avaliaÇÃo farmacolÓgica de novos derivados ... · avaliaÇÃo farmacolÓgica de novos derivados...
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AVALIAAVALIAÇÇÃO FARMACOLÃO FARMACOLÓÓGICA DE NOVOS DERIVADOS GICA DE NOVOS DERIVADOS METILENODIOXIFENILSULFONAMMETILENODIOXIFENILSULFONAMÍÍDICOS DICOS
FUNCIONALIZADOSFUNCIONALIZADOS
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIROLABORATÓRIO DE FARMACOLOGIA CARDIOVASCULAR – DFBC – ICBLABORATÓRIO DE AVALIAÇÃO E SÍNTESE DE SUBSTÂNCIAS BIOATIVAS – LASSBio - FACULDADE DE FARMÁCIA
Família (nº de genes)
Características Localização Exemplos de inibidores
PDE1 Estimulada por Ca2+/calmodulina
Coração, cérebro, pulmão, músculo liso Vinpocetina
Coração, pulmão, plaquetas, tecido
adiposo, músculo liso vascular.
Vias aéreas, células de Sertoli, rim, cérebro,
fígado, pulmão.
Pulmão, plaquetas, músculo liso
Milrinona, cilostamida
Rolipram
Sildenafil, zaprinast, dipiridamol
PDE3seletiva para AMPc; inibida
por GMPc;
PDE4Específica para
AMPc; insensível a GMPc
PDE5 Específica para GMPc
Principais PDEs encontradas no músculo liso
Materiais e métodos
TENSÃO ISOMÉTRICA DE MÚSCULO LISO VASCULAR E TRAQUEAL
Cuba experimental
Transdutor de tensãoAnel de aorta
ou traquéia
Sinaisdigitalizados
Ratos Wistar, machos, 220-300 g
derivados → 0,5 – 1000 µM
CH3
S
O
O
O O
N
H
O
O
CH3
CH3
LASSBio 448
CH3
S
O
O
O O
N
H
O
O
CH3
CH3
LASSBio 448
O O
N
H
OCH3
O
CH3
S
LASSBio 965
SO
N O
O
CH3
CH3
O
CH3
LASSBio 982
SO
N O
O
CH3
CH3
O
LASSBio 984N O
O
CH3
CH3
O
H
CH3 SO
LASSBio 985
Resultados
DERIVADOS NA CONTRATILIDADE DE ANÉIS DE TRAQUÉIA
log [M]-7 -6 -5 -4 -3
Con
tratu
ra -
Ace
tilco
lina
(% c
ontro
le)
0
20
40
60
80
100
120
140
LASSBio 448 LASSBio 965 LASSBio 982 LASSBio 984 LASSBio 985
CH3
S
O
O
O O
N
H
O
O
CH3
CH3
LASSBio 448
CH3
S
O
O
O O
N
H
O
O
CH3
CH3
LASSBio 448
LASSBio 959CH3
SN
O
O
O O
O
O
CH3
CH3
LASSBio 960
CH3
SN
O
O
O O
O
O
CH3
CH3
LASSBio 960CH3
SN
O
O
O O
O
O
CH3
CH3
LASSBio 961
CH3
SN
O
O
O O
O
O
CH3
CH3
LASSBio 961CH3
S
O
O
O O
N
H
LASSBio 964
CH3
SN
CH3O
O
O O
O
O
CH3
CH3
O
O
CH3
SO
N O
O
CH3
CH3
O
LASSBio 962
Resultados
DERIVADOS NA CONTRATILIDADE DE ANÉIS DE TRAQUÉIA
log [M]-7 -6 -5 -4 -3
Con
tratu
ra -
Ace
tilco
lina
(% c
ontro
le)
0
20
40
60
80
100
120
140
LASSBio 448 LASSBio 960 LASSBio 961 LASSBio 962 LASSBio 964 LASSBio 959
Materiais e métodos
MECANISMO DE AÇÃO DO RELAXAMENTO DO MÚSCULO LISO TRAQUEAL
