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ADAPTAÇÃO DE METODOLOGIA PARA ISOLAMENTO DE
MICRORGANISMOS BIORREMEDIADORES DE
HIDROCARBONETOS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS (HAP) DE
PETRÓLEO
LUCIANE DE SÁ BRITO ALMEIDA
CANOAS, 2008
CANOAS, 2008
Trabalho de conclusão de curso apresentado como exigência parcial para obtenção do grau de Bacharel em Ciências Biológicas do Centro Universitário Unilasalle, sob orientação do Prof. Ms. Giovani André Piva.
LUCIANE DE SÁ BRITO ALMEIDA
ADAPTAÇÃO DE METODOLOGIA PARA ISOLAMENTO DE
MICRORGANISMOS BIORREMEDIADORES DE
HIDROCARBONETOS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS (HAP) DE
PETRÓLEO
LUCIANE DE SÁ BRITO ALMEIDA
TERMO DE APROVAÇÃO
ADAPTAÇÃO DE METODOLOGIA PARA ISOLAMENTO DE
MICRORGANISMOS BIORREMEDIADORES DE
HIDROCARBONETOS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS (HAP) DE
PETRÓLEO
Trabalho de conclusão aprovado como requisito parcial para a obtenção do grau de licenciatura do curso de Ciências Biológicas do Centro universitário La Salle-
Unilasalle pelo avaliador Prof. Ms. Giovani André Piva.
Prof. Ms. Giovani André Piva Unilasalle
CANOAS, 2008
DEDICATÓRIA
Dedico esse trabalho a minha mãe, Terezinha de Sá Brito
Almeida e ao meu pai, Clodomiro Daltro Colina Almeida (in
memorian)
AGRADECIMENTOS
Agradeço a todos que participaram dessa minha jornada. A minha mãe e irmãos pela compreensão nesses anos de luta. Ao meu marido Jefferson por acreditar em mim, quando eu mesma
já não acreditava. As minhas madrinhas: Nana, Nara e Vera, pelo carinho e
compreensão por não poder estar presentes em muitos momentos especiais.
Aos meus sogros João e Mariza pelo apoio dado em momentos difíceis.
Aos meus tios, avós, cunhados e amigos por acreditarem no meu sonho.
Ao meu “mestre com carinho” Giovani André Piva, não apenas orientador,mas grande amigo que me compreendeu, foi tolerante, solidário e paciente, pelo carinho, dedicação e confiança.
A minha amiga Cristiane Janssen por toda força e apoio para realização desse trabalho.
"O papel dos infinitamente pequenos é infinitamente grande"
(Louis Pasteur).
RESUMO
O presente trabalho teve por objetivo demonstrar o potencial da aplicação da Coluna de Winogradsky como metodologia para verificar a presença de microrganismos biorremediadores. Foram retiradas quatro amostras de solo de dois locais da região metropolitana de Porto Alegre, uma do CECAN – Centro de Empreendedorismo e Parque Tecnológico de Canoas, localizado no município de Canoas – RS e a outra do BIOTRAKTO – estufa experimental, localizada no município de Alvorada – RS e montadas colunas de Winogradsky. Aos 45 dias de cultivo amostras do solo das diferentes camadas foram inoculadas pour plate e cultivadas em ágar Saburaud com e sem cloranfenicol, com 0,05g/L de resorcinol, a fim de observar a reação de Bavendamm. Após cultivo de 3 dias em 28°C, as colônias foram isoladas por esgotamento para a caracterização. Os resultados apresentados nos meios de cultura são compatíveis com os organismos encontrados nas zonas da coluna de Winogradsky. Visto que cada zona requer certa tolerância ambiental e necessidade vital para o desenvolvimento dos microrganismos. A presença de microrganismos Bavendamm positivos justificou o uso da metodologia para a detecção de áreas contaminadas e prospecção de novas cepas com potencialidade na biorremediação. Palavras-chave: Winogradsky. Biorremediadores. Bavendamm.
ABSTRACT
The present work had for objective to demonstrate the potential of the application of the Winogradsky Column as methodology to verify the presence of bioremediation microorganisms. Four ground samples of two places of the region had been removed metropolitan of Porto Alegre, one of the CECAN (Centro de Empreendedorismo e Parque Tecnológico de Canoas), located in the city of Canoas – RS and to another one of the Biotrakto’s experimental greenhouse, located in the city of Alvorada – RS and mounted Winogradsky columns. To the 45 days of culture samples of the ground of the different cultivated layers they had been pour plate inoculated in Saburaud agar with and without chloramphenicol, with 0,05g/L of resorcinol, in order to observe the Bavendamm reaction. After culture of 3 days in 28°C, the colonies had been isolated for exhaustion for the characterization. The results presented in the ways of culture are compatible with the organisms found in the zones of the Winogradsky column. Since each zone requires certain ambient tolerance and vital necessity for the development of the microorganisms. The presence of Bavendamm positive microorganisms justified the use of the methodology for the detention of contaminated areas and prospection of potential new strains in the biorremediation. Key-Words:. Winogradsky. Biorremediation. Bavendamm
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
CECAN – Centro de Empreendedorismo e Parque Tecnológico de Canoas,
BIOTRAKTO –
HAP – hidrocarbonetos aromáticos policíclicos de petróleo.
EPA – Environmental Protection Agency
CO2 – Gás carbônico
Na2CO3 – Carbonato de sódio.
Na2SO4 – Sulfato de sódio.
(NH4)2SO4 – Sulfato de amônio.
