enzimas (parte ii) bioquímica para enfermagem prof. dr. didier salmon msc. daniel lima

Enzimas (Parte II)Bioquímica para Enfermagem

Prof. Dr. Didier SalmonMSc. Daniel Lima

Cinética Enzimática• Estudo da velocidade da reação e dos fatores que a influenciam• Pode ser medido por:

– Quantidade de produto formado por unidade de tempo– Quantidade de substrato consumido por unidade de tempo

V = -ΔS/Δt = ΔP/Δt

Cinética Enzimática

Cinética Enzimática

2[S][S]

3[S]4[S]5[S]

tempo

[pro

duto

]

[S]Ve

loci

dade

da

reaç

ão

V0 e Vmáx

• V0 sobe linearmente a medida que se aumenta a concentração de substrato, e então começa a se nivelar e se aproximar de um ponto máximo onde a velocidade não aumenta, mesmo em concentrações maiores de substrato.

Velocidade da reação é proporcional a S Substrato satura todas

as moléculas de enzima

V0 e Vmáx

• Após curto tempo - estabilidade dinâmica com relação a [E] e [ES] é alcançado

E + ES E + PK1

K -1

K2

K -2

Hipótese: etapa limitante

Substrato Único

S

Substrato Único• Estado estacionário - [ES] constante

– Ou seja: formação do complexo = sua degradação• V0 é determinado pela quebra de ES formando o produto

– V0 = k2[ES]

• [ES] difícil de determinar. Alternativa! [Et]=[E] + [ES]

• As velocidades de formação e quebra de ES são determinadas pelas etapas governadas pelas constantes k1 (formação) e k-1 + k2 (quebra em reagentes e produtos)– V de Formação de ES = K1 [E] [S]– V de degradação de ES = K –1[ES] + K2 [ES]

Substrato Único• Uma vez que a degradação de ES é igual a sua formação, temos:

– k1 ([Et]-[ES]) [S] = k–1[ES] + k2 [ES], ou seja:– k1[S][Et] - k1[S][ES] = (k–1+ k2) [ES]

– Dessa forma: [ES] = [Et][S] [S] + (k-1 + k2)/k1

• Se V0=k2[ES]– V0 = k2. [Et] [S]

[S] + Km

[Et]=[E] + [ES]

Km

Equação de Michaelis-Menten• Na Vmax, [ES] = [Et], assim:

– Vmax = k2[Et]– Substituindo na equação anterior

V0 = k2. [Et] [S] [S] + Km

temos,

V0 = Vmax [S] [S] + Km

Propriedade Importante• Quando V0 = Vmax, temos: 2

Vmax = Vmax [S] , 2 [S] + Km

Km + [S] = 2 [S],Km = 2 [S] – [S]Km = [S]

• Ou seja, o Km é igual a concentração do substrato quando a velocidade inicial é metade da velocidade máxima

Km = [S]

Km

• Característico de cada enzima.• Reflete a afinidade da enzima pelo seu substrato.

Equação de Lineweaver-Burk

V e [Enzima]

• A velocidade da reação é proporcional à concentração da enzima

• Facilita a determinação da concentração de uma enzima

• Dosagens (transaminases, LDH, amilase, fosfatase alcalina) v0

[E]

Mais de um substrato...• Ex: ATP + d-glicose → ADP + d-glicose-6-fosfato

Mais de um substrato...• Reações em que há 2 substratos envolvem a transferência de átomos ou

grupos funcionais de um substrato para o outro:Sequencial (formação do complexo ternário)

Pingue-pongue ou duplo deslocamento

Inibidores• A atividade das enzimas pode ser diminuída ou parada por várias

substâncias chamadas de inibidores.

• Existem inibidores naturais, fazendo parte dos constituintes da célula, e outros estranhos ao organismo que podem provocar alterações do metabolismo celular.

• Aqueles encontrados nas células são fundamentais para a fisiologia pois

permitem às células um controle preciso da velocidade de algumas reações chave, permitindo uma resposta integrada à mudança das condições fisiológicas.

• Inhibição específica de certas enzimas permita as aplicações farmacológicas – Ex: sulfonamidas: usadas para combater as infecções bacterianas

Sulfonamidas• Inibidores competitivos da diidropteroato sintetase (dhps), enzima

importante envolvida no metabolismo dos folatos (síntese de DNA e RNA) de muitos organismos menos o homem.

• Os folatos nos serem humanos são fornecidos pela dieta.

• Toxicidade seletiva para bactérias.

