO

A produção de cerveja devido ao seu extenso histórico pode ser considerada

como uns dos mais antigos processos biotecnológicos. Atualmente, existe diversos

tipos de formulações dependo do tipo de cerveja, porém o processo produtivo e os

componentes principais para a elaboração do produto são basicamente os mesmos

(DRAGONE et al., 2007). A produção de cerveja é constituída das etapas de

mosturação, fermentação primária e maturação.

A cerveja é a bebida obtida pela fermentação alcoólica do mosto cervejeiro

oriundo do malte de cevada e água potável, por ação da levedura, com adição de

lúpulo (BRASIL, 1997).

O mosto cervejeiro pode ser adicionado de alguns adjuntos que o

suplementam. Os adjuntos mais comuns são o milho, o arroz e o trigo, na qual são

adicionados na etapa de mosturação. Conforme Venturini (2005), o amido presente

nessas fontes amiláceas é hidrolisado em açúcares fermentescíveis pelas enzimas

contidas no próprio malte.

As células de leveduras apresentam necessidades nutricionais durante o

processo fermentativo, as quais influenciam diretamente na multiplicação, no

crescimento celular e na eficiência da transformação de açúcar em álcool (BADER,

et al., 2010).

Um dos fatores essenciais para se obter uma cerveja de boa qualidade é a

correta condução da etapa de fermentação do mosto, que segundo Bader et al.

(2010), o crescimento do microrganismo envolvido na fermentação confere

mudanças no aroma, sabor e textura da matéria-prima. Compostos como álcoois

superiores, ésteres, aldeídos, cetonas, compostos de enxofre e ácidos orgânicos

fazem parte da enorme gama de compostos sensoriais excretados pelas leveduras

(ERTEN et al., 2007).

A modificação da matéria prima resultante da fermentação pode servir

também como uma proteção natural para a cerveja decorrente da síntese de

substâncias inibidoras de crescimento de microrganismos patogênicos e

deterioradores, como alguns ácidos e o etanol (SCHWENNINGER; MEILE, 2004).

Os vários tipos de cerveja encontrados no mercado decorrem da maneira

como são processadas as matérias-primas, da proporção em que elas são

utilizadas, da duração das etapas de produção e do processo tecnológico

empregado.

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Desse modo, o objetivo desse trabalho foi avaliar o potencial fermentativo de

leveduras isoladas a partir da fermentação do cacau amazônico para a produção de

cerveja.

2. JUSTIFICATIVA

A diversidade de leveduras presentes na fermentação do cacau tem sido

frequentemente associada às diferentes localidades de fermentação, bem como as

condições do processo fermentativo (como nutrientes, pH, temperatura, presença ou

ausência de oxigênio, entre outros). Vários estudos revelam uma abundante

diversidade de leveduras na fermentação de sementes de cacau em diferentes

países. Estes microrganismos são bastante versáteis em termos de atividade

metabólica, especialmente fisiológica (BADER et al., 2010).

Leveduras são microrganismos unicelulares que se multiplicam sexuada e

assexuadamente e são importantes devido a sua capacidade de realizar a

fermentação alcoólica dos açúcares (MADIGAN et al., 2004). Por esta característica

de seu metabolismo, são consideradas como as formadoras de muitos produtos

fermentados. As leveduras do gênero Saccharomyces possuem diversas aplicações

tecnológicas, principalmente, na produção de álcool na cerveja e vinho

(VERSTREPEN et al., 2003).

Na indústria cervejeira de acordo com Cervieri (2014), o Brasil se consolidou

como o terceiro maior produtor de cerveja mundial, ficando atrás somente da China

e Estados Unidos, que ocupam respectivamente o primeiro e segundo lugar.

Consequentemente, setor cervejeiro é responsável por 2% do PIB brasileiro, sendo

este setor um dos que mais empregam no país.

Apesar de existirem centenas de variedades de leveduras sendo que,

habitualmente, se dividem em dois grandes grupos: as leveduras de fermentação

alta (Saccharomyces cerevisiae, típicas das cervejas do tipo Ale) e as leveduras de

fermentação baixa (Saccharomyces uvarum, antes conhecidas por Saccharomyces

carlsbergensis, típicas das Lager) (BEKATOROU; PSARIANOS; KOUTINAS, 2006).