ATP – Adenosina tri-fosfato
ADP – Adenosina difosfato
NADPH – Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
H2S – Gás Sulfídrico
S – enxofre
O.L.U. – Óleo lubrificante usado
NAOH – Hidróxido de sódio
HcL – ácido clorídrico
SAB– meio de Ágar Sabouraud
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 9 2 REFERENCIAL TEÓRICO .................................................................................. 11 2.1 Petróleo ............................................................................................................ 11
2.1.1 Composição química do petróleo ................................................................... 11
2.1.2 História do petróleo ......................................................................................... 12
2.1.3 Hidrocarbonetos Aromáticos ........................................................................... 13 2.2 Biorremediação ................................................................................................. 13 2.2.1 Técnicas de biorremediação ........................................................................... 14 2.3 Microrganismos e o meio ambiente .................................................................. 15
2.4 Coluna de Winogradsky .................................................................................... 16 2.4.1 Zona aeróbica ................................................................................................. 17 2.4.2 Zona de Microaerófila ..................................................................................... 18 2.4.3 Zona Anaeróbica ............................................................................................ 19 3 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................... 21
3.1 Coleta das amostras ......................................................................................... 21 3.2 Montagem das Colunas de Winogradsky ......................................................... 22
3.3 Análise das Colunas de Winogradsky ............................................................... 23 3.3.1 Análise d’água da superfície das colunas ....................................................... 23 3.3.2 Incubação do solo ........................................................................................... 24 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................... 25 5 CONCLUSÕES ................................................................................................... 28
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 29 APÊNDICE A – Adaptação de coloração para análise de fungo ............................... 31 APÊNDICE B – Tabela 1 com os resultados obtidos ................................................ 32 APÊNDICE C – Fotos dos Locais de coleta .............................................................. 33 APÊNDICE D – Fotos Coluna de Winogradsky ......................................................... 34
APÊNDICE E – Fotos dos resultados ....................................................................... 35 ANEXO A – Meio de cultura Ágar Sabouraud com e sem cloranfenicol ................... 36
ANEXO B – Coloração Gram .................................................................................... 37
1 INTRODUÇÃO
A indústria petrolífera constitui o principal setor de fontes energéticas
responsável pela geração de energia mundial, tendo o petróleo como matéria prima
e seus derivados na fabricação de produtos.
A composição química do petróleo é complexa, variável e extremamente
influenciada por condições físico-químicas, biológicas e geológicas do ambiente de
formação. O petróleo natural ocorre como uma mistura de compostos orgânicos,
principalmente hidrocarbonetos que são os mais importantes constituintes do
petróleo, podendo ser divididos em três partes: alifáticos, alicíclicos e aromáticos. Os
hidrocarbonetos aromáticos são compostos orgânicos, basicamente constituídos por
carbono e hidrogênio, dispostos em dois ou mais anéis aromáticos, são gerados pela
combustão incompleta de substâncias orgânicas, mas a contaminação dos solos é
decorrente das ações antrópicas, devido à industrialização dos hidrocarbonetos
aromáticos para fabricação, extração, refino e transporte de produtos.
Há preocupação em torno da contaminação do solo, remete-nos ao
desenvolvimento de técnicas que possam ser aplicadas para remediar os danos
causados ao meio ambiente, sendo a biorremediação uma das técnicas mais
utilizadas para a remediação de solos contaminados com hidrocarbonetos
aromáticos.
A biorremediação consiste na utilização de processo ou atividade biológica
para transformar os contaminantes em substâncias inertes, CO2 e água. As técnicas
utilizadas podem ser in situ sem a necessidade de remoção do solo, realizada no
próprio local e a ex situ que necessita da remoção do solo, realizada em outro local,
processo este utilizado em vários países, com resultados satisfatórios. O Brasil
apresenta grandes possibilidades de desenvolvimento desta metodologia, uma vez
que o país apresenta condições climáticas favoráveis a biodegradação.
10
A biodegradação consiste na transformação de moléculas xenobióticas por
microrganismos usados para remediar áreas contaminadas através da
biorremediação.
O presente trabalho tem por objetivo adaptar metodologia e verificar a
presença de possíveis microrganismos utilizando a coluna de Winogradsky para
isolamento de comunidades microbiológicas em solos provenientes de duas áreas
da região metropolitana de Porto Alegre, CECAN – Centro de Empreendedorismo e
Parque Tecnológico de Canoas, localizado no município de Canoas com solo sem
tratamento e BIOTRAKTO – estufa experimental, localizado no município de
Alvorada com solo em tratamento, para a verificação de presença de
microrganismos biorremediadores de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAP)
de petróleo.
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Petróleo
O petróleo é uma substância oleosa, menos densa do que a água, constituída
pela mistura de compostos orgânicos formados pela combinação de moléculas de
carbono e hidrogênio, constituindo longas cadeias parafínicas abertas e
cicloparafinas ou anéis aromáticos ligados por complexos orgânicos variados. Há
coloração varia conforme a origem, oscilando do negro ao âmbar, apresenta-se sob
a forma fluida ou semi-sólida, de consistência semelhante à das graxas.
Segundo, POPP (2004, p.332-333) a origem do petróleo por muito tempo
baseou-se em teorias inorgânicas e orgânicas, mas estudos modernos revelaram
uma origem orgânica mista, ou seja, a mistura de matérias provenientes de animais
e vegetais em ambiente planctônico. A matéria orgânica constituída de restos
vegetais e animais é depositada juntamente com lama e areia no fundo d’água, ao
longo da orla marinha, em baías, lagunas, deltas e outros ambientes de circulação
restrita.
Essas camadas com matéria orgânica são cobertas por espessas camadas
de outros sedimentos que, juntamente com a água salgada, impedem a destruição
pela oxidação.
2.1.1 Composição química do petróleo
A composição química varia das proporções de hidrocarbonetos de acordo
com o campo petrolífero.
Os hidrocarbonetos mais abundantes são os da série alcanos, no petróleo as
moléculas variam desde o simples metano até moléculas constituídas por quase
uma centena de carbono e no óleo cru as moléculas são constituídas por dois tipos
12
de estruturas, uma cadeia carbônica longa e contínua e outra cadeia principal e
ramificações curtas.
O petróleo também contém quantidades substanciais de cicloalcanos,
principalmente aqueles de cinco ou seis carbonos por anel que incluem o
metilciclopentano e o ciclohexano e alguns hidrocarbonetos aromáticos, como
benzeno e seus derivados simples, nos quais um ou mais átomos de hidrogênio
foram substituídos por grupos metila ou etila. Além dos hidrocarbonetos, o petróleo
contém certas quantidades de compostos de enxofre como sulfeto de hidrogênio
gasoso e compostos orgânicos de enxofre que são análogos a alcoóis e éteres, nos
quais um átomo de enxofre substitui o oxigênio (BAIRD, 2002p. 468).
2.1.2 História do petróleo
O petróleo é conhecido desde os tempos remotos. Na Babilônia, estradas
eram pavimentadas com petróleo e os egípcios o usavam como impermeabilizante e
por vários séculos o petróleo foi utilizado para iluminação.
Desde 200 anos A.C. já se dominava a técnica de perfuração de poços
profundos, com objetivo de explorar água potável, mas durante o século XVIII, os
poços eram cavados com profundidades de até 50m para buscar petróleo. A
vantagem desse procedimento é que o petróleo assim produzido era mais leve do
que o aflorante naturalmente e com seus constituintes mais voláteis presentes.
No início do século XIX, as primeiras destilarias e refinarias foram
construídas, visando à separação e processamento de constituintes do petróleo.
A moderna “era” do petróleo teve início, quando o norte-americano conhecido
como coronel Drake encontrou petróleo a cerca de vinte metros de profundidade no
Oeste da Pensilvânia, utilizando uma máquina perfuratriz para a construção de
poços. A descoberta causou tanto furor que na época em apenas um ano 15
refinarias foram instaladas, porém os primeiros exploradores eram pessoas ou
empresas ligadas ao ramo de mineração, acostumados ao ciclo da indústria mineral,
com o tempo à exploração do petróleo mostrou-se diferente da realidade na qual
estavam acostumados, levando além da descoberta de novos campos petrolíferos à
falência e a redução no preço do petróleo.
No entanto, a grande revolução da indústria do petróleo ocorreu com a
invenção dos motores de combustão interna e a produção de automóveis em grande
13
escala, que deram à gasolina que é obtida do refino do petróleo uma utilidade mais
nobre do que a simples queima ou descarte nos rios, o que era uma prática comum
no século XIX (TEIXEIRA, 2000p. 475-476).
2.1.3 Hidrocarbonetos Aromáticos
Entre os constituintes do petróleo, os hidrocarbonetos são compostos
orgânicos formados por carbono e hidrogênio, estes hidrocarbonetos apresentam
características apolares (hidrófobos), ou seja, não apresentam atração pela água.
Desse modo, eles têm uma maior tendência de associação às fases sólidas, tais
como as partículas em suspensão, os tecidos biológicos e os sedimentos. (BENTO,
2005, p.23).
Os hidrocarbonetos aromáticos são compostos químicos constituídos de
átomos de carbono e hidrogênio, arranjados em forma de anéis aromáticos, com
dois ou mais anéis. Devido à possibilidade da fusão de um número variável de anéis
e das várias posições em que estes anéis podem se ligar há atualmente mais de 100
hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HAPs) reconhecidos, mas apenas 16 HAPs
são considerados em função de sua importância industrial, ambiental e toxicológica.
(JACQUES et al, 2007, p.1193).
A Agência de Proteção Ambiental (Environmental Protection Agency –
EPA) dos Estados Unidos lista vários hidrocarbonetos policíclicos aromáticos
(HAPs) como compostos poluentes de prioridade ambiental e que devem ser
freqüentemente monitorados em efluentes industriais, devido ao fato de serem
considerados como carcinogênicos, mutagênicos, teratogênicos, além de possuírem
efeitos tóxicos aos seres vivos e terem a capacidade de se bioacumularem nas
diferentes cadeias alimentares. Por isso existe um interesse crescente de se
entender o destino e as formas de desaparecimento dos hidrocarbonetos para que
haja o desenvolvimento de métodos mais eficazes de remoção dos mesmos do meio
ambiente. (BENTO, 2005, p.16).
2.2 Biorremediação
Biorremediação é o uso de organismos vivos, sobretudo microrganismos,
para degradar resíduos ambientais. Tecnologia que apresenta atualmente um
14
crescimento rápido, sobretudo em colaboração com a engenharia genética, utilizada
para desenvolver linhagens de microrganismos com capacidade de degradar
poluentes específicos. É particularmente usada para a remediação de depósitos de
lixos e solos contaminados com compostos orgânicos semivoláteis, como os HAPs
explorando a capacidade dos microrganismos, especialmente de bactérias e fungos.
Em biorremediação várias estratégias são utilizadas baseadas nas
propriedades dos microrganismos de evoluir rapidamente, devido ao curto ciclo
reprodutivo desenvolvendo características que permitem o uso da fonte de alimento
mais próxima, mesmo que sejam resíduos químicos. Uma estratégia de remediação
é o isolamento dos melhores microrganismos degradadores que tenham se
desenvolvido em um local contaminado, deixar crescer uma grande população dos
mesmos em laboratório e devolver a população aumentada ao local.
Outra estratégia é introduzir microrganismos que tenham sido úteis em outros
locais na degradação de um tipo especifico de resíduo em outros locais e esperar
que os mesmos evoluam, mas alguns microrganismos adaptados a um ambiente
não podem ser capaz de sobreviver em outros ambientes com a presença de
contaminantes hostis, podendo assim a engenharia genética ser usada para
desenvolver linhagens de microrganismos com características biodegradativas
apropriadas. A estimulação no aumento da população de microrganismos nativos do
local, adicionando nutrientes aos resíduos é alternativa, garantindo os níveis ótimos
de acidez e umidade no solo. (BAIRD, 2002, p. 564-565).
2.2.1 Técnicas de biorremediação
Por ser uma nova tecnologia é muito considerada para tratarem locais
contaminados mediante o uso de agentes biológicos capazes de modificar ou
decompor poluentes. (ANGELIS, 2007, p.296).
As estratégias utilizadas para a biorremediação dos HAPs podem ser
divididas entre as técnicas in situ e ex situ. Nas técnicas in situ, onde não há
necessidade de remoção do solo, usa-se biorremediação passiva ou intrínseca, na
qual o contaminante permanece no local sofrendo processos naturais como
biodegradação, volatilização, diluição e sorção. Por ser um processo natural, a
biorremediação passiva pode ser muito lenta, exigindo o uso conjunto de outras
técnicas e um monitoramento do local por um longo período de tempo. Outra técnica
15
in situ é a bioestimulação, onde nutrientes orgânicos e inorgânicos podem ser
adicionados no solo, estimulando a atividade dos microrganismos degradadores.
(JACQUES et al.2007,p.1196).
As técnicas ex situ consistem na biorremediação com remoção do solo
contaminado para outro local. A compostagem é uma das técnicas ex situ que pode
ser utilizada para o tratamento do solo contaminado, sendo este removido do local
de origem e colocado na forma de pilhas, desencadeando um processo em que os
microrganismos aeróbios degradarão os contaminantes orgânicos transformando-os
em material orgânico estabilizado, CO2 e água.
Há outras técnicas de biorremediação de solos contaminados com HAPs,
como a fitorremediação que é uma técnica emergente que utiliza plantas para
remediar solos contaminados por metais pesados.
O landfarming é uma técnica em que os microrganismos heterotróficos são
estimulados a degradar os contaminantes, transformando-os em substâncias inertes.
Sendo que esta estimulação ocorre através do revolvimento do solo por operações
de aração e gradagem, visando aerar e homogeneizar as camadas com diferentes
concentrações de contaminantes. Esta técnica pode ser realizada in situ, visando
descontaminar o solo no local, ou pode ser realizada ex situ, removendo o solo para
outro local onde o landfarming será operado. O landfarming também pode ser
considerado um sistema de tratamento de resíduos, utilizado por refinarias e
indústrias petroquímicas de vários países, inclusive do Brasil. A escolha deste
sistema deveu-se à simplicidade de operação e à alta taxa de aplicação dos
resíduos ao solo, reduzindo dessa forma o custo por unidade de volume de resíduo
tratado. No entanto erros na operação e condições ambientais desfavoráveis à
atividade microbiana podem reduzir as taxas de degradação, além disso, sua
utilização in situ é limitada aos casos de contaminação superficial do solo, sendo que
nos casos de contaminação subsuperficial, faz-se necessário à remoção e o
tratamento ex situ. (JACQUES et al.2007,p.1198).
2.3 Microrganismos e o meio ambiente
Conforme MANDIGAN, (2004, p.09) Os microrganismos desempenham
papéis de extrema importância nos processo de geração de energia, a maior parte
do gás natural metano é de origem bacteriana, proveniente das atividades
16
metabólicas de bactérias metanogênicas. Microrganismos fototróficos podem
absorver a energia luminosa, produzindo biomassa. A biomassa microbiana e os
materiais orgânicos descartados podem ser convertidos em bicombustíveis pelas
atividades degradativas dos microrganismos.
Os microrganismos podem ser utilizados na degradação de poluentes pelo
processo de biorremediação, vários microrganismos isolados a partir da natureza
apresentam a capacidade de consumir óleo, solventes entre outros poluentes
tóxicos ao ambiente.
Atualmente, a grande diversidade de microrganismos presentes na terra vem
sendo amplamente estudada, no sentido de melhor conhecer os vastos recursos
genéticos que estes organismos apresentam, pois a partir desses achados novas
soluções podem ser desenvolvidas para a limpeza do ambiente.
2.4 Coluna de Winogradsky
Toda a vida sobre a terra poderia ser classificada baseada nas fontes de
carbono e de energia que cada organismo depende: a energia pode ser obtida das
reações luminosas (fototróficos) ou das oxidações químicas (dos compostos
orgânicos ou inorgânicos); o carbono para a síntese celular pode ser obtido do CO2
(autotróficos) ou de compostos orgânicos pré-formados (heterotróficos).
Combinando estas categorias teremos as quatro estratégias básicas dos seres
vivos: fotoautotróficos (plantas), quimioheterotróficos (animais, fungos),
fotoheterotróficos e quimioautotróficos. Somente entre as bactérias estas quatro
estratégias básicas de vida podem ser encontradas.
Os primeiros cientistas a estudar esses processos foram dois microbiologistas
famosos: Sergei Winogradsky (1856-1953) e Martinus Willen Beijerinck (1851-1931).
Em 1880, Winogradsky desenvolveu uma coluna com o objetivo de estudar
microrganismos do solo. Em contraste aos estudos de culturas puras feitos por
outros microbiologistas, como Louis Pasteur e Robert Koch, Winogradsky se
concentrou na investigação das relações existentes entre os diferentes tipos de
microorganismos em comunidades mistas, ou seja, pesquisar as complexas
interações entre as condições ambientais e a atividade microbiana. (ROSA apud
FERNÁNDEZ, 2005, p.02).
17
A coluna de Winogradsky é um sistema laboratorial que permite a
observação dos processos evolutivos e adaptativos dos microrganismos aos
diferentes ambientes, demonstrações clássicas de como os microrganismos
ocupam micro – ambientes altamente específicos de acordo com suas tolerâncias
ambientais e necessidades vitais. Além de ilustrar como microrganismos diferentes
desenvolvem seus ciclos, e a interdependência que começa existir entre eles. A
coluna é um sistema completo e independente, mantido somente pela energia da
luz solar.
Após algumas semanas em média entre quatro a seis semanas da sua
montagem a coluna se estabelece em ambientes básicos diferentes zonas:
Aeróbica, Microaerófila e Anaeróbica em que os microrganismos específicos serão
desenvolvidos seguindo suas exigências ambientais. (ECO QUÍMICA, 2008, p.01).
2.4.1 Zona aeróbica
Na zona superficial da coluna de água, surgirão algas e cianobactérias
(organismos aeróbicos, autotróficos fotossintéticos) que produzirão O2, à
semelhança do que acontece com as plantas. Esta é a parte da coluna mais pobre
em enxofre e a mais rica em oxigênio. As bactérias fotoautotróficas sintetizam
matéria orgânica a partir de CO2 e produzem O2 a partir da oxidação da H2O.
Na fotossíntese a água funciona como doador de elétron, liberando H+ e O2
para o meio conforme a seguinte reação: H2O 2e– + ½O2 + 2H+. Os elétrons da
oxidação da água após serem excitados pela luz na molécula de clorofila entram
numa cadeia transportadora de elétron onde uma seqüência de moléculas
transportadoras irá gerar ATP a partir de ADP e fosfato, e NADPH a partir de NADP+
e H+. Parte do ATP gerado nesta etapa (fotofosforilação) será usada num ciclo de
reações (Ciclo de Calvin – Benson) para produzir açúcar a partir da fixação do CO2.
Além das algas e cianobactérias fotossintéticas, pode-se encontrar nesta
zona bactérias oxidantes de enxofre, como Beggiatoa e Thiobacillus, que são
quimiolitotróficas. O H2S necessário é gerado pelas bactérias redutoras do sulfato
e enxofre na região inferior da coluna chega que até esta zona por meio de
difusão.
Na superfície da coluna de água desenvolve-se, por vezes uma película
(biofilme) constituída por bactérias aeróbias e heterotróficas dotadas geralmente de
18
flagelos que permite a locomoção e o estabelecimento em novas áreas (FIGURA
1).
Figura 1-Zonas na Coluna de Winogradsky
Fonte: ROSA apud FERNÁNDEZ, 2005, p.07.
2.4.2 Zona de Microaerófila
Nesta zona, pode-se observar uma faixa de água avermelhada,
correspondente a uma população de bactérias púrpuras não sulfurosas. Estes
microrganismos crescem em condições de baixa tensão de oxigênio, não suportam
elevadas concentrações de H2S e são microrganismos fotoheterotróficos com as
bactérias Rhodospirillum e Rhodopseudomonas. O oxigênio desta zona é
19
proveniente da difusão da zona imediatamente acima, sendo por isso, limitada sua
concentração (FIGURA 1).
2.4.3 Zona Anaeróbica
No fundo da coluna, a presença de celulose irá promover o rápido
desenvolvimento de microrganismos que consomem o oxigênio presente no
sedimento e na coluna de água, de modo que apenas o topo da coluna fica
oxigenado.
O estabelecimento de condições anóxicas no fundo da coluna vai favorecer o
aparecimento de microrganismos com um metabolismo fermentativo, assim como,
de outros microrganismos que realizam o processo de respiração anaeróbia. Em
condições estritamente anaeróbicas, após algumas semanas aparecem às bactérias
do gênero Clostridium, incorporando a celulose do sedimento como a fonte primária
de seu metabolismo.
Todas as espécies deste gênero são estritamente anaeróbicas, pois, embora
seus esporos possam sobreviver em condições aeróbicas, às células vegetativas
morrem se forem expostas ao oxigênio. Por essa razão não crescem até que todo o
oxigênio desapareça do sedimento, ou seja, não se desenvolvem até que condições
anóxicas sejam estabelecidas na camada de Solo. Os Clostridium degradam a
celulose à glicose e, em seguida, fermentam a glicose para obter a energia de que
necessitam, produzindo uma série dos compostos orgânicos simples (etanol, ácido
acético, succínico, H2, etc.) como produtos finais da fermentação.
Estes compostos servirão de substrato para as bactérias anaeróbicas
redutoras de sulfato ou enxofre, tais como Desulfovibrio e Desulforomonas,
reduzindo-o a sulfeto de hidrogênio (H2S). Neste processo, chamado de redução
dissimilatória, a matéria orgânica é oxidada e o sulfato, ou outras formas
parcialmente oxidadas do enxofre como o tiossulfato, são reduzidos ao funcionarem
como aceptores finais de elétron, gerando grandes quantidades de H2S.
Parte do sulfeto de hidrogênio formado poderá reagir com algum ferro que
esteja presente no sedimento, formando-se um precipitado preto de sulfeto de ferro,
que dá a coloração negra à camada.
O sulfeto de hidrogênio restante ao se difundir através da coluna será
utilizado por bactérias anaeróbias fototróficas (bactérias sulfurosas verdes e
20
púrpuras) que se desenvolverão de uma forma estratificada ao longo da coluna, de
acordo com gradiente de sulfeto (as bactérias sulfurosas púrpura são menos
tolerantes ao sulfeto do que as verdes). São vistas geralmente como duas faixas
brilhantemente coloridas imediatamente acima do sedimento – uma zona de
bactérias verdes do enxofre, tais como Chlorobium, caracterizado por uma cor verde
oliva indicativa de crescer condições anaeróbicas, seguida de uma zona de
bactérias púrpuras do enxofre, tais como Chromatium, que exibe uma coloração
vermelha.
As bactérias verdes e púrpuras do enxofre obtêm energia das reações
fotoquímicas e produzem seus materiais celulares a partir do CO2 de maneira bem
semelhante à fotossíntese das plantas. Entretanto, há uma diferença essencial: não
geram o oxigênio durante a fotossíntese porque não usam a água como o redutor;
utilizam o H2S como doador de elétron, com conseqüente produção de S (enxofre
elementar), que regressa ao sedimento do solo, sendo reciclado pelas bactérias
redutoras de sulfato (FIGURA 1) (ROSA apud FERNÁNDEZ, 2005, P. 03-04).
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Coleta das amostras
As amostras de solo usadas foram coletadas de dois locais da região
metropolitana de Porto Alegre, uma no CECAN – Centro de Empreendedorismo e
Parque Tecnológico de Canoas, localizado no município de Canoas, latitude 29° 55’
04’’ e longitude 51° 11’ 01’’ a 19 km de Porto Alegre – RS e a outra na estufa
experimental da Biotrakto – Tratamento Biológico de Resíduos, localizada no
município de Alvorada, latitude 29° 59’ 24’’ e longitude 51° 05’ 01’’ a 22,9 km de
Porto Alegre – RS.
De ambos os locais foram retiradas quatro amostras de solo, as primeiras
amostras foram realizadas no dia 01 de setembro de 2008, na CECAN/Canoas em
três pontos: primeiro ponto o solo coletado próximo à bomba de combustível,
segundo ponto solo próximo a vegetação de arbórea, terceiro ponto, local de
lavagem dos caminhões – tanque de combustível, uma amostra de solo com
vegetação e uma amostra de solo sem vegetação.
As outras amostras foram realizadas no dia 03 de setembro de 2008, na
Biotrakto em dois pontos: primeiro ponto solo de esgoto doméstico próximo à estufa,
segundo ponto solo da estufa, uma amostra de solo com compostagem orgânica e
as outras duas amostras, uma com óleo lubrificante usado e a outra sem O.L.U.
Todas as amostras foram acondicionadas em potes plásticos e armazenadas
em geladeira a temperatura de 4ºC durante um período de quinze dias. Sendo
realizada a montagem das colunas de Winogradsky no dia 18 de setembro de 2008
às 19h no laboratório de Microbiologia, sala 425 do prédio 1 do Centro Universitário
La Salle.
22
3.2 Montagem das Colunas de Winogradsky
As colunas de Winogradsky foram montadas no dia dezoito de setembro de
2008 às 19h, no Laboratório de Microbiologia sala 425 do prédio 1 do Centro
Universitário La Salle.
Para a montagem das colunas foram utilizados como materiais: reagentes:
Carbonato de sódio (Na2CO3), Sulfato de sódio (Na2SO4), materiais biológicos: papel
jornal, água mineral e solos dos dois locais de coleta; equipamento balança Gehaka
além de outros materiais de insumo como tubo de ensaio de vidro de 250 ml,
espátula, bastão de vidro, folha de alumínio, fita para medir pH e solução de NaOH e
HcL 0,1 mol/L.
A montagem consistiu da colocação de 60g do papel jornal no fundo de cada
coluna acrescido de 100 g de solo com 4,5 g de sulfeto de sódio (Na2So4,), 0,2 de
carbonato de sódio (Na2CO3) prensadas com auxilio de uma espátula, adicionando
água mineral até a borda de cada coluna, medindo pH e reajustando-o quando
necessário para o pH de 7,0. Após estas adições cada coluna foi recoberta com
papel alumínio apenas na sua borda, sendo alojado em bancada perto da janela
para a exposição à luz solar.
Foram montadas quatro colunas de cada local de coleta conforme os pontos
citados anteriormente, seguindo-se de:
a) CECAN
Primeira coluna A1 com 100g de amostra de solo do primeiro ponto
próximo à bomba de combustível. Esta houve reajuste de pH, pois este
estava com 9,0, adicionado-se cinco gotas de Hcl 0,1 mol-1;
Segunda coluna A2 com 100g de amostra de solo do segundo ponto
próximo a vegetação arbórea;
Terceira coluna A3 com 100g de amostra de solo sem vegetação;
Quarta coluna A4 com 100g de amostras de solo com vegetação;
b) Biotrakto
Primeira coluna B1 com 100g amostra de solo proveniente de esgoto
doméstico;
Segunda coluna B2 com 100g de amostra de solo com compostagem
orgânica;
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Terceira coluna B3 com 87, 409g de amostra de solo contaminado
artificialmente com O.L.U.;
Quarta coluna B4 com 100g de amostra de solo sem O.L.U.;
As colunas de Winogradsky ficaram no laboratório de microbiologia na sala
425 do prédio 1 do Centro Universitário La Salle pelo período de 45 dias
expostas conforme citado anteriormente, com observação semanal para registro
de quaisquer alterações na coloração e presença de microrganismos.
3.3 Análise das Colunas de Winogradsky
Para análise das colunas foram preparados dois tipos de meios de cultura, um
com Ágar Sabouraud com cloranfenicol e um Ágar Sabouraud sem cloranfenicol. A
preparação consistiu de quatro frascos de Erlenmeyers 500 ml esterilizados em
autoclave a 120° C por 20 minutos com meio de cultura Sabouraud (SAB) (ANEXO
A), dois frascos de Erlenmeyer com SAB contendo cloranfenicol e dois frascos de
Erlenmeyer sem cloranfenicol, após o preparo verteu-se o meio de cultura com SAB
em quarenta e oito placas de Petri identificadas, conforme o local de coleta. As
placas de Petri foram deixadas à parte para a solidificação, enquanto o solo e água
eram preparados para inoculação.
3.3.1 Análise d’água da superfície das colunas
Foram retiradas com o auxilio de canudos amostras d’água da superfície das
colunas, para análise direta em microscópio óptico, com o uso de lâminas e
lamínulas, a fim de verificar a presença de microrganismos como algas e
cianobactérias entre outros, para cada ponto, foi realizada a confecção de uma
lâmina.
Além disso, também foi inoculado 100µl de água de cada coluna com auxilio
de pipeta automática, espalhando-a com espátula de Drigalsky em cada uma das
dezesseis placas de Petri, oito placas de Petri com meio contendo cloranfenicol e
oito placas de Petri sem cloranfenicol identificadas conforme os pontos de coleta já
citados, sendo, portanto realizado um total de 16 placas.
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3.3.2 Incubação do solo
A incubação do solo foi composta por duas etapas, primeiramente retirou-se
solo da camada superficial de todos os pontos, sendo utilizado 5g de cada uma
adicionando 50 ml de solução salina 0,9%. Cada solo e solução salina foram
colocados em copos de Becker e agitados em agitador magnético Fifaton por
aproximadamente um minuto em velocidade dois, para diluição total do solo, após
esperou-se haver sedimentação para então com o auxílio de pipeta automática de
100µl dispensar essa água nas placas contendo os meios. A técnica usada foi Pour-
plate, com o auxílio de espátula de Drigalsky. Por conseguinte utilizou-se o mesmo
procedimento para extração de solo da camada inferior, incubando da mesma
maneira que a camada superficial. Totalizando aqui a confecção de 32 placas.
As quarenta e oito placas de Petri foram inoculadas por setenta e duas horas
(três dias) em estufa De Leo com temperatura de 28ºC +/- 2ºC, retiradas após esse
período e colocadas em refrigeração com temperatura 4ºC. A contagem das colônias
foi realizada vinte e quatro horas depois manualmente, diferenciando-as pela
coloração e forma.
Sendo realizada a repicagem das colônias para isolamento em placas
contendo meio SAB sem cloranfenicol e incubadas por quarenta e oito horas em
estufa De Leo com temperatura 28ºC +/- 2ºC., identificadas por coloração Gram
(ANEXO B) e coloração adaptada para identificação de fungo (APÊNDICE A).
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A coluna de Winogradsky teve por objetivo verificar a presença de
microrganismos e seu processo evolutivo a partir da adaptação aos diferentes
ambientes representados por zonas: aeróbica, microaerófila e anaeróbica.
Os resultados apresentados nos meios de cultura são compatíveis com os
organismos encontrados nas zonas da coluna de Winogradsky. Visto que cada zona
requer certa tolerância ambiental e necessidade vital para o desenvolvimento dos
microrganismos.
Água da superfície, zona aeróbica em exame direto apresentou como
resultados grande presença de algas e cianobacterias em destaque Botrydiopsis
Callosa algas unicelulares encontrada em solo e vegetação com musgo.
Chlorellidiopsis separabilis, os indivíduos de Chlorellidiopsis são epífitos, prendendo-
se diretamente ao substrato, e aparecem ora isolados, ora em grupos de quatro,
porém no último caso, sem qualquer organização (hábito gregário). As células são
hemisféricas, a parede celular é fina e lisa, dois ou mais cromo plastídios laminares
parietais. Vários autores sugerem reunir os gêneros Chlorellidiopsis e chlollidium
num só porque a única diferença entre ambos está em que a única espécie do
primeiro (C.separabilis) tem a possibilidade de destacar facilmente suas tétrades por
conta da pressão sobre o limite da mucilagem, as colônias seriam bastante
consistentes.
O gênero inclui só uma espécie conhecida, atualmente, apenas da Suíça e da
República Tcheca na Europa, e dos Estados Unidos e do Canadá, na América do
Norte. C.separabilis à única espécie deste gênero já coletada no Brasil e mais
especificamente, de um tanque artificial na cidade de SP. (BICUDO apud
PASCHER, 2006, p.334).
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Esses organismos crescem em vários tipos de ambientes, sendo a aquáticos.
Já as cianobacterias presentes nos indicam a ocorrência de fotossíntese.
Foram encontrados também Estamoeba coli que pertence à classe Lobosea
e a ordem amoebida, que são parasitas do homem, podendo ser encontradas em
todo o mundo. Várias espécies de vida livre podem tornar-se parasitas do homem,
devido a estes organismos serem encontrados em água doce, salgada, solo úmido e
vegetação em decomposição. Na maior parte dos casos doença alguma é causada
por ela por ela se tratar de um comensal não patogênico.
Cistos de Giardia lamblia é um flagelo da superclasse mastigophora sendo o
parasita intestinal mais comum. Podem ser encontrados em sistemas de águas de
esgotos, habitats de animais selvagens e fezes contaminadas.
A observação microscópica do solo nos permite verificar as inter-relações
entre os microrganismos as partículas do solo. Como esperado após cultivo em meio
de cultura SAB com clorofenicol e sem cloranfenicol obtivemos crescimentos de
actinomicetos, bactérias na forma de leveduras, basidiomicetos, zigomicetos e
fungos produtores de fenol oxidases.
Os actinomicetos encontrados apresentavam micélio, produziam esporos e a
produção de substâncias voláteis com cheiro rançoso característico. São aeróbicos e
heterotróficos, desempenhando um papel importante, junto com fungos e bactérias
na degradação de substâncias, apesar dos actinomicetos terem proporção pequena
na microbiota do solo, no presente trabalho apresentou-se ao contrário tendo uma
proporção maior na produção de fenol oxidase confirmado pela presença de
Bavendamm +. O Bavendamm é um método que se baseia na capacidade dos
microrganismos em oxidar o ácido Tânico, provocando o aparecimento de halos
escuros ao redor da colônia. Porém Piva (2005, p.251-264) após estudos constatou
que a substituição do ácido Tânico por resorcinol não alterava os resultados,
passando a utilizar resorcinol no teste.
As bactérias mostraram-se dentro do esperado, sendo mais observadas na
camada superficial do solo, porém somente em pontos onde ocorre tratamento do
solo.
Os fungos não se apresentaram tão abundantes no solo comparando a
literatura, pois se obteve maiores representantes na zona aeróbica do que na zona
anaeróbica, onde seria à ideal por apresentar resistências a altas pressões de Co2
que são úteis ao seu desenvolvimento, os fungos encontrados são das classes
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basidiomicetos representados pelos Aspergillus sp e zigomicetos representados pela
Absidia sp.
Absidia corymbifera É um gênero de fungo da família Mucoraceae, sendo esta
a mais conhecida pela sua patogenicidade especialmente de aborto em vacas.
Estão onipresentes na maioria dos ambientes sendo freqüentemente associados a
plantas e compostagem.
Em relação aos microrganismos com presença de fenol oxidase
provavelmente ocorreram devido aos pontos serem provenientes de solo de esgoto
doméstico próximo ao um ponto de combustível podendo ter ocorrido infiltração no
solo por HAP e solo de compostagem orgânica contaminado artificialmente com
OLU da estufa experimental BIOTRAKTO.
Cabe salientar que todos os resultados obtidos descritos (APÊNDICE B), são
provenientes de inoculação do substrato em SAB com e sem cloranfenicol, esses
meios de cultura destinam-se ao cultivo artificial dos microrganismos, nos quais
fornecem princípios nutritivos indispensáveis ao seu crescimento. Para o estudo
utilizou-se o meio (ANEXO A), porém conforme estudo PIVA, (2005, p.251-264)
substitui-se ácido tânico por resorcinol, obtendo-se os mesmos resultados.
5 CONCLUSÕES
A partir dos ensaios laboratoriais e monitoramento das colunas de
Winogradsky foi possível identificar microrganismos presentes no solo que são
condizentes às informações que constam na literatura. Isto porque os
microrganismos encontrados são capazes de biodegradar hidrocarbonetos.
Apesar dos resultados obtidos neste trabalho terem sido satisfatórios,
podemos verificar que há ainda necessidade da realização de culturas das zonas
aeróbica e anaeróbica em meio especifico, maiores estudos para que se tenha um
uso mais potencial da separação das colônias de acordo com suas necessidades
nutricionais.
REFERÊNCIAS
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APÊNDICE A – Adaptação de coloração para análise de fungo
900 mm de solução salina 0,9%;
Duas gotas de cristal violeta 37%
APÊNDICE B – Tabela 1 com os resultados obtidos
Coluna água superfície solo superfície solo última camada
Ponto análise direta c/clorofenicol s/clorofenicol c/clorofenicol s/clorofenicol c/ clorofenicol s/clorofenicol
A1 cianobactérias _ _ _ _ _ actinomiceto A2 Botrydiopsis Callosa _ _ _ _ _ actinomiceto A3 hifas _ _ _ _ _ actinomiceto A4 Botrydiopsis Callosa _ _ _ _ _ actinomiceto B1 fragmento de vegetação _ _ _ _ _ actinomiceto c/ fenol oxidase B2 Entamoeba coli _ actinomiceto actinomiceto actinomiceto _ actinomiceto c/ fenol oxidase
Botrydiopsis Callosa basidiomiceto Protista Cistos de Giardia lamblia Chlorellidiopsis separabilis
B3 Botrydiopsis Callosa actinomiceto leveduras Absidia sp. Levedura Gram+
_ actinomiceto Pisolithus tinctorius actinomiceto Pisolithus tinctorius actinomiceto basidiomiceto c/fenol oxidase
Levedura Gram
+
actinomiceto
B4 fragmento de vegetação _ _ actinomiceto diplococos Gram +
_ actinomiceto Basidiomiceto actinomiceto basidiomiceto Basidiomiceto Pisolithus tinctorius
A1 – Solo/ bomba de combustível, A2 – solo/vegetação arbórea, A3 – solo/lavagem de caminhão c/vegetação e A4 – solo/lavagem de caminhão s/vegetação B1 – Solo /esgoto doméstico, B2 – Solo/estufa c/ compostagem orgânica, B3 – solo/OLU e B4 – solo/estufa s/ tratamento
APÊNDICE C – Fotos dos Locais de coleta
CECAN – Centro de Empreendedorismo e BIOTRAKTO – estufa experimental Parque Tecnológico de Canoas Fonte: Anderson Fonte: http://www.unilasalle.edu.br/cecan
BIOTRAKTO – estufa experimental BIOTRAKTO – imagem área Fonte: Anderson Fonte: Anderson
APÊNDICE D – Fotos Coluna de Winogradsky
Colunas: CECAN Colunas: BIOTRAKTO Fonte: Luciane Fonte: Luciane
Colunas: CECAN Colunas: BIOTRAKTO Fonte: Luciane Fonte: Luciane
APÊNDICE E – Fotos dos resultados
Botrydiopsis Callosa Actinomiceto Fonte: Luciane Fonte: Luciane
Bavendamm
+ Bavendamm+
Fonte: Luciane Fonte: Luciane
Bactérias Gram
+ Absidia sp.
Fonte: Luciane Fonte: Luciane
ANEXO A – Meio de cultura Ágar Sabouraud com e sem cloranfenicol
Sabouraud/500 ml
D- Glicose Andra (Dextrose) Synth - 20g
Peptona de carne Bacteriológica Vetec - 5g
Ágar Bacteriológico Biobrás diagnósticos - 7,5g c/cloranfenicol
Água destilada - 500 ml
Resorcina P.A (resorcinol) Vetec – 2,5g
pH – 5,0
Sabouraud/500 ml
D- Glicose Andra (Dextrose) Synth – 20g
Peptona de carne Bacteriológica Vetec – 5g
Ágar Bacteriológico Biobrás diagnósticos – 7,5g s/ cloranfenicol
Água destilada – 500 ml
Resorcina P.A (resorcinol) Vetec – 2,5g
pH – 5,0
ANEXO B – Coloração Gram
Fixar o esfregaço seco à lâmina, flambando rapidamente três vezes no bico de
Bunsen;
Cobrir o esfregaço com solução cristal violeta, aguardar um minuto e desprezar
o corante;
Cobrir a lâmina com solução de lugol, aguardar um minuto e desprezar o
corante;
Gotejar solução de álccol-acetona rapidamente lavar a lâmina em H2O
corrente;
Cobrir a lâmina com fucsina de Gram e aguardar vinte ou trinta segundos;
Lavar a lâmina em H2O corrente e secar com papel absorvente sem esfregar.