a inibição farmacológica de igf1r/irs reduz a...
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A inibição farmacológica de IGF1R/IRS reduz a migração e adesão celular e modula genes da via
MAPK em leucemia linfoide aguda
Ana Paula Nunes Rodrigues Alves1, João Agostinho Machado-Neto1, Jaqueline Cristina Fernandes1, Bruna Alves Fenerich1, Renata Scopim-Ribiero1, Fernanda Borges da Silva1, Belinda
Pinto Simões1, Eduardo Magalhães Rego1, Anne J. Ridley2, Fabiola Traina1
1 Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP – Ribeirão Preto, SP, Brasil2King’s College London – Londres, Reino Unido
Departamento de Clínica Médica - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
Ribeirão Preto, São Paulo, Brasil
Leucemia Linfoide Aguda
Expansão clonal de células progenitoras linfoides
Emily Elert. Nature, 2013.
Adapatado de Mardilovich et al. Cell Communication and Signaling, 2009.
Via de sinalização IGF1R/IRS
IRS1/2
PI3K Gbr2
Akt
mTORp70S6K
ERK1/2
SHP2
Via de sinalização MAPK
Síntese ProteicaGlicólise
Expressão gênicaProliferação celularMobilidade/Invasão
GlicóliseExpressão gênica
Proliferação celularMobilidade/Invasão
Via de sinalização PI3K/Akt/mTOR
pYIGF1R/IR
Expressão de IGF1R e IRS1 em LLA
Fernandes, J.C. e Rodrigues Alves, A. P. N., et. al. Artigo em revisão, 2016.
Adapatado de Mardilovich et al. Cell Communication and Signaling, 2009.
OSI-906 (Linsitinib) – inibidor seletivo de IGF1R/IR
IRS
PI3KGbr2
Akt
mTOR
p70S6K
ERK1/2
IGF1/Insulina
IGF1R/IR OSI-906 (Linsitinib)
NT157 – inibidor seletivo de IRS1/2
NT157
Reuveni, H. et al. The Journal of Cancer Research, 2013.Adapatado de Mardilovich et al. Cell Communication and Signaling, 2009.
OSI-906 (Linsitinib) – inibidor seletivo de IGF1R/IR
IRS
PI3KGbr2
Akt
mTOR
p70S6K
ERK1/2
IGF1/Insulina
IGF1R/IR OSI-906 (Linsitinib)
NT157 reduz viabilidade e induz apoptose em células de LLA
∅ 0.2 0.4 0.8 1.6 320
20
40
60
80
100
120
14024 horas48 horas72 horas
*********
****
***
****** ***
***
***
*** *** ***
NT157 (µM)
Viab
ilida
de (%
do
cont
role
)
∅ 0.2 0.4 0.8 1.60
20
40
60
80
100
12024 horas48 horas72 horas
**
***
***
*********
***
NT157 (µM)%
de
célu
las
apop
tótic
as
ØNT157 (μM)
72 horas
48 horas
24 horas
0.2 0.4 0.8 1.6
Anexina V
Iode
tode
Pro
pídi
oCélulas Jurkat
∅ 0.2 0.4 0.8 1.6 3.20
20
40
60
80
100
120
14024 horas48 horas72 horas
***** ***
***
**** ***
***
NT157 (µM)
Viab
ilida
de (%
do
cont
role
)
∅ 0.2 0.4 0.8 1.60
20
40
60
80
100
12024 horas48 horas72 horas
**
**
NT157 (µM)
% d
e cé
lula
s ap
optó
ticas
ØNT157 (μM)
Anexina V
Iode
tode
Pro
pídi
o
72 horas
48 horas
0.2 0.4 0.8 1.6
24 horas
Células Namalwa
Rodrigues Alves, A. P. N., et. al. Doutorado em andamento.
Células Jurkat Células Namalwa
∅ 1 5 10 200
20
40
60
80
100
120
14024 horas48 horas72 horas
***
******
***
**
******
OSI-906 (µM)
Viab
ilida
de (%
do
cont
role
)
∅ 1 5 100
20
40
60
80
100
12024 horas48 horas72 horas
*
OSI-906 (µM)%
de
célu
las
apop
tótic
as
ØOSI- 906 (μM)
Anexina V
Iode
tode
Pro
pídi
o
72 horas
48 horas
24 horas
1 5 10
∅ 1 5 10 200
20
40
60
80
100
120
14024 horas48 horas72 horas
******* ******
******
******
******
*
OSI-906 (µM)
Viab
ilida
de (%
do
cont
role
)
∅ 1 5 100
20
40
60
80
100
12024 horas48 horas72 horas
OSI-906 (µM)
% d
e cé
lula
s ap
optó
ticas
ØOSI- 906 (μM)
Anexina V
Iode
tode
Pro
pídi
o
72 horas
48 horas
24 horas
1 5 10
OSI-906 modula viabilidade, mas não apoptose em células de LLA
Rodrigues Alves, A. P. N., et. al. Doutorado em andamento.
Objetivos
Investigar os mecanismos moleculares envolvidos na respostadas células de LLA aos inibidores farmacológicos de
IRS1/IRS2 (NT157) e de IGF1R/IR (OSI-906) e seus efeitos naadesão e migração celular
Material e Métodos
Análise estatística: t de Student. p<0.05 foi considerado significamente estatístico.
