A FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA: ALGUNS ASPECTOS BIOQUÍMICOS,
FISIOLÓGICOS E MICROBIOLÓGICOS
LUIZ CARLOS BASSODEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS ESALQ/USP
V SEMANA DE FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA, Piracicaba 19/20- 5-2011
CONTEÚDO DA APRESENTAÇÃO
• O PROCESSO INDUSTRIAL E OS ESTRESSES IMPOSTOS À LEVEDURA
• SELEÇÃO DE LEVEDURAS E SEU BENEFÍCIO PARA A FERMENTAÇÃO INDUSTRIAL
• REDUÇÃO DA CONTAMINAÇÃO BACTERIANA: ALTERNATIVAS RELACIONADAS COM AS LEVEDURAS
• A DIVERSIDADE DOS LACTOBACILLUS E ESTRATÉGIA PARA O CONTROLE DAS BACTÉRIAS
• CONSIDERAÇÕES FINAIS
PORQUE A LEVEDURA TRANSFORMA O AÇÚCAR EM ETANOL?
AÇUCAR (100g)
ETANOL+ CO2 = 90%
ATP
CARBONOBIOMASSA
(5%)
OUTROS = 5%
HEXOSE
ETANOL
PIRUVATOGLICEROL
CO2
+
SACAROSE
FRUTOSE GLICOSE
ETANOL
TREALOSE E
GLICOGÊNIO
ATP
AC.ORGÂNICOS
AMINOÁCIDOS
PROTEINAS
BIOMASSA
AC.ORGÂNICOS : SUCCÍNICO, MÁLICO, PIRÚVICO
K+
Mg++
Zn++
P
K+
NH4+
NH4+
A FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA
O PROCESSO FERMENTATIVO COM RECICLO DE CÉLULAS
MOSTO
CREME
DORNA
CUBA
VINHO
ÁCIDO
pH=1.8-2.5
2-5 horas
32-40oC
6-10 horas
7-14% cels
pH=3.7-4.5
7-11%EtOH
CENTRÍFUGAPé de cuba
O SUBSTRATO: CALDO DE CANA E MELAÇO
CANAEXTRAÇÃO
CALDO (16-20% AT)
CONCENTRAÇÃO (EVAPORAÇÃO)
SACAROSE (CRISTAIS)
MELAÇO (50-60% AT)
AGUA
SUBSTRATO(18-20%AT)
BAGAÇO
FATORES LIMITANTES DA PRODUTIVIDADE
Alta densidade de células (10-14%) : deficiências minerais-N,P,Mg,Mn,Zn
Fermentação rápida (6-10 h)
Pressão osmótica (sais, açúcar)
Etanol (7-11%)
Acidez (pH=1.8-2.5)
Temperatura (32 - 40oC)
Contaminação bacteriana
Sulfito, Alumínio, excesso K, Ca, etc
FATORES ESTRESSANTES
ADPADP
TEMPERATURA ETANOL
SULFITO = S02
GLICEROL
K+, Ca++
AÇÚCAR
ÁGUADESN.PROTEINAS
H2SO3HSO3
-
H+
ATP
H+
AC. ORGÂNICOS
CH3COOH H+
CH3COO-COOH
CHOH
CH3
COO-
CHOH
CH3+ H+
CONT. BACTERIANA = ACIDOS .ACÉTICO E LÁTICOAl+3
ATP-Mg
ATP-Al
H2SO4
SO4-2
+ 2 H+
PRESSÃO OSMÓTICA
ADP
A ESTEQUIOMETRIA DA FERMENTAÇÃO
Açúcar
da cana
ETANOL E CO2: 80-90% DO AÇÚCAR
BIOMASSA
GLICEROL
ÁCIDOS ORGÂNICOS
OUTROS SUBPRODUTOS
AÇÚCAR RESIDUAL
1% NO RENDIMENTO EM ALCOOL TEM GRANDE IMPACTO NO LUCRO !
10-20%
BALANÇO DE MASSA(EM ANAEROBIOSE)
OUTROS SUBPRODUTOS
% DO ART CONSUMIDOPRODUTOS DAFERMENTAÇÃO
84-92
1 - 52 - 9
0,3 - 1,20,1 - 0,70,1 - 0,4
ETANOLGÁS CARBÔNICOBIOMASSAGLICEROLAC. SUCCÍNICOAC. ACÉTICOÓLEO FUSEL
< 0,1OUTROSPara um consumo total do açúcar pela levedura
GANHOS EM PRODUTIVIDADE
VARIEDADES DE CANA E MELHORES PRÁTICAS AGRÍCOLAS
MELHOR ENGENHARIA DO PROCESSO
MELHOR ASSEPSIA
NUTRIÇÃO DA LEVEDURA
LINHAGENS DE LEVEDURAS
LINHAGENS TRADICIONALMENTE EMPREGADAS (1987)
HAVERIA NECESSIDADE DE NOVAS LINHAGENS ????
IZ-1904
TA (M300-A)
PANIFICAÇÃO
LEVEDURAS INDUSTRIAIS1987: 1ª avaliação com reciclos
9407TREALOSE (%) 3
169716GLICOGÊNIO (%) 3
97482880VIABILIDADE (%) 3
4935-1041TAXA CRESCIMENTO (%) 2
3,75,75,14,6GLICEROL (%) 1
93,289,590,088,8REND. ETANOL (%) 1
PE-2FLIZ-1904FL
21% ART A 33 0C17% ART A 30 0CPARÂMETROS AVALIADOS
07TREALOSE (%) 3716GLICOGÊNIO (%) 3
2880VIABILIDADE (%) 3
-1041TAXA CRESCIM. (%) 25,14,6GLICEROL (%) 1
90,088,8REND. ETANOL (%) 1IZ-1904
7-8%EtOH A 30 0CPARÂMETROSAVALIADOS
1 – Fração do açúcar metabolizado transformado em etanol ou glicerol
2 – Taxa de crescimento da levedura no transcorrer de 6 ciclos
3 – Valores referentes à levedura do 60 ciclo fermentativo
COERÊNCIA
SOBREVIVERIA AO ESTRESSE INDUSTRIAL?
PAN/TA
LEVEDURAS INDUSTRIAIS1987: 1ª avaliação com reciclos
9407TREALOSE (%) 3
169716GLICOGÊNIO (%) 3
97482880VIABILIDADE (%) 3
4935-1041TAXA CRESCIMENTO (%) 2
3,75,75,14,6GLICEROL (%) 1
93,289,590,088,8REND. ETANOL (%) 1
PE-2FLIZ-1904FL
21% ART A 33 0C17% ART A 30 0CPARÂMETROS AVALIADOS
07TREALOSE (%) 3716GLICOGÊNIO (%) 3
2880VIABILIDADE (%) 3
-1041TAXA CRESCIM. (%) 25,14,6GLICEROL (%) 1
90,088,8REND. ETANOL (%) 1IZ-1904
7-8%EtOH A 30 0CPARÂMETROSAVALIADOS
1 – Fração do açúcar metabolizado transformado em etanol ou glicerol
2 – Taxa de crescimento da levedura no transcorrer de 6 ciclos
3 – Valores referentes à levedura do 60 ciclo fermentativo
COERÊNCIA
SOBREVIVERIA AO ESTRESSE INDUSTRIAL?
PAN/TA
Colonias individuais DNA intacto
+
Eletroforese
IZME1ME3MA4
SABG
PE
VR1VR2
CR
TA
-
A CARIOTIPAGEM E A QUEBRA DE UM PARADIGMA (1989)
SURPRESAS INICIAIS PERMANÊNCIA DAS LINHAGENS NO PROCESSO
LEVEDURAS /SAFRA (DESTIL.)
SAFRA 91/92 (3)
SAFRA 92/93 (6)
SAFRA 93/94 (9)
PAN - 20-30 30-40
TA 30-40 15-40 30-40
NF (Canadá) 30 - -JA-1 - >150 >100
JA-1 –Colônia isolada no final da safras anteriores pela propria destilaria (Jardest)!
DIAS DE PROCESSO
AVALIAÇÃO DE LINHAGENS ISOLADAS DE PROCESSO
PARÂMETRO* TA JA-1 SA-1 RENDIMENTO(%) 86,8 87,3 88,0 GLICEROL(%ART) 4,49 3,98 3,71 TAXA CRESC.(%) 44 44 45
VIABILIDADEFINAL(%) 76 91 93
1993
6 CICLOS FERMENTATIVOS
IMPLANTAÇÃO DAS LINHAGENS SELECIONADAS
SAFRA 94/95 – 25 DESTILARIAS
LEVEDURA(No DEST.)
