17 1 introduÇÃo a epilepsia é considerada uma condição
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1 INTRODUÇÃO
A epilepsia é considerada uma condição neurológica crônica e compreende um grupo
de doenças, cujo ponto em comum são as crises epilépticas, que recorrem na ausência de
doenças tóxico-metabólicas ou febris (GASTAUT, 1973; ROGAWISKI e PORTER, 1990). A
epilepsia não é uma doença individual, mas a expressão clínica de um grande número de
desordens decorrentes de atividade elétrica cerebral anormal, excessiva e hiper-sincrônica.
Tende a se repetir e pode decorrer de múltiplos processos patológicos, em diferentes áreas
encefálicas (COCKERELL et al., 1997).
A chamada crise epiléptica é um paroxismo transitório de descarga neuronal cortical
capaz de produzir uma manifestação que pode ser percebida pelo paciente ou por um
observador. Estas manifestações variam muito de paciente a paciente, refletindo as funções
corticais na qual a descarga se originou e para onde se propaga (SANDER e HART, 1999).
Como geralmente este trajeto de origem e propagação é o mesmo, as manifestações motoras
duram poucos minutos (período ictal) e cedem espontaneamente, seguindo-se de sonolência e
confusão mental (período pós-ictal) (SANDER e HART, 1999).
O distúrbio epiléptico é frequente e acomete em torno de 1-3% da população mundial.
É uma condição crônica recorrente e pode ter importantes repercussões psicossociais. São
comuns os casos de distúrbios de aprendizado, estimando-se que aproximadamente 50% das
crianças epilépticas têm alguma dificuldade na escola (ROSS et al., 1980; SILLAMPA et al.,
1999).
Ao se pesquisar as causas do distúrbio cognitivo no paciente portador de epilepsia, a
multiplicidade de fatores envolvidos deve sempre ser levada em conta. Há os fatores ligados à
doença de base que causa a epilepsia (a etiologia), às crises epilépticas propriamente ditas, ao
efeito adverso dos fármacos anti-epilépticos (FAEs), aos transtornos de humor e de conduta
que frequentemente acompanham estes pacientes, além das menores oportunidades de
aprendizado muitas vezes oferecidas por professores e pais que criaram falsas expectativas
negativas quanto ao desempenho destas crianças (CORNAGGIA e GOBBI, 2001).
Quando se analisa a influência dos FAEs na cognição destes pacientes, também há
vários aspectos que podem ser positivos ou negativos, dependendo da situação. Obviamente,
ao manter sob controle os fatores provocados pela epilepsia em si, como quando há múltiplas
crises diárias, o fármaco trará benefícios sobre a cognição. Por outro lado, em virtude dos seus
possíveis efeitos adversos, em especial a sonolência, o retardo nas reações e a diminuição da
atenção, trará prejuízos cognitivos (PERUCCA, 1996).
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Como era de se esperar neste contexto, os estudos clínicos para caracterizar as causas
reais do distúrbio cognitivo na epilepsia têm se deparado com grandes desafios
metodológicos, o que leva, muitas vezes, a resultados complementares contraditórios
(CORNAGGIA e GOBBI, 2001). Isto se deve ao fato de ser muito difícil isolar todos os
fatores de confusão, quando se lida com um problema que se apresenta de múltiplas formas,
já que a epilepsia é uma doença neurológica subjacente, podendo ser causada por variadas
etiologias, com diferentes níveis de gravidade e tipos de tratamento. Pode ser afetada de
forma significativa por fatores sociais, econômicos e culturais (BAKER et al., 1996).
Atualmente, estão disponíveis modelos adequados para analisar experimentalmente
estas variáveis; um exemplo a ser considerado, é o modelo de epilepsia crônica induzida por
pilocarpina em ratos (TURSKI et al., 1983). Este modelo é especialmente importante por
reproduzir a epilepsia do lobo temporal (ELT), uma das formas mais comuns de síndrome
epiléptica, que compreende cerca de 40% de todos os casos em indivíduos adultos e tende a
ser a forma mais frequentemente refratária ao tratamento medicamentoso. Isto implica em
tratamento polimedicamentoso ou mesmo cirúrgico, além de tratar-se de uma síndrome
epiléptica onde a memória é a principal função prejudicada (JONES-GOTMAN, 1996).
Apesar de inúmeros estudos sobre os mecanismos fisiopatogênicos relacionados à
epilepsia, alguns fatores ainda permanecem obscuros, dentre eles, as alterações cognitivas
decorrentes da própria patologia ou influenciadas pelos tratamentos com terapia celular.
Assim, justifica-se a necessidade de estudos que analisariam tanto manifestações
comportamentais quanto os mecanismos celulares envolvidos nos circuitos epileptogênicos,
além das possíveis influências das terapias celulares nos processos cognitivos (DASS et al.,
2006).
Recentemente uma área nova de pesquisa biomédica, denominada engenharia tecidual,
vem estudando novas formas de regeneração tecidual, inclusive para o uso em cirurgias
reparadoras (CHANG et al., 2003). A engenharia tecidual é multidisciplinar e compreende
todos os métodos e esforços para projetar, produzir, modificar, expandir e manter tecidos
vivos específicos em locais específicos (GOESSLER et al., 2005). Para isso, a manipulação
poderá utilizar células, matrizes ou de estímulos biológicos (MUSCHLER e MIDURA, 2002).
Nos últimos anos, o conceito do uso potencial das células-tronco (CT), de origem
embrionária ou do organismo adulto, introduziu novas perspectivas para o tratamento celular
de patologias teciduais (JONES e TRAINOR, 2004). O termo células-tronco descreve um tipo
celular não-especializado, que pode renovar-se e manter-se por um período longo de tempo
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com o potencial de derivar para linhagens celulares com funções especializadas (CONRAD e
HUSS, 2005).
O sangue de cordão umbilical e placentário (SCUP) representa uma fonte alternativa
de células-tronco hematopoiéticas para serem utilizadas no transplante alogênico de pacientes
afetados por doenças hematológicas, imunodeficiências hereditárias e doenças metabólicas
(WAGNER et al, 2002). Em comparação a outras fontes de células-tronco hematopoiéticas,
como o sangue periférico e a medula óssea, o SCUP fornece inúmeras vantagens logísticas e
clínicas, tais como: 1) disponibilidade imediata de unidades crio-preservadas em bancos de
SCUP, e que diminuições em média, em 25 a 36 dias a espera pelo transplante em relação à
medula óssea, 2) extensão do pool de doadores devido à tolerância de dois mismatches
(incompatibilidades no sistema HLA, Human Leukocyte Antigens), 3) menor freqüência e
gravidade da doença do enxerto contra o hospedeiro, 4) menor risco da transmissão de
infecções latentes tais como citomegalovírus e Epstein Barr Vírus, 5) ausência de riscos ao
doador e 6) maior incidência de haplótipos raros comparados aos encontrados nos registros de
doadores de medula óssea (GLUCKMAN et al., 2005).
O potencial terapêutico das células do sangue de cordão umbilical humano para o
tratamento de doenças do sistema nervoso tem sido intensamente pesquisado. Estudos relatam
que estas células podem ser utilizadas como uma fonte de substâncias terapeuticamente eficaz
com a capacidade para melhorar resultados funcionais após o acidente vascular cerebral
(CHEN et al., 2001; WILLING et al., 2003a, 2003b) e morte de animais com esclerose lateral
amiotrófica (CHEN e ENDE, 2000; GARBUZOVA-DAVIS et al., 2003). Além disso, essas
células estão sendo utilizadas em modelos de lesão cerebral traumática (LU et al., 2002) e
injúria da medula espinhal (ZHAO et al., 2004). Também há relatos de melhora funcional em
modelos experimentais da doença de Alzheimer (WU et al., 2008).
No tratamento de doença cardíaca HU e colaboradores (2009) no modelo de infarto
agudo do miocárdio transplantados na área peri-infarto com células progenitoras endoteliais
derivadas de sangue de cordão umbilical humano (HUCB), demonstraram que as células do
doador foram detectadas e integradas no miocárdio, demonstraram também um maior grau de
formação de microvasos resultando na melhoria da função cardíaca global.
Pessina e colaboradores (2004) mostraram que a células de HUCB, após cultura em
meio suplementado com soro bovino fetal (sem citocinas específicas ou factores de
crescimento), apresentaram um painel de marcadores com as características das células
epiteliais, apresentando genes considerados essenciais para a diferenciação em tecido
pancreático endócrino (Isl1, PDX1, Pax4 e Ngn3). Chao e colaboradores (2008) obtiveram
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híbridos diferenciados do HUCB onde a célula de insulina e de outros agrupamentos
apresentaram gens de células pancreáticas β (PDX1, Hlxb9, Nkx2.2, Nkx6.1 e GLUT2)
lançando insulina e peptídeo C, em resposta a concentrações fisiológicas de glicose, in vitro.
Desde o primeiro transplante bem sucedido da HUCB em 1988 (GLUCKMAN et al.,
1989), o cordão umbilical tornou-se uma importante fonte de células-tronco hematopoiéticas
(CTHs) para o tratamento do sangue e doenças genéticas. Dentro deste contexto, o presente
trabalho visou analisar o efeito das células mononucleares obtidas de sangue de cordão
umbilical humano na epilepsia experimental induzida por lítio e pilocarpina. Investigamos o
efeito do transplante destas células sobre as crises recorrentes espontâneas e também sobre a
perda celular hipocampal característica da patologia em estudo.
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2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 As epilepsias
As primeiras referências sobre epilepsia surgiram em torno do ano 2000 a.C. na antiga
Babilônia, em um texto acádico que fornecia a descrição de um episódio convulsivo,
atribuindo à epilepsia caráter mágico e sagrado, pois acreditava-se que ela era a manifestação
de espíritos do mal ou a expressão do descontentamento divino. Em cerca de 400 a.C.,
Hipócrates afirmou que a causa da epilepsia não estava em espíritos malignos, mas no
cérebro, tentando desfazer a idéia de doença sagrada. Na Idade Média, a epilepsia foi
relacionada à doença mental e tida como doença contagiante, conceito que persiste até os dias
de hoje entre muitas pessoas menos esclarecidas (REYNOLDS, 1996).
A epilepsia é um distúrbio cerebral caracterizado por manifestações clínicas (crises)
recorrentes e espontâneas. Estas manifestações clínicas são causadas pelo disparo intenso,
sincronizado e rítmico, de populações neuronais no sistema nervoso central, com tendência a
se repetir ao longo da vida (GUERREIRO, 1993; Da COSTA et al., 1998; MELDRUM,
1999). Existem evidências experimentais de alterações neuronais e/ou de redes neurais
estabelecendo circuitos excitatórios que seriam responsáveis por estas manifestações clínicas.
No entanto, aproximadamente 30% de todos os pacientes não respondem a nenhum tipo de
terapia e apresentam mortalidade 2 a 3 vezes maior que a população geral (MORIMOTO et
al., 2004).
A epilepsia é uma condição relativamente comum na população geral e uma das
doenças mais freqüentemente tratadas pelo neurologista. Estima-se que a incidência da
epilepsia em países desenvolvidos seja de aproximadamente 50/100.000, enquanto que em
países em desenvolvimento essa taxa deve aumentar para 100 casos/100.000 pessoas
(SANDER e HART, 1999).
A incidência de crises epilépticas é maior na adolescência, quando comparada com a
que ocorre na vida adulta, sendo que a maioria das epilepsias é iniciada durante as fases
iniciais do desenvolvimento humano (Da COSTA et al., 1998). Hauser e colaboradores
(1993) descrevem que a incidência de epilepsia em idosos é superior a incidência em crianças,
e está incluída entre os mais comuns distúrbios neurológicos em idosos.
Estima-se que 1% da população desenvolva epilepsia até os vinte anos de idade
(BERG et al., 2003), e que a epilepsia acometa 1 a 3% da população mundial (ENGEL et al,
2003). No entanto, este número é variável nas diversas regiões do mundo, ocorrendo com
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maior freqüência nos países em desenvolvimento. A incidência anual varia de 20 a 70 casos
por 100 mil habitantes e a prevalência, de 4 a 10 casos por mil habitantes (SHORVON, 1992).
No entanto, de acordo com a Organização Mundial da Saúde, aproximadamente 0,8% da
população mundial (50 milhões) é portadora de epilepsia (PITKÄNEN et al., 2007). No Brasil
é estimado que existam mais de três milhões de pessoas com epilepsia (GUERREIRO e
GUERREIRO, 1999).
O termo Status Epilepticus (SE) é definido como crises epilépticas suficientemente
prolongadas, ou repetidas em intervalos curtos, que resultam num estado epiléptico contínuo e
duradouro (GASTAUT, 1973). Estima-se que entre 1 a 8% dos pacientes epilépticos
apresentaram, em algum período da sua doença, pelo menos um episódio de SE. O SE está
associado a um risco significativo de déficit cognitivo (AKMAN et al., 2003).
As crises epilépticas podem ser classificadas de muitas formas (conforme a etiologia,
idade de início e topografia das descargas, por exemplo). A mais aceita atualmente é a
proposta pela Liga Internacional Contra a Epilepsia (ILAE) (COMMISSION, 1989), que se
baseia nas manifestações clínicas e eletroencefalográficas das crises (tabela 1). Esta
classificação divide as crises em dois grandes grupos: as crises parciais, quando a fonte da
descarga neuronal se origina em áreas corticais localizadas (podendo generalizar-se
secundariamente), e as generalizadas, quando se originam em ambos os hemisférios ao
mesmo tempo. Desta forma, as primeiras apresentam uma manifestação clínica que antecede a
perda de consciência, enquanto que, na segunda, esta perda de consciência inicia-se
subitamente (ILAE) (COMMISSION, 1989). São classificadas também como simples,
quando há a preservação da consciência, ou complexas, quando ocorre a perda da consciência
(McNAMARA, 1994).
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Tabela 1. Classificação internacional das crises epilépticas conforme a Liga
Internacional Contra a Epilepsia (ILAE) (COMMISSION, 1989).
I-CRISES PARCIAIS Crises parciais simples (CPS) com sintomas motores com sintomas somatosensoriais ou sensoriais especiais com sintomas autonômicos com sinais psíquicos com ilusões com alucinações estruturadas Crises parciais complexas (CPC) início de CPS com progressão ao embotamento da consciência com alteração do estado de consciência desde o início Crises parciais secundariamente generalizadas CPS evoluindo para crise tônico-clônica generalizada CPC evoluindo para crise tônico-clônica generalizada CPS evoluindo para CPC que evolui para a crise tônico-clônica generalizada II- CRISES GENERALIZADAS A. crises de ausência crises de ausência típicas crises de ausência atípicas B. crises mioclônicas C. crises clônicas D. crises tônicas E. crises tônico-clônicas F. crises atônicas III- CRISES EPILÉPTICAS NÃO CLASSIFICÁVEIS (dados incompletos ou inadequados) ______________________________________________________________________
2.2 Epileptogênese O processo em que, após um insulto cerebral agudo, alterações patológicas e
fisiológicas gradualmente ocorrem em determinadas regiões cerebrais, levando à expressão de
epilepsia, é referido como epileptogenesis. Estruturas do lobo temporal, nomeadamente o
hipocampo, a amígdala, o córtex piriforme estão mais suscetíveis a epileptogenesis-acionando
insultos no cérebro.
A epileptogênese deve-se a um desequilíbrio entre os mecanismos de inibição e de
excitação sináptica que atuam em uma população neuronal suscetível, levando a um estado de
hiper excitabilidade e hipersincronia. Estas alterações podem ser devido à predisposição
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genética ou alterações estruturais dos circuitos neuronais, sendo mediadas por
neurotransmissores e canais iônicos (DICHTER e WEIBERG, 1997).
Em geral, crises epilépticas podem ser geradas por um desequilíbrio entre a excitação
e a inibição neuronal, onde o glutamato e GABA assumem um papel importante. Uma das
hipóteses é que as crises são causadas por um aumento na ativação da via que utiliza o
glutamato como neurotransmissor excitatório e/ou uma diminuição na via que utiliza o GABA
como neurotransmissor inibitório (MORIMOTO et al., 2004).
