estudo da nefrotoxicidade de venenos de serpentes botrópicas do nordeste do brasil

ESTUDO DA NEFROTOXICIDADE DE VENENOS DE SERPENTES

BOTRÓPICAS DO NORDESTE DO BRASIL

Gdayllon Cavalcante Meneses

Universidade Federal do CearáDepartamento de Análises clínicas-

FFOELaboratório de Cultivo Celular

INTRODUÇÃO

O Brasil é um país com características climáticas e geográficas muito variadas, possuindo assim uma ampla diversidade biológica.

Pesquisas com toxinas de origem animal

apresentam-se como potencial fonte de futuros agentes terapêuticos e têm contribuído muito na compreensão de mecanismos fisiopatológicos de doenças (Mortari et al.2007).

SERPENTES DA FAUNA BRASILEIRA

Espécies Peçonhentas

Elapidae

Micrurus

Viperidae

Bothrops

Bothrops erythromela

s

Bothrops insularis

Crotalus Lachesis

COMPOSIÇÃO DOS VENENOS DE SERPENTES

VENENO

Componentes Protéicos

Propriedades enzimáticas

Não enzimáticas

Componentes Não

Protéicos

Orgânicos Não orgânicos

FOSFOLIPASES A2

CLASSIFICAÇÃO:

PLA2

Intracelulares ou citosólicas

Independentes de Ca+2

Extracelulares ou secretórias

Tipo I Tipo II

(Asp-49 PLA2s) (Lys-49 PLA2s) (Ser-49 PLA2s)

Tipo III

(Ownby, 1999; Lomonte, 2003).

ENVENENAMENTOS POR SERPENTES BOTRÓPICAS

As características importantes são sério dano muscular, hemorragia e coagulopatia;

A insuficiência renal, insuficiência respiratória e choque podem ocorrer nos casos mais graves (Bjarnason; Fox, 1994; Kamiguti et al., 1996; Gutiérrez, 2002; White, 2005);

A etiopatogenia da lesão renal tem sido atribuída à nefrotoxicidade direta da peçonha, miólise, hemólise, hipotensão, coagulação capilar glomerular, ação tóxica vascular e até mesmo reações de hipersensibilidade à toxina ou ao soro antiofídico (Pinho et al., 2000).

JUSTIFICATIVA

Os acidentes ofídicos representam um sério problema de saúde pública nos países tropicais, pela frequência com que ocorrem e pela morbimortalidade que ocasionam (Pinho et al., 2000);

O gênero Bothrops possui ampla distribuição e corresponde ao grupo de serpentes peçonhentas mais importantes em número de espécies e densidade populacional (Queiroz et al.,

2008);

A importância fisiológica do rim e a patogênese da IRA;

JUSTIFICATIVA

Quanto a linhagem de células MDCK e mesangiais;

A resposta a injúrias de células tubulares renais; Qual a importância do estudo do mecanismo

apoptótico?

OBJETIVO GERAL

Avaliar os efeitos dos venenos das serpentes B. erythromelas, Bothrops insularis e suas frações fosfolipase A2 sobre linhagens de células renais, podendo contribuir para a descoberta de ferramentas farmacológicas e/ou elucidar os mecanismos de nefrotoxicidade.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Estudar o efeito dos venenos e frações das serpentes Bothrops erythromelas, Bothrops insularis e suas frações fosfolipase A2 em células mesangiais e tubulares renais;

Determinar o efeito dos venenos e frações sobre a viabilidade e proliferação das linhagens celulares em estudo;

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Avaliar o potencial apoptótico do veneno e suas frações;

Investigar a expressão das proteínas pró-apoptóticas (FAS, Bax e caspase 3) e anti-apoptóticas (BclxL) em células renais;

Investigar os possíveis mediadores

envolvidos no efeito renal.

METODOLOGIA

CULTIVO CELULAR (MDCK):

Meio de cultura RPMI 1640 + 10% de SBF;

100 UI/mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina;

Serão mantidas a uma temperatura de 37 ºC em estufa contendo 5% de CO2 .

METODOLOGIA

CULTIVO CELULAR (Mesangiais):

Meio de cultura RPMI 1640 + 20% de SBF + 2% de glicose;

100 UI/mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina;

Serão mantidas a uma temperatura de 37 ºC em estufa contendo 5% de CO2 .

METODOLOGIA

Armazenar em meio sem SBF por 24h para a obtenção de células na fase G0 do ciclo celular;

Retirar as células das garrafas utilizando tripsina-EDTA;

As células serão então quantificadas em câmara de Neubauer e subcultivadas (1-2x105céls/ml) permitindo o crescimento confluente por 24h.

METODOLOGIA

Ensaios de Viabilidade e Proliferação Celulares

MTT;

Lactato Desidrogenase;

MTT

Leitura em espectrofotômetro

LACTATO DESIDROGENASE

Avaliar a integridade de membrana no processo de morte celular;

Análise da liberação da enzima LDH, através da sua atividade enzimática.

AVALIAÇÃO DA MORTE CELULAR POR APOPTOSE

1) Detecção da Externalização de Fosfatidilserina;

2) Determinação do potencial transmembrânico mitocondrial;

3) Isolamento de RNA total;

4) Reação de Transcriptase reversa;

5) Reação em cadeia de polimerase (PCR);

6) Eletroforese em gel de agarose.

DETECÇÃO DA EXTERNALIZAÇÃO DE FOSFATIDILSERINA

Novas descobertas do processo apoptótico estão surgindo com a descoberta de novos parâmetros, Um deles é a dosagem de fosfatidilserina (PS);

Mudanças na estrutura da membrana plasmática como forma de sinalização;

A Anexina V é uma proteína de ligação para fosfolipídeos que pertence a família das Anexinas. Na presença de íons de cálcio ela exibe alta afinidade para a ligação seletiva a fosfatidilserina.

DETERMINAÇÃO DO POTENCIAL TRANSMEMBRÂNICO MITOCONDRIAL

Rodamina é um nome genérico para uma família de compostos orgânicos, corantes chamados fluoronas;

A rodamina-123 (Rh-123) é um fluorocromo específico para a marcação mitocondrial em células vivas;

Alterações ao nível da integridade mitocondrial podem ser detectadas através do aumento da fluorescência verde citosólica, indiciando uma difusão da Rh-123 da mitocôndria para o citosol (Johnson et al., 1980).

ISOLAMENTO DE RNA TOTAL

Serão isolados utilizando o reagente Trizol (Invitrogen) seguindo o protocolo descrito pelo fabricante:

SEPARAÇÃO PRECIPITAÇÃO ANÁLISE EM ESPECTROFOTÔMETRO

REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE

Extração do RNA Total feita para a formação do cDNA na reação de Transcriptase Reversa;

É feita então a ampificação do cDNA;

Analisar a expressão gênica dos diversos mediadores celulares pró-apoptóticos (FAS, Bax e caspase 3) e anti-apoptóticos (BclxL) .

ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

DETERMINAÇÃO DE MEDIADORES EM CULTURA DE CÉLULAS RENAIS

Determinação de nitrito;

Determinação de TNF-α;

Qual a importância da determinação desses mediadores?

ANÁLISE ESTATÍSTICA

Serão realizados três experimentos independentes, em triplicata, para cada ensaio.

As médias obtidas em cada experimento serão comparadas utilizando o teste t ou ANOVA, seguido do teste de Bonferroni, quando apropriado, usando o software Prism GraphPad versão 5.0. Valores de p < 0,05 serão considerados para a análise.

OBRIGADO!