Ratos Wistar, machos, 220-300 g
Pré-incubação com diversos antagonistas:
- L-NAME: inibidor da óxido nítrico sintase
- indometacina: inibidor da cicloxigenase
- propranolol: antagonista de receptor β-adrenérgico
derivados → 5 – 1000 µM
Resultados
MECANISMO DE AÇÃO DE LASSBio 448 NO MÚSCULO LISO TRAQUEAL
log [M]
-7 -6 -5 -4 -3
Con
tratu
ra -
Ace
tilco
lina
(% c
ontro
le)
0
20
40
60
80
100
120
LASSBio 448 LASSBio 448 + L-NAME
log [M]
-7 -6 -5 -4 -3
Con
tratu
ra -
Acet
ilcol
ina
(% c
ontro
le)
0
20
40
60
80
100
120
LASSBio 448 LASSBio 448 + indometacina
log [LASSBio 448] M
-7 -6 -5 -4 -3 -2C
ontra
tura
-Ace
tilco
lina
(% c
ontro
le)
0
20
40
60
80
100
120
LASSBio 448 LASSBio 448 + propranolol
CH3
S
O
O
O O
N
H
O
O
CH3
CH3
LASSBio 448
CH3
S
O
O
O O
N
H
O
O
CH3
CH3
LASSBio 448
O O
N
H
OCH3
O
CH3
S
LASSBio 965
SO
N O
O
CH3
CH3
O
CH3
LASSBio 982
SO
N O
O
CH3
CH3
O
LASSBio 984N O
O
CH3
CH3
O
H
CH3 SO
LASSBio 985
Resultados
DERIVADOS NA CONTRATILIDADE DA MUSCULATURA LISA VASCULAR DE ANÉIS DE AORTA
log [M]-8 -7 -6 -5 -4 -3 -2
Con
tratu
ra -
Feni
lefri
na(%
con
trole
)
0
20
40
60
80
100
LASSBio 448 LASSBio 965 LASSBio 982 LASSBio 985 LASSBio 984
CH3
S
O
O
O O
N
H
O
O
CH3
CH3
LASSBio 448
CH3
S
O
O
O O
N
H
O
O
CH3
CH3
LASSBio 448
LASSBio 959CH3
SN
O
O
O O
O
O
CH3
CH3
LASSBio 960
CH3
SN
O
O
O O
O
O
CH3
CH3
LASSBio 960CH3
SN
O
O
O O
O
O
CH3
CH3
LASSBio 961
CH3
SN
O
O
O O
O
O
CH3
CH3
LASSBio 961 CH3
S
O
O
O O
N
H
LASSBio 964
CH3
SN
CH3O
O
O O
O
O
CH3
CH3
Resultados
DERIVADOS NA CONTRATILIDADE DA MUSCULATURA LISA VASCULAR DE ANÉIS DE AORTA
O
O
CH3
SO
N O
O
CH3
CH3
O
LASSBio 962
log [M]-8 -7 -6 -5 -4 -3 -2
Con
tratu
ra -
Feni
lefri
na(%
con
trole
)
0
20
40
60
80
100
LASSBio 448 LASSBio 959 LASSBio 960 LASSBio 961 LASSBio 964
LASSBio 960 - log [M]
-5 -4 -3
Con
tratu
ra -
Feni
lefri
na(%
con
trole
)
0
20
40
60
80
100
120
com endotéliosem endotélio
LASSBio 959 - log [M]
-5 -4 -3
Con
tratu
ra -
Feni
lefri
na(%
con
trole
)
0
20
40
60
80
100
120
com endotéliosem endotélio
LASSBio 448 - log [M]
-5 -4 -3
Con
tratu
ra -
Feni
lefri
na(%
con
trole
)
0
20
40
60
80
100
120
com endotélio sem endotélio
CH3
S
O
O
O O
N
H
O
O
CH3
CH3
LASSBio 448
CH3
S
O
O
O O
N
H
O
O
CH3
CH3
LASSBio 448
CH3
SN
O
O
O O
O
O
CH3
CH3
LASSBio 960
CH3
SN
O
O
O O
O
O
CH3
CH3
LASSBio 960
CH3
SN
CH3O
O
O O
O
O
CH3
CH3
LASSBio 959
Resultados
AÇÃO NO MÚSCULO LISO VASCULAR EM AORTAS SEM ENDOTÉLIO
LASSBio 965 - log [M]