O estudo cinético de um processo fermentativo é importante, pois, permite a

aquisição de conhecimento básico do processo. A cinética de biotransformação está

relacionada com a velocidade de consumo de substrato e de formação de produto.

Os processos de fermentação utilizando leveduras utilizam-na determinação dos

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parâmetros cinéticos a velocidade de crescimento celular e o efeito que estas sofrem

por influência das condições do meio em processo (ANDRIETTA, 1999).

A seleção de leveduras para o desenvolvimento de processos fermentativos

favorece o início mais rápido do processo e os riscos de contaminação apresentados

pela fermentação espontânea podem ser evitados, favorecendo menor competição

por nutrientes essenciais, maior rendimento e qualidade do produto resultante

(SANNI et al, 1993).

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo geral

Avaliar o desempenho de 3 leveduras de leveduras isoladas durante a

fermentação do cacau nativo da região Amazônica (Theobroma cacao), para a

produção de cerveja.

3.2. Objetivo específico

Estudar a cinética de fermentação através dos parâmetros de pH, sólidos

solúveis e teor alcoólico para as leveduras L22, L33 e L74 e uma levedura comercial.

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Procedências das leveduras de leveduras

As leveduras de leveduras L22, L33 e L74 foram selecionadas da coleção de

microrganismos presentes no Laboratório de Processos Biotecnológicos

(LABIOTEC) da Faculdade de Engenharia de Alimentos. Estas cepas foram isoladas

no ano de 2014, a partir da fermentação do cacau sendo a levedura L22 da espécie

Zygosaccharomyces bailii do município de Tucumã e as leveduras L33 e L74 da

espécie Saccharomyces cerevisiae do município de Medicilândia. As leveduras L33

e L74 foram escolhidas para este estudo por apresentarem maior diferenciação

genética intra-espécie observada através do estudo filogenético (Figura 1).

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Figura 1. Trecho da árvore filogenética das cepas de Saccharomyces

cerevisiae isoladas em Medicilândia, PA.

4.2. Reativação das cepas e preparo do inóculo

A reativação das cepas foi realizada em tubos de ensaio contendo meio

YEPD (2% glicose, 2% peptona, 1% extrato de levedura, 1,5% ágar). Os tubos foram

colocados em estufa incubadora por 48 h a 30 ºC. Em seguida as cepas de

leveduras foram inoculadas em 100 mL de caldo YEPD e colocadas em agitador

orbital (TECNAL®, modelo TE-421), durante 36 h a 30 ºC e 120 rpm para o

desenvolvimento do inóculo/biomassa.

A biomassa obtida foi centrifugada a 800xg por 10 min em centrífuga

refrigerada de bancada (Centribio®, modelo 80-2B).

4.3. Elaboração das cervejas

O mosto cervejeiro foi formulado com uma proporção de 158 g de extrato de

malte/L de água adicionado de 1,8 g de lúpulo de amargor/L de água e 0,45 g de

lúpulo aromático/L de água. O extrato de malte foi transferido para um recipiente

contendo a água a 40 ºC. Em seguida, a mistura aquecida até fervura por 60 min e,

após 15 min do início da fervura, adicionou-se o lúpulo de amargor e, nos 15 min

finais, adicionou-se o lúpulo de aroma.

Após a fervura do mosto, foi adicionado 2,5 g de Whirfloc, um agente

floculante que atua na sedimentação de partículas suspensas, seguido de

resfriamento em banho de gelo (-10 ºC) para a coagulação de proteínas. Essas

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etapas são necessárias para remoção de sólidos em suspensão que causam

turvação na cerveja.

Em seguida, foram transferidos 500 mL do mosto para 4 kitassatos estéreis

com capacidade de 1L, sendo adicionado 1 g de biomassa das leveduras L22, L33,

L74 e da levedura comercial em cada kitassato, posteriormente foram agitados para

que houvesse uma melhor oxigenação do mosto. Uma pequena quantidade de

oxigênio dissolvido no começo da fermentação é importante para que a levedura

tenha uma boa adaptação, vitalidade e crescimento celular (WHITE; ZAINASHEFF,

2010).