• Utilizados para tratar:– Pneumonia a pneumocystis (Pneumocystis jirovici, P. carinii) IO em pacientes HIV + – Infecção do trato urinário– Shigelose (Desinteria)– Algumas infecções por protozoários (Plasmodium falciparum)

Inibidores• Largo campo de aplicação para o combate de insetos

• Ex: enzimas digestivas de insetos como as α-amilases catalisam a hidrólise de ligações glicosídicas α-1,4 do amido, glicogênio e outros carboidratos. Essas enzimas são muito importantes para os insetos, especialmente para aqueles que se desenvolvem em grãos ricos em amido. (No feijão foram identificados 4 desses inibidores)

• Desenvolvimento de plantas mais resistentes ao ataque das pragas contribuindo para a redução do uso de inseticidas químicos.

Inibidores• Importância:

– Agentes farmacêuticos– Ferramentas no estudo de mecanismo de funcionamento das enzimas– Ferramenta nos estudos das vias metabólicas

Inibidores

Reversíveis

Irreversíveis Inib. Competitiva (freqüente)

Inib. Acompetitiva (quando o inibidor liga-se ao complexo ES , mas não a enzima livre)

Inib. Mista

Inib. Não-competitiva (caso particular de inib. Mista)

Inibidor Irreversível• 1-Reagentes específicos para grupo (R) • 2- Análogos de substrato • 3- Inibidor suicida

1

2

Inibidores Reversíveis

Semelhança estrutural entre S e I

Não há semelhança estrutural entre S e I

Não há semelhança estrutural entre S e I

• Inibidor competitivo – Estrutura

semelhante à do substrato

– Liga-se ao Sítio Ativo da enzima

– Aumento da [substrato] diminui a inibição

– A Vmax NÃO se altera

– Km da enzima AUMENTA na presença do inibidor

• Inibidor não competitivo – Não tem estrutura

semelhante à do substrato

– Não se liga ao Sítio Ativo da enzima

– Aumento da [substrato] não diminui a inibição

– A Vmax diminui na presença do inibidor altera

– Km da enzima não se altera

Inibição CompetitivaSubstrato (mM) V0 (sem inibidor)

mmol.L-1.min-1 V0 (com inibidor)

mmol.L-1.min-1 0.2 5 3 0.4 7.5 5 0.8 10.0 7.5 1.0 10.7 8.3 2.0 12.5 10.7 4.0 13.6 12.5 6.0 13.5 13.5

0 1 2 3 4 5 6 70

5

10

15

Sem inibidor

Com inibidor

Substrato (mM)

V 0(m

ol.L

-1.m

in-1

)

Inibição Competitiva Inibição Não-Competitiva

Inibição Incompetitiva• O inibidor se liga somente no complexo ES, em sítio próprio

Analgésicos – Inibidores de Prostaglandinas

• Ligação covalente– Inibidor irreversível (suicida) - Aspirina

• Interações sem ligação covalente – Inibidor competitivo e reversível – Ponstan

Regulação de perfusão renalAgregação plaquetáriaProtetora de mucosa gástrica

Inflamação

Sítio Ativo da COX

Inibidor competitivo e reversível da COX-1/2 Interação iônica

Dipirona sódica

Inibidor competitivo e reversível da COX-2

Meloxicam

Inibidores de Proteases do HIV• Gag e Pol são clivados pela protease do HIV em 9 pontos específicos para

produzir proteínas funcionais. – O precursor Gag vai originar proteínas estruturais– O precursor Pol vai originar enzimas como transcriptase reversa,

integrase e proteases.

Amprenavir

Ciclo de replicação do HIV

Sistema multienzimático sequencial

Enzimas Alostéricas

Enzimas Alostéricas• Analogia com proteínas alostéricas: Hemoglobina• Moduladores alostéricos (≠ de inibidores não-competitivos ou mistos!!)• Mudanças conformacionais entre forma ativa e inativa e parâmetros

cinéticos diferentes (≠ do Michaelis-Menten)

• Homotrópicas ou heterotrópicas

Enzimas Alostéricas• Reguladas por moduladores

alostéricos → envolvendo ou não o sítio ativo

• Várias subunidades • Inibição por retroalimentação

• Exemplo: Aspartato transcarbamilase• 12 cadeias polipeptídicas

• Azul: catalítica• Vermelho/Amarela:

regulatórias

Aspartato TranscarbamilaseSíntese de pirimidinas

Modulador Alostérico• Pode ser tanto um inibidor quanto um ativador.

Michaelis-Menten

Enzimas AlostéricasEnzima Homotrópica

Efeito moduladores

Efeito moduladores

Exemplos de Enzimas RegulatóriasPFK-1

Modificação Covalente Reversível

Exemplos de Enzimas RegulatóriasGlicogênio Fosforilase

Ativação Proteolítica

Fatores que afetam a Velocidade Enzimática

pH

Temperatura

Concentração de substratos

Concentração de cofatores

Presença de Inibidores e/ou ativadores

Modificações químicas: fosforilações, adenilações, etc

Concentração de enzima