SA-1(20)
CR-1(20)
JA-1(20)
FL/IT(5)
TAXA PERMA-NÊNCIA (%) 48 25 5 0
TAXA DOMI-NÂNCIA (%) 41 14 10 0
45
STRAINS DOMINANTES E PERSISTENTES
DOMINÂNCIA = COMPETITIVIDADE PERSISTÊNCIA = MÚLTIPLA TOLERÂNCIA
DESTILARIA B 31/08/04
O PROCESSO INDUSTRIAL COMO FONTE DE LINHAGENS APROPRIADAS• GRANDE BIODIVERSIDADE• LINHAGENS PERSISTENTES (TOLERANTES ?)• LINHAGENS DOMINANTES (COMPETITIVAS ?)• POUCAS LINHAGENS DOMINANTES E PERSISTENTES
PRESSÃO SELETIVA DO PROCESSO COM RECICLO DE CÉLULAS
SELEÇÃO OU ADAPTAÇÃO EVOLUTIVA LEVANDO A LINHAGENS COM TOLERÂNCIA A
VÁRIOS TIPOS DE ESTRESSE, MESMO DESCONHECIDOS
2 CICLOS/DIA 200-250 DIAS
RESISTENTES, MAS
NÃO NECESSARIAMENTE
COM BONS ATRIBUTOS
FERMENTATIVOS
COM PROBLEMAS SEM PROBLEMAS
A MAIORIA DAS LINHAGENS SÃO IMPRÓPRIAS PARA A FERMENTAÇÃO
INDUSTRIAL
15%
85%
ESPUMA
FLOCULAÇÃO
SOBRA DE ART
PRIMEIRO PASSO: ESPUMA, FLOCULAÇÃO E AÇÚCAR RESIDUAL
ESPUMA E FLOCULAÇÃOESPUMASUSPENSÃO
HOMOGENEA
AÇÚCAR RESIDUAL
SEGUNDO PASSO: DESEMPENHO
FERMENTATIVO• Rendimento em etanol
• Produção de glicerol
• Taxa de crescimento
• Velocidade de fermentação
• Manutenção de alta viabilidade durante reciclos (altos conteúdos celulares de glicogênio e trealose)
FERMENTAÇÕES COM RECICLO SIMULANDO O PROCESSO INDUSTRIAL
PARÂMETROS FERMENTATIVOS PANIFIC. PE-2
RENDIMENTO EM ETANOL (%) 89 93GLICEROL (%) 5.7 3.7TAXA DE CRESCIMENTO (%) 5.8 8.2VIABILIDADE (%) 48 97GLYCOGENIO CELULAR (%MS) 9 16TREALOSE CELULAR (%MS) 4 9
6 CICLOS FERMENTATIVOS A 33oC, 9% ETANOL
DESEMPENHO FERMENTATIVO
SA-1
3o PASSO: REINTRODUÇÃO NO PROCESSO INDUSTRIAL
• PROPAGAÇÃO DAS LINHAGENS SELECIONADAS
• INTRODUÇÃO EM VÁRIAS DESTILARIAS (EM ATÉ 70 EM 11 ANOS/SAFRAS)
• MONITORAMENTO PELA CARIOTIPAGEM (AMOSTRAS MENSAIS)
• PERSISTÊNCIA • DOMINÂNCIA
CAPACIDADE DE IMPLANTAÇÃO
REINTRODUÇÃO NO PROCESSO INDUSTRIAL
LINHAGENS INTRODUZIDAS(DESTILARIA A – SAFRA 95)
KG
PANIFICAÇÃO 10.000
PE-2 0,5
VR-1 0,5
SA-1 0,5
MONITORAMENTO PELA CARIOTIPAGEM –DINÂMICA POPULACIONAL
PRO
POR
ÇÃ
O
10 25 70 155 190DIAS
0%
20%
40%
60%
80%
100%
PAN PE-2 SA VR-1
MONITORAMENTO EM 24-70 DESTILARIAS DURANTE 11 ANOS (1995-2006)
CAPACIDADE DE IMPLANTAÇÃO
LINHAGEM INTRODUZIDA
DESTILARIAS COM A LINHAGEM (%)
PROPORÇÃO DA LINHAGEM (%)
PE-2 58 54BG-1 42 65CAT-1 51 45SA-1 32 44VR-1 25 15CR-1 17 6OTHERS* 0 0
* PANIFIC., VINHO, CERVEJARIA, Y-904, IZ-1904, TA, NF, M-26, ETC.
40% DAS DESTILARIAS OPERAM COM LINHAGENS INDÍGENAS !
BENEFICIOS DAS LEVEDURAS
SELECIONADAS
• MAIOR RENDIMENTO EM ETANOL
• MENOR FORMAÇÃO DE ESPUMAS
• MENOR FLOCULAÇÃO
A SELEÇÃO PODERIA SER DIRECIONADA TAMBÉM PARA A REDUÇÃO DA CONTAMINAÇAO
BACTERIANA?• MAIOR RENDIMENTO EM ETANOL
• MENOR FORMAÇÃO DE ESPUMAS
• MENOR FLOCULAÇÃO
• AÇÃO ANTIBACTERIANA ?
LEVEDURAS COM ATIVIDADE ANTIBACTERIANA
• Produzir algum inibidor?• Reduzir os alimentos requeridos pela bactéria?• Leveduras geneticamente modificadas (lisozima,
nisina, pediocina...)• Etc...
QUE ATRIBUTOS PODERIAM SER CONSIDERADOS?