O ácido γ-aminobutirico (GABA) é o principal neurotransmissor inibitório presente
em estruturas cerebrais superiores, enquanto a glicina tem papel importante como
neurotransmissor inibitório no tronco cerebral e na coluna vertebral (NICHOLLS, 1993).
Aproximadamente 40% de todas as sinapses cerebrais dos vertebrados são GABAérgicas
(URE e PERASSOLO, 2000).
Desde que se verificou a importância da participação do sistema GABAérgico como
um dos principais sistemas inibitórios do sistema nervoso central (SNC), especula-se a
possibilidade do seu envolvimento na etiologia da epilepsia em humanos. Na tentativa de
averiguar tais especulações, inúmeros trabalhos têm abordado pontos do sistema GABAérgico
e apontado alterações que mostram uma disfunção desse sistema nos modelos experimentais
de epilepsia e nos tecidos de necrópsia de pacientes epilépticos. Não se pode afirmar, porém,
que essas alterações sejam responsáveis diretamente pela gênese de alguma síndrome
epiléptica em humanos.
2.3 Epilepsia do lobo temporal
A epilepsia do lobo temporal (ELT) está entre os tipos de epilepsia a mais comum,
sendo responsável por aproximadamente 40% a 70% das epilepsias nos adultos (ENGEL,
2001b). Devido à sua alta prevalência e refratariedade ao tratamento medicamentoso, é uma
das síndromes neurológicas mais estudadas (ELGER et al., 2004; HENDRIKS et al., 2004).
As crises manifestam-se no lobo temporal, principalmente na amígdala, hipocampo e giro
hipocampal.
De um modo geral, a ELT caracteriza-se por apresentar crises parciais simples com
desconforto e calor epigástrico ascendente associado a distúrbios comportamentais, como o
medo. Ocorrem igualmente crises parciais complexas, nas quais existe perda de consciência
associada a automatismos orofaciais e gestuais, podendo seguir generalizações secundárias
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(WIESER, 2000). Estas manifestações são decorrentes na grande maioria (60-65%) das ELT
do comprometimento das estruturas mesiais do lobo temporal, estabelecendo a esclerose
mesial temporal (LEITE et al., 1998).
Em estudos sobre a esclerose mesial temporal, observou-se a existência de uma
intensidade gradual de perda neuronal nos vários subcampos hipocampais atingindo, em
ordem decrescente: CA1 e setor de Sommer (pró-subículo); hilo do giro denteado (GD) e
CA3; células granulares do GD e CA2 (BLUMCKE e BECK, 1999). Modelos experimentais
que mimetizem a neuropatologia humana sugerem que a esclerose mesial temporal é uma
conseqüência da atividade epiléptica crônica. Isto implica também em uma perda dos
interneurônios hipocampais e do giro denteado, além de modificações morfológicas das
células piramidais sobreviventes com características progressivas (MULLER et al., 1993a).
2.4 Formação hipocampal
O hipocampo é uma estrutura do sistema límbico, adjacente ao córtex entorrinal, que
desempenha função importante no aprendizado e memória (SELING e MALENKA, 1997).
A formação hipocampal compreende quatro regiões relativamente simples que
incluem o giro denteado, o hipocampo propriamente dito, o qual pode ser dividido em três
subdivisões chamadas CA1, CA2 e CA3, (LORENTE de NÓ, 1934), o complexo subicular (o
qual pode ser dividido em três subdivisões chamadas subiculum, presubiculum e
parasubiculum) e o córtex entorrinal, o qual, particularmente em roedores, é subdividido em
lateral e medial (AMARAL e WITTER, 1989) (Figura 1).
Figura 1 - Regiões da formação hipocampal. DG: Giro denteado, sc: colateral de Schaffer, pp: via perforante,
mf: fibras musgosas (AMARAL e WITTER, 1989).
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O giro denteado é uma estrutura simples, do ponto de vista histológico, sendo
organizado em camadas de células distintas das demais regiões do hipocampo, recebe
entradas do córtex entorrinal através da via perfurante, as células granulares do giro denteado
estabelece ligação com as células piramidais de CA3 (AMARAL e WITTER, 1989;
HAYMAN et al., 1998) (Figura 2). Figura 2 - Hipocampo e suas estruturas adjacentes. Reproduzido e adaptado de HAYMAN et al., 1998; p. 1139. O lobo temporal apresenta seus limites bem definidos, exceto nas suas porções
posteriores, onde se confunde com o lobo occipital adjacente. Pode ser dividido em neocórtex
temporal e estruturas mesiais, que incluem uncus, amígdala, hipocampo e giro para-
hipocampal (CENDES, 1995) (Figura 3).
Figura 3 - Desenho do hemisfério cerebral mostrando a anatomia de superfície do lobo temporal medial. Vista medial do cérebro direito no plano mediano com o encéfalo e cerebelo removidos. A área delimitada pelo losango compreende as estruturas mesiais do lobo temporal. Reproduzido e adaptado de SOBOTTA (1988, p. 286).
CA3
FISSURA COROIDAL
FISSURA HIPOCAMPAL
PLEXO CORÓIDE
CORNO TEMPORAL
CORPO GENICULADO LATERAL
FISSURA FIMBRIODENTEADA
NÚCLEO CAUDADO
Área residual com cistos em 10-20% da normalidade
SULCO COLATERAL
GIRO FUSIFORME
Giro denteado
Subículo
Córtex entorrinal
CA1 CA4
CA2
Giro do cíngulo
Corpo caloso
Giro temporal inferior
Hipocampo
Giro para-hipocampal
Giro paraterminal Uncus
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2.5 Fisiopatologia das epilepsias
Cerca de 40% dos pacientes com crises epilépticas apresentam crises parciais
complexas (HAUSER e KURLAND, 1975). Este tipo de crise é gerado pelo acometimento
das estruturas mesiais do lobo temporal, em especial do hipocampo. O acometimento pode
decorrer de lesões estruturais, como por exemplo, tumores e malformações arteriovenosas,
mas em 60 a 65% dos casos (MULLER, 1993a; QUIGG et al., 1997) o padrão histológico
encontrado é a esclerose hipocampal ou esclerose mesial temporal. Esta é caracterizada por
acentuada perda de neurônios piramidais, gliose reacional e brotamento axonal que promove
circuitos aberrantes. A perda neuronal referida ocorre com uma intensidade gradualmente
menor nos seguintes subcampos da formação hipocampal, principalmente (1) em CA1 e setor
de Sommer (pró-subículo), (2) no hilo do giro denteado (GD) e CA3 e, por último, (3) nas
células granulares do GD e CA2 (BLÜMCKE et al., 1999; COUTINHO et al., 1999). A perda
neuronal também ocorre em outras áreas mesiais temporais, como na camada III do córtex
entorrinal e no núcleo lateral da amígdala (MULLER et al., 1993b; BLÜMCKE et al., 1999;
PITKÄNEN et al., 1998). Uma das alterações plásticas mais estudadas é o brotamento
aberrante observado no hipocampo de pacientes epilépticos e em modelos experimentais de
ELT. Conhecido como brotamento das fibras musgosas, ele consiste na formação de novos
contatos sinápticos assimétricos e recorrentes entre os terminais das fibras musgosas e
dendritos das próprias células granulares no terço interno da camada molecular (TAUCK &
NADLER). A gliose reativa é geralmente caracterizada por proliferação e hipertrofia de
corpos celulares gliais, que expressam aumento substancial nos níveis da proteína acídica
fibrilar (GFAP) que expressa o aumento de astroglia (TURSKI et al, 1983).
O tratamento é realizado com fármacos antiepilépticos, mas infelizmente
aproximadamente 30% dos pacientes não respondem a esta terapêutica, tornando-se
refratários ao tratamento (LÖSCHER et al., 2002b). Entre as epilepsias refratárias, aquelas
com origem no lobo temporal são as mais freqüentes (BLÜMCKE et al., 1996).
As características clínicas da epilepsia dependem da localização anatômica do foco,
causa, tipo e extensão do espraiamento da crise, mecanismos neuroquímicos subjacentes e da
idade e nível de imaturidade cerebral (COCKERELL e SHORVON, 1997).
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2.5.1 Modelos experimentais de epilepsias
Existem numerosos modelos animais de epilepsia ou de crises epilépticas. Os
principais induzem uma cascata de eventos moleculares e estruturais que resultam em
modificações nas propriedades neuronais intrínsecas, bem como nas redes neuronais,
tornando-as epileptogênicas. Cada modelo apresenta características próprias quanto à
expressão motora, à eletroencefalografia e à resposta a diferentes agentes antiepilépticos.
Cada modelo se aproxima mais de um determinado tipo de epilepsia humana, podendo-se
citar como exemplo: 1) o modelo com uso de doses de pentilenotetrazol, que pode resultar em
crises de ausência, crises mioclônicas e crises tônico-clônicas, sendo sua expressão muito
semelhante a estes tipos de epilepsias em humanos (MARESCAUX et al., 1984; VELISK et
al., 1992), mioclônicas e tônico-clônicas, respectivamente (LÖSCHER e SCHMIDT, 1988;
MARES e ZOUHAR, 1988); 2) O modelo de atividade convulsiva induzida por penicilina
com aplicação sistêmica, associada à epilepsia generalizada, e com 6 aplicações corticais,
associado à epilepsia parcial com generalização secundária (AVOLI et al., 1982); 3) O
modelo de crise por eletrochoque transauricular associado também à epilepsia com crises
tônico-clônicas generalizadas (LÖSCHER et al., 1991); 4) O modelo audiogênico agudo
associado à epilepsia generalizada, com crises mioclônicas e tônico-clônicas generalizadas
(DAILEY et al, 1989; GARCIA-CAIRASCO et al., 1993) 5) O modelo de abrasamento
elétrico (Racine, 1972) ou audiogênico (GARCIA-CAIRASCO et al., 1996; MORAES et al.,
2000), associado à epilepsia parcial complexa com envolvimento de estruturas límbicas e 6) O
modelo por injeção de pilocarpina, associado à epilepsia parcial complexa com foco no lobo
temporal (TURSKI et al., 1987).
Análises histológicas do hipocampo de animais no modelo experimental de
pilocarpina revelam um mesmo padrão de perda neuronal em CA1 e razoável perda em CA3.
Além disso, as crises desencadeadas por este modelo caracterizam-se eletrograficamente por
descargas epileptiformes hiper-sincrônicas. Sabe-se também que estes animais respondem
satisfatoriamente ao tratamento antiepiléptico utilizado em humanos na fase crônica. Todos
estes fatos reforçam as ligações entre ELT humana e as alterações provocadas pelo uso da
pilocarpina sistêmica.
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2.5.2 Modelo de pilocarpina
A injeção sistêmica de pilocarpina, um agonista colinérgico muscarínico, induz status
epilepticus em ratos. Ao modelo epileptogênico da pilocarpina tem sido acrescido o lítio, uma
vez que este é responsável por potenciar a habilidade da pilocarpina na indução do status
epilepticus, incrementando a morte neuronal seletiva inerente à epilepsia, possivelmente por
um aumento da síntese dos receptores dopaminérgicos e dos receptores colinérgicos
muscarínicos (MELDRUM, 1984).
Ao receber pilocarpina, os ratos apresentam crises epilépticas de intensidade variável,
caracterizadas por imobilidade, tremor, automatismo bucofaciais, abalos de extremidades,
ataxia e crises tônico-clônicas. Interrompendo-se as crises com um fármaco antiepiléptico
benzodiazepínico, após a recuperação, o animal permanece sem crises por um período de 2 a
3 semanas (período latente).
Após este período, surgem crises epilépticas espontâneas recorrentes, caracterizando a
epilepsia experimental do lobo temporal. Acredita-se que este modelo determine insulto
excitotóxico secundário à hiperatividade neuronal prolongada, provocando morte neuronal em
áreas susceptíveis, como no hilo do giro denteado e as regiões CA1 e CA3 do hipocampo,
induzindo uma cascata de eventos que levam às modificações nas propriedades intrínsecas
dos neurônios, bem como das redes neuronais. Isto é semelhante ao que acontece em outros
modelos de epilepsia experimental e em pacientes com epilepsia do lobo temporal (FISHER
et al., 1998).
Os modelos experimentais de epilepsia têm contribuído de forma significativa para o
entendimento dos mecanismos básicos envolvidos na epileptogênese, bem como dos
processos dinâmicos relacionados à hiperexcitabilidade e à refratariedade (MAJAK e
PITKÄNEN, 2004).
2.6 Células-tronco
As células-tronco representam uma unidade natural do desenvolvimento embrionário e
da reparação tecidual e são um subconjunto de células imaturas, indiferenciadas e não-
especializadas que apresentam a capacidade de se auto-regenerar e de originar diferentes
linhagens celulares (LI e XIE, 2005).
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Recentes descobertas revolucionaram a biologia das células-tronco e têm demonstrado
o potencial clínico destas células em uma variedade de doenças humanas. As células-tronco
têm sido encontradas em órgãos como o cérebro e o coração, previamente conhecidos pela
carência de progenitores celulares e de potencial regenerativo (KAJI e LEIDEN, 2001).
O momento adequado para o transplante, a melhor via de administração das células-
tronco (sistêmica versus local e intra-arterial versus endovenosa), o tipo de célula apropriada e
os critérios de seleção dos pacientes ainda são aspectos pouco conhecidos da terapia celular.
Estudos recentes têm demonstrado que o transplante de células-tronco causa melhora
funcional em modelos de isquemia cerebral, doença de Parkinson, doença de Huntington e
traumatismo raquimedular (HAAS et al., 2005; DUNNETT et al., 2004 e KODA et al.,
2005). No entanto, pouco é conhecido sobre os mecanismos responsáveis por esta melhora
funcional. Acredita-se que alguns mecanismos estejam envolvidos neste processo, tais como a
transdiferenciação, a fusão celular e a produção de fatores tróficos (RICE e SCOLDING,
2004).
Muitos estudos demonstram uma recuperação funcional com o uso de progenitores
celulares transplantados nos três primeiros dias pós-isquemia. No entanto, essa recuperação
também tem sido encontrada com a liberação tardia das células-tronco, como por exemplo,
um mês pós-insulto (BLISS et al., 2007; SHEN et al., 2007).
Em relação à rota de transplante, Jin e colaboradores (2005), estudando a migração das
células transplantadas em um modelo de isquemia cerebral, demonstraram que todas as vias
de administração das células-tronco neurais resultaram em migração para o local da lesão. No
entanto, um número maior de células foi encontrado com o uso do transplante intracerebral
em comparação com a injeção intraventricular e endovenosa (JIN et al., 2005).
Estudos com o uso de células-tronco da medula óssea (BORLOGAN, 2005; LI et al.,
2002; CHEN et al., 2003) e do cordão umbilical (VENDRAME et al., 2004; 2005; WILLING
et al., 2003; CHEN et al., 2001) em modelos animais de isquemia têm demonstrado melhora
sensório-motora após a terapia celular. No entanto, poucas células são encontradas no cérebro
e uma pequena porcentagem expressa marcadores neurais. Acredita-se que as células
transplantadas secretem fatores tróficos para aumentar os mecanismos endógenos de
reparação cerebral.
A toxicidade de muitos distúrbios neurológicos pode resultar na morte das células-
tronco transplantadas. Por outro lado, o ambiente neuronal, durante a fase precoce de
recuperação na isquemia, por exemplo, pode facilitar o crescimento, a sobrevivência e a
31
transdiferenciação das células-tronco implantadas (SAVITZ, 2004; SANBERG et al., 2005).
Vários tipos de células-tronco têm sido identificados no embrião, no feto e no tecido adulto.
Em relação à plasticidade das células-tronco, estas podem ser classificadas da seguinte
maneira: (a) células-tronco totipotentes - são as células encontradas no oócito fecundado nos
blastômeros do embrião no estágio de 2, 4 até 8 células (WOBUS, 2001). A denominação
“totipotente” está relacionada à capacidade de gerar um novo organismo, inclusive os anexos
embrionários, tais como placenta, corion, que são necessários para o desenvolvimento do
indivíduo. As células-tronco totipotentes apresentam enorme capacidade de diferenciação e
plasticidade. (b) células-tronco pluripotentes - são derivadas de embriões, e podem se
diferenciar em tecidos de todas as camadas germinativas, tanto in vivo, quanto in vitro
apresentando assim alta plasticidade, podendo ainda ser expandida quase que infinitamente
em laboratório, e preservar seu cariótipo estável. (c) células-tronco multipotentes - podem
ser denominadas de células-tronco quiescentes, ou células progenitoras comprometidas com o
órgão no qual residem (GAGE, 1998).