O sistema do processo fermentativo foi montado (Figura 2) e armazenado em

uma câmara de refrigeração (Gelopar®, modelo GRCS-4P) durante as primeiras 24

h a 20 ºC. A partir de 24 h, a temperatura de fermentação foi estabelecida em 17 ºC

até o término do processo (144 h).

Figura 2. Processo de fermentação em escala laboratorial.

4.4. Analises físico químicas

Foram retiradas assepticamente (vidraria estéril em cabine de fluxo

unidirecional vertical VECO, modelo FUV-06) alíquotas de 10mL nos tempos: 0, 24,

48, 72, 96, 120, e 144 h. Foram analisados os parâmetros: pH, teor de sólidos

solúveis, teor alcoólico (IAL, 2008). O pH foi determinado pela leitura direta em

potenciômetro (BEL, modelo W3B), o teor de sólidos solúveis e o teor alcoólico foi

determinado com auxílio de um densímetro digital (ANTON PAAR, modelo DMA 35).

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4.5. Cinética do processo fermentativo

Os parâmetros cinéticos analisados foram as velocidades instantâneas de

consumo de substrato (equação 1) e de formação de produto (equação 2). A

produtividade das leveduras (equação 3), além dos coeficientes de rendimento

(equação 4) e eficiência (equação 5) (SCHMIDELL et al, 2001).

(Equação 1)

(Equação 2)

(Equação3)

(Equação 4)

(Equação 5)

Onde,

(rs) - velocidade de consumo de substrato em g/L

(rp) - velocidade de produção de etanol em g/L.h

(P0) - concentração inicial de produto em g/L

(S0) - a concentração inicial de substrato em g/L

(Yp/s) o coeficiente de rendimento. O valor teórico do coeficiente de

rendimento é 51,1% e está relacionada a estequiometria do processo.

5. Resultados e Discussão

A Figura 3 mostra a evolução do pH do mosto durante a fermentação primária

para as 4 leveduras de leveduras.

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Figura 3. Variação de pH para as 4 leveduras estudadas.

O mosto com a levedura comercial foi a que apresentou menor valor de pH

durante o processo fermentativo (pH 144h - 4,07), em contrapartida as leveduras L74,

L33, L22 apresentaram pH valores de pH superiores à levedura comercial (pH 144h -

4,21, 4,18 e 4,23, respectivamente). A maior variação de pH durantes as primeiras

48 h de fermentação para as quatro leveduras decorrem da maior performance

metabólica das leveduras para formação de compostos secundários, como ácidos

orgânicos. Este comportamento se deve principalmente a uma maior concentração

de substrato. De acordo com Dorta (2006), alguns dos ácidos orgânicos produzidos

por essas leveduras são os ácidos acético, succínico, málico, tartárico, lático, cítrico

e aconítico.

Segundo Castro (2012), quanto maior o pH da cerveja maior é sua

estabilidade sensorial. Muitas reações de degradação da cerveja são aceleradas em

pH menor que 4,2 e retardadas em pH superior a este valor. Do ponto de vista

microbiológico quanto menor o pH, maior é a estabilidade microbiológica e da

espuma na cerveja.

O desempenho das leveduras em função do consumo de substrato e de

substrato e formação de produto para cada levedura é apresentado nas Figuras 3, 4,

5 e 6.

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Figura 4. Cinética da fermentação (LC). Figura 5. Cinética da fermentação (L74).

Figura 6. Cinética da fermentação (L33). Figura 7. Cinética da fermentação (L22).

Todas as leveduras apresentaram um comportamento linear mais acentuado

durante a durante as 48 h iniciais da fermentação, tanto para consumo de sacarose,

quanto para formação de etanol. De acordo com a Tabela 2 a levedura comercial

apresentou maior velocidade de consumo e produção.

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Tabela 2. Velocidade de formação de etanol e consumo de sacarose.

