A FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA: ALGUNS ASPECTOS BIOQUÍMICOS,

FISIOLÓGICOS E MICROBIOLÓGICOS

LUIZ CARLOS BASSODEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS ESALQ/USP

V SEMANA DE FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA, Piracicaba 19/20- 5-2011

CONTEÚDO DA APRESENTAÇÃO

• O PROCESSO INDUSTRIAL E OS ESTRESSES IMPOSTOS À LEVEDURA

• SELEÇÃO DE LEVEDURAS E SEU BENEFÍCIO PARA A FERMENTAÇÃO INDUSTRIAL

• REDUÇÃO DA CONTAMINAÇÃO BACTERIANA: ALTERNATIVAS RELACIONADAS COM AS LEVEDURAS

• A DIVERSIDADE DOS LACTOBACILLUS E ESTRATÉGIA PARA O CONTROLE DAS BACTÉRIAS

• CONSIDERAÇÕES FINAIS

A SINGULARIDADE DA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA

AÇUCAR

ETANOL

CO2

CARBONO CÉLULA FILHA

LEVEDURA

PORQUE A LEVEDURA TRANSFORMA O AÇÚCAR EM ETANOL?

AÇUCAR (100g)

ETANOL+ CO2 = 90%

ATP

CARBONOBIOMASSA

(5%)

OUTROS = 5%

HEXOSE

ETANOL

PIRUVATOGLICEROL

CO2

+

SACAROSE

FRUTOSE GLICOSE

ETANOL

TREALOSE E

GLICOGÊNIO

ATP

AC.ORGÂNICOS

AMINOÁCIDOS

PROTEINAS

BIOMASSA

AC.ORGÂNICOS : SUCCÍNICO, MÁLICO, PIRÚVICO

K+

Mg++

Zn++

P

K+

NH4+

NH4+

A FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA

O PROCESSO FERMENTATIVO COM RECICLO DE CÉLULAS

MOSTO

CREME

DORNA

CUBA

VINHO

ÁCIDO

pH=1.8-2.5

2-5 horas

32-40oC

6-10 horas

7-14% cels

pH=3.7-4.5

7-11%EtOH

CENTRÍFUGAPé de cuba

O coração da fermentação: a dorna

Açúcar

da cana

ETANOL LEVEDURA

Saccharomyces cerevisiae

5 – 10 µ

CONTAMINANTES DA FERMENTAÇÃO

Açúcar

da cana

ETANOLLEVEDURA

+ BACTÉRIA

O SUBSTRATO: CALDO DE CANA E MELAÇO

CANAEXTRAÇÃO

CALDO (16-20% AT)

CONCENTRAÇÃO (EVAPORAÇÃO)

SACAROSE (CRISTAIS)

MELAÇO (50-60% AT)

AGUA

SUBSTRATO(18-20%AT)

BAGAÇO

FATORES LIMITANTES DA PRODUTIVIDADE

Alta densidade de células (10-14%) : deficiências minerais-N,P,Mg,Mn,Zn

Fermentação rápida (6-10 h)

Pressão osmótica (sais, açúcar)

Etanol (7-11%)

Acidez (pH=1.8-2.5)

Temperatura (32 - 40oC)

Contaminação bacteriana

Sulfito, Alumínio, excesso K, Ca, etc

FATORES ESTRESSANTES

ADPADP

TEMPERATURA ETANOL

SULFITO = S02

GLICEROL

K+, Ca++

AÇÚCAR

ÁGUADESN.PROTEINAS

H2SO3HSO3

-

H+

ATP

H+

AC. ORGÂNICOS

CH3COOH H+

CH3COO-COOH

CHOH

CH3

COO-

CHOH

CH3+ H+

CONT. BACTERIANA = ACIDOS .ACÉTICO E LÁTICOAl+3

ATP-Mg

ATP-Al

H2SO4

SO4-2

+ 2 H+

PRESSÃO OSMÓTICA

ADP

A ESTEQUIOMETRIA DA FERMENTAÇÃO

Açúcar

da cana

ETANOL E CO2: 80-90% DO AÇÚCAR

BIOMASSA

GLICEROL

ÁCIDOS ORGÂNICOS

OUTROS SUBPRODUTOS

AÇÚCAR RESIDUAL

1% NO RENDIMENTO EM ALCOOL TEM GRANDE IMPACTO NO LUCRO !

10-20%

BALANÇO DE MASSA(EM ANAEROBIOSE)

OUTROS SUBPRODUTOS

% DO ART CONSUMIDOPRODUTOS DAFERMENTAÇÃO

84-92

1 - 52 - 9

0,3 - 1,20,1 - 0,70,1 - 0,4

ETANOLGÁS CARBÔNICOBIOMASSAGLICEROLAC. SUCCÍNICOAC. ACÉTICOÓLEO FUSEL

< 0,1OUTROSPara um consumo total do açúcar pela levedura

GANHOS EM PRODUTIVIDADE

VARIEDADES DE CANA E MELHORES PRÁTICAS AGRÍCOLAS

MELHOR ENGENHARIA DO PROCESSO

MELHOR ASSEPSIA

NUTRIÇÃO DA LEVEDURA

LINHAGENS DE LEVEDURAS

LINHAGENS TRADICIONALMENTE EMPREGADAS (1987)

HAVERIA NECESSIDADE DE NOVAS LINHAGENS ????

IZ-1904

TA (M300-A)

PANIFICAÇÃO

LEVEDURAS INDUSTRIAIS1987: 1ª avaliação com reciclos

9407TREALOSE (%) 3

169716GLICOGÊNIO (%) 3

97482880VIABILIDADE (%) 3

4935-1041TAXA CRESCIMENTO (%) 2

3,75,75,14,6GLICEROL (%) 1

93,289,590,088,8REND. ETANOL (%) 1

PE-2FLIZ-1904FL

21% ART A 33 0C17% ART A 30 0CPARÂMETROS AVALIADOS

07TREALOSE (%) 3716GLICOGÊNIO (%) 3

2880VIABILIDADE (%) 3

-1041TAXA CRESCIM. (%) 25,14,6GLICEROL (%) 1

90,088,8REND. ETANOL (%) 1IZ-1904

7-8%EtOH A 30 0CPARÂMETROSAVALIADOS

1 – Fração do açúcar metabolizado transformado em etanol ou glicerol

2 – Taxa de crescimento da levedura no transcorrer de 6 ciclos

3 – Valores referentes à levedura do 60 ciclo fermentativo

COERÊNCIA

SOBREVIVERIA AO ESTRESSE INDUSTRIAL?

PAN/TA

LEVEDURAS INDUSTRIAIS1987: 1ª avaliação com reciclos

9407TREALOSE (%) 3

169716GLICOGÊNIO (%) 3

97482880VIABILIDADE (%) 3

4935-1041TAXA CRESCIMENTO (%) 2

3,75,75,14,6GLICEROL (%) 1

93,289,590,088,8REND. ETANOL (%) 1

PE-2FLIZ-1904FL

21% ART A 33 0C17% ART A 30 0CPARÂMETROS AVALIADOS

07TREALOSE (%) 3716GLICOGÊNIO (%) 3

2880VIABILIDADE (%) 3

-1041TAXA CRESCIM. (%) 25,14,6GLICEROL (%) 1

90,088,8REND. ETANOL (%) 1IZ-1904

7-8%EtOH A 30 0CPARÂMETROSAVALIADOS

1 – Fração do açúcar metabolizado transformado em etanol ou glicerol

2 – Taxa de crescimento da levedura no transcorrer de 6 ciclos

3 – Valores referentes à levedura do 60 ciclo fermentativo

COERÊNCIA

SOBREVIVERIA AO ESTRESSE INDUSTRIAL?

PAN/TA

Colonias individuais DNA intacto

+

Eletroforese

IZME1ME3MA4

SABG

PE

VR1VR2

CR

TA

-

A CARIOTIPAGEM E A QUEBRA DE UM PARADIGMA (1989)

SURPRESAS INICIAIS PERMANÊNCIA DAS LINHAGENS NO PROCESSO

LEVEDURAS /SAFRA (DESTIL.)

SAFRA 91/92 (3)

SAFRA 92/93 (6)

SAFRA 93/94 (9)

PAN - 20-30 30-40

TA 30-40 15-40 30-40

NF (Canadá) 30 - -JA-1 - >150 >100

JA-1 –Colônia isolada no final da safras anteriores pela propria destilaria (Jardest)!

DIAS DE PROCESSO

AVALIAÇÃO DE LINHAGENS ISOLADAS DE PROCESSO

PARÂMETRO* TA JA-1 SA-1 RENDIMENTO(%) 86,8 87,3 88,0 GLICEROL(%ART) 4,49 3,98 3,71 TAXA CRESC.(%) 44 44 45

VIABILIDADEFINAL(%) 76 91 93

1993

6 CICLOS FERMENTATIVOS

IMPLANTAÇÃO DAS LINHAGENS SELECIONADAS

SAFRA 94/95 – 25 DESTILARIAS

LEVEDURA(No DEST.)

SA-1(20)

CR-1(20)

JA-1(20)

FL/IT(5)

TAXA PERMA-NÊNCIA (%) 48 25 5 0

TAXA DOMI-NÂNCIA (%) 41 14 10 0

45

GRANDE BIODIVERSIDADE(SUCESSÃO DE DIFERENTES LINHAGENS)

DEST. A 27/07/04

STRAINS DOMINANTES E PERSISTENTES

DOMINÂNCIA = COMPETITIVIDADE PERSISTÊNCIA = MÚLTIPLA TOLERÂNCIA

DESTILARIA B 31/08/04

O PROCESSO INDUSTRIAL COMO FONTE DE LINHAGENS APROPRIADAS• GRANDE BIODIVERSIDADE• LINHAGENS PERSISTENTES (TOLERANTES ?)• LINHAGENS DOMINANTES (COMPETITIVAS ?)• POUCAS LINHAGENS DOMINANTES E PERSISTENTES

PRESSÃO SELETIVA DO PROCESSO COM RECICLO DE CÉLULAS

SELEÇÃO OU ADAPTAÇÃO EVOLUTIVA LEVANDO A LINHAGENS COM TOLERÂNCIA A

VÁRIOS TIPOS DE ESTRESSE, MESMO DESCONHECIDOS

2 CICLOS/DIA 200-250 DIAS

RESISTENTES, MAS

NÃO NECESSARIAMENTE

COM BONS ATRIBUTOS

FERMENTATIVOS

COM PROBLEMAS SEM PROBLEMAS

A MAIORIA DAS LINHAGENS SÃO IMPRÓPRIAS PARA A FERMENTAÇÃO

INDUSTRIAL

15%

85%

ESPUMA

FLOCULAÇÃO

SOBRA DE ART

PRIMEIRO PASSO: ESPUMA, FLOCULAÇÃO E AÇÚCAR RESIDUAL

ESPUMA E FLOCULAÇÃOESPUMASUSPENSÃO

HOMOGENEA

AÇÚCAR RESIDUAL

SEGUNDO PASSO: DESEMPENHO

FERMENTATIVO• Rendimento em etanol

• Produção de glicerol

• Taxa de crescimento

• Velocidade de fermentação

• Manutenção de alta viabilidade durante reciclos (altos conteúdos celulares de glicogênio e trealose)

FERMENTAÇÕES COM RECICLO SIMULANDO O PROCESSO INDUSTRIAL

PARÂMETROS FERMENTATIVOS PANIFIC. PE-2

RENDIMENTO EM ETANOL (%) 89 93GLICEROL (%) 5.7 3.7TAXA DE CRESCIMENTO (%) 5.8 8.2VIABILIDADE (%) 48 97GLYCOGENIO CELULAR (%MS) 9 16TREALOSE CELULAR (%MS) 4 9

6 CICLOS FERMENTATIVOS A 33oC, 9% ETANOL

DESEMPENHO FERMENTATIVO

SA-1

3o PASSO: REINTRODUÇÃO NO PROCESSO INDUSTRIAL

• PROPAGAÇÃO DAS LINHAGENS SELECIONADAS

• INTRODUÇÃO EM VÁRIAS DESTILARIAS (EM ATÉ 70 EM 11 ANOS/SAFRAS)

• MONITORAMENTO PELA CARIOTIPAGEM (AMOSTRAS MENSAIS)

• PERSISTÊNCIA • DOMINÂNCIA

CAPACIDADE DE IMPLANTAÇÃO

REINTRODUÇÃO NO PROCESSO INDUSTRIAL

LINHAGENS INTRODUZIDAS(DESTILARIA A – SAFRA 95)

KG

PANIFICAÇÃO 10.000

PE-2 0,5

VR-1 0,5

SA-1 0,5

MONITORAMENTO PELA CARIOTIPAGEM –DINÂMICA POPULACIONAL

PRO

POR

ÇÃ

O

10 25 70 155 190DIAS

0%

20%

40%

60%

80%

100%

PAN PE-2 SA VR-1

MONITORAMENTO EM 24-70 DESTILARIAS DURANTE 11 ANOS (1995-2006)

CAPACIDADE DE IMPLANTAÇÃO

LINHAGEM INTRODUZIDA

DESTILARIAS COM A LINHAGEM (%)

PROPORÇÃO DA LINHAGEM (%)

PE-2 58 54BG-1 42 65CAT-1 51 45SA-1 32 44VR-1 25 15CR-1 17 6OTHERS* 0 0

* PANIFIC., VINHO, CERVEJARIA, Y-904, IZ-1904, TA, NF, M-26, ETC.

40% DAS DESTILARIAS OPERAM COM LINHAGENS INDÍGENAS !

BENEFICIOS DAS LEVEDURAS

SELECIONADAS

• MAIOR RENDIMENTO EM ETANOL

• MENOR FORMAÇÃO DE ESPUMAS

• MENOR FLOCULAÇÃO

A SELEÇÃO PODERIA SER DIRECIONADA TAMBÉM PARA A REDUÇÃO DA CONTAMINAÇAO

BACTERIANA?• MAIOR RENDIMENTO EM ETANOL

• MENOR FORMAÇÃO DE ESPUMAS

• MENOR FLOCULAÇÃO

• AÇÃO ANTIBACTERIANA ?

LEVEDURAS COM ATIVIDADE ANTIBACTERIANA

• Produzir algum inibidor?• Reduzir os alimentos requeridos pela bactéria?• Leveduras geneticamente modificadas (lisozima,

nisina, pediocina...)• Etc...

QUE ATRIBUTOS PODERIAM SER CONSIDERADOS?

RELAÇÕES TRÓFICAS ENTRE LEVEDURAS E BACTÉRIAS

REDUÇÃO DO RENDIMENTO EM ETANOL-METABÓLITOS BACTERIANOS

-BIOMASSA BACTERIANA

-MAIOR PRODUÇÃO DE GLICEROL PELA LEVEDURA

REDUÇÃO DA VIABILIDADADE DA LEVEDURA

FLOCULAÇÃO

ESPUMA

Antagonismo entre leveduras e bactérias

C6H12O6

COOH

CH2

CH2

COOH

GLICEROL

10 H++10 e-

CO225

1+

Ácidos lático e acético

levedura

bactéria

ácido succínico

ÁCIDO SUCCÍNICO X CONTAMINAÇÃOBACTERIANACONTAMINAÇAO

(cel/mL x 10>6)

1 2 3 4 5 6CICLOS

0

10

20

30

40

50

60

M-26 PE-2 M-26: 46% a mais que PE-2

Cherubin (2003)

Oliva Neto (2006)

QUAIS SERIAM OS SUBSTRATOS PARAAS BACTÉRIAS ?CINETICA FERMENTAÇAO

(4 HORAS DE ALIMENTAÇAO)

