substratos do receptor de insulina-1 e 2 (irs-1 e irs-2) na tireóide

Substratos do receptor de insulina-1 e 2 (IRS-1 e IRS-2)

na tireóide e no fígado – estudo do dimorfismo sexual

e da modulação pelo estrogênio

Renata Grozovsky

Dissertação de Doutorado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Medicina (Endocrinologia), Faculdade de Medicina, da Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Medicina (Endocrinologia).

Orientadores: Profa. Denise Pires de Carvalho Prof. Mário Vaisman

Rio de Janeiro Maio/2006

2

SUBSTRATO DO RECEPTOR DE INSULINA-1 E 2 (IRS-1 E IRS-2) NA TIREÓIDE

E NO FÍGADO – ESTUDO DO DIMORFISMO SEXUAL E DA MODULAÇÃO PELO

ESTROGÊNIO

Renata Grozovsky

Orientadores: Profa. Denise Pires de Carvalho e Prof. Mário Vaisman

Dissertação de Doutorado submetida ao Programa de Pós-Graduação em

Medicina (Endocrinologia), Faculdade de Medicina, da Universidade Federal do Rio

de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de

Doutor em Medicina (Endocrinologia).

Aprovada por: Dra. Maria Lúcia Fleiuss de Faria Dra. Vivian Mary Barral Dodd Rumjanek Dra. Doris Rosenthal Dra. Tânia Weber Furlanetto Dra. Flávia Lúcia Conceição

Rio de Janeiro Maio/2006

3

FICHA CATALOGRÁFICA

Grozovsky, Renata. Substratos do receptor de insulina-1 e 2 (IRS-1 e IRS-2) na

tireóide e no fígado – estudo do dimorfismo sexual e da modulação pelo estrogênio / Renata Grozovsky. – Rio de Janeiro: UFRJ / Faculdade de Medicina, 2006. xiv, 83 f.: il. Dissertação (Doutorado em Endocrinologia) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de Medicina / Endocrinologia, 2006. Orientadores: Denise Pires de Carvalho e Mario Vaisman 1. Tireóide. 2. Estrogênio. 3. IRSs. 4. Fígado. 5. Castração – Teses. I. Grozovsky, Renata. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Faculdade de Medicina/ Endocrinologia. III. Título.

4

“Ciência também é perseverança”

5

AGRADECIMENTOS

Denise Pires de Carvalho, minha eterna orientadora. E eu que achei que o

mestrado tinha sido tortuoso... Obrigada pelo apoio, pela formação, pelo exemplo,

pela paciência, pelo carinho, você com certeza é uma pessoa especial.

Mario Vaisman, meu novo orientador, que na ausência da Denise não me

deixou sem pai ou mãe! Obrigada pelo carinho, pela disciplina (quase consegui

cumprir todos os prazos!) e por confiar em mim.

Nádia, você foi nota 10. obrigada pela força, competência e carinho.

Dra. Doris, minha admiração é eterna. Obrigado pelos conselhos, conversas

na volta pra casa e carinho.

Michelle e Alba, companheiras de bancada, obrigada pela força e

gargalhadas em todos os momentos, sábados no laboratório são bem melhores com

música e quitutes.

Flávia e Sabrina, minhas grandes amigas, apesar de trabalharem com

humanos, a ajuda e conselhos de vocês são indispensáveis.

Luiz Felipe, um novo amigo, que me ajudou muito no decorrer desta tese.

Karen, minha mais que amiga, irmã de todas as horas, obrigada mais uma

vez pelo incentivo e por escutar sempre que estou mais triste.

Aos amigos super-companheiros do laboratório, Álvaro, Andréia, Camilla,

Danielle, Débora, Elaine, Gloria, Lívia, Mônica, Renatinha, Rodrigo, Thiago,

Valmara, sem esquecer do Wagner, Valdo e da Norma, a descontração no

ambiente de trabalho torna tudo mais fácil, obrigada pelo companheirismo.

Mariana e Suzana, minhas super-amigas, que mesmo sem ter idéia do que

faço, (quer dizer, eu mato ratinho...) me dão muito apoio e torcem sempre por mim.

6

Família, vô Icek, vó Fanny, tios Jaques e Eliana, primo Bruno, apesar de

pequena somos uma “grande” família. Obrigada pela força, também tenho muito

orgulho de vocês!

Gilda, minha mãe, você me colocou no mundo, preciso dizer mais?!

Dafne, querida irmã, o companheirismo não podia ser maior, a gente ainda

vai muito longe.

Moacyr, meu pai, meu eterno anjo da guarda.

7

RESUMO

Substratos do receptor de insulina-1 e 2 (IRS-1 e IRS-2) na tireóide e no fígado

– estudo do dimorfismo sexual e da modulação pelo estrogênio

Renata Grozovsky

Orientadores: Denise Pires de Carvalho e Mário Vaisman

Resumo da Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-Graduação em




A maior prevalência de disfunções tireóideas entre as mulheres e o seu aumento com a idade torna evidente a possibilidade da influência do estrogênio sobre o funcionamento da tireóide. Há alguns estudos sobre a relação entre o estrogênio e as vias de sinalização da insulina e de IGF-I em tecidos não tireóideos, no entanto, estes mecanismos ainda são pouco estudados. O estrogênio também influencia a função hepática, alterando o metabolismo lipídico. Avaliamos ratos adultos e pré-púberes, machos e fêmeas, assim como ratas intactas ou ovariectomizadas, tratadas ou não, com benzoato de 17β-estradiol (Eb) por 10 e 30 dias. As concentrações séricas de T3 e T4 foram alteradas com o tratamento com Eb, no entanto, o TSH sérico ficou inalterado em todos os grupos estudados. As fêmeas castradas, tratadas ou não com Eb têm colesterol mais alto que as intactas e o triglicerídeo aumenta com a administração de Eb de forma dose dependente. A castração diminui a atividade D1 tireóidea, mas não altera a D1 hepática em nenhum grupo estudado, no entanto as fêmeas têm D1 hepática menor que os machos, tanto adultas quanto pré-púberes. O tratamento com Eb aumenta a expressão de IRS-1 na tireóide, assim como a castração. Já o IRS-2 tireóideo está diminuído na castração e este efeito foi revertido com a administração de Eb. No tecido hepático o IRS-1 está diminuído com a castração de 10 dias e o IRS-2 não se alterou. Concluímos que os níveis de T3 e T4 séricos são modulados pelo estrogênio independente das alterações de TSH sérico. O IRS-2 pode estar relacionado à ação mitogênica do estrogênio sobre a tireóide, entretanto as mudanças no conteúdo dos RNAm do IRS-1 e do IRS-2 no fígado de animais castrados não parecem estar relacionadas à resistência insulínica descrita nestes animais. Palavras-chave: tireóide, estrogênio, IRSs, fígado, castração

8

ABSTRACT

Insulin receptor substrate -1 and 2 (IRS-1 e IRS-2) in thyroid and liver – sexual

dimorphism and estrogen modulation

Renata Grozovsky

Orientadores: Denise Pires de Carvalho e Mário Vaisman

Abstract da Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-Graduação em




Thyroid diseases are more prevalent in women and rise with aging, becoming evident the estrogen influence on thyroid function. Studies showed the relationship between estrogen and insulin and IGF-I signaling pathways in non-thyroid tissues, although, the mechanisms are not well understood. Estrogen also have influence on hepatic function changing lipid metabolism. We evaluated thyroid function in adults and immature rats, male and female as well as intact or ovariectomized female rats, treated or not, with 17β-estradiol benzoate (Eb) for 10 and 30 days. Castration of female adult rats increased body weight and Eb treatment reverses this effect. Serum T3and T4 concentrations were altered with Eb treatment, however, serum TSH remained unaltered in all experimental groups. Immature rats showed higher cholesterol and triglycerides levels. Castrated female rats treated or not with Eb have higher cholesterol levels than intact rats and triglycerides rise with Eb administration in a dose dependent manner. Castration decreased thyroid D1 activity, but did not alter hepatic D1 in none of the studied groups, however, females presented lower hepatic D1 activity compared to male, both immature and adult rats. Eb treatment increased IRs-1 expression in the thyroid, as well as castration. Thyroid IRS-2 is diminished in castrated rats and Eb administration reverses this effect. Hepatic IRS-1 diminishes with castration of 10 days and IRS-2 didn’t alter. We concluded that serum T3 and T4 are modulated by estrogen independent from serum TSH alterations. IRS-2 may be related to estrogen mitogenic action on the thyroid gland, although changes in IRS-1 and IRS-2 mRNA content in the liver of castrated animals do not seem to be related to insulin resistance previously described in these animals. Key words: thyroid, estrogen, IRSs, liver, castration.

9

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

AMPc adenosina monofosfato cíclico

ATP adenosina trifosfato

cDNA ácido deoxirribonucléico complementar

Eb benzoato de 17β-estradiol

ER receptor de estrogênio

D1 iodotironina desiodase tipo 1

D2 iodotironina desiodade tipo 2

D3 iodotironina desiodade tipo 3

FRTL-5 linhagem celular de tireócitos de ratos Fisher

FSH hormônio folículo estimulante

GAPDH gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase

GDP guanosina difosfato

GTP guanosina trifosfato

IGF-I fator de crescimento insulina-símile I

IGF-IR receptor de IGF-I

IR receptor de insulina

IRS-1 substrato do receptor de insulina 1

IRS-2 substrato receptor de insulina 2

LH hormônio luteinizante

10

MMI Metimazole, metilmercaptoimidazole

OVX ovariectomia bilateral

RNAm ácido ribonucléico mensageiro

rT3 3,3’,5’ triioditironina reversa ou T3 reverso

RT-PCR transcrição reversa – reação em cadeia de polimerase

SNC sistema nervoso central

TAM tecido adiposo marrom

TBG proteína ligadora de tiroxina

TRH hormônio liberador de tireotrofina

TSH hormônio estimulador da tireóide ou tireotrofina

TSH-R receptor de TSH

T3 3, 5, 3’ triiodotironina

T4 3, 5, 3’, 5 tetraiodotironina ou tiroxina

11

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Pag

Tabela 1 Características gerais dos oligonucleotídeos ......................................23

Tabela 2 Comparação do peso corporal absoluto dos animais dos diferentes

grupos experimentais.................................................................................................28

Figura 1 Esquema representativo do eixo hipotálamo-hipófise-tireóde................4

Figura 2 Quadro demonstrativo das características da iodotironinas desiodades

tipo 1, 2 e 3...................................................................................................................6

Figura 3 Esquema representativo da vias de sinalização do TSH, insulina, IGF-I

e estrogênio................................................................................................................10

Figura 4 Esquema representativo da administração de benzoato de 17β-

estradiol (Eb) nos grupos experimentais....................................................................19

Figura 5 Concentração sérica de T3...................................................................30

Figura 6 Concentração sérica de T4...................................................................32

Figura 7 Concentração sérica de TSH................................................................33

Figura 8 Valores de colesterol circulante...........................................................35

Figura 9 Valores de triglicerídeos circulantes.....................................................37

Figura 10 Atividade da enzima D1 tireóidea.........................................................38

Figura 11 Atividade da enzima D1 hepática.........................................................40

Figura 12 Expressão do RNA mensageiro do IRS-1 tireóideo.............................41

Figura 13 Expressão do RNA mensageiro do IRS-2 tireóideo.............................42

Figura 14 Expressão do RNA mensageiro do IRS-1 hepático.............................44

Figura 15 Expressão do RNA mensageiro do IRS-2 hepático.............................46

12

LISTA DE ANEXOS

Anexo 1 Artigo de revisão submetido aos Arquivos Brasileiros de Endocrinologia

e Metabologia.............................................................................................................65

13

SUMÁRIO

1 INTRUDUÇÃO.................................................................................................01

2 REVISÃO DA LITERATURA...........................................................................03

Regulação da Função Tireóidea.....................................................................03

Regulação da Proliferação Tireóidea..............................................................07

Cascata de Sinalização de insulina e IGF-I....................................................08

Tireóide e Dimorfismo Sexual.........................................................................11

3 OBJETIVOS....................................................................................................16

4 MATERIAL E MÉTODOS................................................................................17

1. Animais........................................................................................................17

1.1. Dimorfismo Sexual.................................................................................17

1.2. Citologia Vaginal....................................................................................17

1.3. Castração e Administração de benzoato de 17β-estradiol....................18

1.4. Sacrifício do Animais.............................................................................19

2. Avaliação da expressão do RNA mensageiro.............................................20

2.1. Extração de RNA total..........................................................................20

2.2. Quantificação do RNA total extraído....................................................20

2.3. Gel de Agarose....................................................................................21

2.4. Purificação do RNA total extraído........................................................21

2.5. Transcrição Reversa sequida de Reação em Cadeia de Polimerase..22

3. Atividade da enzima iodotironina desiodade tipo 1.....................................23

4. Dosagem de Colesterol e Triglicerídeos......................................................24

5. Dosagem de Hormônios Tireóideos e TSH.................................................25

5.1. TSH sérico............................................................................................25

14

5.2. T3 e T4 séricos.....................................................................................25

6. Análise Densitométrica da RT-PCR............................................................26

7. Análises Estatísticas....................................................................................26

5 RESULTADOS................................................................................................27

I. Dimorfismo Sexual: Função Tireóidea.........................................................27

1. Peso Corporal...........................................................................................27

2. Concentração Sérica de T3......................................................................29

3. Concentração Sérica de T4......................................................................31

4. Concentração Sérica de TSH...................................................................33

II. Dimorfismo Sexual: Colesterol e Triglicerídeos Séricos .............................34

5. Valores de Colesterol Circulante..............................................................34

6. Valores de Triglicerídeos Circulantes.......................................................36

II. Desiodase Tipo 1 e Substratos do Receptor de Insulina.............................38

1. Atividade Desiodase Tipo 1 (D1) Tireóidea..............................................38

2. Atividade Desiodase Tipo 1 (D1) Hepática...............................................39

3. Avaliação da Expressão do RNAm na Tireóide........................................41

3.1. Substrato do Receptor de Insulina -1 (IRS-1)....................................41


4. Avaliação da Expressão do RNAm no Fígado.........................................43

4.1. Substrato do Receptor de Insulina-1 (IRS-1).....................................43


6 DISCUSSÃO...................................................................................................47

7 CONCLUSÕES...............................................................................................53

8 REFERENCIAS...............................................................................................54

9 ANEXO............................................................................................................65

15

INTRODUÇÃO

A incidência de doenças tireóideas é pelo menos 3 vezes maior entre as

mulheres (Tunbridge e cols., 1977; Nyström e cols., 1981). Essa diferença entre os

sexos é observada mundialmente, não corresponde apenas a doenças auto-imunes

relacionadas à glândula e sugere que o crescimento tireóideo e a progressão de

tumores podem ser influenciados por hormônios sexuais femininos (Valle e cols.,

1998). Além disto, há relatos de maior prevalência de disfunções tireóideas entre os

idosos, sendo mais comum entre as mulheres e podendo chegar a mais de 10% da

população na pós-menopausa (Sawin e cols., 1985). Assim, existe evidente

influência dos esteródes sexuais sobre o funcionamento da tireóide.

Alguns autores mostraram que o aumento dos níveis circulantes de

estrogênio poderia estimular a secreção de TSH (D’Angelo & Fisher, 1969; Mori e

cols., 1990). Entretanto, há relatos mais recentes sugerindo que o estrogênio

poderia estar suprimindo o eixo-hipófise-tireóide e possivelmente alterando

diretamente a estrutura da glândula tireóide (Sosic-Jurjevic e cols., 2005). De fato, a

presença de receptores de estrogênio e progesterona já foi detectada em tecido

tireóideo humano por imunohistoquímica (Money e cols., 1989) e ensaio de ligação

de hormônio (Van Hoeven e cols., 1993). O principal estudo descrevendo a

possibilidade de ação direta do estradiol sobre a tireóide foi realizado em cultura de

células nas quais se detectou efeito proliferativo direto deste esteróide sobre os

tireócitos (Furlanetto e cols., 1999).

Embora o estrogênio possa agir estimulando a proliferação de tireócitos,

muito pouco se sabe sobre as possíveis vias intra-celulares ativadas por este

hormônio na tireóide. Na literatura há alguns estudos sobre a relação entre

16

estrogênio e as vias de sinalização da insulina e de IGF-I em tecido adiposo,

hepático e muscular (Gonzáles e cols., 2003). Foi observado, em linhagem celular

de câncer de mama, que o estrogênio aumenta a expressão do substrato receptor

de insulina-1 (IRS-1) (Molloy e cols., 2000). Vale ressaltar que a modulação do IRS-

1 pelo estrogênio no fígado, músculo esquelético e tecido adiposo de ratos, parece

ser dose e tempo dependente (González e cols., 2003).

Além dos efeitos sobre a função tireóidea, os esteróides sexuais também

influenciam a função hepática. Algumas alterações no metabolismo lipídico como

aumento da secreção biliar e de ácidos graxos foram descritos como efeito direto do

tratamento com estrogênios (Noh e cols., 1999).

A literatura confirma que há diferenças entre os sexos na função de diversos

órgãos. Desvendar essas diferenças é um desafio que nos ajudará a entender, pelo

menos em parte, a maior prevalência de bócios no sexo feminino, assim como

durante a gravidez e na puberdade, ou a menor incidência de cirrose hepática em

mulheres.

17

REVISÃO DA LITERATURA

Regulação da Função Tireóidea

Os principais fatores capazes de regular a função dos tireócitos são a

tireotrofina (TSH) e o iodo. Assim, o crescimento e a funcionalidade das células

diferenciadas da tireóide são dependentes do receptor específico do TSH, o TSH-R,

que se encontra na membrana basolateral dos tireócitos, e do conteúdo intracelular

de iodo. O TSH regula tanto a síntese quanto a secreção dos hormônios tireóideos,

aumentando também o tamanho e a vascularização da glândula.

A tireotrofina (TSH) é um hormônio glicoprotéico, sintetizado e secretado

pelos tireotrofos, localizados na adenohipófise. O hipotálamo exerce efeito

estimulatório sobre a função tireóidea através da síntese e liberação do hormônio

liberador de tireotrofina (TRH), o qual estimula a liberação de TSH pela

adenohipófise. O TRH é um tripeptídeo sintetizado pelos neurônios hipotalâmicos e

transportado via sistema porta até a adenohipófise, agindo diretamente sobre os

tireotrofos. Apesar do TRH agir em balanço com reguladores hipotalâmicos

inibitórios, como somatostatina e dopamina, os hormônios tireóideos exercem o

controle mais importante do feedback negativo. São capazes de inibir a secreção de

TSH, agindo diretamente nos tireotrofos (Scanlon, 2001)(Figura 1).

O TSH é o principal hormônio regulador da função da tireóide, estimulando

todos os passos da biossíntese hormonal, endocitose e liberação dos hormônios

tireóideos (Larsen e cols.,1998). Evidências indicam também, que o TSH regula a

nível transcripcional a expressão de tireoglobulina, assim como aumenta a

18

expressão e atividade enzimática da tireoperoxidase e a expressão do NIS (Dumont

& Vassart, 2001).

Embora o TSH seja o principal regulador dos estados morfológicos e

funcionais da tireóide, nem todos os ajustes da função tireóidea são por ele

mediados. Mecanismos autorregulatórios intrínsecos também controlam a

sensibilidade das células tireóideas ao TSH, como o aporte de iodo (Larsen e cols.,

1998).

Figura 1. Esquema representativo do eixo hipotálamo-hipófise-tireóide.

Hipófise

T4

T3

Hipotálamo

T4 T3

T4 T3

Tireóide

++++

++++

TSH

TRH

Hipófise

T4

T3

Hipotálamo

T4 T3

T4 T3

Tireóide

++++

++++

TSH

TRH

Hipófise

T4

T3

T4

T3

Hipotálamo

T4 T3

T4 T3

Tireóide

++++

++++

TSH

TRH

19

O principal produto secretado pela tireóide é a tiroxina (T4), no entanto, a

triioditironina (T3) é o principal hormônio metabolicamente ativo. Na década de 70

foi demonstrado que o T3 não é produzido somente pela tireóide, comprovando a

existência de um processo periférico de desiodação. Estudos posteriores

estabeleceram que diferentemente do T4 gerado exclusivamente pela tireóide, a

maior parte do T3 sérico é produzido pela desiodação do T4 em diversos tecidos,

como tireóide, hipófise, rim e fígado (Germain & Galton, 1997). A desiodação das

moléculas de T4 e T3 podem ocorrer nas posições 3’ ou 5’ do anel aromático

externo, denominada via ativadora ou desiodação do anel externo (ORD, do inglês

outer ring deiodination) ou podem ocorrer nas posições 3 ou 5 do anel aromático

interno, denominada via inativadora ou desiodação do anel interno (IRD, do inglês

inner ring deiodination) (Köhrle, 1999; Bianco e cols., 2002) (Figura 2). Já foram

descritos 3 tipos de iodotironinas desiodades denominadas desiodase tipo 1 (D1),

tipo 2 (D2) e tipo 3 (D3); todas possuem uma selenocisteína em seu sítio ativo,

entretanto, diferem em algumas características como distribuição tecidual e

subcelular e preferência por substrato (Leonard & Visser, 1986; Berry e cols., 1991;

Kohrle 1994; Croteau e cols., 1995). A D1 é a mais estudada das três enzimas,

sendo, portanto a desiodase que tem mais características conhecidas. Em humanos,

a D1 está presente em rim, fígado, tireóide e hipófise e em ratos, é expressa em

fígado, rim, SNC, hipófise, intestino, tireóide e placenta (Bianco e cols., 2002). A D1

é uma proteína de membrana com o seu sítio de ligação voltado para o citoplasma e

tem como substrato preferencial o rT3 (Germain & Galton, 1997). A D2 está

expressa na hipófise, cérebro e tecido adiposo marrom, em ratos, e em humanos, a

atividade D2 foi identificada na tireóide, cérebro, músculo esquelético, coração e

medula espinhal. A D2 é uma proteína que se encontra aderida à membrana do

20

retículo endoplasmático e tem seu sítio de ligação voltado para o citoplasma, assim

como a D1. Apresenta como substrato preferencial o T4, sendo a principal

responsável pela produção de T3 extratireóideo, em humanos. No entanto, em ratos

a D1 parece ser a enzima responsável por aproximadamente 50% da produção de

T3 extra tireóideo (Bianco e cols., 2002). Dados recentes, entretanto, indicam que a

D1 seja mais importante para a regulação do “clearance” de T3 (Zavacki e cols.,

2005). A D3 é a principal enzima inativadora de T4 e T3 (Leonard & Visser, 1986),

sendo encontrada predominantemente no SNC, pele e placenta. A D3 também é

encontrada em recém natos, e sua atividade pode ser crucial para a proteção do feto

contra altas concentrações de T4 e T3 materno (Bianco & Larsen, 2005).

Figura 2. Quadro demonstrativo das características da iodotironinas desiodades tipo 1, 2 e 3. A) Distribuição subcelular. B) Distribuiação tecidual e subtrato preferencial. Adaptado de Bianco, A.C. Arq Bras Endocrinol Metab. 48:16-24,2004.

D1Tireóide

RimFígado

Hipófise

D2SNCTAM

Músculo esq.Tireóide

D3SNCPele

Placenta

T3 > T4T4 > rT3rT3 > T4, T3

A)

B)

D1Tireóide

RimFígado

Hipófise

D2SNCTAM

Músculo esq.Tireóide

D3SNCPele

Placenta

T3 > T4T4 > rT3rT3 > T4, T3

A)

B)

21

Regulação da Proliferação Tireóidea

Vários fatores além do TSH e do iodo modulam o tamanho, o grau de

diferenciação e a capacidade replicativa dos tireócitos. O hormônio luteinizante (LH),

o hormônio folículo-estimulante (FSH) e a gonadotrofina coriônica, são hormônios

glicoprotéicos compostos por 2 subunidades, sendo a subunidade α comum a todos,

inclusive ao TSH (Utiger, 1995). Em altas concentrações, esses hormônios podem

estimular a função tireóidea diretamente, possivelmente através da sua ligação com

o receptor de TSH (TSH-R). Além destes, outros hormônios são capazes de

influenciar a função tireóidea, como a insulina e o hormônio do crescimento via IGF-

I.

Distintas vias mitogênicas já foram descritas na tireóide: além do sistema

adenilato ciclase-AMPc, principal via de ação do TSH, temos vias intracelulares

relacionadas à ativação do sistema de proteínas tirosinas cinase (Dumont e cols.,

1992). A via proteína tirosina cinase pode ser subdivida em 2 ramos: as vias de

alguns fatores de crescimento como EGF, que induzem proliferação e reprimem a

diferenciação; e a via mitogênica que não inibe a expressão da diferenciação, como

as estimuladas por FGF (fator de crescimento de fibroblasto), IGF-I e insulina (Pohl e

cols., 1990). Em humanos, IGF-I ou insulina são requeridos para a ação mitogênica

do TSH ou EGF, mas não estimulam a proliferação dos tireócitos sozinhos (Kahn &

White, 1995). Além disto, sabe-se que o TSH também depende da presença de

insulina ou IGF-I para exercer a sua ação mitogênica.

22

Cascata de Sinalização de insulina e IGF-I

A insulina e o IGF-I agem via diferentes receptores, no entanto sua via de

sinalização intracelular é comum (Kimura e cols., 2001). A insulina possui um

receptor específico (IR), que é uma glicoproteína transmembrana composta por 4

subunidades, enquanto o receptor para IGF-I (IGF-IR) possui somente 2

subunidades (Czech, 1981; Kahn e cols., 1988). As regiões intracelulares dos

receptores possuem sítios com atividade tirosina cinase intrínsecas, assim, IR e IGF-

IR caracterizam-se como proteínas com atividade tirosina cinase (Kasuga e cols.,

1982, Le Roth e cols., 1995).

Os receptores exercem basicamente 3 funções: reconhecem e se ligam à

insulina ou IGF-I com alta especificidade; transmitem um sinal que resulta na

ativação/inativação de vias metabólicas intracelulares e são, posteriormente,

endocitados, juntamente com o hormônio ligado levando à proteólise lisossomal com

subseqüente degradação, armazenamento ou reciclagem das subunidades do

receptor (Felig, 1995; Genuth, 1998).

A ligação da insulina ou IGF-I à subunidade α de seus receptores é o sinal

para a ativação da cinase presente na subunidade β, iniciando a cascata de

sinalização intracelular que irá culminar nos diversos efeitos dos hormônios. Além de

catalisar a fosforilação do próprio receptor (autofosforilação), alguns receptores

tirosina cinase fosforilam proteínas intracelulares que transmitem o estímulo

hormonal (Wahl e cols., 1992). Os substratos do receptor de insulina (IRSs)

interagem especificamente com os receptores de insulina e IGF-I, funcionando como

proteínas ancoradouras, que são fosforiladas em resíduos tirosila, recrutando

proteínas para a cascata de sinalização (Myers e cols., 1994). Já foram identificados

23

e clonados 4 membros desta família: IRS-1 (White e cols., 1985), IRS-2 (Sun e cols.,

1995), IRS-3 (Lavan e cols., 1997) e IRS-4 (Fantin e cols., 1998).

IRS-1 e IRS-2 são expressos, em ratos, em diversos tecidos (fígado, músculo

esquelético, coração, cérebro, rim, pulmão, baço, testículo) (Sun e cols., 1995).

Quanto a sua localização subcelular, o IRS-1 está duas vezes mais concentrado no

compartimento de membrana que o IRS-2, que se encontra duas vezes mais

concentrado no citosol (Sesti e cols., 2001). IRS-3 é abundantemente expresso em

tecido adiposo, tendo sido encontrado em outros tecidos, como pulmão e coração.

Curiosamente, foi detectada sua expressão durante o desenvolvimento embrionário,

fato que não ocorre com IRS-1 (Sciacchitano & Taylor, 1997). Já o IRS-4 é

expresso em níveis muito baixos em ratos, e sua caracterização foi realizada em

células embrionárias de rim humano (Lavan e cols., 1997). Este último pode ser

encontrado em tecido tireóideo, hipófise, ovário e fibroblastos (Sesti e cols., 2001).

Diferentemente dos outros IRSs (IRS-1 localizado no cromossomo 2, IRS-2,

cromossomo 13 e IRS-3, cromossomo 5) em humanos, o gene do IRS-4 está

localizado no cromossomo X.

O desenvolvimento de animais knockout para genes específicos tornou

possível o melhor entendimento do papel fisiológico dessas proteínas.

Camundongos Knockout para IRS-1 apresentaram resistência insulínica, entretanto

não foram observados outros grandes distúrbios metabólicos. No entanto, a

deficiência de IRS-1 causou retardo no crescimento intra-uterino e pós-natal,

indicando que o IRS-1 é indispensável, pelo menos em parte, pelo crescimento.

Experimentos realizados em células 3T3 destes camundongos knock-out para IRS-

1, demonstraram que o IRS-2 não é capaz de substituir por completo os efeitos

mediados por IRS-1 (Modric e cols., 1999). Os camundongos knockout para IRS-2

24

nascem normais, se mantendo assim até a idade adulta. No entanto, estes

camundongos apresentam resistência insulínica ao nascimento e progressivamente

desenvolvem hiperglicemia como resultado de uma inadequada compensação na

secreção de insulina. Estes efeitos parecem ser causados devido a defeitos no

desenvolvimento das células β pancreáticas, já que estes animais apresentam uma

redução de 50% na massa destas células quando comparados ao grupo controle

(Lamothe e cols., 1999).

Apesar da insulina e do IGF-I exercerem importante papel sobre a regulação

da função e proliferação tireóidea, ainda há mecanismos desconhecidos acerca da

regulação de suas vias de sinalização intracelulares em tireócitos.

Figura 3. Esquema representativo das vias de sinalização de TSH, insulina, IGF-I e estrogênio.

Proliferação

Síntese de DNA

IGF-1Insulina

IR, IGF-R

PI3K, Ras

IRSs

Síntese de proteínas

Estrogênio

ER

ER

Diferenciação

?

TSH

Receptor acopladoa proteína G

AMPc

Fosforilação de proteínas

Proliferação

Síntese de DNA

IGF-1Insulina

IR, IGF-R

PI3K, Ras

IRSs

Síntese de proteínas

Estrogênio

ER

ER

Diferenciação

?

TSH

Receptor acopladoa proteína G

AMPc

Fosforilação de proteínas

25

Tireóide e Dimorfismo Sexual

Alguns aspectos como idade e sexo podem ser fatores importantes na

modulação da via de sinalização da insulina e do IGF-I.

Em 1990, Bagchi e cols. relataram que é significativamente maior a

prevalência de disfunções tireoidianas entre os idosos, com importante diferença entre

os sexos, sendo mais comum entre as mulheres. Alguns autores relatam que o câncer

de tireóide parece ter pior prognóstico quando ocorre antes dos 7-8 anos de idade ou

acima de 40-50 anos, períodos em que há elevação ou declínio na produção de

estrogênios (Samaan e cols.,1983; Giani e cols.,1993). Testes clínicos mostraram que

nódulos benignos diagnosticados na idade reprodutiva têm seu crescimento reduzido,

na maioria das pacientes, quando estas entram na menopausa (Costante e cols.,

2004).

Paralelamente ao papel que desempenham na regulação da secreção

hipofisária de gonadotrofinas, os estrogênios podem exercer outros efeitos. Um

estudo mostrou que o TSH de mulheres em uso de contraceptivos orais, estava

aumentado (Weeke e cols., 1975). Isto provavelmente ocorre devido à elevação da

concentração de proteína ligadora de tiroxina (TBG) causada pelo estrogênio

(Henderson e cols., 1982). Estas alterações nas concentrações de hormônios

tireóideos em pacientes em terapêutica hormonal com T4, em mulheres grávidas ou

em mulheres que iniciam o uso de estrogênios na pós-menopausa, levam a

necessidade do aumento da dose de T4 utilizada previamente (Mandel e cols., 1990;

Kaplan, 1992).

Diferenças relacionadas ao sexo foram descritas quando em 1968, D’Angelo

observou que ratas fêmeas apresentavam concentrações séricas e conteúdo

26

hipofisários de TSH diminuídos. Em 1987, Donda e cols., descreveram aumento das

concentrações plasmáticas T3 nas fêmeas adultas, assim como Lisboa e cols., (1997)

demonstraram que estas fêmeas também apresentam aumento das concentrações

séricas de T4.

A biossíntese do estrogênio, assim como de outros hormônios esteróides,

ocorre em apenas alguns tecidos, como supra-renal, mama, tecido adiposo e

ovários. A primeira etapa da síntese de todos os esteróides é a clivagem de parte da

cadeia lateral da molécula de colesterol, dando origem à ∆ 5-pregnolona. Esse é o

passo que limita a biossíntese dos esteróides, e é catalisado por uma das enzimas

do complexo do citocromo P-450 existente no interior mitocondrial, responsável pelo

processamento da molécula de colesterol (Bianco & Kimura, 1999). A biossíntese

dos principais estrogênios circulantes, estradiol e estrona, ocorre após a

aromatização dos precursores androgênicos: testosterona e androstenediona.

O estrogênio possui receptores específicos que estão localizados tanto no

citoplasma quanto no núcleo. Já foram descritas duas isoformas do receptor de

estrogênio (ER), a isoforma α e a isoforma β (Peterson, 2000). Os receptores estão

presentes em vários tecidos, e apresentam expressão diferenciada, tecidos como

útero, mama, vagina e núcleo arqueado hipotalâmico expressam

predominantemente ERα, enquanto, rim, osso, pulmão, sistema cardivascular,

ovário, próstata e núcleo paraventricular hipotalâmico expressam

predominantemente ERβ. Outros tecidos como tireóide, hipófise e fígado expressam

ambas isoformas (Money e cols., 1989; Pelletier, 2000; Limer & Speirs, 2004;

Cornwell e cols., 2004).

27

Furlanetto e cols., (1999) demonstraram em linhagem de células FRTL-5, que

o estradiol é capaz de estimular diretamente a proliferação celular dos tireócitos.

Mais recentemente, foi observada também em células FRTL-5 a modulação por

testosterona e estrogênio da proliferação celular induzida por TSH (Banu e cols.,

2002).

Há relação entre o estrogênio e as vias de sinalização da insulina de IGF-I em

tecido adiposo, hepático e muscular (Gonzáles e cols., 2003). Foi observado, em

linhagem celular de câncer de mama, que o estrogênio aumenta a expressão do

IRS-1 (Molloy e cols., 2000) e logo depois foi demonstrado que não só a expressão,

mas também a sua fosforilação está aumentada pelo estrogênio (Mauro e cols.,

2001). Além disso, a modulação do IRS-1 por estrogênio em fígado, músculo

esquelético e tecido adiposo de ratos, parece ser dose e tempo dependente

(Gonzàlez e cols., 2003).

A idade também pode ser um fator importante na sinalização insulínca. Em

experimentos utilizando ratos velhos, foi observada diminuição da atividade tirosina

cinase do receptor de insulina, bem como alterações no transporte de glicose, que

podem levar à resistência insulínica observada em pacientes idosos (Carrascosa e

cols., 1989; Barnard e cols., 1992). Consistente com esses achados, foi

demonstrado que animais velhos têm redução no conteúdo e na fosforilação de IRS-

1 e IRS-2, em músculo esquelético e no fígado (Carvalho e cols., 1996)

É importante ressaltar que esses achados dependem amplamente do tempo

de tratamento, da substância e das concentrações utilizadas, além da idade dos

animais ou pacientes utilizados para os estudos.

28

O fígado é um importante órgão alvo das ações da insulina e há relatos de

associação entre resistência insulínica e distúrbios da função ovariana. Sendo

também, um importante alvo da ação de esteróides sexuais.

A progressão de várias formas de doenças hepáticas crônicas é mais rápida

em homens do que mulheres (Becker e cols., 1996), apesar do fígado não ser um

órgão reconhecidamente dependente de estrogênio, tanto em machos quanto em

fêmeas, o estrogênio parece ser importante no controle da função hepática (Porter e

cols., 1983).

Os receptores hormonais são geralmente regulados pela alta concentração

dos seus ligantes. Este parece ser o caso do receptor de estrogênio (ER) em tecidos

como útero, ovários e glândulas mamárias, onde o estrogênio está envolvido no

crescimento e diferenciação celular (Stavreus e cols., 1997) No fígado, no entanto, o

receptor de estrogênio possui uma função bem diferente e a resposta hepática ao

estrogênio parece requerer altas concentrações deste hormônio (Xu e cols., 1992).

Van Thiel e cols., (1990) demonstraram que há relação direta entre o número de

receptores de estrogênio e a massa hepática do animal. Assim como a ausência de

estrogênio e a reposição hormonal alteram o metabolismo lipídico (Joles e cols.,

19995; Schram e cols., 1995).

Alguns estudos mostraram a superexpressão de IRS-1 (Spector, 1999) e IRS-

2 (Boissan e cols., 2005) em carcinoma hepatocelular, e sua significativa relação

com o tamanho do tumor. O IRS-1 também parece participar da regeneração

hepática que ocorre em alguns pacientes com cirrose (Spector, 1999). No entanto,

os efeitos mais evidentes dos IRSs no tecido hepático estão relacionados ao

metabolismo glicêmico. Recentemente foi demonstrado que apesar na enorme

semelhança estrutural, o IRS-1 e IRS-2 possuem papel complementar na regulação

29

do metabolismo hepático, sendo o IRS-1 relacionado principalmente com a

gliconeogênese, enquanto o IRS-2 é mais importante para a lipogênese (Tanaguchi

e cols., 2005).

Pretendemos com este trabalho avaliar alguns aspectos gerais da influência

do estrogênio sobre a função do eixo hipófise-tireóide e sobre a metabolização dos

hormônios tireóideos. Com relação à regulação da proliferação dos tireócitos

exercida pelo estrogênio, avaliaremos a possibilidade de influência deste hormônio

sobre a via de sinalização da insulina e IGF-I em tireócitos e hepatócitos. Os nossos

achados poderão acrescentar informações acerca dos mecanismos pelos quais o

estrogênio agiria alterando o metabolismo hepático e estimulando a proliferação

tireóidea, o que poderia justificar, pelo menos em parte, a maior prevalência de

bócios no sexo feminino, assim como o desenvolvimento de resistência insulínica

em animais do sexo feminino com deficiência de estrogênio.

30

OBJETIVOS

Objetivamos estudar alguns dos mecanismos que podem estar envolvidos

no dimorfismo sexual relacionado à função tireóidea. Como o estrogênio

modula a proliferação de tireócitos e as concentrações séricas de hormônios

tireóideos, focalizamos os nossos estudos na regulação da atividade

desiodase tipo 1 e no primeiro passo da via proliferativa regulada por

insulina e IGF-I.

Para avaliar a influência fisiológica dos esteróides sexuais sobre a função

tireóidea utilizaremos ratos machos e fêmeas adultos e pré-púberes. Com o

intuito de verificar a influência do estradiol sobre alguns aspectos da função

e proliferação tireóideas in vivo, utilizaremos fêmeas adultas intactas

tratadas com estradiol, além de fêmeas castradas e repostas ou não com

esse hormônio.

Avaliaremos nesses modelos:

1- Níveis séricos de T4, T3 e TSH;

2- Desiodase tipo 1 tireóidea e hepática;

3- Expressão do mRNA dos substratos do receptor de insulina 1 e 2

(IRS-1 e 2) no fígado e tireóide.

31

MATERIAIS E MÉTODOS

1. ANIMAIS

Foram utilizados ratos Wistar machos e fêmeas, pré-púberes (até 40 dias de

vida pós-natal) e adultos (entre 2 e 3 meses de idade), mantidos em condições de

temperatura e ciclo claro/escuro (12h) controlados, em nosso biotério. Todos os

experimentos foram realizados de acordo com os padrões de cuidados com animais,

definidos pelo comitê institucional (www.biof.ufrj.br/cauap.doc). Todos os animais

tiveram água e ração oferecidos ad libitum.

1.1. DIMORFISMO SEXUAL

Ratos Wistar, machos e fêmeas com 40 dias pós-natal ou 3 meses, foram

sacrificados por decaptação, sem qualquer tratamento.

1.2. CITOLOGIA VAGINAL

As variações que ocorrem durante o ciclo estral das ratas são refletidas no

epitélio vaginal. Avaliamos, então, as ratas pelo método de citologia, que consiste na

coleta das células que descamam do epitélio vaginal, após lavagem com soro

fisiológico (NaCl 0,9%). O material foi colhido diariamente, durante 2 (duas) semanas

e analisado por microscopia ótica. Somente as ratas que apresentaram ciclo estral

regular foram incluídas nos grupos experimentais.

32

1.3. CASTRAÇÃO E ADMINISTRAÇÃO DE BENZOATO DE 17ββββ-ESTRADIOL

Depois de selecionadas através da citologia, algumas fêmeas foram submetidas

à ovariectomia (remoção bilateral dos ovários), sob efeito anestésico de cetamina (5

mg/100g de peso corporal) e do relaxante muscular xilasina (0,5 mg/100 g de peso

corporal), via intraperitoneal.

No dia seguinte à cirurgia, um grupo de ratas ovariectomizadas recebeu

benzoato de 17β-estradiol (Eb), via subcutânea (s.c.), diariamente em duas

diferentes doses: 0,7µg/100g de peso corporal, dose considerada suficiente para

alcançar concentrações fisiológicas e 14µg/100g de peso corporal, dose

suprafisiológica capaz de elevar cerca de 20 vezes a concentração sérica de

estrogênio (Moreira e cols., 1997). Este tratamento teve duração de 10 dias.

Outro grupo de ratas ovariectomizadas permaneceu 14 dias em repouso,

somente após este período iniciou-se a administração com benzoato de 17β-

estradiol nas mesmas dose descritas acima, e este tratamento teve duração de 30

dias.

Em paralelo, ratas intactas foram também foram tratadas com benzoato de 17β-

estradiol nas duas doses acima descritas, por 10 e 30 dias.

33

Figura 4. Esquema representativo da administração de benzoato de 17β-estradiol (Eb) nos grupos experimentais.

1.4. SACRIFÍCIO DOS ANIMAIS

Ao término dos tratamentos, os animais foram sacrificados por decapitação.

Os tecidos tireóideo e hepático foram excisados e guardados em nitrogênio líquido,

para posterior extração de RNA ou proteína e dosagem da atividade da enzima D1.

Amostras de sangue foram coletadas para a dosagem de TSH, T3 e T4 por

radioimunoensaios (RIE) específicos.

Intactas Castradas

Eb Eb

10 dias deadministração(Eb 0,7; Eb 14)

ou(OVX + 0,7; OVX + 14)


30 dias deadministração

(OVX + 0,7; OVX + 14)

14 dias derepouso

C OVX

Intactas Castradas

Eb Eb


ou(OVX + 0,7; OVX + 14)



(OVX + 0,7; OVX + 14)

14 dias derepouso

C OVX

Intactas Castradas

Eb Eb


ou(OVX + 0,7; OVX + 14)



(OVX + 0,7; OVX + 14)

14 dias derepouso

C OVX

34

2. AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DO RNA MENSAGEIRO

2.1. EXTRAÇÃO DE RNA TOTAL

Para a extração do RNA total das tireóides, foi utilizado o reagente Trizol

(Invitrogen, NY, EUA). As amostras, contendo 2 (duas) glândulas de animais de

cada grupo experimental, foram homogeneizadas em 0,5 ml de Trizol. Aos lisados

celulares foram adicionados 0,1 ml de clorofórmio, para separação do RNA total.

Após centrifugação (12000 x g, 4ºC, 10 minutos) foi possível observar uma fase

superior aquosa, transparente e uma fase inferior mais densa e rosada. A fase

aquosa foi transferida para um novo tubo, onde foram adicionados 0,25 ml de

Isopropanol, para a precipitação do RNA total. Após centrifugação (12000 x g, 4ºC

por 10 minutos), o sobrenadante foi descartado e 1ml de etanol 75% foi adicionado

para lavagem do precipitado remanescente. O etanol foi descartado e o precipitado,

depois de seco, foi ressuspenso em água tratada com dietil-pirocarboneto (DEPC)

(Sigma, MO, EUA). O RNA total extraído foi armazenado em freezer à -70º C.

2.2. QUANTIFICAÇÃO DO RNA TOTAL EXTRAÍDO

O RNA total extraído dos tecidos foi diluído em água tratada com DEPC na

proporção de 1:500. A absorbância das amostras foi medida em comprimento de

onda 260nm em espectrofotômetro (Hitachi, U 3000). Através dos cálculos

indicados, foi determinada a quantidade de RNA total de cada amostra em µg/µl:

(absorbância 260nm x fator de diluição x 40)/ 1000 = RNA em µg/µl).

35

2.3. GEL DE AGAROSE

Depois da quantificação do RNA total extraído, uma alíquota de cada mostra

foi submetida à eletroforese em gel de agarose [TAE (Tampão contendo Tris 40mM,

Ácido acético 25mM e EDTA 1mM)+ 1% de agarose + 0,01% brometo de etídeo

(intercalante de ácido nucléico)] para a verificação da integridade das amostras,

através da observação das bandas correspondentes às subunidades do RNA

ribossomal, 28S e 18S. A visualização das bandas foi possível através da utilização

de transiluminador UV (Bio Rad).

2.4. PURIFICAÇÃO DO RNA TOTAL EXTRAÍDO

Para eliminar contaminação por DNA das amostras, o RNA total foi tratado

com uma DNAse (enzima degradadora de DNA), deoxiribonuclease I (Boehringer

Mannheim, Germany). Utilizamos 10µg de RNA total para 10U de DNAse, 1µl do

tampão DNAse (25mM Tris-HCl, pH 7.2, 5mM MgCl2, 0,1mM EDTA) e H2O DEPC.

Após 30 minutos de incubação à 37oC adicionou-se 40µl de H2O DEPC e 50µl de

fenol:clorofórmio (1:1), para re-extrair o RNA agora purificado. O tubo foi submetido

à centrifugação (12000 rpm, à 4oC, por 5 minutos). Depois da transferência da fase

aquosa (fase superior) para um novo tubo, foram adicionados 2,5 volumes de etanol

100% e 0,3 volumes de acetato de amônia, para a precipitação do RNA purificado.

Depois de 18 horas em freezer –20oC, as amostras foram centrifugadas (12000 rpm,

à 4oC, por 30 minutos). Após a lavagem do precipitado com etanol 75%, este foi

ressuspenso em 15µl de H2O DEPC. Uma alíquota foi retirada para re-quantificação

do RNA purificado e outra alíquota foi submetida à eletroforese em gel de agarose

1% para a verificação da sua integridade.

36

2.5. TRANSCRIÇÃO REVERSA SEGUIDA DE REAÇÃO EM CADEIA DE

POLIMERASE – RT-PCR

Transcrição reversa

Na síntese de fitas simples de DNA complementar (cDNA) a partir do RNA

total purificado, foram utilizados, 0,5µg de oligonucleotídeo dT (Promega, USA), 2U

da enzima M-MLV (Promega, USA), tampão M-MLV 5x [250mM Tris-HCl (pH 8,3),

375mM KCl, 15mM MgCl2, 100mM DTT], 10 unidades RNA OUT (inibidor de RNAse)

(Invitrogen, NY, EUA) e 10µM dNTP (coquetel de nucleotídeos) (Invitrogen, NY,

EUA). 2,5 µg de RNA purificado foi incubado à 70oC, por 10 minutos, na presença de

H2O DEPC e oligo dT, para reconhecimento e ligação à cauda poli A dos RNA

mensageiros. Em seguida, adicionou-se ao tubo o restante dos reagentes e incubou-

se à 42oC por 50 minutos. A reação foi submetida à 90oC por 5 minutos para a

inativação da enzima. Foram adicionados ao tubo 0,3 volumes de 7,5 M acetato de

amônia, pH 7,5 e 2,5 volumes de etanol 100% por 18 horas em freezer à -20 oC. As

amostras foram submetidas à centrifugação (12000 rpm, por 30 min, à 4oC) para

precipitação do cDNA. O precipitado foi lavado com 100µl de etanol 75%. O etanol

foi todo retirado, o cDNA ressuspenso em 10 µl de H2O MilliQ e armazenado em

freezer à –20oC.

Reação em Cadeia de Polimerase (PCR)

Após a obtenção do cDNA, foi realizada a amplificação do fragmento

correspondente ao RNA mensageiro do gene desejado, utilizando-se

oligonucleotídeos senso (5’ → 3’) e antisenso (3’ → 5’) específicos (Tabela 1).

Na reação de PCR foram utilizados 1µL de cDNA (tecido hepático) ou 2 µL

cDNA (tecido tireóideo), 30 pmol do oligonucleotídeo senso e 30 pmol do

37

oligonucleotídeo antisenso, tampão 10X [200mM Tris-HCl (pH 8,4) e 500mM KCl,

2mM MgCl2] (Biotools, BR), 10µM dNTP (Invitrogen, NY, EUA) e 2,5 unidades da

enzima DNA polimerase (Biotools, BR).

Como controle interno dos experimentos foi utilizado o gene GAPDH, um

gene constitutivo (10 pmol do oligonucleotídeo senso, 10 pmol do oligonucleotídeo

antisenso).

Tabela 1. Características gerais dos oligonucletídeos. Seqüências, temperaturas de anelamento e tamanho esperado dos oligonucleotídeos específicos para os genes do GAPDH, do substrato do receptor de insulina-1(IRS-1) e do substrato do receptor de insulina-2 (IRS-2).

3. ATIVIDADE DA ENZIMA IODOTIRONINA DESIODASE TIPO 1 (D1)

O método utilizado para dosagem da atividade da enzima D1 foi baseado na

técnica desenvolvida por Berry e cols. (1991) e padronizada em nosso laboratório.

Amostras de tecido hepático (25 mg/mL) foram homogeneizadas em tampão

sucrose-DTT (0,25 M sucrose, 10 mM DTT (Invitrogen, NY, USA)). Uma alíquota foi

Gene TamanhoSeqüência

GAPDH 377 pb5’ – TCCTGCACCACCAACTGCTTA – 3’3’ – TAGCCCAGGATGCCCTTTAGT – 5’ 66oC

Temp.

IRS-1 580 pb5’ – CACCCAGTTTTTCGACAC – 3’3’ – GAGTTGAGCTTCACAAAG – 5’

55oC

IRS-2 388 pb5’ – CTCATCACTCAGCAGTGC – 3’3’ – GACTTGGGACTGAAG – 5’

59oC

Gene TamanhoSeqüência

GAPDH 377 pb5’ – TCCTGCACCACCAACTGCTTA – 3’3’ – TAGCCCAGGATGCCCTTTAGT – 5’ 66oC

Temp.

IRS-1 580 pb5’ – CACCCAGTTTTTCGACAC – 3’3’ – GAGTTGAGCTTCACAAAG – 5’

55oC

IRS-2 388 pb5’ – CTCATCACTCAGCAGTGC – 3’3’ – GACTTGGGACTGAAG – 5’

59oC

38

separada para dosagem protéica pelo método de Bradford (1976) e os homogenatos

foram armazenados em freezer -70oC até o dia do ensaio.

Foi adicionado ao microtubo:

a) (300 – x)µL tampão PE (100 mM fosfato de sódio, 1 mM EDTA, pH 6,9);

b) 30 µL de DTT 10 mM;

c) 30 µL de rT3 frio 1 mM;

d) x µL do homogenato hepático ou tireóideo (30 µg de proteína).

Para iniciar a reação foi adicionado 50 µL de rT3-125I e os microtubos foram

incubados à 37oC, por 1 hora. A reação foi interrompida colocando os microtubos no

gelo e adicionou-se 200 µL de soro fetal bovino (Cultilab, BR) e 100 µL de TCA 50%

(Vetec, BR), para a precipitação das proteínas. Os microtubos foram agitados

vigorosamente por 2 minutos e centrifugados à 10 000 rpm por 3 minutos. Após a

centrifugação, 360 µL do sobrenadante foram transferidos para um novo tubo e

levados ao contador de radioatividade gama (Compugama). Os valores da atividade

da enzima D1 foram expressos em pmoles de rT3/ min x mg de proteína.

4. DOSAGEM DE COLESTEROL E TRIGLICERÍDEOS

Os valores de colesterol e triglicerídeos séricos foram determinados através

de testes enzimáticos colorimétricos. Kits comerciais foram adquiridos da In Vitro

Diagnóstica, manufaturado por Human GMBH, Weisbaden, Germany. O protocolo foi

seguido segundo fabricante e as amostras foram lidas em espectrotômetro UV/VIS

(Hitachi, U3000).

39

5. DOSAGEM DE HORMÔNIOS TIREÓIDEOS E TSH

As concentrações séricas de TSH, T3 e T4 foram determinadas por

radioimunoensaio (RIE) a partir de amostras de soro obtidas dos animais dos

diversos grupos experimentais. Todos os RIEs foram feitos em duplicata e a

detecção foi realizada em um cintilador de fase sólida (CompuGama, LKB,

WALLAK).

5.1. TSH sérico

As dosagens de TSH sérico foram feitas por RIE específico, através de

reagentes fornecidos pelo National Institute of Diabetes and Kidney Diseases

(NIDDK- Bethesda, EUA); expressos em termos da preparação de referência 2 (RP-

2). Os reagentes são: TSH murino purificado para a preparação das amostras

utilizadas na curva padrão (0,18 – 11,46 ng/ml), TSH murino purificado para ser

iodado e anticorpo de coelho anti-TSH murino (1oAc).

A iodação da molécula do TSH com 125I foi feita em nosso laboratório, pelo

método da cloramina T e a molécula marcada foi purificada em uma coluna (Biogel –

P60 fino da Bio-rad, EUA). O RIE foi realizado pelo método do 2o anticorpo, com

adição de 5% de polietilenoglicol (Ortiga, 1996). Os resultados foram expressos em

ng/ml.

5.2. T3 e T4 séricos

As concentrações séricas de T3 e T4 foram determinadas através de kit

comercial para RIE de T3 e T4 contendo anticorpo específico aderido à parede dos

tubos de polipropileno e o radiotraçador (DSL, TX, EUA). A curva padrão será

realizada com concentrações conhecidas de T3 e T4 dissolvidas em soro de rato

(soro zero) e o protocolo para a realização do RIE foi fornecido pelo fabricante.

40

6. ANÁLISE DENSITOMÉTRICA do RT-PCR

As intensidades das bandas obtidas nos experimentos de RT-PCR e

‘Immunoblot’ foram analisadas no programa Scion Image do National Institute for

Health (EUA). Os valores obtidos foram normalizados considerando o grupo controle

como 1. Os dados foram colocados nos gráficos como valores relativos ao controle.

7. ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os valores foram expressos como média ± erro padrão da média, tendo sido

realizados três experimentos diferentes. Cada grupo experimental continha pelo

menos cinco animais a cada experimento.

Os dados de TSH sofrerão transformação logarítmica e posteriormente foram

analisados por análise de variância univariada paramétrica, seguida do teste de

comparação múltipla de Newman-Keuls..

As concentrações séricas de T3 e T4, os valores de colesterol e triglicerídeos

circulantes, a atividade D1 tireóidea e hepática e as densitometrias do experimentos

de RT-PCR foram analisados por análise de variância bivariada paramétrica, do

programa superANOVA (1988-1991, Abacus Concept, Inc.)

41

RESULTADOS I. DIMORFISMO SEXUAL: FUNÇÃO TIREÓIDEA

1. PESO CORPORAL

Apesar de não haver diferenças no peso corporal de machos e fêmeas pré-

púberes, na idade adulta, os machos são significativamente mais pesados do que as

fêmeas da mesma idade, conforme amplamente conhecido, devido à ação anabólica

potente dos esteróides sexuais masculinos (Tabela 2).

Ratas intactas que receberam dose fisiológica de estrogênio (Eb 0,7) por 10

dias apresentaram aumento significativo do ganho de peso corporal quando

comparadas ao controle (p<0,01). No entanto, as ratas intactas que receberam dose

alta de estrogênio (Eb 14) tiveram diminuição significativa do ganho de peso corporal

(p<0,05). Ratas intactas tratadas com Eb por 30 dias não apresentaram alteração no

ganho de peso corporal, quando comparadas ao controle.

As ratas que sofreram ovariectomia bilateral apresentaram aumento

significativo do ganho de peso corporal após 10 dias, quando comparadas ao grupo

controle (p<0,01). A administração de Eb tanto em dose fisiológica (OVX + 0,7)

quanto em dose alta (OVX + 14), além de reverter o ganho de peso corporal

promovido pela ovariectomia, levou à redução significativa do ganho de peso

corporal (Tabela 2).

A ovariectomia durante 44 dias promoveu aumento significativo do ganho de

peso corporal. A reposição com a dose fisiolófgca de hormônio, por 30 dias, reverteu

parcialmente o ganho de peso corporal promovido pela ovariectomia, enquanto a

42

dose alta reverteu completamente, pois os animais apresentaram ganho de peso

semelhante ao dos animais controle.

Tabela 2. Comparação do peso corporal absoluto dos animais dos diferentes grupos experimentais. Ratos adultos e pré-púberes, machos e fêmeas (A) e fêmeas adutas intactas e ovariectomizadas, tratadas ou não com Eb por 10 ou 30 dias (B). Os resultados são expressos como média ± EPM. A) B)

810810n

86,5 ± 2,5981,2 ± 4,50226,3 ± 7,44a304 ± 2,4Peso inicial

FêmeasMachosFêmeasMachos(g)

Pré-púberesAdultos

b p< 0,001, comparado ao macho adulto.

810810n

86,5 ± 2,5981,2 ± 4,50226,3 ± 7,44a304 ± 2,4Peso inicial

FêmeasMachosFêmeasMachos(g)

Pré-púberesAdultos

b p< 0,001, comparado ao macho adulto.

Tratamento com Eb por 10 dias

14149141517n

-0,85 ± 2,88c3,57 ± 2,43c24,67 ± 1,607,53 ± 1,55b19,2 ± 1,81a12,76 ± 1,67Ganho

192,6 ± 3,56203,6 ± 5,50214,1 ± 8,60202,1 ± 3,74236,1 ± 5,88219,4 ± 3,88Peso final

193,5 ± 4,36200,1 ± 4,39189,4 ± 8,33194,5 ± 3,46216,9 ± 5,61206,6 ± 3,88Peso inicial

OVX + 14OVX + 0,7OVXEb 14Eb 0,7Controle(g)

14149141517n

-0,85 ± 2,88c3,57 ± 2,43c24,67 ± 1,607,53 ± 1,55b19,2 ± 1,81a12,76 ± 1,67Ganho

192,6 ± 3,56203,6 ± 5,50214,1 ± 8,60202,1 ± 3,74236,1 ± 5,88219,4 ± 3,88Peso final

193,5 ± 4,36200,1 ± 4,39189,4 ± 8,33194,5 ± 3,46216,9 ± 5,61206,6 ± 3,88Peso inicial


a p< 0,01, comparado ao controle; b p< 0,05, comparado ao controle; c p< 0,001, comparado ao OVX.

181919171717n

34,22 ± 4,14 b41,21 ± 3,11 b64,21 ± 3,93 a31,59 ± 4,5529,18 ± 3 27,59 ± 2,33Ganho

226,3 ± 5,02234,9 ± 4,08260,6 ± 5,81232,6 ± 5,36232,8 ± 3,38227 ± 5,04Peso final

192,1 ± 4,55193,7 ± 5,63196,4 ± 3,80201 ± 3,33203,6 ± 2,96199,4 ± 4,67Peso inicial


181919171717n

34,22 ± 4,14 b41,21 ± 3,11 b64,21 ± 3,93 a31,59 ± 4,5529,18 ± 3 27,59 ± 2,33Ganho

226,3 ± 5,02234,9 ± 4,08260,6 ± 5,81232,6 ± 5,36232,8 ± 3,38227 ± 5,04Peso final

192,1 ± 4,55193,7 ± 5,63196,4 ± 3,80201 ± 3,33203,6 ± 2,96199,4 ± 4,67Peso inicial


ap< 0,0001, comparado ao controle; b p< 0,001, comparado ao OVX.

Tratamento com Eb por 30 dias

43

2. CONCENTRAÇÃO SÉRICA DE T3

Observamos que nas fêmeas adultas a concentração sérica de T3 é

significativamente mais alta que nos machos adultos. Os animais pré-púberes não

apresentaram diferença entre si. No entanto, a concentração sérica de T3 da fêmea

pré-púbere é significativamente menor que a da fêmea adulta (Figura 5A).

Fêmeas adultas intactas que foram tratadas com Eb, tanto na dose de 0,7µg

quanto na dose de 14µg por 10 dias, apresentaram diminuição significativa na

concentração sérica de T3 (p<0,05) (Figura 5B). As fêmeas intactas que foram

tratadas com Eb por 30 dias não apresentaram diferenças significativas (Figura 5C).

As ratas ovariectomizadas por 10 dias apresentaram diminuição significativa

na concentração sérica de T3. Sendo, o tratamento com Eb, nas duas doses, capaz

de reverter esta diminuição da concentração sérica de T3 (p<0,001). A ovariectomia

de 44 dias não alterou a concentração sérica de T3. A administração de 0,7µg/100g

p.c. por 30 dias, aumentou a concentração de T3 sérico (p=0,05), o que não foi visto

com a dose de 14µg/100g p.c.

A)

Macho Fêmea Macho Fêmea 0

10

20

30

40

T3

séri

co(n

g/d

L)

Adultos Pré-púberes

*

≠≠≠≠


10

20

30

40

T3

séri

co(n

g/d

L)


*

≠≠≠≠

44

B)

C) Figura 5. Concentração sérica de T3. Gráfico representativo do dimorfismo sexual entre adultos (3 meses, n=15) e pré-púberes (40 dias pós-natal, n=15); * Comparado ao macho adulto, ≠ comparado a fêmea adulta; p<0,01 (A); tratamento com Eb por 10 dias em ratas intactas (Eb, n=15) e ovariectomizadas (OVX + Eb, n=15); ¥ comparado ao controle; p<0,05;

* comparado ao controle; p<0,001; ≠ comparado ao OVX; p<0,01 (B); tratamento com Eb por 30 dias em ratas intactas (Eb, n=10) e ovariectomizadas (OVX + Eb, n=10) (C).

C 0,7 14 OVX 0,7 140

10

20

30

40

50

60

70T

3 sé

rico

(ng

/dL

)

Eb OVX + Eb

≠≠

*

C 0,7 14 OVX 0,7 140

10

20

30

40

50

60

70T

3 sé

rico

(ng

/dL

)

Eb OVX + Eb

≠≠

*¥ ¥

C 0,7 14 OVX 0,7 140

10

20

30

40

50

60

70

T3

séri

co(n

g/d

L)

Eb OVX + Eb

p< 0,05p= 0,05

C 0,7 14 OVX 0,7 140

10

20

30

40

50

60

70

T3

séri

co(n

g/d

L)

Eb OVX + Eb

C 0,7 14 OVX 0,7 140

10

20

30

40

50

60

70

T3

séri

co(n

g/d

L)

Eb OVX + Eb

p< 0,05p= 0,05

45

3. CONCENTRAÇÃO SÉRICA DE T4

Fêmeas adultas apresentaram concentração sérica de T4 maior que os

machos adultos (p<0,05). Os animais pré-púberes não apresentaram diferença nos

valores de T4 sérico entre si, no entanto, seus valores são significativamente

menores que os adultos (p<0,001) (Figura 6A).

A administração de Eb a ratas intactas por 10 dias não alterou a concentração

sérica de T4 (Figura 6B). A administração da dose fisiológica de Eb (Eb 0,7) por 30

dias em ratas intactas promoveu aumento significativo na concentração sérica de T4

(p<0,001), o que não foi observado quando administrada a dose alta de Eb (Eb 14)

(Figura 6C).

A ovariectomia de 10 ou 44 dias não alterou as concentrações séricas de T4.

As ratas ovariectomizadas tratadas com Eb na menor dose (OVX + Eb 0,7) por 10 e

30 dias apresentaram aumento significativo nas concentrações de T4 (p<0,05). No

entanto, não foi observada alteração na concentração de T4 das ratas

ovariectomizadas tratadas com a maior dose de Eb (OVX + Eb 14) (Figura 6B e 6C).

A)


1

2

3

4

5

6

T4

séri

co(u

g/d

L)



1

2

3

4

5

6

T4

séri

co(u

g/d

L)


*

≠≠≠≠ ≠≠≠≠

46

B)

C) Figura 6. Concentração sérica de T4. Gráfico representativo do dimorfismo sexual entre adultos (3 meses, n=9) e pré-púberes (40 dias pós-natal, n=6); * Comparado ao macho adulto, p< 0,05; ≠ pré-púberes comparados aos adultos, p< 0,001 (A); tratamento com Eb por 10 dias em ratas intactas (Eb, n=11) e ovariectomizadas (OVX + Eb, n=8); € comparado ao controle, p< 0,05 (B); tratamento com Eb por 30 dias em ratas intactas (Eb, n=10) e ovariectomizadas (OVX + Eb, n=10); * Comparado ao controle, p< 0,001; ≠ comparado ao 0,7; p< 0,05; ¥ comparado ao OVX; p< 0,05 (C).

C 0,7 14 OVX 0,7 140

2

4

6

8

T4

séri

co(u

g/d

L)

Eb OVX + Eb

*

≠≠

¥

C 0,7 14 OVX 0,7 140

2

4

6

8

T4

séri

co(u

g/d

L)

Eb OVX + Eb

C 0,7 14 OVX 0,7 140

2

4

6

8

T4

séri

co(u

g/d

L)

Eb OVX + Eb

*

≠≠

¥

C 0,7 14 OVX 0,7 140

1

2

3

4

5

6

T4

séri

co(u

g/d

L)

Eb OVX + Eb

C 0,7 14 OVX 0,7 140

1

2

3

4

5

6

T4

séri

co(u

g/d

L)

Eb OVX + Eb

p<0,05

47

4. CONCENTRAÇÃO SÉRICA DE TSH

Não encontramos diferenças significativas na concentração sérica de TSH

entre os animais macho e fêmea adultos ou entre macho e fêmea pré-púberes. No

entanto, observamos que os animais adultos apresentaram concentração sérica de

TSH significativamente maior que os pré-púberes (p<0,05) (Figura 7A).

Nenhum dos grupos experimentais apresentou diferença significativa na

concentração sérica de TSH (Figura 7B e 7C).

A) B) C) Figura 7. Concentração sérica de TSH. Gráfico representativo do dimorfismo sexual entre adultos (3 meses, n=15) e pré-púberes (40 dias pós-natal, n=10) (A); tratamento com Eb por 10 dias em ratas intactas (Eb, n=15) e ovariectomizadas (OVX + Eb, n=15) (B); tratamento com Eb por 30 dias em ratas intactas (Eb, n=10) e ovariectomizadas (OVX + Eb, n=10) (C).


1

2

TS

H s

éric

o(n

g/m

L)


p < 0,05


1

2

TS

H s

éric

o(n

g/m

L)



1

2

TS

H s

éric

o(n

g/m

L)


p < 0,05

C 0,7 14 OVX 0,7 140

1

2

OVX + EbEb

TS

H s

éric

o(n

g/m

L)

C 0,7 14 OVX 0,7 140

1

2

OVX + EbEb

TS

H s

éric

o(n

g/m

L)

C 0,7 14 OVX 0,7 140

1

2

OVX + EbEb

TS

H s

éric

o(n

g/m

L)

C 0,7 14 OVX 0,7 140

1

2

OVX + EbEb

TS

H s

éric

o(n

g/m

L)

48

II. DIMORFISMO SEXUAL: COLESTEROL E TRIGLICERÍDEO SÉRICOS

1. VALORES DE COLESTEROL CIRCULANTE

Os valores de colesterol sérico nas fêmeas adultas tendem a ser mais altos

que os valores obtidos nos machos adultos (p=0,06). Os animais pré-púberes não

apresentaram diferença entre si, mas a fêmea pré-púbere apresentou valores de

colesterol significativamente mais altos que a fêmea adulta (p<0,05). Além disso, os

animais pré-púberes apresentaram valores significativamente mais altos de

colesterol quando comparados aos animais adultos (p<0,001) (Figura 8A).

As fêmeas tratadas por 10 ou 30 dias, intactas ou ovariectomizadas, não

apresentaram diferença nos níveis de colesterol (Figura 8B e 8C). Interessante notar

que os valores de colesterol encontrados nas ratas ovariectomizadas e

ovariectomizadas com administração de Eb são significativamente maiores que os

valores encontrados nas ratas intactas e intactas com administração de Eb (p<0,05).

A)

Macho Fêmea Macho Fêmea0

25

50

75

100

Co

lest

ero

l (m

g/d

L)

p< 0,001


≠

Macho Fêmea Macho Fêmea0

25

50

75

100

Co

lest

ero

l (m

g/d

L)

p< 0,001


≠

49

B)

C)

Figura 8. Valores de colesterol circulante. Gráfico representativo do dimorfismo sexual entre adultos (3 meses, n=8) e pré-púberes (40 dias pós-natal, n=8); ≠ comparada a fêmea adulta, p<0,05 (A); tratamento com Eb por 10 dias em ratas intactas (Eb, n=7) e ovariectomizadas (OVX + Eb, n=7) (B); tratamento com Eb por 30 dias em ratas intactas (Eb, n=10) e ovariectomizadas (OVX + Eb, n=8) (C).

C 0,7 14 OVX 0,7 140

10

20

30

40

50

60

70

80

Co

lest

ero

l (m

g/d

L)

Eb OVX + Eb

C 0,7 14 OVX 0,7 140

10

20

30

40

50

60

70

80

Co

lest

ero

l (m

g/d

L)

Eb OVX + Eb

p<0,01

C 0,7 14 OVX 0,7 140

25

50

75

100

125

Co

lest

ero

l (m

g/d

L)

Eb OVX + Eb

C 0,7 14 OVX 0,7 140

25

50

75

100

125

Co

lest

ero

l (m

g/d

L)

Eb OVX + Eb

p< 0,05

50

2. VALORES DE TRIGLICERÍDEOS CIRCULANTES

Não detectamos diferenças nos níveis de triglicerídeos entre os animais

adultos. Os animais pré-púberes apresentaram níveis significativamente mais altos

do que os animais adultos (p=0,02) (Figura 9A).

A administração das duas doses de Eb (0,7 e 14µg) por 10 dias a ratas

intactas aumentou significativamente os níveis de triglicerídeos circulantes. A

administração de Eb por 30 dias as ratas intactas também aumentou

significativamente os níveis de triglicerídeos quando utilizamos a maior dose (OVX +

Eb 14) (p<0,01) (Figura 9C).

A ovariectomia por 10 dias reduziu significativamente os níveis de

triglicerídeos, comparado ao controle (p<0,005). A reposição com dose mais alta de

Eb reverteu significativamente esta diminuição (Eb 14, p< 0,01) (Figura 9B). A

ovariectomia por 44 dias não alterou os níveis de triglicerídeos, contudo, a

administração das duas doses de Eb aumentou significativamente a concentração

dos triglicerídeos (p<0,05).

A)


25

50

75

100

Tri

glic

eríd

eos

(mg

/dL

)


p=0,02


25

50

75

100

Tri

glic

eríd

eos

(mg

/dL

)


p=0,02

51

B)

C)

Figura 9. Valores de triglicerídeos circulantes. Gráfico representativo do dimorfismo sexual entre adultos (3 meses, n=8) e pré-púberes (40 dias pós-natal, n=8) (A); tratamento com Eb por 10 dias em ratas intactas (Eb, n=7) e ovariectomizadas (OVX + Eb, n=7); € p< 0,05 comparado ao controle; ≠ comparado ao controle, p<0,005; * comparado ao OVX, p< 0,01 (B) tratamento com Eb por 30 dias em ratas intactas (Eb, n=8) e ovariectomizadas (OVX + Eb, n=8); ≠ comparado ao controle, p<0,001; ¥ comparado ao OVX, p<0,05 (C).

C 0,7 14 OVX 0,7 140

100

200

Tri

glic

eríd

eos

(mg

/dL

)

Eb OVX + Eb

€€

*

≠

C 0,7 14 OVX 0,7 140

100

200

Tri

glic

eríd

eos

(mg

/dL

)

Eb OVX + Eb

€€

*

≠

C 0,7 14 OVX 0,7 140

100

200

Tri

glic

eríd

eos

(mg

/dL

)

Eb OVX + Eb

≠

¥

¥

C 0,7 14 OVX 0,7 140

100

200

Tri

glic

eríd

eos

(mg

/dL

)

Eb OVX + Eb

≠

¥

¥

52

III. DESIODASE TIPO 1 E SUBSTRATOS DO RECEPTOR DE INSULINA

1. ATIVIDADE DESIODASE TIPO 1 (D1) TIREÓIDEA

Analisamos fêmeas intactas e ovariectomizadas tratadas com Eb por 30 dias.

Não encontramos diferenças na atividade D1 na tireóide das ratas intactas tratadas

com Eb. A ovariectomia por 44 dias diminuiu significativamente a atividade D1

tireóidea quando comparada ao grupo controle (p=0,001). E somente a reposição

com a dose maior (OVX + Eb 14) foi capaz de reverter esta diminuição (p=0,002).

Figura 10. Atividade da enzima D1 tireóidea. Gráfico representativo da atividade da enzima D1 tireóidea de ratas intactas (Eb) e ovariectomizadas (OVX + Eb) que receberam tratamento com Eb por 30 dias (n=7); ≠ comparado ao controle, p=0,001; * comparado ao OVX; p= 0,002.

Eb

C 0,7 14 OVX 0,7 140

100

200

Ati

vid

ade

D1

tire

óid

ea(p

mo

les

rT3/

min

.mg

ptn

)

OVX + Eb

*

Eb

C 0,7 14 OVX 0,7 140

100

200

Ati

vid

ade

D1

tire

óid

ea(p

mo

les

rT3/

min

.mg

ptn

)

OVX + Eb

*

≠

53

2. ATIVIDADE DESIODASE TIPO 1 (D1) HEPÁTICA

As fêmeas adultas têm menor atividade D1 hepática, quando comparadas aos

machos adultos (p<0,01). As fêmeas pré-púberes têm menor atividade D1 hepática,

quando comparadas aos machos pré-púberes, embora a diferença não seja

significativa (p=0,08) (Figura 11A). Esses dados corroboram achados recentes do

nosso laboratório (Marassi, 2005).

As fêmeas intactas tratadas com Eb por 10 ou 30 dias, não apresentaram

diferença significativa na atividade da enzima (Figura 11B e 11C).

As ratas ovariectomizadas não apresentaram diferença significativa na

atividade D1. O tratamento com Eb na dose 14µg, por 10 dias, aumentou

significativamente a atividade D1 hepática (p<0,05). O tratamento de ratas OVX com

Eb por 30 dias, nas duas doses, também aumentou significativamente a atividade

D1 hepática (p<0,05).

A)


10

20

30

40

50

60


Ati

vid

ade

D1

(pm

ole

srT

3/m

in.m

gp

tn)

*


10

20

30

40

50

60


Ati

vid

ade

D1

(pm

ole

srT

3/m

in.m

gp

tn)

*≠

54

B)

C) Figura 11. Atividade da enzima D1 hepática. A) Dimorfismo sexual entre adultos (3 meses, n=4) e pré-púberes (40 dias pós-natal, n=6); * comparado ao macho adulto, p<0,05; ≠ comparado ao macho pré-púbere, p=0,08. B) Tratamento com Eb por 10 dias em ratas intactas (Eb, n=4) e ovariectomizadas (OVX + Eb, n=4); * comparado ao OVX, p<0,05. C) Tratamento com Eb por 30 dias em ratas intactas (Eb, n=6) e ovariectomizadas (OVX + Eb, n=6); * comparado ao OVX, p<0,05.

C 0,7 14 OVX 0,7 140

10

20

30

40

50

60

Eb OVX + Eb

Ati

vid

ade

D1

(pm

ole

srT

3/m

in.m

gp

tn)

C 0,7 14 OVX 0,7 140

10

20

30

40

50

60

Eb OVX + Eb

Ati

vid

ade

D1

(pm

ole

srT

3/m

in.m

gp

tn)

*

C 0,7 14 OVX 0,7 140

10

20

30

40

50

60

Eb OVX + Eb

Ati

vid

ade

D1

(pm

ole

srT

3/m

in.m

gp

tn)

C 0,7 14 OVX 0,7 140

10

20

30

40

50

60

Eb OVX + Eb

Ati

vid

ade

D1

(pm

ole

srT

3/m

in.m

gp

tn)

* *

55

3. AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DO RNAm NA TIREÓIDE

3.1. SUBSTRATO DO RECEPTOR DE INSULINA- 1 (IRS-1)

A expressão do RNAm do IRS-1 aumentou significativamente nas ratas

intactas tratadas com as duas doses de Eb administradas por 10 dias (p<0,01).

As ratas ovariectomizadas apresentaram maior expressão de IRS-1 quando

comparadas ao grupo controle (p<0,01). O tratamento com Eb na menor dose (OVX

+ Eb 0,7) diminuiu significativamente a expressão de IRS-1 (p<0,001).

A)

B) Figura 12. Expressão do RNA mensageiro do IRS-1 tireóideo. A) Foto representativa do produto de PCR para GAPDH. B) Foto representativa do produto de PCR para IRS-1 e análise densitométrica da intensidade das bandas; * comparado ao controle, p<0,01; ≠ comparado ao OVX, p<0,001. Os valores foram normalizados pela razão entre a intensidade da banda IRS-1 e a intensidade da banda do GAPDH. Os dados foram colocados no gráfico como valores relativos ao controle.

GAPDH600 pb

377 pb GAPDH600 pb

377 pb

C 0,7 14 OVX 0,7 140

0.5

1.0

1.5

Den

sito

met

ria

(un

idad

es a

rbit

rári

asre

lati

vas

ao c

on

tro

le)

Eb OVX + Eb

IRS-1580 pb

**

*≠

C 0,7 14 OVX 0,7 140

0.5

1.0

1.5

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le)

Eb OVX + Eb

C 0,7 14 OVX 0,7 140

0.5

1.0

1.5

Den

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met

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es a

rbit

rári

asre

lati

vas

ao c

on

tro

le)

Eb OVX + Eb

IRS-1580 pb IRS-1580 pb

**

*≠

56

3.2. SUBSTRATO DO RECEPTOR DE INSULINA- 2 (IRS-2)

A expressão do IRS-2 não se alterou nas ratas intactas tratadas com as duas

doses de Eb por 10 dias.

A ovariectomia por 10 dias reduziu significativamente a expressão do IRS-2

na tireóide (p<0,0001). A administração da dose fisiológica de Eb foi capaz de

reverte este efeito (p<0,001), o que não foi observado na administração da dose

mais alta.

Figura 13. Expressão do RNAm do IRS-2 tireóideo. Foto representativa do produto de PCR para IRS-2 e análise densitométrica da intensidade das bandas, * comparado ao controle, p<0,0001; ≠ comparado ao OVX; p<0,001. Os valores foram normalizados pela razão entre a intensidade da banda do IRS-2 e a intensidade da banda do GAPDH. Os dados foram colocados no gráfico como valores relativos ao controle.

≠

*

≠

C 0,7 14 OVX 0,7 140

0.25

0.50

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1.00

1.25

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600 pb

388 pb IRS-2

C 0,7 14 OVX 0,7 140

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

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Eb OVX + Eb

C 0,7 14 OVX 0,7 140

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

Den

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lati

vas

ao c

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tro

le)

Eb OVX + Eb

600 pb

388 pb IRS-2

57

4. AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DO RNAm NO FÍGADO

4.1. SUBSTRATO DO RECEPTOR DE INSULINA-1 (IRS-1)

A expressão do IRS-1 no tecido hepático não se alterou nas ratas intactas

tratadas com Eb nas duas doses por 10 dias (Figura 14B).

A ovariectomia diminui significativamente a expressão do IRS-1 hepático

(p<0,05). O tratamento com a dose fisiológica de Eb reverteu este efeito, e a dose

mais alta de Eb parece não normalizar a expressão do IRS-1 nas ratas tratadas por

10 dias (Figura 14B).

Não observamos alteração significativa na expressão do IRS-1 hepático das

ratas intactas ou ovariectomizadas tratadas por 30 dias com Eb (Figura 14D).

A)

B)

600 pb377 pb GAPDH – 10 dias600 pb377 pb GAPDH – 10 dias

580 pb IRS-1580 pb IRS-1

C 0,7 14 OVX 0,7 140.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

Den

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es a

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rári

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lati

vas

ao c

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Eb OVX + Eb

*

C 0,7 14 OVX 0,7 140.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

Den

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(un

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es a

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rári

asre

lati

vas

ao c

on

tro

le)

Eb OVX + Eb

*

58

C) D) Figura 14. Expressão do RNA mensageiro do IRS-1 hepático. A) Foto representativa do produto de PCR para GAPDH de ratas intactas e ovariectomizadas que receberam Eb por 10 dias. B) Foto representativa do produto de PCR para IRS-1 e análise densitométrica da intensidade das bandas de ratas intactas e ovariectomizadas que receberam Eb por 10 dias (Eb 0,7 e 14); * comparado ao controle, p<0,05. C) Foto representativa do produto de PCR para GAPDH ratas intactas e ovariectomizadas que receberam Eb por 30 dias. D) Foto representativa do produto de PCR para IRS-1 e análise densitométrica da intensidade das bandas de ratas intactas e ovariectomizadas que receberam Eb por 30 dias (OVX + 0,7 e 14). Foram realizados 3 experimentos; os valores foram normalizados pela razão entre a intensidade da banda do IRS-1e a intensidade da banda do GAPDH. Os dados foram colocados no gráfico como valores relativos ao controle.

600 pb

377 pb GAPDH – 30 dias600 pb

377 pb GAPDH – 30 dias

C 0,7 14 OVX 0,7 140

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

Den

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rári

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Eb OVX + Eb

580 pb IRS-1

C 0,7 14 OVX 0,7 140

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

Den

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le)

Eb OVX + Eb

C 0,7 14 OVX 0,7 140

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

Den

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le)

C 0,7 14 OVX 0,7 140

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

Den

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es a

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rári

asre

lati

vas

ao c

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tro

le)

Eb OVX + Eb

580 pb IRS-1

59

4.2. SUBSTRATO DO RECEPTOR DE INSULINA-2 (IRS-2)

A expressão do IRS-2 no tecido hepático não se alterou nas ratas intactas

que receberam estradiol por 10 dias. A ovariectomia e a reposição com dose

fisiológica de Eb parecem não exercer efeito, mas a administração da dose alta de

Eb a ratas OVX foi capaz de diminuir significativamente a expressão de IRS-2

(P=0,02) (Figura 15A).

A administração de Eb por 30 dias em ratas intactas e ovariectomizadas

parece não alterar a expressão do IRS-2 no tecido hepático (Figura 15B).

A)

C 0,7 14 OVX 0,7 140

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

Den

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Eb OVX + Eb

*

C 0,7 14 OVX 0,7 140

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

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Eb OVX + Eb

*

388 pb IRS-2

60

B)

Figura15. Expressão do RNA mensageiro do IRS-2 hepático. A) Foto representativa do produto de PCR para IRS-2 e análise densitométrica da intensidade das bandas de ratas intactas e ovariectomizadas que receberam Eb por 10 dias (Eb 0,7 e 14); * comparado ao OVX, p<0,05. B) Foto representativa do produto de PCR para IRS-2 e análise densitométrica da intensidade das bandas de ratas intactas e ovariectomizadas que receberam Eb por 30 dias (OVX + 0,7 e 14). Foram realizados 3 experimentos; os valores foram normalizados pela razão entre a intensidade da banda do IRS-2 e a intensidade da banda do GAPDH. Os dados foram colocados no gráfico como valores relativos ao controle.

C 0,7 14 OVX 0,7 140

0.25

0.50

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C 0,7 14 OVX 0,7 140

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0.50

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le)

Eb OVX + Eb

388 pb IRS-2

61

DISCUSSÃO

Neste trabalho avaliamos diversos aspectos da influência dos esteróides

sexuais sobre a função tireóidea e os níveis séricos de colesterol e triglicerídeos.

Avaliamos as diferenças entre os sexos em animais adultos e pré-púberes e as

alterações provocadas pela administração ou ausência de estrogênio em ratas

fêmeas adultas.

Vários estudos relatam maior incidência de distúrbios tireóideos nas mulheres

do que nos homens, tanto durante a vida reprodutiva quanto na pós-menopausa.

Durante a infância, a prevalência de doenças tireóideas entre meninas e meninos é

igual, aumenta na puberdade para 3:1 (meninas:meninos) e se mantém até a

menopausa, quando começa a diminuir, chegando à 1:1,5 (mulheres:homens) aos

65 anos de idade (Fassina e cols., 1994; Henderson e cols., 1982). Esses dados

epidemiológicos sugerem haver importante influência dos esteróides sexuais sobre a

tireóide. O estrogênio poderia agir de forma deletéria ou a testosterona poderia

proteger de alguma forma o desenvolvimento de doenças da tireóide.

O peso corporal, assim como a concentração de IGF-I e os níveis de

gonadotrofinas são parâmetros importantes durante a progressão da puberdade e

da menopausa (Khosla e cols., 1996; Kulik-Rechberger & Janiszewska, 2004;

Veldhuis e cols., 2005). Nossos resultados mostraram que ratas intactas apresentam

aumento significativo no ganho de peso corporal, quando tratadas com Eb por 10

dias na dose 0,7. E o tratamento na dose 14 diminuiu o peso corporal desses

animais. A castração tanto de 10 quanto 44 dias, levou ao aumento significativo do

ganho de peso corporal dos animais, dados já vistos por outros autores (Khosla e

62

cols., 1996; Davidge e cols., 2001; Kavanagh e cols., 2005). A reposição com

estradiol reverteu o ganho de peso promovido pela castração, como também

mostrado por Noh e cols., (1999). Aparentemente, as ratas castradas têm maior

sensibilidade à ação do estrogênio sobre o controle do peso corporal, principalmente

nos primeiros dias após a castração. As ratas intactas tratadas com estradiol por

curto intervalo de tempo também têm maior sensibilidade à ação do estradiol.

Provavelmente, há modulação dos receptores de estrogênio após a castração e

durante o tratamento com estradiol por diferentes intervalos de tempo. (Ohlsson e

cols., 2000; Ito e cols., 2004; Kang e cols., 2004; Badger e cols., 2006).

O fígado é um órgão extremamente sensível à ação dos hormônios

esteróides. Van Thiel e cols., (1990) mostraram que a massa hepática está

diretamente relacionada ao número de receptores de estrogênio, assim como há

progressão mais rápida de doenças hepáticas em homens. Esses efeitos são

atribuídos, provavelmente, à ação protetora do estrogênio (Becker e cols., 1996).

Também encontramos diferenças na avaliação do perfil lipídico de nossos grupos

experimentais. As fêmeas adultas têm valores mais altos de colesterol total que os

machos adultos. No entanto, os valores de colesterol não são alterados quando

administramos Eb, como demonstrado por Noh e cols., (1999). Mas, na presença do

estrogênio os valores de triglicerídeos aumentam de maneira dose dependente,

corroborando os dados de Joles e cols., (1995) e Noh e cols., (1999).

Corroborando os dados da literatura (Donda e cols., 1987; Lisboa e cols.,

1997), encontramos a concentração sérica de T3 mais alta nas fêmeas adultas que

nos machos adultos e nas fêmeas pré-púberes a concentração de T3 sérico também

foi significativamente mais baixa quando comparada à fêmea adulta. O mesmo

padrão foi encontrado na análise da concentração sérica de T4. Esses resultados

63

corroboram os achados de Cheron e cols., (1980) e Banu e Aruldhas (2002).

Podemos especular que o estrogênio, pelo aumento da TBG, leva ao aumento da

concentração sérica dos hormônios tireóideos (Henderson e cols., 1982 Ain e cols.,

1987). Entretanto, o papel da TBG em ratos ainda é pouco definido. Um outro

achado que poderia explicar os níveis séricos de T4 e T3 maiores nas fêmeas

adultas está relacionado ao fato de que esses animais têm atividade desiodase

hepática significativamente menor. Recentemente, demonstrou-se que animais

knockout para a desiodase tipo 1 apresentam menor clearance de T4 e T3 e níveis

circulantes normais (Schneider e cols., 2006).

Assim como na literatura, encontramos a concentração sérica de TSH

maiores nas fêmeas adultas quando comparadas às fêmeas pré-púberes (Figura 7A)

(Christianson e cols., 1981; Donda e cols., 1990). Entretanto, a mesma diferença

existe entre machos adultos e pré-púberes, indicando que tanto o estrogênio quanto

a testosterona possam agir estimulando a secreção de TSH, conforme anteriormente

descrito (Banu e cols., 2002b).

Sabe-se que a desiodase tipo 1 tireóidea, assim como outras proteínas

tireóideas, sofre importante estímulo do TSH. Entretanto, a atividade desiodase

tireóidea parece não sofrer grande influência da ação dos estrogênios. A literatura

mostra que a castração de 3 semanas não altera a atividade D1 tireóidea e que

somente a reposição hormonal com alta dose de Eb aumenta a sua atividade

(Lisboa e cols., 1997). Estudos prévios do nosso laboratório mostraram que

realmente não há diferença significativa entre as ratas intactas e ovariectomizadas

por 21 dias, mas mostraram que a reposição hormonal aumenta a atividade D1

tireóidea (Marassi, 2005). Entretanto, no presente estudo mostramos que após 44

dias de castração há diminuição significativa da atividade D1 tireóidea e reversão

64

deste efeito com a alta dose de Eb. Assim, a desiodase tireóidea pode estar

diminuída em animais com deficiência crônica de estrogênio, embora o TSH,

principal regulador desta enzima, esteja normal nesses animais.

Encontramos atividade D1 hepática menor nas fêmeas adultas que nos

machos, o que concorda com os dados mostrados por Donda e cols (1990) e

Miyashita e cols., (1995). Nas fêmeas intactas, assim como nas ovariectomizadas

tratadas por 10 dias com Eb, a atividade D1 hepática não se alterou, como

observado por Lisboa e cols., (1997). Somente a maior dose de Eb foi capaz de

elevar a atividade D1 hepática em animais intactos. A ovariectomia por período mais

prolongado tende a diminuir a atividade D1 hepática, apesar dos valores não serem

significativos, e o tratamento prolongado de ratas OVX com Eb aumentou

significativamente a atividade D1, o mesmo efeito observado por Harris e cols.,

(1979). Anteriormente, dados do nosso laboratório demonstraram que a desiodase

tireóidea também é significativamente menor em fêmeas adultas que nos machos e

que a ovariectomia não altera essa atividade (Marassi, 2005). Sendo assim, as

menores atividades D1 hepática e tireóidea encontradas nas fêmeas adultas não

podem ser explicadas pela presença de estrogênio, ou da função ovariana normal.

Outros fatores ainda não conhecidos, relacionados ao desenvolvimento sexual,

devem estar envolvidos com a regulação da atividade desiodase nas ratas fêmeas.

Nossos dados tornam evidentes que as concentrações séricas dos hormônios

tireóideos sofrem influência do estrogênio, provavelmente através da modulação da

metabolização periférica através de desiodases. Em ratos, uma importante fonte de

T3 sérico é o tecido adiposo marrom, que expressa apenas a desiodase tipo 2.

Entretanto, ainda não há estudos na literatura acerca da modulação desta enzima

pelo estrogênio.

65

Já foi descrita a presença de receptores de estrogênio (ER) no tecido

tireóideo (Money e cols., 1989). Outros estudos mostram que os níveis de ER em

tecido neoplásico estão aumentados quando comparados com tecido normal (Yane

e cols., 1994), assim como demonstraram potencial para síntese e ação do

estrogênio no tecido tanto normal quanto neoplásico (Valle e cols., 1998).

Recentemente, demonstraram que o estrogênio aumenta a sinalização de

IGF-I e sua cascata intracelular em tecido não tireóideo (Lee e cols., 1999). Neste

mesmo ano, Furlanetto e cols., (1999) demonstraram que o estrogênio leva à

proliferação dos tireócitos. Sendo assim, resolvemos analisar a regulação pelo

estrogênio da expressão das principais proteínas iniciadoras das cascatas de

sinalização intracelular da insulina e de IGF-I, substratos do receptor de insulina -1 e

2 (IRS-1 e IRS-2). Nossos resultados mostram que a administração de Eb aumenta

significativamente a expressão do IRS-1 no tecido tireóideo de fêmeas intactas,

assim como a castração. Curiosamente, em fêmeas castradas, a administração de

Eb diminuiu a expressão de IRS-1, fazendo-o retornar para os valores da

normalidade. Em células de câncer de mama MCF-7, o estrogênio aumenta a

expressão do IRS-1 mesmo na ausência de IGF-IR, mas não os outros

componentes da via intracelular insulina/IGF-I (Dupont e Le Roith, 2001). O IRS-2

apresentou um perfil bem diferente, não alterando nas ratas intactas, mas

diminuindo significativamente durante a castração de 10 dias. Neste caso, o

estrogênio aumenta a expressão de IRS-2, revertendo o efeito observado nas ratas

castradas (Figura 13). O estrogênio tem efeito proliferativo sobre a tireóide e fêmeas

castradas têm diminuição do peso tireoideano (Banu e cols., 2002c). Estudos em

culturas de células mostram que o IRS-2 parece ser modulado pelo TSH, mas não o

IRS-1 (Ariga e cols., 2000) e, recentemente, demonstrou-se que células FRTL-5

66

transfectadas com o oncogene RET/PTC 3 apresentam níveis aumentados de IRS-2

total e fosforilado (Miyagi e cols., 2004).

No fígado, só observamos diminuição na expressão do IRS-1 nas ratas

ovariectomizadas por 10 dias. Curiosamente, somente a administração de Eb na

maior dose foi capaz de exercer efeito sobre a expressão de IRS-2 no fígado.

Animais knockout para IRS-2 apresentam baixa concentração de LH, prolactina e

estrogênio, além de reduzido tamanho da hipófise e conteúdo de gonadotrofos

(células responsáveis pela síntese e secreção de LH e FSH). Esses achados

indicam que a insulina, assim como a leptina e outros neuropeptídeos, podem

modular o controle hipotalâmico do apetite e da reprodução (Burks e cols., 2000). Os

mecanismos pelos quais IRS-1 e IRS-2 podem regular a homeostase lipídica e da

glicose ainda não são esclarecidos. Apesar do IRS-1 e IRS-2 agirem de forma

complementar para manter a sinalização da PI3 cinase, eles possuem papéis

individuais. O IRS-1, no tecido hepático, parece estar diretamente relacionado com a

manutenção de enzimas essenciais para a gliconeogênese, enquanto o IRS-2

parece ser essencial para a regulação da lipogênese pela insulina (Taniguchi, e

cols., 2005).

Os diferentes padrões de expressão dos IRSs causados pela presença ou

ausência do estrogênio indica que o IRS-1 e IRS-2 possuem papéis diferentes nos

diversos tecidos. A possibilidade de modulação do IRS-2 e da sua fosforilação pelo

estrogênio na tireóide merece maior atenção nos estudos futuros que pretendam

entender as vias intracelulares de ação do estrogênio sobre essa glândula.

No fígado, o IRS-1 parece estar um pouco diminuído durante a deficiência de

estrogênio, entretanto, a diminuição do IRS-1 ou IRS-2 hepáticos não parecem

explicar a resistência insulínica presente em fêmeas castradas.

67

CONCLUSÕES

1 - O aumento de peso corporal observado nas fêmeas castradas é secundário à

deficiência de estrogênio;

2 - Os níveis de T4 e T3 circulantes são modulados pelo estrogênio

independentemente de alterações no TSH sérico, mostrando haver ações diretas do

esteróide sexual feminino sobre a função tireóidea e metabolização periférica dos

HT, embora os mecanismos ainda não estejam elucidados;

3 - Não há relação entre o controle do peso corporal e os níveis circulantes de T4 e

T3 nas ratas fêmeas castradas;

4 - As fêmeas adultas têm menor atividade desiodase hepática, o que não é

normalizado pelo tratamento com estradiol ou com a castração. Algum outro fator

não gonadal regula a atividade desiodase em fêmeas adultas;

5 - O IRS-2 pode estar relacionado à ação mitogênica do estrogênio sobre a tireóide;

6 - A diminuição no conteúdo do mRNA do IRS-1 no fígado de ratas castradas pode

estar relacionada, pelo menos em parte, com a resistência insulínica descrita nesses

animais.

68

REFERÊNCIAS

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79

Anexo I: artigo de revisão submetido aos Arquivos Brasileiros de Endocrinologia e

Metabologia.

Fatores de Crescimento e a Função Tireóidea

Renata Grozovsky, Mario Vaisman e Denise Pires de Carvalho

Serviço de Endocrinologia do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho e

Laboratório de Fisiologia Endócrina do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho,

Universidade Federal do Rio de Janeiro.

80

Com o avanço da biotecnologia e o desenvolvimento de novas técnicas,

novos personagens foram adicionados à tradicional tireoidologia. Descrito há

algumas décadas, o TSH ou tireotrofina, é o hormônio mais importante envolvido no

controle da função tireoideana, crescimento e proliferação celular e biossíntese

hormonal. Ser o principal hormônio não significa que o TSH é o único regulador da

função tireoideana, diversos fatores de crescimento e seus receptores atuam como

agentes permissivos aos efeitos proliferativos do TSH (1). Nesta revisão, iremos

discutir o papel do TSH e de outros fatores de crescimento e seus receptores na

proliferação tireoideana.

I. Regulação da Função Tireóidea

Os principais fatores capazes de regular a função dos tireócitos são a

tireotrofina (TSH) e o iodo. Assim, o crescimento e a funcionalidade das células

diferenciadas da tireóide são dependentes do receptor específico do TSH, o TSH-R,

que se encontra na membrana basolateral dos tireócitos, e do conteúdo intracelular

de iodo. O TSH regula tanto a síntese quanto a secreção dos hormônios tireóideos,

aumentando também o tamanho e a vascularização da glândula.

A tireotrofina (TSH) é um hormônio glicoprotéico, sintetizado e secretado

pelos tireotrofos, localizados na adenohipófise. O hipotálamo exerce efeito

estimulatório sobre a função tireóidea através da síntese e liberação do hormônio

liberador de tireotrofina (TRH), o qual estimula a liberação de TSH pela

adenohipófise. O TRH é um tripeptídeo sintetizado pelos neurônios hipotalâmicos e

transportado via sistema porta até a adenohipófise, agindo diretamente sobre os

tireotrofos. Apesar do TRH agir em balanço com reguladores hipotalâmicos

inibitórios, como somatostatina e dopamina, os hormônios tireóideos exercem o

81

controle mais importante do feedback negativo. São capazes de inibir a secreção de

TSH, agindo diretamente nos tireotrofos (2).

O TSH é o principal hormônio regulador da função da tireóide, estimulando

todos os passos da biossíntese hormonal, endocitose e liberação dos hormônios

tireóideos (3). Evidências indicam também, que o TSH regula a nível transcripcional

a expressão de tireoglobulina, assim como aumenta a expressão e atividade

enzimática da tireoperoxidase e a expressão do NIS (4).

Embora o TSH seja o principal regulador dos estados morfológicos e

funcionais da tireóide, nem todos os ajustes da função tireóidea são por ele

mediados. Mecanismos autorregulatórios intrínsecos também controlam a

sensibilidade das células tireóideas ao TSH, como o aporte de iodo (3).

II. Regulação da Proliferação Tireóidea

Vários fatores além do TSH e o iodo modulam o tamanho, o grau de

diferenciação e a capacidade replicativa dos tireócitos. O hormônio luteinizante (LH),

o hormônio folículo-estimulante (FSH) e a gonadotrofina coriônica, são hormônios

glicoprotéicos compostos por 2 subunidades, sendo a subunidade α comum a todos,

inclusive ao TSH (5). Em altas concentrações, esses hormônios podem estimular a

função tireóidea diretamente, possivelmente através da sua ligação com o receptor

de TSH (TSH-R). Além destes, outros hormônios são capazes de influenciar a

função tireóidea, como a insulina e o hormônio do crescimento via IGF-I.

Distintas vias mitogênicas já foram descritas na tireóide: além do sistema

adenilato ciclase-AMPc, principal via de ação do TSH, temos vias intracelulares

relacionadas à ativação do sistema de proteínas tirosinas cinase (6). A via proteína

tirosina cinase pode ser subdivida em 2 ramos: as vias de alguns fatores de

82

crescimento como EGF, que induzem proliferação e reprimem a diferenciação; e a

via mitogênica que não inibe a expressão da diferenciação, como as estimuladas por

FGF (fator de crescimento de fibroblasto), IGF-I e insulina (7). Em humanos, IGF-I ou

insulina são requeridos para a ação mitogênica do TSH ou EGF, mas não estimulam

a proliferação dos tireócitos sozinhos (8). Além disto, sabe-se que o TSH também

depende da presença de insulina ou IGF-I para exercer a sua ação mitogênica.

III. Fatores de crescimento e a Função Tireóidea

Fatores de crescimento e seus receptores são produtos de oncogenes. A sua

maioria possui efeitos proliferativos e dediferenciadores. Eles garantem o

crescimento autonômico da população das células tumorais pelo seus efeitos

autócrino e parácrino. Fatores de crescimento afetam o crescimento tumoral não só

por seu efeito direto, mas também indiretamente influenciando imunidade e

angiogênese. (9).

1. Insulina e IGF-I

A insulina e o IGF-I agem via diferentes receptores, no entanto sua via de

sinalização intracelular é comum (10). A insulina possui um receptor específico (IR),

que é uma glicoproteína transmembrana composta por 4 subunidades, enquanto o

receptor para IGF-I (IGF-IR) possui somente 2 subunidades (11,12). As regiões

intracelulares dos receptores possuem sítios com atividade tirosina cinase

intrínsecas, assim, IR e IGF-IR caracterizam-se como proteínas com atividade

tirosina cinase (13,14).

83

Os receptores exercem basicamente 3 funções: reconhecem e se ligam à

insulina ou IGF-I com alta especificidade; transmitem um sinal que resulta na

ativação/inativação de vias metabólicas intracelulares e são, posteriormente,

endocitados, juntamente com o hormônio ligado levando à proteólise lisossomal com

subseqüente degradação, armazenamento ou reciclagem das subunidades do

receptor (15,16).

A ligação da insulina ou IGF-I à subunidade α de seus receptores é o sinal

para a ativação da cinase presente na subunidade β, iniciando a cascata de

sinalização intracelular que irá culminar nos diversos efeitos dos hormônios. Além de

catalisar a fosforilação do próprio receptor (autofosforilação), alguns receptores

tirosina cinase fosforilam proteínas intracelulares que transmitem o estímulo

hormonal (17). Os substratos do receptor de insulina (IRSs) interagem

especificamente com os receptores de insulina e IGF-I, funcionando como proteínas

ancoradouras, que são fosforiladas em resíduos tirosila, recrutando proteínas para a

cascata de sinalização (18). Já foram identificados e clonados 4 membros desta

família: IRS-1 (19), IRS-2 (20), IRS-3 (21) e IRS-4 (22).

IRS-1 e IRS-2 são expressos, em ratos, em diversos tecidos (fígado, músculo

esquelético, coração, cérebro, rim, pulmão, baço, testículo) (20). Quanto a sua

localização subcelular, o IRS-1 está duas vezes mais concentrado no compartimento

de membrana que o IRS-2, que se encontra duas vezes mais concentrado no citosol

(23). IRS-3 é abundantemente expresso em tecido adiposo, tendo sido encontrado

em outros tecidos, como pulmão e coração. Curiosamente, foi detectada sua

expressão durante o desenvolvimento embrionário, fato que não ocorre com IRS-1

(24). Já o IRS-4 é expresso em níveis muito baixos em ratos, e sua caracterização

foi realizada em células embrionárias de rim humano (21). Este último pode ser

84

encontrado em tecido tireóideo, hipófise, ovário e fibroblastos (23). Diferentemente

dos outros IRSs (IRS-1 localizado no cromossomo 2, IRS-2, cromossomo 13 e IRS-

3, cromossomo 5) em humanos, o gene do IRS-4 está localizado no cromossomo X.

Apesar da insulina e do IGF-I exercerem importante papel sobre a regulação

da função e proliferação tireóidea, ainda há mecanismos desconhecidos acerca da

regulação de suas vias de sinalização intracelulares em tireócitos.

2. Estrogênio

Alguns aspectos como idade e sexo podem ser fatores importantes na

modulação da via de sinalização da insulina e do IGF-I.

Em 1990, Bagchi e cols. (25) relataram que é significativamente maior a

prevalência de disfunções tireoidianas entre os idosos, com importante diferença entre

os sexos, sendo mais comum entre as mulheres. Alguns autores relatam que o câncer

de tireóide parece ter pior prognóstico quando ocorre antes dos 7-8 anos de idade ou

acima de 40-50 anos, períodos em que há elevação ou declínio na produção de

estrogênios (26, 27). Testes clínicos mostraram que nódulos benignos diagnosticados

na idade reprodutiva têm seu crescimento reduzido, na maioria das pacientes, quando

estas entram na menopausa (28).

Paralelamente ao papel que desempenham na regulação da secreção

hipofisária de gonadotrofinas, os estrogênios podem exercer outros efeitos. Um

estudo mostrou que o TSH de mulheres em uso de contraceptivos orais, estava

aumentado (29). Isto provavelmente ocorre devido à elevação da concentração de

proteína ligadora de tiroxina (TBG) causada pelo estrogênio (30). Estas alterações

nas concentrações de hormônios tireóideos em pacientes em terapêutica hormonal

com T4, em mulheres grávidas ou em mulheres que iniciam o uso de estrogênios na

85

pós-menopausa, levam a necessidade do aumento da dose de T4 utilizada

previamente (31, 32).

Diferenças relacionadas ao sexo foram descritas quando em 1968, D’Angelo (33)

observou que ratas fêmeas apresentavam concentrações séricas e conteúdo

hipofisários de TSH diminuídos. Em 1987, Donda e cols., (34) descreveram aumento

das concentrações plasmáticas T3 nas fêmeas adultas, assim como Lisboa e cols., (35)

demonstraram que estas fêmeas também apresentam aumento das concentrações

séricas de T4.

A biossíntese do estrogênio, assim como de outros hormônios esteróides,

ocorre em apenas alguns tecidos, como supra-renal, mama, tecido adiposo e

ovários. A primeira etapa da síntese de todos os esteróides é a clivagem de parte da

cadeia lateral da molécula de colesterol, dando origem à ∆ 5-pregnolona. Esse é o

passo que limita a biossíntese dos esteróides, e é catalisado por uma das enzimas

do complexo do citocromo P-450 existente no interior mitocondrial, responsável pelo

processamento da molécula de colesterol (36). A biossíntese dos principais

estrogênios circulantes, estradiol e estrona, ocorre após a aromatização dos

precursores androgênicos: testosterona e androstenediona.

O estrogênio possui receptores específicos que estão localizados tanto no

citoplasma quanto no núcleo. Já foram descritas duas isoformas do receptor de

estrogênio (ER), a isoforma α e a isoforma β (37). Os receptores estão presentes em

vários tecidos, e apresentam expressão diferenciada, tecidos como útero, mama,

vagina e núcleo arqueado hipotalâmico expressam predominantemente ERα,

enquanto, rim, osso, pulmão, sistema cardivascular, ovário, próstata e núcleo

86

paraventricular hipotalâmico expressam predominantemente ERβ. Outros tecidos

como tireóide, hipófise e fígado expressam ambas isoformas (38-41).

Furlanetto e cols., (42) demonstraram em linhagem de células FRTL-5, que o

estradiol é capaz de estimular diretamente a proliferação celular dos tireócitos. Mais

recentemente, foi observada também em células FRTL-5 a modulação por

testosterona e estrogênio da proliferação celular induzida por TSH (43).

Há relação entre o estrogênio e as vias de sinalização da insulina de IGF-I em

tecido adiposo, hepático e muscular (44). Foi observado, em linhagem celular de

câncer de mama, que o estrogênio aumenta a expressão do IRS-1 (45) e logo

depois foi demonstrado que não só a expressão, mas também a sua fosforilação

está aumentada pelo estrogênio (46). Além disso, a modulação do IRS-1 por

estrogênio em fígado, músculo esquelético e tecido adiposo de ratos, parece ser

dose e tempo dependente (44).

A idade também pode ser um fator importante na sinalização insulínca. Em

experimentos utilizando ratos velhos, foi observada diminuição da atividade tirosina

cinase do receptor de insulina, bem como alterações no transporte de glicose, que

podem levar à resistência insulínica observada em pacientes idosos (47, 48).

Consistente com esses achados, foi demonstrado que animais velhos têm redução

no conteúdo e na fosforilação de IRS-1 e IRS-2, em músculo esquelético e no fígado

(49)

É importante ressaltar que esses achados dependem amplamente do tempo

de tratamento, da substância e das concentrações utilizadas, além da idade dos

animais ou pacientes utilizados para os estudos.

87

3. HGF

O HGF, fator de crescimento de hepatócito, é uma citocina multifuncional que

age como fator mitogênico, morfogênico e angiogênico em diversos tipos celulares

(50, 51). O seu receptor é codificado por um proto oncogene, c-met, que pertence à

família dos receptores tirosina cinase. É uma proteína de membrana constituído por

uma subunidade α extracelular, de 45 kDa e uma subunidade β com atividade

tirosina cinase, de 145 kDa (52).

HGF modula negativamente a diferenciação dos tireócitos, inibe a captação

de iodeto e induz a mudanças morfológicas, fenótipo de alongado como dos

fibroblastos (53). Expressão de HGF já foi demonstrada em tecido tireóideo normal e

neoplásico, indicando um possível papel parácrino na regulação do crescimento e

função do folículo tireóideo (54). Sendo que a expressão da proteína c-Met está

presente em 70-80% dos carcinomas papiliferos (55).

4. EGF

EGF, fator de crescimento epidermal, é um importante fator de crescimento

de muitos cânceres humanos, como câncer de mama e esofágico (56). EGF é

produzido pelos tireócitos de forma que atua de maneira autócrina ou parácrina. Em

contraste ao TSH, EGF estimula o crescimento celular do tireócito, mas inibe as

funções diferenciadas, como captação de iodo e organificação (57). Em um estudo

feito por Dumont e col. (58), com cultura primária de tireócitos caninos, foi mostrado

que EGF inibiu a expressão de tireoglobulina (Tg) induzida por TSH. Esta inibição foi

provocada diretamente pela ativação da via de EGF no tireócito e não simplesmente

pela indução da progressão do ciclo celular. Baixas concentrações de insulina são

permissivas para o efeito mitogênico do TSH, mas para o efeito de EGF são

88

necessárias maiores concentrações (59, 60). Porém a inibição da expressão de Tg

por EGF é independente de insulina (7).

5. Somatostatina

A somatostatina é um hormônio produzido no hipotálamo também encontrada

na tireóide, especula-se que este peptídeo exerce efeito local, atuando na liberação

dos hormônios tireóideos de forma parácrina (61). Em células FRTL-5 a

somatostatina inibe a proliferação mediada por TSH e IGF-I (62). Já em células PC

CL3, a somatostatina inibe o crescimento celular dependente de insulina e insulina e

TSH, causando bloqueio do ciclo celular (63). Santisteban e col. (64) mostraram que

a ação da somatostatina é mediada por p27 e, além disso, são mostradas

evidências de que a somatostatina é expressa em células FRTL-5 e sua transcrição

está sob controle do TSH. Estes resultados sugerem que a expressão de

somatostatina seria um mecanismo local de regulação do crescimento celular de

modo autócrino.

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