Levedura

Etanol (g/L.h)

0-48 h 48 h - 144 h

LC 1,037 0,673

L74 0,334 0,038

L33 0,360 0,045

L22 0,324 0,028

Sacarose (g/L.h)

LC -2,705 -0,151

L74 -0,940 -0,064

L33 -0,967 -0,114

L22 -0,894 -0,080

Após 48 h de fermentação, as leveduras isoladas da fermentação do cacau

apresentaram uma redução média de 88,8% na velocidade de produção de etanol.

Para as quatro leveduras, a redução média no consumo de sacarose foi similar, em

torno de 91,7%. A maior velocidade nas primeiras 48 h está relacionada a uma

menor concentração de etanol e maior concentração inicial de sacarose no mosto.

Sousa (2011) relata que uma elevada de sacarose resulta em alto teor

alcoólico, que pode causar toxicidade à levedura por desestabilizar a membrana

plasmática desse microrganismo. Por outro lado, o teor alcoólico serve como

controle para a multiplicação excessiva desses microrganismos, o que poderia

ocasionar um desvio da quantidade de substrato para a produção de biomassa em

detrimento ao álcool.

A Tabela 3 apresenta os parâmetros de produtividade, rendimento e eficiência

do processo de fermentação, considerando a produção de etanol.

Tabela 3. Produtividade, rendimento e eficiência do processo de fermentação.

Levedura Produtividade (g/L.h) Rendimento (%) Eficiência (%)

LC 0,425 38,82 75,97

L74 0,140 38,66 75,66

L33 0,142 37,50 73,39

L22 0,129 36,42 71,27

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As leveduras apresentaram valores de rendimento similar aos reportados por

Ferrari (2013), que encontrou valores entre 37,4% a 44,8%. Este resultado mostra

que as leveduras isoladas da fermentação de cacau possuem potencial para na

produção de cerveja. Em relação às espécies utilizadas, as duas leveduras de

Saccharomyces cerevisiae do município de Medicilândia apresentaram valores de

produtividade próximas.

A levedura L22 (Zygosaccharomyces bailii) apresentou rendimento de

produção de etanol 5% inferior às leveduras comercial, L33 e L74, no entanto, outros

metabólitos importantes para o sabor e aroma da cerveja podem ter sido excretados

pela levedura L22.

Segundo Zarnkow (2016) relata que leveduras não-Saccharomyces já são

utilizadas no processo de vinificação e a utilização de um mix de leveduras

(Saccharomyces e não-Saccharomyces) proporciona impacto positivo no sabor da

cerveja.

A levedura comercial foi a que apresentou a maior eficiência,

consequentemente a maior produtividade. Essa característica se dá, devido a

levedura comercial ter sofrido melhoramento genético para aumentar sua

capacidade produtiva e resistência às mudanças físicas e químicas, como pH, teor

de oxigênio e teor alcóolico, do meio fermentativo (OLIVEIRA, 2011).

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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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MADIGAN, T. M.; MARTINKO, J. M.; PARKER, J. Microbiologia de Brock. 10. ed, 620 p. São Paulo: Prentice Hall, 2004.

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Michel, M., Kopecká, J., Meier-Dörnberg, T., Zarnkow, M., Jacob, F., and Hutzler, M. Screening for new brewing yeasts in the non-Saccharomyces sector with Torulaspora delbrueckii as model. Yeast, 33: p129–144, 2016.

OLIVEIRA, N. A. M. Leveduras utilizadas no processo de fabricação de cerveja. 2011. 45 p. Trabalho de Conclusão (Especialista em Microbiologia Ambiental e Industrial) – Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biológicas. UFMG. Belo Horizonte, 2011.

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WHITE, C.; ZAINASHEFF, J. Yeast: The pradical guide beer fermentation.

Brewers Publications, 2010.

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DIFICULDADES

Não foram relatadas dificuldades pelo bolsista na execução das atividades

programadas no projeto.

PARECER DO ORIENTADOR:

O bolsista Felipe de Andrade Maia teve excelente desempenho, inciativa e

responsabilidade com as atividades programadas no projeto.

DATA: 21/02/2017.

_________________________________________

ASSINATURA DO ORIENTADOR

____________________________________________ ASSINATURA DO ALUNO

INFORMAÇÕES ADICIONAIS: