A diferença de média de hiperplasia mio-intimal pós-angioplastia na artéria ilíaca externa de

coelhos com aterosclerose induzida e tratados com Allium sativum comparados aos tratados

com Cilostazol

 

2013    

Paulo Roberto da Silva Lima

Maceió

Doutorado  Renorbio  

1. Introdução 1.1. Contexto

A hiperplasia da íntima: Migração e proliferação de células musculares lisas vasculares Remodelagem desse novo tecido (Davies, 2007)

É reversível apenas na primeira e segunda semanas após o trauma vascular (Li, 1999; Sterpetti, 1996)  Davies MG. Hiperplasia da íntima: Resposta básica à lesão e reconstrução do enxerto arterial e venoso. In: Rutherford RB, editor. Cirurgia

Vascular. 6a ed. Rio de Janeiro: DiLivros; 2007;149-72. Li JM, Brooks G. Cell cycle regulatory molecules (cyclins, cyclin-dependent kinases and cyclin-dependent kinase inhibitors) and the cardiovascular

system; potential targets for therapy? Eur Heart J. 1999 Mar;20(6):406-20. Review. PubMed PMID: 10213344. Sterpetti AV, Cucina A, Lepidi S, Randone B, Stipa F, Aromatario C, Travi D, D'Angelo LS, Cavallaro A, Stipa S. Progression and regression of

myointimal hyperplasia in experimental vein grafts depends on platelet-derived growth factor and basic fibroblastic growth factor production. J Vasc Surg. 1996 Apr;23(4):568-75. PubMed PMID: 8627890.

2  

•  A radiação ionizante é eficaz (Costa, 2002; Ducasse, 2006)

•  O paclitaxel reduz a hiperplasia da íntima (Park, 2003; Shafiq, 2005)

Costa R, Fagundes D. Modelos experimentais de hiperplasia intimal: efeitos da radiação ionizante. Acta Cir Bras. 2002 May;17(3).

Ducasse E, Chevalier J, Cosset JM, Creusy C, Eschwege F, Speziale F, Sbarigia E, Midy D, Baste JC, Lartigau E. Ionizing radiation to prevent arterial intimal hyperplasia at the edges of the stent: induces necrosis and fibrosis. J

Surg Res. 2006 Oct;135(2):331-6. Epub 2006 May 22. PubMed PMID: 16716353. Park SJ, Shim WH, Ho DS, Raizner AE, Park SW, Hong MK, Lee CW, Choi D, Jang Y, Lam R, Weissman NJ, Mintz GS. A paclitaxel-eluting stent for the prevention of coronary restenosis. N Engl J Med. 2003 Apr 17;348(16):1537-45.

PubMed PMID:12700373. Shafiq N, Malhotra S, Pandhi P, Grover A, Uboweja A. A meta-analysis of clinical trials of paclitaxel- and sirolimus-

eluting stents in patients with obstructive coronary artery disease. Br J Clin Pharmacol. 2005 PubMed PMID 15606446; PubMed Central PMCID: PMC1884956.

3  

•  O cilostazol demonstrou ser eficaz na redução da hiperplasia da íntima (Tsai, 2008; Robertson, 2012) –  Tem ação antiplaquetária (Robertson, 2012;

Friedland, 2012) –  Inibe o acúmulo de triglicerídeos e colesterol na

parede arterial (Ito, 2012)

Tsai CS, Lin FY, Chen YH, Yang TL, Wang HJ, Huang GS, Lin CY, Tsai YT, Lin SJ, Li CY. Cilostazol attenuates MCP-1 and MMP-9 expression in vivo in LPS-administrated balloon-injured rabbit aorta and in

vitro in LPS-treated monocytic THP-1 cells. J Cell Biochem. 2008 Jan 1;103(1):54-66. PubMed PMID:17516547.

Robertson L, Ghouri MA, Kovacs F. Antiplatelet and anticoagulant drugs for prevention of restenosis/reocclusion following peripheral endovascular treatment. Cochrane Database Syst Rev. 2012 Aug

15;8:CD002071. Review. PubMed PMID: 22895926. Friedland SN, Eisenberg MJ, Shimony A. Meta-analysis of randomized controlled trials on effect of cilostazol

on restenosis rates and outcomes after percutaneous coronary intervention. Am J Cardiol. 2012 May 15;109(10):1397-404. Epub 2012 Feb 28. Review. PubMed PMID: 22381162.

Ito H, Uehara K, Matsumoto Y, Hashimoto A, Nagano C, Niimi M, Miyakoda G, Nagano K. Cilostazol inhibits accumulation of triglyceride in aorta and platelet aggregation in cholesterol-fed rabbits. PLoS One

2012;7(6):e39374. Epub 2012 Jun 22. PubMed PMID: 22761774; PubMed Central PMCID: PMC3382212 4  

•  Efeitos do Allium sativum (Efendy,1997; Srilatha, 1997; Borek, 2001; Campbell, 2001): – Anti-inflamatório – Hipocolesterolêmico – Anti-hipertensivo – Antitumoral

Efendy JL, Simmons DL, Campbell GR, Campbell JH. The effect of the aged garlic extract, 'Kyolic', on the development of experimental atherosclerosis. Atherosclerosis. 1997 Jul 11;132(1):37-42. PubMed PMID: 9247357.

Srilatha B, Adaikan PG, Ng SC, Aulkumaran S. Effects of feeding egg yolk on the serum lipid levels in rabbits. Methods Find Exp Clin Pharmacol. 1997 Sep;19(7):489-92. PubMed PMID: 9413832.

Borek C. Antioxidant health effects of aged garlic extract. J Nutr. 2001 Mar;131(3s):1010S-5S. Review. PubMed PMID: 11238807.

Campbell JH, Efendy JL, Smith NJ, Campbell GR. Molecular basis by which garlic suppresses atherosclerosis. J Nutr. 2001 Mar;131(3s):1006S-9S. PubMed PMID: 11238806.

5  

•  O Allium sativum é um produto seguro com DL 50 de 3034 mg/Kg (Mikail, 2010)

Mikail HG. Phytochemical screening, elemental analysis and acute toxicity of aqueous extract of Allium sativum L. bulbs in experimental rabbits. Journal of Medicinal Plants Research. 2010 Fev 18;4(4):322-6.

6  

Pergunta de pesquisa qual a diferença de média de hiperplasia mio-intimal pós-angioplastia na artéria ilíaca externa de coelhos com aterosclerose induzida tratados com Allium sativum comparados aos tratados com Cilostazol ?

1.2. Hipótese •  A hipótese é que o Allium sativum é mais eficaz na

redução da hiperplasia mio-intimal pós-angioplastia na artéria ilíaca externa de coelhos com aterosclerose induzida que os tratados com Cilostazol

1.3. Objetivo •  Determinar a diferença de média da hiperplasia mio-

intimal pós-angioplastia na artéria ilíaca externa de coelhos com aterosclerose induzida tratados com Allium sativum comparados aos tratados com Cilostazol

7  

2. Métodos Comitê de Ética em Pesquisa •  Aprovado no CEP/UNCISAL sob o nº 63-A em

19/11/2009 •  Aprovado no CEPA/LTF/UFPB sob o n˚ 0412/09 em

16/12/2009

2.1. Tipo de estudo •  Ensaio aleatório em animais de experimentação

2.2. Local •  Biotério do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica

(LTF) do Campus I da Universidade Federal da Paraíba,

João Pessoa, PB 8  

•  2.3. Amostra •  2.3.1. Critérios de inclusão •  Coelhos (Oryctolagus cuniculus) da raça Nova Zelândia com

aterosclerose induzida e submetidos à angioplastia da artéria ilíaca externa direita

•  2.3.2. Critérios de exclusão •  Morte antes da administração das drogas •  Machos •  Idade menor que 4 e maior que 6 meses

•  Peso corporal menor que 2 kg e maior que 5 kg de peso

•  Modificações na anatomia das estrutura a serem abordadas

•  Trombose

9  

•  2.3.3. Amostragem

•  Amostra probabilística por conveniência

•  2.3.4. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

•  Não se aplica, cabe apenas o CEPA

10  

2.4. Procedimentos

2.4.1. Grupos estudados

-  Grupo AS(Allium sativum) – tratados com 800 µg/kg de

Allium sativum por via oral por 35 dias (Efendy, 1997)

-  Grupo C (Cilostazol) – 50 mg/dia de cilostazol por via

oral por 35 dias (Tsai, 2008)

- Grupo SF (Soro Fisiológico) – tratados com solução

fisiológica com 10 mL/dia por via oral por 35 dias

Efendy JL, Simmons DL, Campbell GR, Campbell JH. The effect of the aged garlic extract, 'Kyolic', on the development of experimental atherosclerosis. Atherosclerosis. 1997 Jul 11;132(1):37-42. PubMed PMID: 9247357

Tsai CS, Lin FY, Chen YH, Yang TL, Wang HJ, Huang GS, Lin CY, Tsai YT, Lin SJ, Li CY. Cilostazol attenuates MCP-1 and MMP-9 expression in vivo in LPS-administrated balloon-injured rabbit aorta and in vitro in LPS-treated monocytic

THP-1 cells. J Cell Biochem. 2008 Jan 1;103(1):54-66. PubMed PMID: 17516547. 11  

Q  

Quarentena40  dias  

100  dias  

Angioplas>a  2  dias    

35  dias  

Dieta  hipercolesterolêmica  20ml/dia   A   Tratamento  

Cil,  SF,  Al   E  

T1  

   

T5  T4  T2   T3  T0  

Eutanásia  24h  

Microsphere Perfusion

The authors hypothesized that thewound healing response would havean immediate effect on the hindlimbvessel perfusion. The authors there-fore studied three animals in eachgroup on day 3 post-occlusion toquantify these effects. Microsphereanalysis was performed as previouslydescribed and validated (14). Briefly,2.5 ! 106 stable radiolabeled 15 !mmicrospheres (BioPhysics Assay Labo-ratory, Worcester, MA) were injected(1 mL) through a straight flush cathe-ter in the left ventricle just prior tosacrificing on day 3. Animals werethen sacrificed. The lateral head of thegastrocnemius and the soleus wereharvested from both hindlimbs in eachanimal. Three separate 1 g blocks fromeach muscle were submitted for mi-crosphere analysis and averagecounts/gram of tissue for each hind-limb was calculated. A 1 g specimenfrom the apex of the left ventricleserved as an internal control. Ratios ofleft and right hindlimb to left ventriclewere calculated from the raw data.

Clinical Assessment

All animals were clinically evalu-ated for muscle atrophy and distallimb necrosis on days 0, 3, 7, 14, and28. Muscle atrophy was evaluated bymeasurement of calf circumference.Atrophy was considered significant ifthe size of the experimental calf wasreduced by more than 20% when com-pared with the control. Distal limb ne-crosis was evaluated by macroscopicexamination and considered to be sig-nificant if skin necrosis was observedat the level of the foot or ankle.

Immunohistochemistry/Histology

All animals were euthanized by anintravenous injection of thiopental(100 mg/kg). With a straight flushcatheter positioned in the distal ab-dominal aorta, 500 mL of 10% forma-lin were hand injected into both hind-limbs. After disarticulating both hipjoints each hindlimb was removed andplaced in 10% formalin for 24 hours.Two axial sections were obtained fromthe entire leg, 4–4.5 cm and 4.5–5 cm

cephalad to the superior pole of thepatella and immediately fixed in 10%phosphate-buffered saline formalin,and then embedded in paraffin.Five-!m thick sections were preparedfrom paraffin-embedded samples atthe cephalad portion of each slide.

Immunohistochemical staining wascarried out with mouse monoclonalantibody against human CD31(N1596; Dako Cytomation, Carpinte-ria, CA) to detect vascular endothelialcells, or with mouse monoclonal anti-body against human alpha smoothmuscle actin (dilution 1:100 RDI-AC-TINabm-A4; Research Diagnostics,Flanders, NJ) to detect vascularsmooth muscle cells. Microwave irra-diation was performed to retrieve theantigens. Sections were incubated in0.3% hydrogen peroxide to block en-dogenous peroxidase activity. Proteinblocking, incubation with secondarybiotinylated antibody and avidin-bi-otin interaction were performed with aVectastain ABC kit (Vector Laborato-ries, Burlingame, CA) according to themanufacturer’s protocol. These anti-bodies were visualized with diamino-benzidine as a chromogen (DAB kit;Vector Laboratories).

At !200 magnification, with a CarlZeiss AxioCam (Thornwood, NY) dig-ital camera with the Zeiss Axioskop(DIC and Neofluar optics) connectedto a personnel computer (Dell, Austin,TX), 6 random fields were captured.The images were imported into J-Im-age (National Institutes of Health) tocalculate the average arteriolar lumi-nal area per animal. The number ofcapillaries and myocytes per fieldwere manually counted and expressedas the capillary/muscle fiber ratio.

Hematoxylin and eosin stainingwas done on the sections to identifyand quantify inflammatory cells.Stained sections were reviewed at !20magnification, by an experienced vet-erinary pathologist (K.L.G.), who wasblinded to sample group. Inflamma-tion was scored subjectively on a scalefrom 1 to 10 (1 " mild, 10 " severe)based on both the area occupied byinflammatory cells (mononuclear cellsincluding macrophages) and the de-gree of hypercellularity.

Statistics

The data are presented as mean #standard deviation. All P values were

Figure 2. Lateral spot radiograph of the left proximal hindlimb demonstrating normalvascular anatomy. EIA, external iliac artery; CFA, common femoral artery; SFA, super-ficial femoral artery; PA, popliteal artery; SA, saphenous artery; HA, hypogastric artery;PFA, profunda femoral artery.

994 • Endovascular Model of Rabbit Hindlimb Ischemia July 2005 JVIR

13  

Anatomia vascular normal: EIA, artéria ilíaca externa; CFA, artéria femoral comum; SFA, artéria femoral superficial; PA, artéria poplítea; SA, artéria safena; HA, artéria hipogástrica; PFA, artéria femoral profunda; LCA, artéria circunflexa lateral

Liddell RP, Patel TH, Weiss CR, Lee DS, Matsuhashi T, Brown PR, Gabrielson KL, Rodriguez ER, Eng J, Kimura H, Hofmann LV. Endovascular model of rabbit hindlimb ischemia: a platform to evaluate therapeutic angiogenesis. J Vasc Interv Radiol. 2005 Jul;16(7):991-8. PubMed PMID: 16002507

Barone R, Pavaux C, Blin PC. Atlas D`Anatomie du Lapin. Paris: Masson et Cie; 1973. Pág 133

14  

15  

Área  da  parede  /  área  total  

2.4.2. Técnica de randomização

Por permutação simples (http://www.randomizer.org/

form.htm)

2.4.3.Técnica de mascaramento

Foi aplicada no momento da coleta tanto para o laboratório

como para histologia.

16  

2.5.  Variáveis    2.5.1.  Variável  primária  - A diferença de média de hiperplasia mio-intimal  2.5.2  Variáveis  secundárias   • A média de hiperplasia mio-intimal no grupo AS • A média de hiperplasia mio-intimal no grupo C • A média de hiperplasia mio-intimal no grupo SF

17  

•  Foi mensurada por microscopia óptica • Morfometria digital (Image J 1.46o, 64

bit, for Mac, Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA, the public domain)

• Cinco semanas após angioplastia

18  

2.5.3. Dados complementares

•  A média de colesterol total

•  A média de HDL

•  A média de LDL

•  A média de VLDL

•  A média de triglicerídeo

19  

• Média de peso

•  Frequência de isquemia do membro

•  Frequência de perda do membro

•  Frequência de morte

•  Frequência de hematoma, equimose

•  Frequência de infecção

20  

2.6. Método estatístico 2.6.1. Cálculo do tamanho da amostra

•  O tamanho da amostra foi arbitrado em 10 coelhos por grupo (Cortelekoglu, 2006; Santos, 2005)

Cortelekoglu  T,  Bozkurt  AK,  Ustundag  N,  Koksal  C,  Sayin  AG.  The  effects  of  clopidogrel  and  calcium  dobesilate  on  in>mal  hyperplasia  following  vascular  injury.  Acta  Chir  Belg.  2006  Mar-­‐Apr;106(2):206-­‐10.  PubMed  PMID:  16761479.  

21  

2.6.2. Análise estatística •  Coleta de dados

–  Formulário padronizado

•  Armazenamento dos dados –  Planilha de dados eletrônica (Microsoft Excel® for

Mac 2011, Versão 14.1.4 (111121)

•  Tabulação dos dados –  Planilha de dados eletrônica

22  

•  Estatística descritiva – O  intervalo  de  confiança  de  95%  (Gardner,  1989)  

•  Aplicativo – GraphPad  Prisma®  (Versão  6,  for  Mac  OS  X,  GraphPad  Sojware  Inc.,  San  Diego,  CA),  3  de  outubro  de  2012  

Gardner  MJ,  Altman  DJ.  Esta>s>c  with  confidence:  confidence  intervals  and  sta>s>cal  guidelines.  London:  BMJ  Publishing  Group;  1989  