0 2 4 6 8HORAS

0

1

2

3

4

0

3

6

9

12

GLIC FRUT SAC ETANOL

A ATIVIDADE DA INVERTASE É MAIOR QUE A VELOCIDADE DE ABSORÇÃO DA GLICOSE E

FRUTOSE PELA LEVEDURA

OH2O

+INVERTASE

SACAROSE

GLICOSE

Açúcares absorvidos pela levedura com preferencia pela glicose

FRUTOSE

Não é absorvida pela levedura

Ácido Lático

Açúcares Açúcares

Ácido Lático

Ácido Acético

Etanol

CO2

Manitol

Lactobacilos: tipos de metabolismo

Homo-fermentativa Hetero-fermentativa

Gallo, 1989; Costa et al. (2008)

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

tempo (horas)

Açú

care

s (%

)

Glicose Frutose

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

tempo (horas)

Açú

care

s (%

)

Glicose Frutose

Consumo de glicose e frutose por Lactobacilosisolados de destilarias

Homo-fermentativo Hetero-fermentativo

A bactéria hetero-fermentativa tem preferência pela frutose

A FERMENTAÇÃO FAVORECEO CRESCIMENTO DO TIPO HETEROFERMENTATIVO

CINETICA FERMENTAÇAO

(4 HORAS DE ALIMENTAÇAO)

0 2 4 6 8HORAS

0

1

2

3

4

0

3

6

9

12

GLIC FRUT SAC ETANOL

3 X mais frutose

Fermentação contaminada com bactériashomo- e heterofermentativa

BACTERIAS

(Cel/mL x 10e7)

1 2 3 4 5CICLOS

0

10

20

30

40

50

S/ BACT HOMO HETERO

Poucas diferenças nos níveis deacido láticoACIDO LATICO

(mg/L)

1 2 3 4 5CICLOS

0

800

1600

2400

3200

4000

S/ BACT HOMO HETERO

A bactéria hetero-fermentativaproduz mais ácido acético

ACIDO ACETICO

(mg/L)

1 2 3 4 5CICLOS

0

600

1200

1800

S/ BACT HOMO HETERO

A bactéria hetero-fermentativa afeta mais a viabilidade da levedura

VIABILIDADE

(%)

1 2 3 4 5CICLOS

70

80

90

100

S/ BACT HOMO HETERO

Somente a bactéria hetero-fermentativaproduz manitol

MANITOL

(mg/L)

1 2 3 4 5CICLOS

0

500

1000

1500

2000

S/ BACT HOMO HETERO

Apenas a bactéria hetero-fermentativainduz maior formação de glicerol

GLICEROL

(%)

1 2 3 4 5CICLOS

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

S/ BACT HOMO HETERO

A bactéria hetero-fermentativaafeta mais o rendimento

RENDIMENTO

(%)

1 2 3 4 5CICLOS

82

84

86

88

90

92

S/ BACT HOMO HETERO

Haveria necessidade de combater todos os tipos de lactobacilos?

Como avaliar os antibacterianos (homo- e hetero)?

PODEMOS REDUZIR O CRESCIMENTOBACTERIANO ?

REDUZINDO OS ALIMENTOS PARA AS BACTÉRIAS:

AÇÚCARES

AMINOÁCIDOS E VITAMINAS (MOSTO E LEVEDURAS MORTAS)

A CONTAMINAÇÃO BACTERIANA

SELEÇÃO DE LEVEDURAS PARA METABOLIZAÇÃO MAIS RÁPIDA DOS AÇÚCARES

As leveduras selecionadas colaboram para reduzir os custos de produção do etanol

Novas e mais apropriadas linhagens ainda podem ser selecionadas a partir da biodiversidade encontrada nas destilarias (processos diferentes, diferentes linhagens)

Os lactobacilus hetero-fermentativos se mostram mais perniciosos para a fermentação em relação aos do tipo homo-fermentativo

Novas linhagens com características antibacterianas poderão ser isoladas (baixos teores de açúcar durante a fermentação)

Considerações finais

LUIZ CARLOS BASSO

lucbasso@esalq.usp.br

OBRIGADO PELA ATENÇÃO !