2.6.1 Células-tronco embrionárias
As células-tronco embrionárias são derivadas do blastocisto e são consideradas
pluripotentes, ou seja, apresentam a capacidade de originar mais de 200 tipos diferentes de
linhagens celulares. O sucesso do cultivo de células do blastocisto, e do estabelecimento de
linhagens celulares de células-tronco embrionárias (EVANS e KAUFMAN, 1981; MARTIN,
1981) foram um grande salto para a biologia do desenvolvimento e biologia celular já no
início dos anos oitenta. Em 1984, Bradley e colaboradores implantaram células-tronco
embrionárias em embriões jovens de camundongos. Este experimento demonstrou que as
células-tronco embrionárias apresentavam a capacidade de dar origem a todos os tecidos do
animal, inclusive às células germinativas (LABOSKY et al., 1994).
Além da capacidade de diferenciação em sistemas in vivo, foi demonstrado que as
células-tronco embrionárias podiam não só se diferenciar em organismos vivos, mas também
em sistemas in vitro. Desta forma, as células-tronco embrionárias cultivadas in vitro
originaram tipos celulares característicos da endoderme, mesoderme e ectoderme, quando
cultivadas em formas tridimensionais de agregados celulares denominados corpúsculos
embrionários (WOBUS, 1991).
32
2.6.2 Células-tronco adultas
Estudos sugerem que algumas células-tronco embrionárias permanecem
indiferenciadas no indivíduo adulto. Estas células, aparentemente, possuem a capacidade de
dar origem a células diferenciadas do tecido em que residem, quando adequadamente
estimuladas, e podem ser ativadas durante o desenvolvimento do indivíduo, ou em caso de
dano a algum tecido ou órgão. As células-tronco adultas são encontradas em vários tecidos do
organismo, como na medula, cérebro e fígado (LAVKER e SUN, 2000; UCHIDA et al.,
2000). Estas células já têm sido utilizadas terapeuticamente por muitos anos em doenças
hematológicas malignas, através do transplante de células da medula óssea ou do sangue de
cordão umbilical (HAAS et al., 2005; DALEY et al., 2003; RICE et al., 2004). Atualmente
pesquisas clínicas e experimentais exploram o uso das células-tronco hematopoiéticas para
outros tipos de doenças (NASH, 2003).
Inicialmente acreditava-se que estas células possuíam algum tipo de comprometimento
com a regeneração do tecido no qual reside, dando origem somente a um número bastante
limitado de tipos celulares. No entanto, recentemente cientistas têm comprovado que as
células-tronco adultas apresentam uma plasticidade bem maior, originando células de outros
tecidos (BLAU et al., 2001; MORRISSON, 2001; PROCKOP et al., 2003).
A medula óssea e o sangue de cordão umbilical são fontes de células-tronco com
potencial terapêutico para a utilização em diversas doenças, inclusive em lesões cerebrais.
Uma das aplicações mais promissoras do sangue de cordão umbilical humano é a lesão
cerebral no período neonatal, especialmente pela facilidade de coleta e pelo grande número de
células disponíveis (MEIER et al., 2006).
2.6.3 Células-tronco do cordão umbilical
O sangue do cordão umbilical e placentário tem sido reconhecido como uma fonte
alternativa de células-tronco hematopoiéticas para o transplante em pacientes adultos e
pediátricos. O sangue do cordão umbilical e placentário é altamente enriquecidas com
progenitores celulares hematopoiéticos, mesenquimais e endoteliais (BRUSTEIN e
WAGNER, 2006; CHEN et al., 2005 e NAN, 2005). Além disso, as células-tronco são mais
abundantes no cordão umbilical e apresentam um potencial proliferativo e migratório mais
33
elevado em comparação aos progenitores da medula óssea (SANBERG et al., 2005;
KOGLER et al., 2004).
A plasticidade in vitro das células-tronco de cordão umbilical sugere fortemente que
estas podem representar uma alternativa viável para a regeneração cerebral (SANBERG et al.,
2005). Alguns estudos sugerem que estas células têm a capacidade de se transdiferenciar em
progenitores não-hematopoiéticos, incluindo as células nervosas (CHEN et al., 2005; NAN,
2005 e SANCHEZ-RAMOS et al., 2001). Pesquisas em modelos animais também têm
demonstrado o potencial dessas células na melhora funcional após isquemia (CHEN et al.,
2001), esclerose lateral amiotrófica (GARBUZOVA-DAVIS et al., 2003), traumatismo
crânio-encefálico (LU et al., 2002) e traumatismo raqui-medular (ZHAO et al., 2004). No
entanto, dados experimentais sobre o uso de progenitores celulares do cordão umbilical e da
placenta ainda são escassos (SANBERG et al., 2005).
Chen e colaboradores (2001) realizaram os primeiros estudos sobre o uso de células-
tronco de cordão umbilical humano em ratos submetidos à isquemia cerebral pela oclusão da
artéria cerebral média e demonstraram que a injeção intravenosa de células-tronco auxiliou na
melhora dos animais transplantados. As células-tronco do doador foram detectadas no córtex
afetado, subcórtex e estriato.
Um estudo subseqüente mostrou a melhora no comportamento de ratos após quatro
meses de oclusão da artéria cerebral média. A migração foi observada apenas no hemisfério
lesado e a melhor recuperação foi correlacionada às altas doses de células-tronco de cordão
umbilical humano infundido (VENDRAME et al., 2004).
Os estudos citados acima têm demonstrado que a lesão tecidual é um fator crítico para
“atrair” as células-tronco de cordão umbilical e iniciar o processo de reparação. A liberação
de fatores tróficos no sítio da lesão pode, simultaneamente, promover a migração seletiva de
progenitores celulares do doador e também acelerar o reparo tecidual (SANBERG et al.,
2005).
Quanto às células do sangue de cordão umbilical podemos citar a reduzida resposta
imunológica em relação às células do hospedeiro quando comparadas às da medula óssea.
Isso se deve, provavelmente, ao menor número de linfócitos T presentes no sangue de cordão
umbilical e que, desta forma, induzem menor resposta visto que essas células são
responsáveis pela alo reatividade (GREWAL et al., 2003; BARKER et al., 2003). Além disso,
as células T presentes no sangue de cordão umbilical seriam uma população de células
“virgens”, ou seja, células que ainda não foram expostas à estimulação antigênica (GREWAL
et al., 2003).
34
2.6.3.1 Características fenotípicas
O antígeno CD34, uma glicoproteína de membrana de 90 a 120 kDa, é definido como
o marcador característico da célula-tronco hematopoiética (CTH), mas também pode ser
expresso em células endoteliais (CIVIN e GORE, 1993; VERFAILLIE, 2002). Tem sido
sugerido que esta molécula funciona regulando a adesão da célula hematopoiética às células
do estroma do microambiente hematopoiético (CIVIN e GORE, 1993; SUTHERLAND e
KEATING, 1992). Como na medula óssea, as células CD34+ presentes no SCUP constituem
uma população celular muito heterogênea, sendo que a vasta maioria das células expressa
CD38 e HLA DR (SHEN et al., 2003). A expressão da molécula CD38 identifica uma célula
CD34+ já comprometida, enquanto que o fenótipo CD34+CD38- identifica uma sub-população
de células-tronco hematopoiéticas mais primitivas (MALANGONE et al., 2001), com maior
capacidade para gerarem clones e permitirem a expansão de células CD34+ em cultura
(ENCABO et al., 2003), além de serem responsáveis pela “pega” do enxerto a longo prazo
(ISHIKAWA et al., 2003).
A expressão de Thy-1 também ocorre em células-tronco hematopoiéticas do sangue de
cordão umbilical, sua função não é bem estabelecida e se tem cogitado o envolvimento destas
moléculas na inibição da proliferação celular (VAN HAUTE et al., 2004). O fenótipo CD34+,
CD45RAlow, CD71low também tem sido descrito como característico de células primitivas no
sangue de cordão umbilical (KEENEY et al., 1998). Células-tronco hematopoiéticas
expressam, ainda, o marcador CD133, que tem sido utilizado para caracterizar células mais
imaturas, visto que sua expressão ocorre antes de o CD34 ser detectado na superfície celular
(ENCABO et al., 2003). Também tem demonstrado que as células CD133+ possuem alto
potencial de expansão ex vivo (THEUNISSEN e VERFAILLIE, 2005).
A molécula CD117, ou c-kit, é o receptor de fator de crescimento de células-tronco
(SCF: stem cell factor) o qual possui um papel relevante na viabilidade e proliferação das
células-tronco hematopoiéticas (LEPIDOT et al., 2005; LAUGHLIN et al., 2001). A
expressão deste marcador tem sido relatada para caracterizar as células-tronco
hematopoiéticas primitivas (PAPAYANNOPOULOU et al., 1991), já que a presença desta
molécula pode ser encontrada na maioria das células CD34+ (D’ARENA et al., 1998). O
fenótipo CD34+CD117low tem sido usado para descrever progenitores quiescentes, baseando-
se no fato de que a baixa expressão do c-kit na superfície celular poderia “proteger” a célula,
impedindo-a de receber estímulos e diferenciar-se, caracterizando-se assim como uma célula
mais primitiva (SOLVES et al., 2003).
35
2.6.3.2 Freqüência de células-tronco hematopoiéticas no sangue de cordão umbilical
Aproximadamente 1 a 3% das células-tronco da medula óssea expressam o antígeno
CD34 (SUTHERLAND et al., 1996; KEENEY et al., 1998; BARNETT et al., 1998). No
sangue de cordão umbilical placentário o número de células CD34+ foi encontrado como
sendo em torno de 1 a 2% entre as células mononucleares (KINNIBURGH e RUSSELL,
1993; FRITSCH et al., 1994; PRANKE et al., 2005).
2.7 Potencial terapêutico do sangue de cordão umbilical
Na última década, vários estudos demonstraram o potencial da utilização do sangue de
cordão umbilical como fonte de células progenitoras hematopoiéticas, podendo ser utilizado
na reconstrução da hematopoese de pacientes, após tratamento com altas doses de radioterapia
ou quimioterapia (BROXMEYER et al., 1989). O primeiro transplante de sangue de cordão
umbilical foi realizado em outubro de 1988 (GLUCKMAN et al., 1989), e desde então passou
a ser uma opção terapêutica para diversos pacientes.
O transplante autólogo de células-tronco é indicado como tratamento às seguintes
patologia: doença de Hodgkin, linfomas não-Hodgkin , mieloma múltiplo, tumores sólidos –
neuroblastoma, meduloblastoma e tumor de Wilms e leucoses (ALMICI et al., 1995).
O potencial terapêutico do sangue do cordão umbilical em doenças do sistema nervoso
central tem sido investigado em modelos animais, incluindo entre eles isquemia cerebral
(HAAS et al., 2005), hipóxia-isquêmica perinatal (CHEN et al., 2003), lesão da coluna
vertebral (KODA et al., 2005), esclerose lateral amiotrófica (CHEN et al., 2000), trauma
cerebral (LU et al, 2002). Em todos estes modelos, o transplante de células de sangue de
cordão umbilical humano resulta em uma melhora comportamental observada em teste
sensório motores e cognitivos. No entanto, os mecanismos pelos quais estas células exercem
efeito terapêutico nas doenças do sistema nervoso central ainda não foram elucidados.
2.8 Células-tronco na epilepsia
Considerando que aproximadamente 1/3 dos pacientes com epilepsia são refratários ao
tratamento medicamentoso pode-se afirmar que há um potencial muito grande para a terapia
36
com células tronco no tratamento das epilepsias refratárias, principalmente para aquelas que
têm um curso progressivo pela freqüência de crises associada à polifarmácia (LÖSCHER
2002b).
Chu e colaboradores (2004), ao transplantarem células-tronco neurais humanas em
modelo experimental de ratos submetidos ao status epilepticus, avaliaram seu efeito sobre as
crises epilépticas recorrentes e verificaram que, 35 dias após o transplante, 86,7% dos animais
que receberam o transplante dessas células não apresentaram crises, apesar de ser
desconhecido o efeito dessas células talvez elas possam substituir os neurônios perdidos e
melhorar os déficits funcionais.
Rüschenschmidt e colaboradores (2005) analisaram os efeitos de precursores neurais
derivadas de células-tronco embrionárias de camundongos transplantados no hipocampo de
ratos epilépticos crônicos e controles. A maioria das células-tronco embrionárias de
camundongos foram encontradas em clusters, no tecido cerebral, sendo que uma quantidade
muito pequena destas células migrou para o cérebro. No entanto, não foram encontradas
diferenças nas propriedades funcionais das células-tronco embrionárias de camundongos entre
ratos controles e ratos tratados com pilocarpina.
Shetty e colaboradores (2006) induziram status epilepticus pelo modelo do ácido
caínico em ratos, quatro dias após o transplante de células-tronco neurais isoladas do
hipocampo - na região de CA3. Os resultados obtidos indicam que algumas destas células
migraram para a região do giro denteado e se diferenciaram em neurônios, sendo que, a
maioria das células-tronco se diferenciou em astrócitos, sugerindo então esta terapia para
outras desordens neurológicas, onde as células-tronco possam repor uma população de células
perdidas ou não funcionais no cérebro.
Acharya e colaboradores (2007) avaliaram a eficiência das células-tronco neurais de
hipocampo de ratos na diminuição de crises espontâneas recorrentes, na epilepsia do lobo
temporal crônica induzida por ácido caínico. Os resultados sugerem que o enxerto foi eficaz e
ouve uma redução na freqüência e intensidade das crises espontâneas recorrentes.
Recentemente, Costa-ferro (2008) confirmou em seus estudos que as células
mononucleares da medula óssea de camundongos EGFP-positivas migram para o cérebro de
ratos epilépticos e diminuem a freqüência das crises recorrentes espontâneas no modelo
experimental com SE induzido por Lítio-pilocarpina nas fases aguda e crônica da doença.
Os estudos realizados anteriormente com células-tronco em modelos experimentais de
epilepsia estão representados na (tabela 2).
37
Tabela 2: Estudos com transplante de células-tronco em modelos de epilepsia.
Estudos de transplantes de células-tronco em modelos experimental de epilepsia
Autores Tipo de células Modelo animal
Tempo de transplante
Local do transplante
Efeito Diferenciação
Chu et al. 2004
CTNs da ZV de cérebro humano com 15 semanas de gestação
Pilocarpina (IP)
1 dia após SE
Veia da cauda
Redução da CERs 28-35 dias após SE
Algumas células se diferenciaram em neurônios GABA-érgicos no hipocampo amigdala e córtex piriforme
Ruschenschmidt et al. 2005
Precursores neuronaisdiferenciados de CT de camundongos
Pilocarpina (IP)
1 mês após o SE
Intracerebral no hipocampo
Não analisado As propriedades funcionais nos animais transplantados foi similar aos controles
Shetty e Hattiangady. 2006
CTNs hipocampais de ratos
A.C (ICV) 4 dias após a lesão
Intracerebral no hipocampo
Não analisado Diferenciação em neurônios e astrócitos
Acharya et al. 2007
CTNs hipocampais de ratos
A.C (IP) 4 meses após a lesão
Intracerebral no hipocampo
Redução da CERs
A maioria das células se diferenciou em astrócitos, e algumas em neurônios
Venturin. 2008 CTMO de camundongos EGFPtg
Pilocarpina (IP)
22 dias apoós o SE
Veia da cauda
Redução das CERs
Não analisado
Costa-Ferro. 2008 CTMO de camundongos EGFPtg
Pilocarpina (IP)
1 dia após o SE
Veia da cauda
Redução das CERs em 120-127 dias após o SE de ~80%
Algumas células EGFP+
co-expressaram marcadores para microglia (CD11b) e neurônios imaturos (CDX)
Costa-Ferro. 2008 CTMO de camundongos EGFPtg
Pilocarpina (IP)
22 dias após o SE
Veia da cauda
Redução das CERs 45 dias após transplante em ~50% das CERs
Algumas células EGFP+
co-expressaram marcadores para neurônios adulto (NeuN) e de glia (GFAP)
Camozzato. 2009 CTM e Lise Celular de camundongos EGFPtg
Pilocarpina (IP)
21 dias após o SE
Veia da cauda
Redução das CERs quando tratados com lise celular
Não analisado
IP: intraperitoneal; ICV: intra cerebro ventricular; A.C: ácido caínico; CTNs: células tronco neuronal; CT: células-tronco; CTMO: células-tronco de medula óssea; ZV: zona ventricular; SE: status epilepticus; CERs: crises espontâneas recorrentes.
38
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
O objetivo deste estudo foi verificar se células mononucleares do sangue de cordão
umbilical humano apresentam potencial terapêutico no controle das crises epilépticas e no
dano neuronal associado às crises epilépticas recorrentes de ratos com epilepsia induzida por
lítio-pilocarpina.
3.2 Objetivos específicos
1. Avaliar a ocorrência da migração para o cérebro das células do sangue de cordão
umbilical transplantadas e sua diferenciação em tipos celulares do sistema nervoso central em
ratos tratados com lítio-pilocarpina.
2. Comparar a freqüência das crises epilépticas em animais tratados com lítio-
pilocarpina transplantados ou não com as células mononucleares do sangue de cordão
umbilical humano.
3. Comparar a reorganização cito-arquitetônica do hipocampo de ratos epilépticos em
animais submetidos ou não ao transplante celular.
39
4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Animais
Foram utilizados 95 ratos Wistar machos de 30-35 dias de idade, pesando entre 90 e
120 g. Os animais foram obtidos do Biotério do Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz –
CPqGM – Fiocruz e mantidos no Biotério do CPqGM, sob ciclo claro e escuro de 12
horas, com água e comida ad libitum.
A pesquisa foi realizada no Laboratório de Engenharia Tecidual e
Imunofarmacologia do Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz (Comitê de ética número
L.002/2007).
4.2 Delineamento experimental
Neste estudo avaliou-se o efeito das células mononucleares do sangue de cordão
umbilical humano (CCUH) em ratos com epilepsia induzida que foram transplantados
imediatamente após o SE em comparação com controles que permaneceram em igual
tempo de SE com crises sustentadas em um período de 90 minutos, conforme a escala de
Racine (RACINE, 1972). O nível de severidade de crise na fase aguda da injeção
sistêmica de pilocarpina é graduado de 1 a 5 (quanto maior o grau maior a intensidade da
crise).
Os animais foram distribuídos em três grupos em estudo: grupo controle-salina
(n=12), grupo Li-pilo-salina (que recebeu no transplante solução salina, n=28) e grupo Li-
pilo-CCUH (que recebeu no transplante células mononucleares do sangue de cordão
umbilical humano, n=23), distribuídos aleatoriamente. No modelo de indução de epilepsia
pela pilocarpina em torno de 20-25% não sobrevivem ou não alcançam um nível
satisfatório de severidade de crise que induzira epilepsia crônica (LEITE et al., 1995), e,
portanto foi alocado um maior número de animais nos grupos epilépticos. Assim
procedendo, obteve-se a distribuição dos ratos vista na (Figura 4).
40
Figura 4: Esquema com os grupos experimentais. Na indução do SE: Pilocarpina são animais que receberam Li-pilo e Controle são animais que receberam solução salina. No transplante: Li-pilo-CCUH (receberam o transplante de células mononucleares do sangue de cordão umbilical humano) e Li-pilocarpina-salina (receberam injeção de solução salina).
4.3 Indução da epilepsia do lobo temporal pelo modelo lítio-pilocarpina
Para a indução da epilepsia do lobo temporal, utilizou-se o protocolo desenvolvido por
Cavalheiro e colaboradores (1991) (Figura 5).
Figura 5: Delineamento experimental do modelo da pilocarpina no grupo epiléptico. Li:cloreto de lítio, MS: metilescopolamina, PILO: cloridrato de pilocarpina, DZ: diazepam, CER: crises espontâneas recorrentes.
Os animais com SE induzido por aplicação via intraperitoneal (i.p.) de cloreto de lítio
(ClLi) na dose de 127 mg/kg receberam uma injeção (i.p.) de metilescopolamina (antagonista
colinérgico) na dose de 1 mg/kg, com o objetivo de minimizar os efeitos colinérgicos
periféricos, 20 a 24 h antes da indução do cloridrato de pilocarpina na dose de 60 mg/kg.
Grupo agudo
Pilocarpina
Controle
Li-pilo-salina
Li-pilo-CCUH
Controle-salina
Li ------ MS ------- PILO ------- DZ ----------------- CER ------------ CER -------CER
FASE AGUDA FASE LATENTE FASE CRÔNICA 20-24 h 30 min 0 90 min 15 dias 120dias 300dias
41
Posteriormente, os animais foram colocados em caixas de acrílico transparentes para a
observação das manifestações comportamentais produzidas pela droga. Iniciou-se assim a fase
aguda do protocolo, na qual os animais apresentaram comportamentos estereotipados, como
movimentos mastigatórios, hipocinesia, salivação e clonias. Estas observações foram
acompanhadas por um observador experiente durante 90 minutos e classificadas de acordo
com a escala de Racine (Racine, 1972) (Figura 6), sendo aceitos apenas animais que atingiram
o grau 5 nesta escala (Tabela 3).
Considerou-se, como critério para SE, a persistência de crises contínuas por no
mínimo 90 minutos (CAVALHEIRO et al., 1991; MELLO et al., 1993).
Tabela 3: Escala de Racine para intensidade de respostas motoras dos animais à injeção de pilocarpina.
Uma hora e trinta minutos após a administração da pilocarpina e a observação das
crises durante a fase aguda, os animais receberam uma injeção intraperitoneal de diazepam na
dose de (4 mg/kg). Este fármaco atua como um antiepiléptico com rápido início de ação e foi
utilizado com o objetivo de abortar as crises convulsivas. Desta forma, todos os animais
tiveram um período para desenvolver SE limitado pelo mesmo tempo de 90 minutos, o que
levou a uma padronização do grupo experimental.
Depois de abortadas as crises, os animais foram divididos em 2 grupos: o que recebeu o
transplante de células mononucleares do sangue de cordão umbilical humano e o grupo
controle que recebeu o transplante de solução salina. Os animais foram recolocados em suas
Grau
Alteração comportamental
0 Imobilidade 1 Automatismos faciais 2 Mioclonias de cabeça e pescoço 3 Clonias de patas anteriores 4 Clonias de patas posteriores 5 Elevação e queda
ESCALA DE RACINE (1972)
42
gaiolas e receberam cuidados especiais nos 5 dias seguintes, passando a receber auxílio em
sua alimentação e hidratação. A reposição hidroeletrolítica e nutritiva foi realizada através de
administração de água via oral e injeção subcutânea de solução salina, bem como alimentação
padrão acrescida de banana como repositor de potássio.
Figura 6: Demonstração do controle dos animais durante o status epilepticus. A seta indica um dos animais em crise (grau 5 da escale Racine).
Decorrida a fase aguda do modelo, segue-se um período de ausência de crises
comportamentais, conhecido como período latente (CAVALHEIRO et al., 1991), que pode
variar entre 4 - 44 dias. Segundo Priel e colaboradores (1996), a média para animais de 30-35
dias como o que foi usado neste estudo é de (23.2 ± 10.3). Transcorrido este período, inicia-se
o período crônico, em que ocorre o aparecimento das crises espontâneas recorrentes, e o
animal passa a ser considerado epiléptico crônico. Neste estudo a comprovação de que os
ratos tornam-se epilépticos se deu através da vídeo-monitorização, para isso os animais foram
identificados com tinta preta não alérgica e alojados em caixas de acrílico pretas com frente
transparente, para que pudessem ser filmados e seus comportamentos analisados
posteriormente com identificação das convulsões. Ao completar 15, 120 e 300 dias de SE e
transplante de CCUH, os animais foram monitorados por um período de 12 horas/dia, durante
7 dias consecutivos (6 horas do ciclo claro - 6:00 às 12:00 e 6 horas do ciclo escuro - 00:00 às
6:00) (Figura 7).
43
Figura 7: Monitoramento de crises epilépticas. Para quantificação das crises, os animais foram vídeo-monitorados por 7 dias pelo período de 12 horas (6 horas claro/6 horas escuro); o tempo de início das filmagens ocorreram aos 15, 120 e 300 dias após SE.
4.4 Constituição do grupo controle
Todos os passos citados acima foram realizados no grupo controle, apenas que a
injeção de pilocarpina foi substituída por solução salina (soro fisiológico 0,9%) de mesmo
volume injetado intraperitonealmente (Figura 8).
Figura 8: Delineamento experimental do grupo controle. MS: metilescopolamina, DZ: diazepam.
MS ------------- SALINA --------------- DZ --------------------------------------------------------- Ausência de crises convulsivas - 30 min 0 90 min dias seguintes
44
4.5 Obtenção, preparo e administração das células mononucleares do sangue de cordão
umbilical humano
As células mononucleares do sangue de cordão umbilical humano foram obtidas a
partir de sangue de cordão umbilical humano de recém-nascidos do Hemocentro São Lucas-
SP. Os critérios de inclusão para a seleção das mães doadoras voluntárias foi a concordância
na participação do estudo (Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, em anexo) e pré-
natal documentado. Foram aceitas apenas gestantes que dispunham de boa saúde, para que
não interferisse na vitalidade da placenta.
O sangue foi coletado das veias umbilicais logo após o parto (coleta extra-útero)
através da utilização de seringas esterilizadas e heparinizadas. O material coletado foi mantido
em temperatura ambiente no período máximo de 24 h até o preparo das células
mononucleares. Para este estudo foram utilizados 6 cordões, sendo 5 de recém-nascidos
masculinos e 1 feminino.
Ao sangue obtido do cordão umbilical humano foi adicionado meio Dulbecco´s
modified eagle’s médium (DMEM) sem soro (1:1). Acrescentou-se Ficoll-PaqueTM (G&E
Healthcare) a esta suspensão, que foi submetida à centrifugação com velocidade de 1500
rpm, em temperatura de 25ºC durante 30 minutos, com o objetivo de separar as células
mononucleares por diferença de densidade. A fração mononuclear situada sobre a interface
com o ficoll foi coletada e lavada 2x com meio DMEM. A viabilidade celular foi avaliada
pelo método de exclusão com azul de Trypan 0,4% (Gibco, EUA) em câmara de Newbauer.
Após 90 minutos da indução do SE, as crises foram bloqueadas com o diazepam e
administrou-se as células mononucleares nos ratos selecionados com o auxílio de uma seringa
de insulina contendo (1x107) células em um volume de 200 µL de solução salina através da
veia caudal. Ao término do conteúdo da seringa, uma microtorunda de algodão foi
posicionada no local, com o objetivo de tamponar qualquer sangramento adicional (Figura 9).
Os protocolos experimentais utilizados seguiram as normas internacionais de
experimentação com animais de laboratório. Todos os procedimentos foram realizados,
tomando os cuidados necessários para reduzir ao máximo o número de animais empregados
neste experimento.
45
Figura 9: Ilustração dos passos para obtenção e preparo das células-tronco mononucleares do sangue de cordão umbilical humano. Bolsa contendo sangue de cordão umbilical humano (A), separação das células por gradiente de ficoll (B), separação das células mononucleares por centrifugação (C), separação da camada mononuclear (D), contagem e viabilidade celular (E) e o transplante pela veia da cauda (F).
4.5.1 Marcação das células mononucleares do sangue de cordão umbilical com o
Qtracker
Para a marcação das células mononucleares do sangue do cordão umbilical humano, foi
utilizado o marcador celular Qtracker 655 (Invitrogen), composto de dois componentes, que
são misturados em um microtubo na concentração 1:1 com volume final de 2 µL e incubado
por 5 minutos em temperatura ambiente. Após este período, adicionou-se 200 µL de meio
DMEM e agitou-se por 30 segundos, acrescentando-se 1x107 células mononucleares ao tubo
que continha a solução e novamente, incubando, desta vez, a 37� C por 60 minutos. As
células com o marcador foram lavadas 2x com DMEM + 10% de soro bovino fetal
(Cultilab®), centrifugadas (1500 rpm por 15 minutos) e ressuspensas em solução salina para
posterior transplante nos animais. Para avaliação da migração destas células nos animais,
estes foram perfundidos (conforme descrição posterior) em 24, 48 e 72 h após o transplante e
este marcador foi observado no microscópio confocal FV1000 (Olympus, Tokyo- Japão).
E
F
D
B C A
46
4.6 Perfusão dos animais para estudo histopatológico e de imunofluorêscencia
Ratos dos diferentes grupos experimentais foram anestesiados com tiopental sódico
por via intraperitoneal (0,1 ml/100 g de peso corporal) e, em seguida, realizou-se a
toracotomia e a exposição do coração. No ventrículo esquerdo realizou-se uma incisão para a
fixação de uma cânula de perfusão conectada a uma bomba de perfusão (USA, Watson-
Marlow´s 400 séries). No átrio direito também foi realizada uma incisão. Inicialmente, foram
perfundidos 200 ml de solução salina e, posteriormente, 400 ml de solução fixadora de
paraformaldeído (PFA) 4% diluído em tampão fosfato (pH = 7,4). Em seguida, os encéfalos
foram cuidadosamente retirados.
4.7 Avaliação histopatológica
A coloração de Cresil violeta é uma das técnicas mais utilizadas para avaliações
histológicas e investigação do sistema nervoso. Essa coloração possibilita a evidenciação da
substância de Nissl, um material granular constituído por RNA ribossomal presente no
interior somático das células nervosas. Como esse material granular concentra-se
predominantemente no nucléolo, a coloração cresil violeta resulta na possibilidade de
discriminar esta estrutura celular específica.
Após o término das avaliações das crises epilépticas de 300 dias, os animais
destinados a este estudo foram perfundidos transcardíamente como descrito anteriormente
para posterior avaliação histológica.
4.7.1 Preparação para contagem celular
Após a perfusão, os encéfalos foram pós-fixados por 24 h em PFA 4% (pH 7,4). O
tecido foi processado pela lavagem em água corrente e depois feita a passagem por soluções
de álcool 70% a 80% e absoluto até a inclusão na parafina. Posteriormente, os encéfalos
foram seccionados na espessura de 10 µm em cortes coronal, com o auxílio de um micrótomo
(Leica®RM2145) e colocados em lâminas histológicas preparadas com poly-L-lysina.
Para a coloração, os cortes histológicos foram desparafinizados por 5 minutos no xilol,
desidratados com soluções de concentrações decrescentes de álcool (absoluto, 80% e 70%) e
47
imediatamente incubados em uma solução de violeta de cresila por 1 minuto. A seguir, os
cortes foram desidratados em soluções de concentrações crescentes de álcool (70%, 80% e
absoluto), xilol e as lâminas cobertas com lamínulas contendo bálsamo da Canadá.
A avaliação qualitativa e quantitativa foi realizada com o uso de um microscópio
(Olympus BX41). As imagens das lâminas histológicas foram capturadas por uma câmera
digital acoplada ao microscópio e a um microcomputador com um software de análise de
imagens (Image-Pro Plus 6.1, Media Cybernetics, Silver Spring, EUA).
A estimativa da densidade neuronal foi adaptado de Roch e colaboradores (2002). Foi
realizada a avaliação quantitativa em três secções subseqüentes, do hipocampo posterior que
foram divididas em quadrados de mesmo tamanho ao longo do eixo Z, começando nas
posições (interneural 1.74 mm, 1.62 mm e 1.50 mm, PAXINOS e WATSON, 1997). Após ter
definido as regiões CA1, CA3a e CA3b do hipocampo e duas regiões do hilo sob baixa
ampliação (10x1), a quantificação foi realizada sob a ampliação de (40x1) (Figura 10).
Figura 10: Análise morfométrica de secções de cérebro. As fotos ilustram fatias fixadas nas lâminas para posterior coloração (A) e após a coloração com Violeta de Cresila (B), nos grupos experimentais foi analisado um quadrado de 33,3 X 33,3 m em CA1, CA3 e hilo do GD como demonstrado em (C).
C
B A
48
4.7.2 Imunofluorescência
Após a perfusão, os encéfalos e os órgãos foram pós-fixados por 24 h em PFA 4%,
crioprotegidos em sacarose 30% (pH 7,4) por mais 24 h, congelados em nitrogênio líquido e
armazenados a -80°C.
Os encéfalos foram aclimatados por 2 h em (-20ºC) e seccionados na espessura de 30
µm em criostato (Leica-CM1800) à temperatura de (-24ºC). As fatias cerebrais foram
colocadas em lâminas e pós-fixadas em uma solução de paraformaldeido 4% (Sigma-Aldrich)
por 20 minutos e lavadas duas vezes em PBS por 5 minutos (cada). As secções foram
incubadas com solução Protein Block Serum-Free (Dako Cytomation, Glostrup, Dinamarca)
por 10 minutos, para bloqueio das reações não-especificas. Na seqüência, as fatias foram
incubadas com anticorpo primário anti-neuronal nuclei (NeuN conj Alexa Flúor 488 , 1:400,
Chemicon International, Temecula, CA, USA) e com anti-Glial Fibrillary Acidic Protein
(GFAP, 1:400, Dako Cytomation, Glostrup, Dinamarca) por 36 h a 4º C.
Após da incubação do anticorpo primário, as secções foram lavadas duas vezes (5
minutos cada) em PBS Tween 0,05% e novamente em PBS. Em seguida, para a revelação do
GFAP, as secções foram incubadas com os anticorpos secundários IgG anti-coelho conjugado
Alexa Flúor 488 (1:200, Molecular Probes), ambos por 1 h em temperatura ambiente. A
revelação do anticorpo primário NeuN não se faz necessário devido presença da conjugação
com a molécula fluorescente Alexa Flúor 488. As secções foram lavadas mais duas vezes por
5 minutos em PBS Tween 0,05% e lavadas com PBS. Por fim, as secções foram montadas
com meio de montagem vectashield contendo marcador nuclear (DAPI, 4’,6-diamino-2-
phenylindole, Vector Laboratories, Inc., Burligame, CA).
A presença das células fluorescentes foi determinada por observação no microscópio
confocal FV1000 (Olympus, Tokyo, Japão), usando filtros adequados.
4.8 Análise dos dados e estatística
Para analisar o efeito das células mononucleares do sangue de cordão umbilical
humano sobre as crises espontâneas e recorrentes foi realizada a comparação entre os grupos
através do teste t de Student e análise de variância de uma via (ANOVA), seguida pelo pós-
teste de Tukey.
A possível repopulação neural induzida pelo transplante das CCUH após SE foi
analisada por ANOVA de uma via seguida pelo pós-teste de Tukey.
49
Para a análise estatística dos dados, utilizamos o software Graph-Pad Prisma (Versão
4.00, GraphPad Software Inc., EUA). Os dados estão expressos na forma de (média ± desvio
padrão). Valores de p menores do que 0,05 foram considerados estatisticamente significantes.
4.9 Aspectos éticos
No presente estudo, os protocolos experimentais utilizados seguiram as normas
internacionais de experimentação com animais de laboratório. Todos os procedimentos foram
realizados, tomando os cuidados necessários para reduzir ao máximo o número de animais
empregados. Os animais receberam cuidados adequados, foram submetidos ao mínimo
possível de desconforto. Durante os procedimentos foram instituídas sedação e analgesia de
acordo com a prática veterinária aceita.
O uso de células-tronco de cordão umbilical humano em modelos animais tem sido
amplamente estudado (CHEN et al., 2005; MEIER et al., 2006). Nessa pesquisa, a coleta do
sangue de cordão umbilical e placentário não acarretou riscos para a doadora e qualquer
impedimento para este procedimento foi respeitado pela pesquisadora.
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Centro de Pesquisas
Gonçalo Moniz – CPqGM – Fiocruz – BA, registro CEUA 002/2007.
50
5 RESULTADOS 5.1 Indução do modelo de pilocarpina
Para este estudo foram utilizados n=95 animais, sendo que n=12 foram para o grupo
controle-salina e n=83 animais para o grupo Li-pilo. Dentre estes, 9 animais não atingiram o
grau 5 da escala de Racine e foram descartados. O número final dos animais Li-pilo foi de 74
e 5,4% morreram durante o SE. Os 70 animais aptos para o estudo foram divididos
aleatoriamente em dois grupos, Li-pilo-salina (n=35), e Li-pilo-CCUH (n=35). A mortalidade
no grupo Li-pilo-salina foi de 20% e no grupo Li-pilo-CCUH foi de aproximadamente 34%. 5.2 Efeito das CCHU sobre as crises espontâneas recorrentes em ratos com SE induzido
por Li-pilocarpina
Os animais dos grupos Li-pilo-salina e Li-pilo-CCUH foram vídeo-monitorados em
três períodos de tempo, o primeiro período foi entre os dias 15 e 21, o segundo entre os dias
120 e 127 e o terceiro entre 300 e 307 dias após SE e o transplante. Não foi observada relação
entre a duração do período silencioso, o intervalo entre o SE e a primeira CER. Iniciou-se a
avaliação após 15 dias do SE, baseado no trabalho de Priel e colaboradores (1996), que
demonstraram por vídeo monitoração uma média de latência similar em ratos da mesma idade
daqueles utilizados neste trabalho, o que ocorre em torno de 23± 10 dias após SE.
No presente estudo, a média de latência para a primeira crise do SE foi de 21,27,17
s. Todos os ratos do grupo Li-pilo-salina desenvolveram CER com duração média de 38,00 ±
4,37 s (n=28) no grupo agudo 15-21 dias após SE, de 66,72 ± 10,47 s (n=28) no grupo crônico
120-127 dias após SE e de 38,35± 0,55 s (n=23) 300-307 dias após o SE.
No grupo tratado com células mononucleares do cordão umbilical humano a média
foi de 1,91 ± 0,88 s (n=23) no grupo agudo e de 6,25 ± 2,60 s (n=23) no grupo crônico 120-
127 dias após SE, sendo que, na avaliação realizada aos 300-307 dias de SE, os animais não
desenvolveram crises espontâneas recorrentes.
51
Figura 11: Efeito das células mononucleares do sangue do cordão umbilical humano sobre o tempo de crises. As análises foram realizadas entre os 15-21; 120-127 e 300-307 dias após o SE e transplante (média ± desvio padrão; ***p< 0,0001 comparação pelo pós-teste de Tukey após ANOVA de uma via).
Quanto à quantificação das crises, todos os animais epilepticus tratados com solução
salina apresentaram CER com média por dia de 1,10 ± 0,10 (n=28) no grupo agudo, e no
grupo crônico foi de 1,80 ± 0,27 (n=28) em 120 dias e de 1,67 ± 0,09 (n=28) em 300 dias
após o SE e transplante.
No grupo tratado com as células mononucleares do sangue de cordão umbilical
humano, 4 animais apresentaram CER (~17%) no primeiro período de observações e 5
animais no segundo período de observações (~21%). A média foi de 0,04 ± 0,02 (n=23) no
grupo agudo e de 0,10 ± 0,04 (n=23) em 120 dias no grupo crônico, sendo que em 300 dias
nenhum dos animais apresentaram CER (Figura 12).
52
Figura 12: Efeito das células mononucleares do sangue de cordão umbilical humano sobre as crises recorrentes espontâneas em ratos epilépticos. Após 90 minutos de SE induzido por Li-pilo, os animais foram tratados com células mononucleares obtidos do sangue de cordão umbilical humano ou solução salina. O comportamento foi vídeo-monitorado por 12 h, durante 7 dias a partir de 15, 120 e 300 dias após o tratamento. As barras representam a média do número de CER por dia no grupo (***p< 0,0001, **p<0,01 e **p<0,05 pilocarpina salina x tratado em comparação pelo pós-teste de Tukey após ANOVA de uma via).
5.3 Efeito das células mononucleares do sangue de cordão umbilical humano sobre os
neurônios hipocampais
A análise dos neurônios hipocampais em secções corados por Cresil violeta não
mostrou lesões histológicas no grupo controle e uma substancial perda neuronal acompanhada
de gliose no estrato piramidal do hipocampo nos animais epilépticos após 300 dias de SE e
transplante. Alguns neurônios remanescentes apresentaram retração do citoplasma e núcleo
pinótico. A figura 13 representa o hipocampo de um dos hemisférios de um animal do grupo
controle (A), do grupo Li-pilo transplantado com solução salina (B) e do grupo transplantado
com células mononucleares de cordão umbilical humano (C).
Foi possível verificar perda neuronal nas regiões de CA1 hipocampal (Figura 14), de
CA3a e CA3b (Figuras 14 e 15) e hilo do giro denteado (Figura 16).
53
Controle Li-pilo-salina Li-pilo-tratado- CCUH
Figura 13: Secções de hipocampo. Representação da perda neuronal em secções coradas com cresil de violeta mostrando a estrutura hipocampal de ratos controles (A) e epilépticos tratado com salina (B) e tratado com CCUH (C) na região de CA1, CA3 e hilo do giro denteado, 300 dias após SE (aumento 4x1).
10µm Figura 14: Secções de hipocampo (CA1). Representação da perda neuronal em secções coradas com cresil de violeta mostrando a estrutura hipocampal de ratos controles e epilépticos na região de CA1, 300 dias após SE (aumento 40x1).
CA3a
CA1
A B C
B
Hilo CA3b
CA1
C A B
Controle Li-pilo-salina Li-pilo-tratado- CCUH 4 µm
54
10µm Figura 15: Secções de hipocampo (CA3). Representação da perda neuronal em secções coradas com cresil de violeta mostrando a estrutura hipocampal de ratos controles e epilépticos na região de CA3a e CA3b , 300 dias após SE (aumento 40x1).
10µm
Figura 16: Secções de hipocampo (hilo de giro denteado). Representação da perda neuronal em secções coradas com cresil de violeta mostrando a estrutura hipocampal de ratos controles e epilépticos na região do hilo do giro denteado, 300 dias após SE (aumento 40x1).
Hilo
Controle Li-pilo-CCUH Li-pilo-salina
10µm
Controle Li-pilo-salina Li-pilo-CCUH
CA3b
CA3a
55
Para a quantificação dos neurônios hipocampais após 300 dias do SE, foram
analisados 3 secções de cada hemisfério de 5 animais por grupo, nas três regiões de interesse:
CA1, CA3a e b e hilo do giro denteado.
Na região de CA1 do hipocampo observou-se uma redução estatisticamente
significativa entre os animais epilépticos Li-pilo-salina (87,8%, p<0,001) e Li-pilo-CCUH
(41,9%) (p<0,001), em relação ao grupo controle-salina. Entretanto, a densidade neuronal do
grupo Li-pilo-CCUH foi significativamente maior que no grupo Li-pilo-salina; (p<0,001;
Figura 17).
Figura 17: Efeito do transplante das células mononucleares do sangue de cordão umbilical humano sobre a densidade neuronal na região de CA1 em ratos submetidos ao SE por Li-pilo. No gráfico as barras representam a média ± desvio padrão (número de neurônios/mm2) em ratos controles e epilépticos sacrificados 300 dias após SE. (***p<0,001 em relação ao controle-salina e ... p<0,001 em Li-pilo-salina em relação ao Li-pilo-tratado com células, comparação de Tukey pós ANOVA de uma via).
Na região de CA3a e CA3b do hipocampo, após 300 dias do SE, a redução da
densidade neuronal foi observada no grupo Li-pilo-salina quando comparada com o grupo
controle-salina em (82,34% e 68,15%, respectivamente; p<0,001). Nesta região, a densidade
neuronal dos animais do grupo Li-pilo-CCUH em relação ao grupo controle-salina foi 40,70%
e 58,72%, respectivamente (p<0,001; Figura 18).
56
A B
Figura 18: Efeito do transplante das células mononucleares do sangue de cordão umbilical humano sobre a densidade neuronal na região de CA3a (A) e CA3 b (B) em ratos submetidos à epilepsia por Li-pilo. No gráfico as barras representam a média ± desvio padrão (número de neurônios/mm2) em ratos controles e epilépticos sacrificados 300 dias após SE. (***p<0,001 em relação ao controle e ...p<0,001 em Li-pilo em relação ao Li-pilo-tratado com células, comparação de Tukey pós ANOVA de uma via).
Na região do hilo do GD, a perda neuronal em 300 dias após o SE no grupo Li-pilo-
salina em comparação ao grupo controle-salina foi de 60,60%, (p<0,001). Já no grupo tratado
com CCUH não houve diferenças significativas (13,20%, p>0,05) em comparação com o
grupo controle-salina (Figura 19).
Figura 19: Efeito do transplante das células mononucleares do sangue de cordão umbilical humano sobre
a densidade neuronal na região do hilo do GD em ratos submetidos à epilepsia por Li-pilo. No gráfico as
barras representam a média ± desvio padrão (número de neurônios/mm2) em ratos controles e epilépticos
sacrificados 300 dias após SE. (***p<0,001 em relação ao controle e ... p<0,001 em Li-pilo-salina em relação ao
Li-pilo-tratado com células), comparação de Tukey pós ANOVA de uma via.
57
5.4 Migração das células mononucleares do sangue do cordão umbilical humano nos
animais epilépticos
Para verificar a presença das células transplantadas nos animais epilépticos, os
encéfalos e o baço foram perfundidos e preparados conforme os protocolos descritos
anteriormente (4.5.1 e 4.7.2) e analisados no microscópio de fluorescência.
Em nosso estudo não foi quantificado as células do doador presentes no cérebro dos
animais, entretanto observou-se células marcadas com Qtracker no cérebro dos animais em 24
e 48 h (Figura 20). No entanto, após 30 dias do transplante não foram encontradas células do
doador em secções do cérebro. Células transplantadas foram observadas no baço, 24, 48 e 72
h após o transplante celular (Figura 21).
Figura 20: Presença de células CCUH no cérebro de animais epilépticos. Painel com microfotografias demonstrando a expressão do marcador Qtracker em fatias do cérebro de animais epilépticos e transplantado com CCUH. Marcação das células da glia com GFAP [(verde), aumento 4x1 (A) e em 40x1(B)]. Marcação da camada de neurônios piramidais com Neu-N [(verde), aumento 4x1(C) e em 40x1(D) observa-se célula do doador expressando o marcador Qtracker+ 24 e 48 h após o transplante [(vermelho) (B e D) respectivamente]. (A-D) secções marcadas com o corante nuclear DAPI (azul).
A
C
B
D
58
Figura 21: Presença de células CCUH no baço de animais transplantados. Painel com microfotografias de células expressando o marcador Qtracker em fatias de baço de animais epilépticos e transplantado com CCUH (A-C). As células do doador expressando o marcador Qtracker+ (vermelho) e o marcador nuclear DAPI (azul), em 24 (A), 48 (B) e 72 h (C); aumento de 60x1 (A e B) e 20x1 (C).
A B C
59
6 DISCUSSÃO
A epilepsia, como qualquer doença crônica, afeta uma porcentagem da população em
geral. O impacto da epilepsia depende do tipo e da freqüência das crises, se é pouco
controlada, ela pode desestabilizar a família e reduzir suas reservas financeiras e emocionais.
Em torno de 60 a 70 % das epilepsias são controláveis com medicação antiepiléptica. Fora
deste grupo, alguns pacientes experimentam controle razoável das suas crises utilizando
politerapia, em geral, com a presença de desagradáveis efeitos colaterais. Cerca de 30% dos
pacientes são considerados refratários ao tratamento clínico. A vários destes pacientes, pode
ser oferecida a opção cirúrgica, mas nem todos podem receber esta chance. Entre os pacientes
submetidos ao tratamento cirúrgico da epilepsia, grande parte permanece em uso de
medicação antiepiléptica, porém em regimes reduzidos, sem a ocorrência de efeitos colaterais
incapacitantes.
A virada do século tem sido marcada pela preocupação com os aspectos da qualidade
de vida dos pacientes com epilepsia. Em lugar de tentar o controle das crises a qualquer custo,
as opções têm se tornado mais racionais, colocando em perspectiva investigações na
utilização das células-tronco como potencial terapêutico no tratamento de doenças
neurodegenerativas.
O objetivo deste estudo foi verificar o efeito das células mononucleares do sangue de
cordão umbilical humano, transplantadas sistemicamente, em ratos submetidos a status
epilepticus por lítio e pilocarpina. Para isso, avaliou-se o controle das crises recorrentes e
espontâneas, além da perda neuronal hipocampal. Paralelamente, investigou-se a presença das
células do doador no foco de lesão.
A principal característica da epilepsia é a presença das crises epilépticas recorrentes e
por isso, para comprovar que os animais submetidos ao SE agudo desenvolveram CER, os
grupos foram vídeo-monitorados e avaliados nos seguintes períodos: fase aguda – logo após
indução do SE, na qual foi possível observar que os ratos transplantados apresentaram
diminuição das manifestações das crises, sem, no entanto, serem totalmente bloqueadas; fase
tardia: 120-127 dias após indução do SE e transplante, apenas 21% dos animais apresentaram
crises, que ocorriam em menor frequência e duração em comparação aos animais epilépticos
controle (p<0,0001); e fase crônica: 300 dias após indução do SE e transplante, na qual
nenhum animal transplantado apresentou crises.
60
Estes resultados indicam que o tratamento com células mononucleares do sangue de
cordão umbilical humano é eficiente na prevenção das crises neste modelo de epilepsia e
impede o desenvolvimento de epilepsia crônica, corroborando com resultados de estudos com
outras fontes de células, a exemplo de: CHU e colaboradores (2004) que utilizaram células-
tronco neuronais humanas transplantadas um dia após indução de SE, obtendo resultado
positivo no controle das CER e apresentando redução de 86,7% na frequência das crises no
grupo tratado entre 28 e 35 dias. Outro dado obtido neste estudo está relacionado à redução do
tempo de duração das CER. O grupo tratado com as CCHU apresentou crises, mas estas
tiveram menor duração.
VENTURIN (2008) usou células mononucleares de medula óssea de camundongos
transgênicos EGFP transplantadas 22 dias após o SE e demonstrou uma redução na frequência
de CER em 30% mesmo sem demonstrar a presença de células EGFP+ no hipocampo e do
mesmo grupo, COSTA-FERRO (2008) demonstrou que células mononucleares de
camundongos transgênicos EGFP transplantadas logo após submissão dos animais ao status
epilepticus, inicialmente, inibiram as manifestações das crises em aproximadamente 80%,
mas não as bloquearam totalmente, visto que alguns animais apresentaram crises quando
observados num período mais tardio, 120 dias da indução do status epilepticus e transplante
celular. Finalmente, CAMOZZATO (2009) demonstrou que ao transplantar células-tronco
mesenquimais, não ocorreu alteração na frequência de crises espontâneas recorrentes, quando
foram avaliados os primeiros 14 dias subsequentes à injeção de células transplantadas 21 dias
após o status epilepticus. Já o lise celular proporcionou uma redução de aproximadamente
45% no número de CERs entre o período pré e pós-transplante.
HATTIANGADY e colaboradores (2004) descreveram que o declínio da neurogênese
foi consideravelmente maior em ratos que apresentaram um maior número de crises
espontâneas recorrentes, sugerindo que a maior frequência de CERs durante a epilepsia
crônica é prejudicial à neurogênese no giro denteado. Este fato ocorre porque durante a
epilepsia crônica há uma queda na concentração de diversos fatores tróficos que atuam na
proliferação de células-tronco neurais, bem como na diminuição da neurogênese, contribuindo
para a persistência de crises (SHETTY et al., 2003). No presente estudo, verificou-se a
redução ou desaparecimento de manifestação das crises, ao passo que os animais chegavam à
fase crônica, 300 dias após o status epilepticus.
A esclerose mesial temporal consiste na redução da densidade neuronal com um
padrão característico. Para MATHIESON (1975) e SUTULA (1990) ocorre perda neuronal
nesta ordem decrescente, CA1, CA3 e GD e CA1 e CA3, respectivamente. BABB e BROWN
61
(1987); GLOOR (1991); MEENCKE e VEITH (1991). Neste estudo, foi possível verificar
que o subcampo mais vulnerável à perda neuronal foi CA1, seguido por CA3, concordando
com a literatura. No entanto, hilo do GD apresentou considerável perda neuronal. Isso se deve
ao fato de que em animais com status epilepticus induzido por lítio-pilocarpina leva à perda
neuronal.
Neste estudo, verificou-se que a perda neuronal ocorrida foi menor, principalmente, no
subcampo de CA1 dos animais epilépticos tratados com as células mononucleares do sangue
de cordão umbilical (p<0, 001 em relação ao grupo não tratado) e avaliados após 300 dias de
SE (ver Figura 13 e 14), sugerindo que as células mononucleares do sangue de cordão
umbilical exerçam um efeito neuroprotetor, prevenindo a perda neuronal na formação
hipocampal, quando transplantadas imediatamente após o status epilepticus.
De acordo com os estudos experimentais de PITKÄNEN e colaboradores (2002), as
crises recorrentes podem causar morte neuronal, principalmente na região do hipocampo. Este
dado está diretamente relacionado com a frequência das crises, pois quanto maior a repetição,
maior é o dano. Outro estudo realizado por ROCH e colaboradores (2002a e 2002b) relatou
que, 24 horas após o status epilepticus, ocorreu a formação de edema na amígdala, córtice
entorrinal, subregiões do hipocampo e hilo do giro denteado levando a uma extensiva perda
neuronal.
COSTA-FERRO (2008) verificou perda neuronal crescente em 10, 45 e 120 dias na
região hipocampal nos animais submetidos ao status epilepticus em comparação aos animais
não epilépticos. No entanto, nos animais epilépticos tratados com as células mononucleares da
medula óssea esta perda foi menor, independente do tempo de transplante após status
epilepticus. Estudo realizado por CAMOZZATO (2009) demonstrou que a perda neuronal em
animais submetidos ao status epilepticus ocorreu em aproximadamente 79% na região de
CA1 do hipocampo e em CA3 de 68%, observando também que a densidade numérica nestes
núcleos hipocampais nos animais que foram tratados com células-tronco mesenquimais ou
lise celular, era estatisticamente igual à do grupo pilocarpina não tratado, no entanto verificar
em seu estudo que o tratamento com lítio-pilocarpina compromete o volume, a densidade
numérica e número total de neurônios das camadas piramidais CA1, CA2, CA3 e CA4, e o
transplante de CTM e Lise Celular não reduz essa perda.
No presente trabalho, a menor perda neuronal no hipocampo dos animais epilépticos
tratados com as CCUH está associada com uma menor freqüência de crises espontâneas
recorrentes. Estas informações ratificam os resultados obtidos, indicando que a proteção
proporcionada pelo transplante de CCUH permitiu que não ocorresse a perda neuronal
62
hipocampal e o desenvolvimento das CER. Além disso, é possível que na fase crônica do
status epilepticus 120-127 dias e 300-307 dias, onde as células mononucleares do sangue de
cordão umbilical humano possam ter diferenciado-se em células neuronais ou gliais. Assim
ambos os mecanismos podem estar contribuindo para a preservação da perda celular no
hipocampo após o status epilepticus em ratos tratados com células mononucleares do sangue
de cordão umbilical humano. Por outro lado, associamos a menor perda neuronal no
hipocampo com o fato de que os animais tratados também mostraram menor freqüência de
crises espontâneas recorrentes, uma vez que, a perda celular no hipocampo está associada à
duração das crises (COUTINHO et al., 1999; MATHERN et al., 2002).
A investigação por imunofluorescência apontou a migração das células
transplantadas (marcadas com o traçador Q-tracker), para o baço dos animais em 24, 48 e 72 h
após o transplante, indicando o sucesso do transplante. Células transplantadas foram
encontradas no cérebro dos animais em 24 e 48 h após o transplante. Apesar destas células
não terem sido quantificadas, observou-se sua presença em baixas quantidades e a não-
expressão de marcadores neuronais e gliais (Neu-N e GFAP). Uma razão para esta ausência
pode estar relacionada com o curto espaço de tempo das avaliações realizadas (24 e 48 h).
Este achado está de acordo com estudos realizados por CHEN et al. (2001) e
VENDRAME et al.(2004, 2005) que utilizaram células-tronco do cordão umbilical em
modelos animais com desordens neurológicas e isquemia. Estes estudos descrevem a melhora
funcional dos animais após a terapia celular, porém foram encontradas poucas células no
cérebro dos animais e uma pequena porcentagem destas expressava marcadores neurais.
VENTURIN (2008) demonstrou em seu estudo que a presença de células EGFP+ no
hipocampo e demais regiões do cérebro, bem como o estudo de alguns órgãos não é
detectável por PCR após sete meses do transplante de CMMO. Por outro lado, em um estudo
recente, COSTA-FERRO (2008) verificou a rapidez da migração das células mononucleares
da medula óssea em ratos com SE induzido por Li-pilocarpina, e constatou que, em 24 h após
o transplante, as células estavam presentes no cérebro dos animais, mas não expressavam
marcadores neuronais.
CAMOZZATO (2009) verificou em seu estudo a presença de células EGFP no
hipocampo de animais transplantados com células-tronco mesenquimais detectado pelo PCR
24 h e 14 dias após status epilepticus.
Estudos prévios sugerem que células de cordão umbilical induzem o reparo no tecido
danificado através de diferentes mecanismos, como, por exemplo, a produção de fatores
neurotróficos (LI et al., 2005), a transdiferenciação e a neuroproteção por produção de fatores
63
tróficos (RICE et al., 2004) e pela recuperação funcional em modelos de isquemia cerebral,
doença de Parkinson e traumatismo raquimedular (HAAS et al., 2005; BLISS et al., 2007).
Estratégias terapêuticas envolvendo o transplante de células tronco e terapia gênica já
têm sido relatadas em modelos experimentais de epilepsia. Entre elas está o uso células-tronco
neurais fetais humanas (CHU et al., 2004), células-tronco neurais de ratos (SHETTY e
HATTIANGADY, 2006; ACHARYA et al., 2007) e células mononucleares da medula óssea
(VENTURIN, 2008; COSTA-FERRO, 2008).
Diante dos dados obtidos, pode-se apontar que os seguintes benefícios da terapia
celular com células mononucleares do sangue de cordão umbilical humano: i) disponibilidade
quase irrestrita de doadores, o que permite o estabelecimento de um banco de unidades com
ampla diversidade genética; ii) aproveitamento de material biológico habitualmente
descartado, através de uma coleta simples, sem risco para o doador; iii) presença de células
progenitoras hematopoiéticas imaturas com maior capacidade proliferativa que a medula
óssea; iv) uma menor contaminação por patógenos e agentes virais, como citomegalovírus; e
v) uma menor reatividade imunológica, onde esta característica facilita que células do sangue
de cordão umbilical em transplantes, apresentem certo grau de incompatibilidade entre doador
e receptor (DONALDSON et al., 2000; ROCHA et al., 2001).
Outra vantagem das CCUH é o fato de serem coletadas após o nascimento, sem
necessidade de sedação, anestesia ou analgesia após a coleta e sem dano ao recém nascido
(PARK et al., 2006).
Finalmente, com base nos dados obtidos no presente estudo sugere-se que as células
mononucleares do sangue de cordão umbilical humano têm efeito neuroprotetor uma vez que
o transplante de CCUH na fase aguda da epilepsia induzida por pilocarpina diminui a perda
neuronal e o desenvolvimento de crises. Estes dados foram obtidos utilizando a via
intravenosa, um método menos invasivo e que poderá ser utilizado com facilidade em
pacientes.
Diante do exposto, estudos subsequentes devem ser conduzidos com o intuito de
elucidar os mecanismos de ação das CCUH, permitindo o desenvolvimento de novas
estratégias terapêuticas para esta patologia.
64
7 CONCLUSÕES
1. O tratamento com CCUH, após o SE, reduz progressivamente o aparecimento das crises
recorrentes espontâneas, até serem completamente suprimidas a longo prazo.
2. O tratamento com CCUH previne a perda celular na região hipocampal, mantendo as
conectividades intactas.
3. A migração das CCUH ao foco da lesão é muito pequena, sugerindo um efeito parácrino.
Este estudo demonstra que o transplante de células do sangue de cordão umbilical
humano, durante a fase aguda da epilepsia induzida por lítio e pilocarpina, tem potencial
terapêutico.
Estudos subsequentes devem ser conduzidos para esclarecer o mecanismos de ação
das CCUH, permitindo o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para a epilepsia.
65
8 REFERÊNCIAS ACHARYA, M.M.; RAI, K. S.; HATTIANGADY, B.; et al. Potential of hippocampal stem/progenitor cell grafts for restraining spontaneous motor seizures during chronic temporal lobe epilepsy. Society for Neuroscience Abstracts; San Diego: Acta Neurol Scand, 110(5):291-300, 2007. AKMAN, C.I.; HU, Y.; FU, D.; HOLMES, G.L. The influence of cognitive reserve on seizure-induced injury. Epilepsy & Behavior, 4(4):435-440, 2003.
ALMICI, C.; CARLO-STELLA, C.; WAGNER, J. E.; RIZOLLI, V. Umbilical cord blood as a source of hematopoietic stem cells: from research to clinical application. Haematologica, 80 (5): 473-479, 1995.
AMARAL, D.G.; WITTER, M.P. The three-dimensional organization of the hipocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience,31 (3):571-591, 1989.
ARMSTRONG, D. D. Epilepsy-induced microarchitectural changes in the brain, Pediatr. Dev. Pathol. 8 (2005), pp. 607–614, 2005.
AVOLI, M.; GOOR, P. Interaction of cortex and thalamus in spike and wave discharges of feline generalized penicillin epilepsy. Exp Neurol, 76(1): 196-217, 1982.
BABB, T. L.; BROWN, W. J. Pathological findings in epilepsy (Engel JJr ed). Surgical Treatment of the Epilepsies: New York: Raven Press, 511-540, 1987. BAKER, G. A.; JACOBY, A.; CHADWICK, D. W. The associations of psychopathology in epilepsy: a community study. Epilepsy Res, 25:29-39, 1996. BARKER, J.N.; WEISDORF, D.J.; DeFOR, T.E.; BLAZAR, B.R.; MILLER, J.S.; WAGNER, J.E. Rapid and complete donor chimerism in adult recipients of unrelated donor umbilical cord blood transplantation after reduced-intensity conditioning. Blood, v.102, 1915-1919, 2003.
BARNETT, D.; GRANGER, V.; STORIE, I. et al. Quality assessment of CD34+ stem cell enumeration: experience of the United Kindom National External Quality Assessment Scheme (UK NEQAS) using a unique table whole blood preparation. British Journal of Hematology, v.102, 553-565, 1998. BERG, A.T.; LANGFITT, J.; SHINNAR, S.; VICKREY, B.G.; SPERLING, M.R.; WALCZAK, T.; BAZIL, C.; PACIA, S.V.; SPENCER, S.S. How long does it take for partial epilepsy to become intractable? Neurology, 60:186-190, 2003.
66
BLAU, H.M.; BRAZELTON, T.R.; WEIMANN, J.M. The evolving concept of a stem cell: entity or function? Cell, 105, 829, 2001.
BLISS, T.; GUZMAN, R.; DAADI, M.; STEINBERG, G.K. Cell transplantation therapy for stroke. Stroke, 38:817-826, 2007. BLÜMCKE, I., BECK H., SCHEFFLER, B., HOF, P.R. et al. Altered distribution of the alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionate receptor subunit GluR2(4) and the N-methyl-D-aspartate receptor subunit NMDAR1 in the hippocampus of patients with temporal lobe epilepsy. Acta Neuropathologica 92(6): 576-87, 1996. BLÜMCKE, I.; BECK, H.; et al. "Molecular neuropathology of human mesial temporal lobe epilepsy." Epilepsy Res, 36(2-3): 205-23, 1999. BORLONGAN, C.V.; EVANS, A.; YU, G.; HESS, D.C. Limitations of intravenous human bone marrow CD133+ cell grafts in stroke rats. Brain Res, 1048:116-122, 2005. BORLONGAN CV, HADMAN M, SANBERG CD, SANBERG PR. Central nervous system entry of peripherally injected umbilical cord blood cells is not required for neuroprotection in stroke. Stroke, 35(10):2385-9, 2004. BRADLEY, A.; EVANS, M.; KAUFMAN, M.H.; ROBERTSON, E. Formation of germ line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature, 309, 255-256, 1984. BROXMEYER, H. E.; DOUGLAS, G. W.; HANGOC, G.; COOPER, S.; BARD, J.; ENGLISH, D.; ARNY, M.; THOMAS, L.; BOYSE, E. A. Human umbilical cord blood as potential source of transplantable hematopoietic stem/progenitor cells. Proc Natl Acad Sci USA, 86:3828-3832, 1989. BRUNSTEIN, C.G.; WAGNER, J.E. Umbilical cord blood transplantation and banking. Annu Rev Med, 57:403-417, 2006. CAMOZZATO, T. Efeito do transplante de células-tronco mesenquimais e de células lisadas da medula óssea em ratos submetidos ao modelo lítio-pilocarpina. Tese(Doutorado). Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul. Faculdade de Medicina. 2009, 112f. il. Porto Alegre. BR-RS. CAVALHEIRO, E.A.; LEITE, J.P.; BORTOLOTTO, Z.A.; TURSKI, W.A.; IKONOMIDOU, C.; TURSKI, L. Long term effects pilocarpine in rats: structural damage of the brain triggers kindling and spontaneous recorrent seizures. Epilepsia, 32: 778-782, 1991. CENDES, F. Ressonância magnética na avaliação da epilepsia do lobo temporal. Brazilian Journal of Epilepsy and Clinical Neurophysiology, São Paulo, v.1, n.1, 7-15, 1995. CHAO, C.K.; CHAO, FK.; FU, Y.S.; LIU, S.H.; Islet-like clusters derived from mesenchymal stem cells in Wharton's jelly of the human umbilical cord for transplantation to control type 1 diabetes. PLoS ONE, 3:1451, 2008.
67
CHANG, S.C.; WEI, F.C.; CHUANG, H.; CHEN, Y.R.; CHEN, J.K.; LEE, K.C.; CHEN, P.K. Ex vivo gene therapy in autologous critical-size craniofacial bone regeneration. Plast Reconstr Surg, 112 (7): 1841-50, 2003. CHEN, J.; SANBERG, P.R.; LI, Y.; WANG, L.; LU, M.; WILLING, A.E.; et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats. Stroke, 32:2682-2688, 2001. CHEN, J.; ZHANG, Z.G.; LI, Y.; WANG, L.; XU, Y.X.; GAUTAM, S.C.; et al. Intravenous administration of human bone marrow stromal cells induces angiogenesis in the ischemic boundary zone after stroke in rats. Circ Res, 92:692-699, 2003. CHEN, N.; HUDSON, J.E.; WALCZAK, P.; MISIUTA, I.; GARBUZOVA-DAVIS, S.; JIANG, L.; et al. Human umbilical cord blood progenitors: the potential of these hematopoietic cells to become neural. Stem Cells, 23:1560-1570, 2005. CHEN, R.; ENDE, N. The potential for the use of mononuclear cells from human umbilical cord blood cells in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis in SOD1 mice. J Med 31:21-30, 2000. CHU, K.; KIM, M.; JUNG, K.H.; JEON, D.; LEE, S.T.; KIM, J.; JEONG, S.W.; KIM S.U.; LEE, S.K.; SHIN, H.S.; ROH, J.K. Human neural stem cell transplantation reduces spontaneous recurrent seizures following pilocarpine-induced status epilepticus in adult rats. Brain Research, 1023; (2), 15:213-221, 2004. CIVIN, C.I.; GORE, S.D. Antigenic analysis of hematopoiesis: a review. Journal of Hematotherapy, v.2, 137-144, 1993. COCKERELL, O.C.; SHORVON, S.D. Epilepsia – Conceitos Atuais. Current Medical Literature, 94p, 1997. COMMISSION ON CLASSIFICATION AND TERMINOLOGY OF THE INTERNATIONAL LEAGUE AGAINST EPILEPSY (ILAE): Proposal for revised clinical and electroencephalographic classification of epileptic seizures. Epilepsia, 22(4):489-501, 1989.
CONRAD, C.; HUSS, R. Adult stem cells lines in regenerative medicine and reconstructive surgery. J Surg Res, 124 (2): 201-208, 2005. CORNAGGIA, C.M.; GOBBI, G. Learning disability in epilepsy: definitions and classifications. Epilepsia, 42(1): 2-5, 2001. COSTA-FERRO, Z. S. M. Transplante de células mononucleares da medula óssea na epilepsia experimental induzida por lítio e pilocarpina em ratos. Tese de Doutorado. Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Departamento de Fisiologia. Porto Alegre-RS: Editora da UFRGS. 156p. 2008. COUTINHO, L.M.B.; HILBIG, A.; CALCAGNOTTO, M.A.; PAGLIOLI, E.; PAGLIOLI-Neto E.; Da Costa, J.C.; PALMINI, A.L.; De PAULA, E.C. Neuropatologia das epilepsias de difícil controle. Arq. Neuropsiq, 57(2):405-410, 1999.
68
Da COSTA, J.C.; PALMINI, A.; YACUBIAN, E.M.T.; CAVALHEIRO, E.A. Fundamentos Neurobiológicos das Epilepsias: Aspectos Clínicos e Cirúrgicos. São Paulo: Lemos Editorial, 33-35, 1998.
DAILEY, J.; REIGEL, C.; MISHRA, P.; JOBE, P.C. Neurobiology of seizures predisposition in genetically epilepsy-prone rats. Epilepsy Res, 3: 3-17, 1989.
DALEY, G.Q.; GOODELL, M.A.; SNYDER, E.Y. Realistic prospects for stem cell therapeutics. Hematology, 398-418, 2003. D’ARENA, G.; MUSTO, P.; CASCAVILLA, N.; CAROTENUTO, M. Thy-1 (CDw90) and c-kit receptor (CD117) expression on CD34+ hematopoietic progenitor cells: a five dimensional flow cytometric study. Haematologica, v.83, 404-409, 1998. DASS, B.; OLANOW, C.W.; KORDOWER, J. H. Gene transfer of trophic factors and stem cell grafting as treatments for Parkinson,s diseases. Neurology, 66:89-103, 2006. DICHTER, M.A.; WEINBERG, L. M. Epileptogenensis and the aging brain. In: Rowan AJ, Ramsay R. E. (eds). Seizures and Epilepsy in the Elderly. Boston, Butterworth-Heinemann, 21-27, 1997.
DOMANSKA-JANIK, K.; HABICH, A.; SARNOWSKA, A.; JANOWSKI, M. Neural commitment of cord blood stem cells (HUCB-NSC/NP): Therapeutic perspevtives. Acta Neurobiol Exp 66: 279-291, 2006.
DONALDSON, C.; DENNING-KENDALL, P.; BRADLEY, B.; HOWS, J. The CD34(+)cd38(neg) population is significantly increased in haemopoietic cell expansion cultures in serum-free compared to serum-replete conditions: dissociation of phenotype and function. Bone Marrow transplant, 27:365-371, 2001.
DUNNETT, S. B.; ROSSER, A. E. Cell therapy in Huntington’s disease. NeuroxRX, 1:394-405, 2004.
ELGER, C. E.; HELMSTAEDTER, C.; KURTHEN, M. Chronic epilepsy and cognition. The Lancet Neurology, 3:663-672, 2004.
ENCABO, A.; MATEU, E.; CARBONELL-UBEROS, F.; MIÑANA, M. D. CD34+CD38- is a good predictive marker of cloning ability and expansion potential of CD34+ Cord blood cells. Transfusion, v.43, 383-389, 2003.
ENGEL J., MESIAL J. Temporal lobe epilepsy: what have we learned? Neuroscientist 7 (2001b), pp. 340–352.Epilepsy Curr. Nov;2(6):194-195, 2002.
69
ENGEL, J. Jr.; WIEBE, S.; FRENCH, J.; et al. Practice parameter: temporal lobe and localized neocortical resections for epilepsy. Neurology, 44(6):741-751; 2003. ENGEL J, BABB, T.L. AND CRANDALL, P.H. Surgical treatment of epilepsy: opportunities for research into basic mechanisms of human brain function. Acta Neurochirug. Suppl., 46:3–8, 1989.
EVANS, M. J.; KAUFMAN, M. H. Establisshment in culture of pluripotencial cells from mouse embryos. Nature, 292, 154-158, 1981.
FISHER PD, SPERBER EF, MOSHÉ SL. Hippocampal sclerosis revisited. Brain Dev., 20(8):563-73, 1998. FISHER RS, ESKOLA J, BLUM D, KERRIGAN JF, DRAZKOWSKI JMD., DUNCAN B "Open label pilot study of oxcarbazepine for inpatients under evaluation for epilepsy surgery" Drug Development research., 38:43-49, 1998. FRITSCH, G.; STIMPFL, M.; BUCHINGER, P. Does cord blood contain enough progenitor cells for transplantation? Journal of Hematotherapy, v.3, 291-298, 1994.
GAGE, F. H. Cell therapy. Nature, 392, 18-24, 1998.
GARBUZOVA-DAVIS, S.; WILLING, A. E.; ZIGOVA, T.; SAPORTA, S.; JUSTEN E. B.; LANE, J. C.; et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood cells in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis: distribution, migration, and differentiation. J Hematother Stem Cell Res, 12:255-270, 2003. GARCIA-CAIRASCO N.; TERRA, V. C.; DORETTO, M. C. Midbrain substrates of audiogenic seizures in rats. Behavioural Brain Research, 58: 57-67, 1993. GARCIA-CAIRASCO, N.; WAKAMATSU, H.; OLIVEIRA, J. A. C.; GOMES, E. L. T.; DEL BEL, E. A.; MELLO, L. E. A. M. Neuroethological and morphological (Neo-timm staining) correlates of limbic recruitment during the development of audiogenic kindling in seizures susceptible Wistar rats. Epilepsy Research, 26: 177-192, 1996.
GASTAUT, H. Letter: Epileptic seizures. Dev Med Child Neurol, 15(5):688-689, 1973.
GLOOR, P. Mesial temporal sclerosis: historical background and an overview from a modern perspective. In: LÜDERS, H. (Ed.). Epilepsy Surgery. New York: Raven Press, p.689-703 1991.
GLUCKMAN, E.; BROXMEYER, H. A.; AUERBACH, A. D.; FRIEDMAN, H. S.; DOUGLAS, G. W.; DEVERGIE, A.; ESPEROU, H.; THIERRY, D.; SOCIE, G.; LEHN, P.; COOPER, S.; ENGLISH, D.; KURTZBERG, J.; BARD, J.; BOYSE, E. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi’s anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling. The New England Journal of Medicine, v.321, 1174-1178, 1989.
70
GLUCKMAN, E.; KOEGLER, G.; ROCHA, V. Human Leukocyte Antigen Matching in Cord Blood Transplantation. Seminars in Hematology, v.42, 85-9, 2005.
GOESSLER, U. R.; HORMANN, K.; RIEDEL, F. Tissue engineering with adult stem cells in reconstructive surgery. Int J Mol Med, 15 (6): 899-905, 2005.
GREWAL, S. S.; BARKER, J. N.; DAVIES, S. M.; WAGNER, J. E. Unrelated donor hematopoietic cell transplantation: marrow or umbilical cord blood? Blood, v.101 (11), 4233-4244, 2003. GUERREIRO, C. Aspectos Gerais. Epilepsia. São Paulo, Lemos Editorial, 1-11, 1993. HAAS, S.; WEIDNER, N.; WINKLER, J. Adult stem cell therapy in stroke. Curr Opin Neurol, 18:59-64, 2005. HATTIANGADY, B., RAO, M.S., SHETTY, A. K. Chronic temporal lobe epilepsy is associated with severy declined dentate neurogenesis in the adult hippocampus. Neurobiol Dis 17:473-90, 2004. HAUSER, W. A.; KURLAND, L. T. Incidence of epilepsy and unprovoked seizures in Rochester, Minnesota, 1935-1984. Epilepsia, 34: 453-468, 1993.
HAYMAN, L. A.; et al. The Hippocamous: normal anatomy and pathology. American Journal of Radiology, Baltimore, v.171, 1139-1146, 1998.
HENDRIKS, M. P. H.; ALDENKAMP, A. P.; ALPHERTS, W. C. J.; ELLIS, J.; VERMEEULEN, J.; VLUGT, H. V. Relationships between epilepsy-related factors and memory impairment. Acta Neurol Scand, 110-291, 2004.
HU, C. H.; LI, Z. M.; DU, Z. M.; ZHANG, A. X.; YANG, D. Y.; WU, G. F. Human umbilical cord-derived endothelial progenitor cells promote growth cytokines-mediated neorevascularization in rat myocardial infarction. Chin Med J (Engl.),122(5):548-555, 2009. ISHIKAWA, F.; LIVINGSTON, A. G.; MINAMIGUCHI, H.; WINGARD, J. R.; OGAWA, M. Human cord blood long-term engrafting cells are CD34+ CD38-. Leukemia, v.17, 960-964, 2003
JACOBS, K.M.; JACOBS, K. D.; GRABER, V.N.; KHARAZIA, I. Parada and D.A. Prince, Postlesional epilepsy: the ultimate brain plasticity, Epilepsia, 41 (Suppl 6), pp. S153–S161, 2000.
JIN, K.; SUN, Y.; XIE, L.; MAO, X. O.; CHILDS, J.; PEEL, A.; et al. Comparison of ischemia-directed migration of neural precursor cells after intrastriatal, intraventricular, or intravenous transplantation in the rat. Neurobiol Dis,18:366-374, 2005.
71
JONES-GOTMAN, M. Psychological evaluation for rpileptic surgery. In: Shorvon S, Dreifuss F, Fish D, Thomas D, editors. The treatment of epilepsy. 1ª ed. Oxford: Blackwell Science; p662, 1996. JONES, N. C.; TRAINOR, P. A. The therapeutic potential of stem cells in the treatment of craniofacial abnormalities. Expert Opinion Biol Ther, 4(5):645-657, 2004.
KAJI, E. H.; LEIDEN, J. M. Gene and stem cell therapies. Jama, 285:545-550, 2001.
KEENEY, M.; CHIN-YEE, I.; WEIR, K.; POPMA, J.; NAYAR, R.; SUTHERLAND D. R. Single platform flow cytometric absolute CD34+ cell counts based on the ISHAGE guidelines. Cytometry, v.34, 61-70, 1998.
KINNIBURGH, D.; RUSSELL, N. H. Comparative study of CD34 positive cells and subpopulations in human umbilical cord blood and bone marrow. Bone Marrow Transplantation, v.12, 489-494, 1993.
KODA, M.; OKADA, S.; NAKAYAMA, T.; KOSHIZUKA, S.; KAMADA, T.; NISHIO, Y.; et al. Hematopoietic stem cell and marrow stromal cell for spinal cord injury in mice. Neuroreport, 16:1763-1767, 2005. KOGLER, G.; SENSKEN, S.; AIREY, J. A.; TRAPP, T.; MUSCHEN, M.; FELDHAHN, N.; et al. A new human somatic stem cell from placental cord blood with intrinsic pluripotent differentiation potential. J Exp Med, 200:123-135, 2004.