RELAÇÕES TRÓFICAS ENTRE LEVEDURAS E BACTÉRIAS
REDUÇÃO DO RENDIMENTO EM ETANOL-METABÓLITOS BACTERIANOS
-BIOMASSA BACTERIANA
-MAIOR PRODUÇÃO DE GLICEROL PELA LEVEDURA
REDUÇÃO DA VIABILIDADADE DA LEVEDURA
FLOCULAÇÃO
ESPUMA
Antagonismo entre leveduras e bactérias
C6H12O6
COOH
CH2
CH2
COOH
GLICEROL
10 H++10 e-
CO225
1+
Ácidos lático e acético
levedura
bactéria
ácido succínico
ÁCIDO SUCCÍNICO X CONTAMINAÇÃOBACTERIANACONTAMINAÇAO
(cel/mL x 10>6)
1 2 3 4 5 6CICLOS
0
10
20
30
40
50
60
M-26 PE-2 M-26: 46% a mais que PE-2
Cherubin (2003)
Oliva Neto (2006)
QUAIS SERIAM OS SUBSTRATOS PARAAS BACTÉRIAS ?CINETICA FERMENTAÇAO
(4 HORAS DE ALIMENTAÇAO)
0 2 4 6 8HORAS
0
1
2
3
4
0
3
6
9
12
GLIC FRUT SAC ETANOL
A ATIVIDADE DA INVERTASE É MAIOR QUE A VELOCIDADE DE ABSORÇÃO DA GLICOSE E
FRUTOSE PELA LEVEDURA
OH2O
+INVERTASE
SACAROSE
GLICOSE
Açúcares absorvidos pela levedura com preferencia pela glicose
FRUTOSE
Não é absorvida pela levedura
Ácido Lático
Açúcares Açúcares
Ácido Lático
Ácido Acético
Etanol
CO2
Manitol
Lactobacilos: tipos de metabolismo
Homo-fermentativa Hetero-fermentativa
Gallo, 1989; Costa et al. (2008)
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
tempo (horas)
Açú
care
s (%
)
Glicose Frutose
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
tempo (horas)
Açú
care
s (%
)
Glicose Frutose
Consumo de glicose e frutose por Lactobacilosisolados de destilarias
Homo-fermentativo Hetero-fermentativo
A bactéria hetero-fermentativa tem preferência pela frutose
A FERMENTAÇÃO FAVORECEO CRESCIMENTO DO TIPO HETEROFERMENTATIVO
CINETICA FERMENTAÇAO
(4 HORAS DE ALIMENTAÇAO)
0 2 4 6 8HORAS
0
1
2
3
4
0
3
6
9
12
GLIC FRUT SAC ETANOL
3 X mais frutose
Fermentação contaminada com bactériashomo- e heterofermentativa
BACTERIAS
(Cel/mL x 10e7)
1 2 3 4 5CICLOS
0
10
20
30
40
50
S/ BACT HOMO HETERO
Poucas diferenças nos níveis deacido láticoACIDO LATICO
(mg/L)
1 2 3 4 5CICLOS
0
800
1600
2400
3200
4000
S/ BACT HOMO HETERO
A bactéria hetero-fermentativaproduz mais ácido acético
ACIDO ACETICO
(mg/L)
1 2 3 4 5CICLOS
0
600
1200
1800
S/ BACT HOMO HETERO
A bactéria hetero-fermentativa afeta mais a viabilidade da levedura
VIABILIDADE
(%)
1 2 3 4 5CICLOS
70
80
90
100
S/ BACT HOMO HETERO
Somente a bactéria hetero-fermentativaproduz manitol
MANITOL
(mg/L)
1 2 3 4 5CICLOS
0
500
1000
1500
2000
S/ BACT HOMO HETERO
Apenas a bactéria hetero-fermentativainduz maior formação de glicerol
GLICEROL
(%)
1 2 3 4 5CICLOS
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
S/ BACT HOMO HETERO
A bactéria hetero-fermentativaafeta mais o rendimento
RENDIMENTO
(%)
1 2 3 4 5CICLOS
82
84
86
88
90
92
S/ BACT HOMO HETERO
Haveria necessidade de combater todos os tipos de lactobacilos?
Como avaliar os antibacterianos (homo- e hetero)?
PODEMOS REDUZIR O CRESCIMENTOBACTERIANO ?
REDUZINDO OS ALIMENTOS PARA AS BACTÉRIAS:
AÇÚCARES
AMINOÁCIDOS E VITAMINAS (MOSTO E LEVEDURAS MORTAS)
As leveduras selecionadas colaboram para reduzir os custos de produção do etanol
Novas e mais apropriadas linhagens ainda podem ser selecionadas a partir da biodiversidade encontrada nas destilarias (processos diferentes, diferentes linhagens)
Os lactobacilus hetero-fermentativos se mostram mais perniciosos para a fermentação em relação aos do tipo homo-fermentativo
Novas linhagens com características antibacterianas poderão ser isoladas (baixos teores de açúcar durante a fermentação)
Considerações finais