23  

•  Variável analisada –  A  diferença  de  média  de  hiperplasia  mio-intimal  

•  Hipóteses Estatísticas

–  Ho:  PAS  =  PC  =  PSF    

–  H1:  PAS  ≠  PC  ≠  PSF  

•  Testes Estatísticos

•  ANOVA (One-way e Two-way), Qui-quadrado

•  Valor de Alfa – Menor  que  0,05  

24  

3. Resultados

Morte&na&cirurgia&n=2&&

Animais&selecionados&

n=&37&

Morte&na&quarentena&

n=&5&

Animais&randomizados&

n=32&

Allium&sativum&n=&10&

Cilostazol&n=&10&

Soro&fisiológico&n=&10&

Desvio da pesquisa

25  

HE 100x 26  

HE 100x 27  

HE 40x 28  

Espessamento médio-intimal

pixel

x 105

Soro fisiológico

Cilostazol

Allium sativum

0

10

20

30

40

50

p < 0,0001

Hiperplasia da mio-intimal

29  

Média do soro fisiológico: 35,74 x 105 pixels IC 95%, 31,76 a 39,71 x 105 pixels Média do cilostazol: 16,21x 105 pixels IC 95%, 13,36 a 19,05 x 105 pixels Média do Allium sativum: 21,12 x 105 pixels IC 95%, 17,23 a 25,01 x 105 pixels

Mediana de hiperplasia mio-intimal

Mediana do soro fisiológico: 36,43 x 105 pixels IC 95%, 29,23 a 45,46 x 105 pixels Mediana do cilostazol: 15,46x 105 pixels IC 95%, 12,66 a 23,70 x 105 pixels Mediana do Allium sativum: 19,79 x 105 pixels IC 95%, 12,07 a 31,40 x 105 pixels

30  

Colest total

mg/dL

Cilost

azol

Allium sa

tivum

SF 0,9%

-200

0

200

400

600CilostazolAllium sativumSF 0,9%

P  =  0,0899    

31  

Média do soro fisiológico: 62,30 IC 95%, 25,55 a 99,05 Média do cilostazol: 35,55 IC 95%, 31,72 a 39,38 Média do Allium sativum: 94,45 IC 95%, -23,41 a 212,3

HDL

mg/dL

Cilostazo

l

Allium sativ

um

SF 0,9%0

20

40

60

80

100CilostazolAllium sativumSF 0,9%

P = 0,5796

32  

Média do soro fisiológico: 20,23 IC 95%, 12,65 a 27,80 Média do cilostazol: 20,80 IC 95%, 17,91 a 23,68 Média do Allium sativum: 24,55 IC 95%, 8,24 a 40,88

LDL

mg/dL

Cilostazo

l

Allium sativ

um

SF 0,9%-200

0

200

400

600CilostazolAllium sativumSF 0,9%

P = 0,0124

33  

Média do soro fisiológico: 16,11 IC 95%, -8,75 a 40,97 Média do cilostazol: 2,19 IC 95%, -1,38 a 5,75 Média do Allium sativum: 45,42 IC 95%, -60,20 a 151

VLDL

mg/dL

Cilostazol

Allium sativum

SF 0,9%0

20

40

60

80

100

P = 0,8107

34  

Média do soro fisiológico: 15,33 IC 95%, 10,50 a 20,08 Média do cilostazol: 12,60 IC 95%, 9,69 a 15,51 Média do Allium sativum: 21,85 IC 95%, 10,01 a 33,70

Triglicerideo

mg/dL

Cilostazo

l

Allium sativ

um

SF 0,9%0

100

200

300

400

500CilostazolAllium sativumSF 0,9%

P  =  0,2013            

35  

Média do soro fisiológico: 101,3 IC 95%, 43,77 a 158,7 Média do cilostazol: 66,30 IC 95%, 47,61 a 84,99 Média do Allium sativum: 122,9 IC 95%, 44,68 a 201

Peso

g

Cilostazo

l

Allium sativ

um

SF 0,9%0

1000

2000

3000

4000

5000P <0,0001

36  

Média do soro fisiológico: 2986 g IC 95%, 2540 a 3432 g Média do cilostazol: 3133 g IC 95%, 2702 a 3364 g Média do Allium sativum: 3180 g IC 95%, 2962 a 3399 g

37  

Infecção

N d

e co

elho

s

Sim Não0

2

4

6

8

10SF 0,9%CilostazolAllium sativum

P= 0,7866

38  

Frequência de isquemia do membro -  4 em 30, sendo 3 no SF e 1 no Allium

Frequência de perda do membro -  4 em 30, sendo 3 no SF e 1 no Allium

Frequência de morte - Não houve

Frequência de hematoma, equimose - Não houve

4. Conclusão

•  Não há diferença de média de hiperplasia  mio-­‐in>mal  pós-angioplastia na artéria ilíaca externa de coelhos com aterosclerose induzida tratados com Allium sativum comparados aos tratados com Cilostazol

39