Linhagens celulares Drogas e tratamentos
Jurkat - LLA T
Namalwa - LLA B
NT157 (IRS1/2):0.4; 0.8 µM
OSI-906 (IGF1R/IR): 10 µM
Por 24 e 48 horas
Ensaios
Expressão gênica: PCR array e PCRq
Adesão Celular
Migração (Time-Lapse)
Via de sinalização MAPK PCR Array
84 Genes de Interesse
• Oncogenes• Genes supressores tumoral• Fatores de transcrição• Genes envolvidos em processos
celulares essencias:• - proliferação• - apoptose• - ciclo celular
Células Jurkat não-tratadas vs. NT157 0.8 µM (24 horas de tratamento)
Fold
chan
geem
rela
ção
ao c
ontr
ole
Baixa expressão Alta expressão
MYC 0.27
ETS2 0.34
MAP2K6 0.40
MAPKAPK3 0.43
HSPBB1 0.45
MAP3K1 2.01
MEF2C 2.03
KSR1 2.05
CDKN2B 2.10
MAPK6 2.23
MST1 2.29
NFATC4 2.33
MAKP12 2.60
CDKN2A 2.76
MAPK8IP2 2.77
DLK1 2.83
MAPK11 3.20
MOS 4.87
EGFR 4.98
CDKN1C 6.58
JUN 9.25
MAPK10 17.01
EGR1 19.18
CDKN1A 29.20
FOS 66.26
Genes Fold-change
Células Jurkat tratadas com NT157 (0.8 µM)
NT157 modula a expressão de 25 genes da via de sinalização MAPK
Fold
chan
geem
rela
ção
ao c
ontr
ole
Baixa expressão Alta expressão
MYC 0.27
ETS2 0.34
MAP2K6 0.40
MAPKAPK3 0.43
HSPBB1 0.45
MAP3K1 2.01
MEF2C 2.03
KSR1 2.05
CDKN2B 2.10
MAPK6 2.23
MST1 2.29
NFATC4 2.33
MAKP12 2.60
CDKN2A 2.76
MAPK8IP2 2.77
DLK1 2.83
MAPK11 3.20
MOS 4.87
EGFR 4.98
CDKN1C 6.58
JUN 9.25
MAPK10 17.01
EGR1 19.18
CDKN1A 29.20
FOS 66.26
Genes Fold-change
Células Jurkat tratadas com NT157 (0.8 µM)
p21
10
255075
100125150175200225250 Jurkat
MOLT4NamalwaRaji
NT157 (0.8µM)
**
** *Nív
el r
elat
ivo
de e
xpre
ssão
deC
DK
N1A
(RNA
m)
MYC
10.0
0.5
1.0
1.5
2.0 JurkatMOLT4NamalwaRaji
NT157 (0.8µM)
*
**
*
***
Nív
el r
elat
ivo
de e
xpre
ssão
deM
YC (R
NAm
)
JUN
10
10
20
30
40
50 JurkatMOLT4NamalwaRaji
NT157 (0.8µM)
***** **
*
Nív
el r
elat
ivo
de e
xpre
ssão
deJU
N (R
NAm
)
FOS
10
25
50
75
100
125 JurkatMOLT4NamalwaRaji
NT157 (0.8µM)
*
*
*
Nív
el r
elat
ivo
de e
xpre
ssão
deFO
S (R
NAm
)
NT157 modula a expressão de 25 genes da via de sinalização MAPK
Teste t de Student. * p˂0.05; ** p˂0.001; ***p˂0.0001
Inibidores farmacológicos de IGF1R/IRS reduzem a adesão celular em HUVEC
Células Namalwa
CTRL NT157 0.4µM OSI-906 10µM0
20
40
60
80
100
120
140
Ades
ão H
UVE
C (%
do
cont
role
)
Células Jurkat
CTRL NT157 0.4µM OSI-906 10µM0
20
40
60
80
100
120
140
Ades
ão H
UVE
C (%
do
cont
role
)
Células Jurkat
Células Namalwa
CTRL
CTRL
NT157 0.4µM
NT157 0.4µM
OSI-906 10µM
OSI-906 10µM
Inibidores farmacológicos de IGF1R/IRS reduzem a migração celular em Jurkat
Células Jurkat
CTRL NT157 0.4µM OSI-906 10µM0
50
100
150
200
250
***
Dis
tânc
ia a
cum
ulad
a ( µ
m)
Células Jurkat
CTRL NT157 0.4µM OSI-906 10µM0.0
0.5
1.0
1.5
**
Velo
cida
de ( µ
m/m
in)
Células Jurkat
CTRL NT157 0.4µM OSI-906 10µM
Teste t de Student. * p˂0.05; ** p˂0.001
ConclusõesNT157 modulou 25 genes da via de sinalização MAPK
o Redução da expressão de MYC (gene relacionado à proliferação celular)o Aumento da expressão de CDKN1A (gene relacionado com a parade do ciclo celular)o Aumento da expressão de JUN e FOS (genes relacionados à apoptose)
NT157 e OSI-906 reduziram a adesão celular de linhagens leucêmicas de LLA em célulasendoteliais humanas (HUVEC)
NT157 e OSI-906 inibiram a migração transendotelial em linhagem leucêmica de LLA,contribuindo com novas perspectivas da participação do eixo IGF1R/IRS na quebra dabarreira hemato-encefálica