-7 -6 -5 -4 -3
Con
tratu
ra -
Feni
lefri
na(%
con
trole
)
0
20
40
60
80
100
120
com endotéliosem endotélio
LASSBio 961 - log [M]
-5 -4 -3
Con
tratu
ra -
Feni
lefri
na(%
con
trole
)
0
20
40
60
80
100
120
com endotéliosem endotélio
CH3
SN
O
O
O O
O
O
CH3
CH3
LASSBio 961
CH3
SN
O
O
O O
O
O
CH3
CH3
LASSBio 961CH3
S
O
O
O O
N
H
O O
N
H
OCH3
O
CH3
S
LASSBio 964
LASSBio 965
Resultados
AÇÃO NO MÚSCULO LISO VASCULAR EM AORTAS SEM ENDOTÉLIO
LASSBio 964 - log [M]
-6 -5 -4 -3
Con
tratu
ra -
Feni
lefri
na(%
con
trole
)
0
20
40
60
80
100
120
com endotéliosem endotélio
Substâncias Traquéia (μM) Aorta - com endotélio (μM)
Aorta - sem endotélio (μM)
LASSBio 448 245,5 ± 30,2 15,4 ± 2,4 79,3 ± 3,7
LASSBio 959 99,6 ± 6,5 14,3 ± 4,2 75,9 ± 9,1
LASSBio 960 ND 97,7 ± 22,7 ND
LASSBio 961 66,3 ± 9,2 13,9 ± 3,3 55,2 ± 5,3
LASSBio 962 35,5 ± 13,1 - -
LASSBio 964 191,6 ± 45,7 29,5 ± 5,8 28,8 ± 10,7
LASSBio 965 352,9 ± 29,5 3,1 ± 1,5 11,7 ± 3,7
LASSBio 982 75,4 ± 11,3 19,9 ± 9,9 -
LASSBio 984 ND 33,0 ± 8,2 -
LASSBio 985 ND 16,6 ± 6,9 ND
Resultados
CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÉDIA DOS DERIVADOS DO LASSBIO 448
Materiais e métodos
MECANISMO DA AÇÃO VASODILATADORA DO LASSBio-985
Ratos Wistar, machos, 220-300 g
Remoção mecânica do endotélio vascular
Pré-incubação com diversos antagonistas:
- L-NAME: inibidor da óxido nítrico sintase
- atropina: antagonista muscarínico
- naloxona: antagonista opióide
- indometacina: inibidor da cicloxigenase
- glibenclamida: inibidor de canal de K+
derivados → 5 – 1000 µM
N O
O
CH3
CH3
O
H
CH3 SO
LASSBio 985
LASSBio 985 - log [M]
-5 -4 -3
Con
tratu
ra -
Feni
lefri
na(%
con
trole
)
0
20
40
60
80
100
120
com endotéliosem endotélio + L-NAME
Resultados
MECANISMO DE AÇÃO DE LASSBio 985 NO MÚSCULO LISO VASCULAR
log [M]
-5 -4 -3C
ontra
tura
- Fe
nile
frina
(% c
ontro
le)
0
20
40
60
80
100
120 LASSBio 985 + atropinaLASSBio 985 - log [M]
-5 -4 -3
Con
tratu
ra -
Feni
lefri
na(%
con
trole
)
0
20
40
60
80
100
120 sem endotéliocom endotélio
Resultados
MECANISMO DE AÇÃO DE LASSBio 985 NO MÚSCULO LISO VASCULAR
log [M]
-5 -4 -3C
ontra
tura
- Fe
nile
frina
(% c
ontro
le)
0
20
40
60
80
100
120 LASSBio 985+ glibenclamida
log [M]
-5 -4 -3
Con
tratu
ra -
Feni
lefri
na(%
con
trole
)
0
20
40
60
80
100
120 LASSBio 985+ indometacina
log [M]
-5 -4 -3
Con
tratu
ra -
Feni
lefri
na(%
con
trole
)
0
20
40
60
80
100
120
LASSBio 985+ naloxona
log [M]-6 -5 -4 -3
Con
tratu
ra -
Feni
lefri
na(%
con
trole
)
0
20
40
60
80
100
120
L965 L985 L961
Resultados
AÇÃO DOS DERIVADOS EM CORPO CAVERNOSO DE COBAIO
Materiais e métodos
INFUSÃO CONTÍNUA IN VIVO – PARÂMETROS HEMODINÂMICOS
Ratos Wistar ou SHR, machos, 220-300gInfusão venosa → PA, FC e FRderivados: 10 mg/kg/min
Anestesia Éter etílico
Veia jugularInfusão – 15 min
Artéria carótidaPA
EletrodosECG
Parâmetros – Ratos Wistar Controle 5 min 10 min 15 min
Freqüência cardíaca (bpm) 450,0 ± 0,0 420,0± 30,0 450,0 ± 30,0 405,0 ± 75,0
Freqüência respiratória (irm) 87,0 ± 3,0 96,0 ± 12,0 106,0 ± 10,0 102,0 ± 18,0
Pressão sistólica (mmHg) 125,0 ± 5,0 127,5 ± 7,5 127,5 ± 7,5 127,5 ± 2,5
Pressão diastólica (mmHg) 115,0 ± 5,0 115,0 ± 5,0 110,0 ± 10,0 112,5 ± 7,5
Parâmetros - SHR Controle 5 min 10 min 15 min
Freqüência cardíaca (bpm) 360,0 ± 32,4 360,0± 12,2 367,5 ± 25,6 375,0 ± 8,7
Freqüência respiratória (irm) 77,0 ± 1,9 104,0 ±18,6 100,5 ± 2,6 85,0 ± 3,3
Pressão sistólica (mmHg) 177,5 ± 11,8 172,5 ±10,3 167,5 ± 7,8 166,3 ± 18,4
Pressão diastólica (mmHg) 140,0 ± 12,1 121,3 ±11,3 113,7 ± 6,3 115,0 ± 14,9
ResultadosLASSBio 965 (10 mg.kg-1.min-1) NA PRESSÃO ARTERIAL
DE RATOS WISTAR E SHR
Resultados
LASSBio 448 e 959 (10 mg.kg-1.min-1) NA PRESSÃO ARTERIAL DE SHR
Parâmetros Controle 5 min 10 min 15 min
Freqüência cardíaca (bpm) 420,0 ± 0,0 375,0 ± 45,0 390,0 ± 0,0 390,0 ± 0,0
Freqüência respiratória (irm) 76,0 ± 4,0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 88,0 ± 0,0
Pressão sistólica (mmHg) 217,5 ± 17,5 197,5 ± 17,5 195,0 ± 15,0 192,5 ± 17,5
Pressão diastólica (mmHg) 175,0 ± 15,0 155,0 ± 15,0 147,5 ± 7,5 147,5 ± 7,5
448
959
• Não provocou nenhuma alteração nos parâmetros hemodinâmicos de SHR
LASSBio 985 10 mg.kg-1.min-1
15 min5 minControle 10 min
25 mm/s
mmHg 0
50
150
100
1s
Parâmetros Controle 5 min 10 min 15 min
Freqüência cardíaca (bpm) 390,0 ± 27,4 360,0 ± 24,5 382,5 ± 22,5 382,5 ± 22,5
Freqüência respiratória (irm) 112,0 ± 4,0 128,0 ± 0,0 126,0 ± 10,0 130,0 ± 10,0
Pressão sistólica (mmHg) 131,3 ± 11,6 123,8 ± 11,4 118,8 ± 8,3 117,5 ± 5,2
Pressão diastólica (mmHg) 93,8 ± 9,4 75,0 ± 15,1 65,0 ± 10,2 65,0 ± 10,6
ResultadosLASSBio 985 (10 mg.kg-1.min-1) NA PRESSÃO ARTERIAL DE RATOS WISTAR
15 min5 minControle 10 min
mmHg 0
50
150
100
200
25 mm/s
1s
Parâmetros Controle 5 min 10 min 15 min
Freqüência cardíaca (bpm) 360,0 ± 0,0 360,0± 0,0 360,0 ± 0,0 360,0 ± 0,0
Freqüência respiratória (irm) 132,0 ± 28,0 136,0 ±24,0 152,0 ± 8,0 140,0 ± 20,0
Pressão sistólica (mmHg) 197,5 ± 7,5 162,5 ± 7,5* 157,5± 12,5* 140,0 ± 5,0*
Pressão diastólica (mmHg) 145,0 ± 10,0 105,0 ±10,0* 90,0 ± 10,0* 75,0 ± 10,0**P < 0,05: PAS e PAD 5, 10 e 15 min versus controle
LASSBio 985 10 mg.kg-1.min-1
ResultadosLASSBio 985 (10 mg.kg-1.min-1) NA PRESSÃO ARTERIAL DE SHR
Materiais e MétodosTRATAMENTO CRÔNICO – 14 DIAS – LASSBio 985
Ratos SHR, machos, 220-280g
LASSBio 985: - 5 mg/kg
- 10 mg/kg
Administração intraperitoneal
Tratamento: 14 dias
Medidas: Pressão sistólica
Pressão diastólica
Pressão arterial média
Medida não invasiva: Pletismógrafo
ResultadosLASSBio 985 (5 e 10 mg/kg) NA PRESSÃO ARTERIAL DE SHR
TRATAMENTO CRÔNICO
PRESSÃO SISTÓLICA
Tratamento (dias)
0 2 4 6 8 10 12 14 16
PS
(mm
Hg)
0
40
80
120
160
200
240
5 mg/kg 10 mg/kg
Tratamento (dias)
0 2 4 6 8 10 12
PS
(mm
Hg)
0
40
80
120
160
200
240
5 mg/kg 10 mg/kg
2h após tratamento 24h após tratamento
ResultadosLASSBio 985 (5 e 10 mg/kg) NA PRESSÃO ARTERIAL DE SHR
TRATAMENTO CRÔNICO
PRESSÃO DIASTÓLICA
Tratamento (dias)
0 2 4 6 8 10 12 14 16
PD
(mm
Hg)
0
40
80
120
160
200
240
5mg/kg10mg/kg
2h após tratamento
Tratamento (dias)
0 2 4 6 8 10 12
PD
(mm
Hg)
0
40
80
120
160
200
240
5mg/kg10mg/kg
24h após tratamento
ResultadosLASSBio 985 (5 e 10 mg/kg) NA PRESSÃO ARTERIAL DE SHR
TRATAMENTO CRÔNICO
PRESSÃO ARTERIAL MÉDIA
Tratamento (dias)
0 2 4 6 8 10 12 14 16
PA
M (m
mH
g)
0
40
80
120
160
200
240
5mg/kg10mg/kg
Tratamento (dias)
0 2 4 6 8 10 12
PAM
(mm
Hg)
0
40
80
120
160
200
240
5 mg/kg10mg/kg
2h após tratamento 24h após tratamento
Materiais e MétodosHISTOLOGIA
Fixação: formol 10%
Clivagem
1ª Desidratação: álcool
2ª Desidratação: xilol
Inclusão em parafina
Microtomia
Fixação do corte na lâmina
Coloração: Eosina e Hematoxilina
Montagem
DMSO LASSBio-985 (5mg/kg) LASSBio-985 (10mg/kg)
AORTA
BAÇO
CÉREBRO
X400
DMSO LASSBio-985 (5mg/kg) LASSBio-985 (10mg/kg)
X400
CORAÇÃO
FÍGADO
PULMÃO
DMSO LASSBio-985 (5mg/kg) LASSBio-985 (10mg/kg)
X400
RIM
EDL
SOLEAR
Etapas a serem realizadas
Concluir a investigação do mecanismo de ação para LASSBio-985 no músculo liso vascular
Tratamento crônico com LASSBio-985, 2 vezes ao dia em ratos normais e SHR
Tratamento agudo por injeção em bolo e infusão venosa de LASSBio-985 tendo em vista possível aplicação no tratamento de emergências hipertensivas