LABOSKY, P. A.; BARLOW, D. P.; HOGAN, B. M. L. Mouse embryonic germ (EG) cell lines: transmission through the germ line and differences in the mehylation imprint of insulin-like growth factor 2 receptor 2 receptor (Igf2r) gene compared with embryonic stem(ES) cell lines. Development, 120, 3197-3204, 1994. LAUGHLIN, M. J.; BARKER, J.; BAMBACH, B.; KOC, O. N.; RIZZIERI, D. A.; WAGNER, J. E.; GERSON, S. L.; LAZARUS, H. M.; CAIRO, M.; STEVENS, C. E.; RUBINSTEIN, P.; KURTZBERG, J. Hematopoietic Engraftment and Survival in Adult Recipients of Umbilical-Cord Blood from Unrelated Donors. The New England Journal of Medicine, v.344 (24), 1815-1822, 2001. LAVKER, R. M.; SUN, T. T. Epidermal stem cells: properties, markers, and location. Proceedings of the National Academic Science USA, 5, 97(25):13473-5, 2000. LEITE, J. P.; CAVALHEIRO, E. A. Effects of conventional antiepileptic drugs in a model of spontaneous recurrent seizures in rats. Epilepsy Research, 20(2):93-104, 1995. LEITE, J.P, CAVALHEIRO, E.A. Neurobiologia da esclerose mesial temporal. In: Costa, J. C.; Palmini, A.; Yacubian, E. M. T.; Cavalheiro, E. A. Fundamentos Neurobiológicos das Epilepsias – aspectos clínicos e cirúrgicos. Editora Lemos, Cap 7. Vol. 1, 129-136, 1998.
72
LEPIDOT, T.; DAR, A.; KOLLET, O. How do stem cells find their way home? Blood, v.106(6): 1901-1909, 2005. LI Y, Chen J, Chen X, Wang L, Gautam S, Xu Y, et al. Human marrow stromal cell herapy for stroke in rat: Neurotrophins and functional recovery. Neurology, 59:514-523, 2002. LI, L.; XIE, T. Stem Cell Niche: Structure and Function. Annu Rev Cell Dev Biol, 2005. LORENTE, De NÓ R. Studies on the structure of the cerebral cortex II. Continuation of the study of the ammonic system. Journal fur Psycholigie und Neurologie, 46:113-174, 1934. LÖSCHER, W.; FASSBENDER, C. P.; NOLTING, B. The role of technical, biological and pharmacological factors in the laboratory evaluation of anticonvulsant drugs. II. Maximal electroschock seizures models. Epilepsy Res, 8(2): 79-94, 1991. LÖSCHER, W.; SCHMIDT, D. Which animal models should be used in the search for new antiepileptic drugs? A proposal based on experimental and clinical considerations. Epilepsy Res, 2(3): 145-181, 1988. LÖSCHER, W. Current status and future directions in the pharmacotherapy of epilepsy. Trends Pharmacol Sci 23(3): 113-8, 2002b. LU, D.; SANBERG, P. R.; MAHMOOD, A.; et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces neurological deficit in the rat after traumatic brain injury. Cell Transplant, 11:275-281, 2002.
LU, D.; SANBERG, P. R.; MAHMOOD, A.; LI, Y.; WANG, L.; SANCHEZ-RAMOS J.; et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood cells is not required for neuroprotection in stroke. Stroke, 35:2385-2389, 2002.
McNAMARA, R. K.; SKELTON, R. W. The neuropharmacological and neurochemical basis of place learning in the Morris Water Maze. Brain Res Rev,18:33-49, 1994.
MAJAK, K.; PITKANEN, A. Do seizures cause irreversible cognitive damage? Evidence from animal studies. Epilepsy & Behavior, 5:35-44, 2004.
MALANGONE, W.; BELVEDERE, O.; ASTORI, G.; ADAMI, V.; DONINI, A.; ALASCA, E.; SALA, P. G.; DEL FRATE, G.; PITTINO, M.; DE ANNA, D.; DEGRASSI, A. Increased content of CD34+CD38+ hematopoietic stem cells in the last collected umbilical cord blood. Transplantation Proceedings, v.33, 1766-1768, 2001.
MARES, P.; ZOUHAR, A. Experimental models of epileptic seizures. Cesk Neuronal Neurochic, 51(6): 353-356, 1988.
MARESCAUX, C.; MICHELETTI, G.; VERGNES, M.; DEPAULIS, A.; RUMBACH, I.; WARTER, J. A model of chronic spontaneous petit mal-like seizures in the rat: comparison with pentylenetetrazol-induced seizures. Epilepsia, 25: 326-331, 1984.
73
MARTIN, G. Isolation of a pluripotent cell line fro early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academic of Sciences of the United States, 78(2): 7634-7638, 1981. MATHERN G, ANDELSON PD, CAHAN LD, LEITE JP. Hippocampal neuron damage in human epilepsy: Meyers hypothesis revisited. Progress in Brain Research, 135:237-251, 2002. MATHIESON, G. Pathology of temporal lobe foci. In: PENRY, J.K.; DALY, D.D. (Eds.) Advances in Neurology. New York: Raven Press, v. 11, p. 163-185, 1975. MEENCKE, H.J.; VEITH, G. Hippocampal sclerosis in epilepsy. In: LÜDERS, H. (Ed.). Epilepsy Surgery. New York: Raven Press, p. 705-715, 1991. MEIER, C.; MIDDELANIS, J.; WASIELEWSKI, B.; NEUHOFF, S.; ROTH-HAERER, A.; GANTERT, M. Spastic paresis after perinatal brain damage in rats is reduced by human cord blood mononuclear cells. Pediatr Res, 59(2): 244-249, 2006. MELDRUM, B. Amino acid neurotransmitters and new approaches to anticonvulsant drug action. Epilepsia; 25 Suppl 2:S140-9. 1984. MELDRUM, B. S. Antiepileptic drugs potentiating GABA. Electroencephalogr Clin Neurophysiol, 50:450-457, 1999. MELLO, L. E.; CAVALHEIRO, E. A.; TAN, A. M.; KUPFER, W. R.; PRETORIUS, J. K.; BABB, T. L.; FINCH, D. M. Circuit mechanisms of seizure in the pilocarpina model of chronic epilepsy: cell loss and mossy fiber sprouting. Epilepsia, 34(6):985-995, 1993.
MORAES, M. F.; GALVIS-ALONSO, O. Y.; GARCIA-CAIRASCO, N. Audiogenic kindling in the Wistar rat: a potential model for recruitment of limbic structures. Epilepsy Research, 39:251-259, 2000.
MORIMOTO, K.; FAHNESTOCK, M.; RACINE, R. Kindling and status epilepticus models of epilepsy: rewiring the brain. Progress in Neurobiology, 73(1): 1-60, 2004.
MORRISON, S. J. Stem cell potential: can anything make anything? Current Biology, 9,11(1): R7-9, 2001.
MULLER, M. Morphological and functional consequences of chronic epilepsy in rat hipocampal slice cultures. Europ J Physiol, 422(4): 418-423, 1993a.
MULLER, M. B. H.; GAHWILER, et al. "Reversible loss of dendritic spines and altered excitability after chronic epilepsy in hippocampal slice cultures." Proc Natl Acad Sci USA, 90(1): 257-61, 1993b.
74
MUSCHLER, G. F.; MIDURA, R. J. Connective tissue progenitors: practical concepts for clinical applications. J Clin Orthop, 395:66-80, 2002. NAN, Z.; GRANDE, A.; SANBERG, C. D.; SANBERG, P. R.; LOW, W. C. Infusion of human umbilical cord blood ameliorates neurologic deficits in rats with hemorrhagic brain injury. Ann N Y Acad Sci, 1049:84-96, 2005. NASH, R. A. Allogeneic HSCT for autoimmune diseases: conventional conditioning regimens. Bone Marrow Transplant, 32 Suppl 1:77-80, 2003. NICHOLLS, D. G. Proteins, Transmitters and Synapses. Blackwell Science Ltd, Oxford, 1993. PAPAYANNOPOULOU, T.; BRICE, M.; BROUDY, V. C.; ZSEBO, K. M. Isolation of c-kit receptor-expressing cells from bone marrow, peripheral blood, and fetal liver: functional properties and composite antigenic profile. Blood, v.78(6), 1403-1412, 1991. PARK, K.; YONG-SOON LEE.; KYUNG-SUN KANG. In vitro neuronal and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells from human umbilical cord blood. J. Vet Sci, 7(4): 343-348, 2006. PASSIER, R.; MUMMERY, C. Cardiomyocyte differentiation from embryonic and adult stem cells. Curr Opin Biotechnol, 16(5):498-502, 2005. PAXINOS, G.; WATSON, C. H. The rat brain stereotaxic coordinates. Academic Press, Sydney, 1997. PERUCCA, E. Principles of drug treatment. In: Shorvon S, Dreifuddd F, Fish D, Thomas D, editors. The treatment of epilepsy. Oxford: Blackwell Science, 152-168, 1996. PESSINA, A.; ELETTI, B.; CROERA, C.; SAVALLI, N.; DIODOVICH, C.; GRIBALDO, L. Pâncreas developing markers expressed on human mononucleated umbilical cord blood cells. Biochem Biophys Res Commun, 323:315–22, 2004. PITKÄNEN, A.; TUNANEN, J.; PARTANEN, K.; et al. Amigdala damage in experimental and human temporal lobe epilepsy. Epilepsy Rev, 32: 233-253, 1998. PITKÄNEN, A., SUTULA, T. P. Is epilepsy a progressive disorder? Prospects for new therapeutic approaches in temporal-lobe epilepsy. The Lancet Neurology, 1:173-181, 2002. PRANKE, P.; HENDRIKX, J.; DEBNATH, G.; ALESPEITI, G.; RUBISTEIN, P.; NARDI, N.; VISSER, J. W. M. Immunophenotype of hematopoietic stem cells from placental/umbilical cord blood after culture. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v.38 (12), 1775-1789, 2005. PRIEL, M. R.; DOS SANTOS, N. F.; CAVALHEIRO, E. A. Developmental aspects of the pilocarpine model of epilepsy. Epilepsy Research., 26(1):115-121, 1996.
75
PROCKOP, D. J.; GREGORY, C. A.; SPEES, J. J. One strategy for cell and gene therapy: harnessing the power of adult stem cells to repair tissues. Proceedings of National Academic Science USA, 100: 11917-11923, 2003. QUIGG, M.; BERTRAN, E. H.; JACKSON, T. Longitudinal distribution of hipocampal atrophy in mesial temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res, 27(2):101-110, 1997. RACINE, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation: II Motor seizure. Eletroenceph Clin Neurophysiol, 32(3): 281-294, 1972. REYNOLDS, E. H. Foreword. In: The treatment of epilepsy. Shorvon SD et al. (Eds.). London: Blacwell Science, 1996. RICE, C. M.; SCOLDING, N. J. Adult stem cells--reprogramming neurological repair? Lancet, 364(9420): 193-199, 2004. ROCH, C.; LEROY, C.; NEHLIG, A.; NAMER, I. J. Magnetic resonance imaging in the study of the lithium-pilocarpine model of temporal lobe epilepsy in adult rats. Epilepsia. 2002a; 43:325–335. ROCH, C.; LEROY, C.; NEHLIG, A.; NAMER, I. J. Predictive value of cortical injury for the development of temporal lobe epilepsy in 21-day-old rats: an MRI approach using the lithium-pilocarpine model. Epilepsia. 2002b; 43(10):1129-1136. ROCHA, W.; CORNISH, J.; SIEVERS, E. L.; FILIPOVICH, A.; LOCATELLI, F.; PETERS, C.; REMBERGER, M.; MICHEL, G.; ARCESE, W.; DALLORSO, S.; GLUCKMAN, E.; et al. Comparison of outcomes of unrelated bone marrow and umbilical cord blood transplants in children with acute leukemia. Blood, 97:2962-2971, 2001.
ROGAWISKI, M. A.; PORTER, R. J. Antiepileptic drugs: pharmacological mechanisms and clinical efficacy with consideration of promising developmental stage compounds. Pharmacol. Rev, 42:223-286, 1990.
ROSS, E. M.; PECKHAM, C. S.; WEST, P. B. Epilepsy in childhood: findings from the National Child Development Study. Br Med J, 1:207-210, 1980. RUSCHENSCHMIDT C, KOCH PG, BRUSTLE O ET AL. Functional properties of ES cell-derived neurons engrafted into the hippocampus of adult normal and chronically epileptic rats. Epilepsia ,46 (5):174–183, 2005. SANBERG, P. R.; WILLING, A. E.; GARBUZOVA-DAVIS, S.; SAPORTA, S.; LIU G.; SANBERG, C. D. et al. Umbilical cord blood-derived stem cells and brain repair. Ann NY Acad Sci, 1049:67-83, 2005. SANCHEZ-RAMOS, J. R.; SONG, S.; KAMATH, S. G.; ZIGOVA, T.; WILLING, A.; CARDOZO-PELAEZ, F.; et al. Expression of neural markers in human umbilical cord blood. Exp Neurol,171:109-115, 2001. SANDER, J. W.; HART, Y. M. Epilepsia: um guia prático. Merrit Publishing Internacional, 1999.
76
SAVITZ, S. I.; DINSMORE, J. H.; WECHSLER, L. R.; ROSENBAUM, D. M.; CAPLAN, L. R. Cell therapy for stroke. NeuroRx, 1:406-414, 2004. SCARLATELLI-LIMA, A.; MAGALHÃES, L.; DORETTO, M.; MORAES, M. Assessment of the seizure susceptibility of wistarAudiogenic rat to eletroshock, pentyleneterazole and pilocarpine. Brain Research, 960:184-189, 2003. SELING, D. K.; MALENKA, R. C. Extracellular field potential recording in brain slices. AxoBits, 20:7-10, 1997. SHEN, H. P.; DING, C. M.; CHI, Z. Y.; KANG, Z. Z.; TAN, W. S. Effects of different cooling rates on cryopreservation of hematopoietic stem cells from cord blood. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao, v.19(4) 489-492, 2003. SHEN, L. H.; LI, Y.; CHEN, J.; ZACHAREK, A.; GAO, Q.; KAPKE, A.; et al. Therapeutic benefit of bone marrow stromal cells administered 1 month after stroke. J Cereb Blood Flow Metab, 27:6-13, 2007. SHETTY, A.K., ZAMAN, V., SHETTY, G.A. Hippocampal neurotrophin levels in a kainate model of temporal lobe epilepsy: a lack of correlation between brain-derived neurotrophic factor content and progression of aberrant dentate mossy fiber sprouting. Journal of Neurochemistry 87:147-59, 2003. SHETTY, A. K.; HATTIANGADY, B. Prospects of Stem Cell Therapy for Temporal Lobe Epilepsy. Stem Cells, 25:2396 -2407, 2006. SILLAMPA, M.; GRAM, L.; JOHANNESSEN, S. I.; TOMSON, T. Epilepsy and mental retardation. Pertersfield: Wrightson Biomedica Publisching, 1999. SOBOTTA, J. Atlas de Anatomia Humana. 19 edição. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1988. SOLVES, P.; MORAGA, R.; SAUCEDO, E.; PERALES, A.; SOLER, M. A.; LARREA, L.; MIRABET, V.; PLANELLES, D.; CARBONELL-UBEROS, F.; MONLEON, J.; PLANELLS, T.; GUILLEN, M.; ANDRES, A.; FRANCO, E. Comparison between two strategies for umbilical cord blood collection. Bone Marrow Transplant, v.31(4), p.269-73, 2003. SUTHERLAND, D. R.; KEATING, A. The CD34 antigen: structure, biology and potential clinical applications. Journal of Hematotherapy, v.1, 115-129, 1992. SUTHERLAND, D. R.; ANDERSON, L.; KEENEY, M.; NAYAR, R.; CHIN-YEE, I. The ISHAGE guidelines for CD34+ cells determination by flow cytometry. Journal of Hematotherapy, v.5, 213-226, 1996. SUTULA, T. P. Experimental models of temporal lobe epilepsy: new insigths from the study of kindling and synaptic reorganization. Epilepsia, New York, v. 31, p. s45-s54, 1990.
77
TAUCK, D. L.; NADLER, J. V. Evidence of functional mossy fiber sprouting in hippocampal formation of kainic acid-treated rats. J Neurosci., 5:1016-1022, 1985. THEUNISSEN, K.; VERFAILLIE, C. M. A multifactorial analysis of umbilical cord blood, adult bone marrow and mobilized peripheral blood progenitors using the improved ML-IC assay. Experimental Hematology, v.33(2): 165-172, 2005. TURSKI, W. A.; CAVALHEIRO, E.A.; SCHWARZ, M.; CZUCZWAR, S. J.; KLEINROK, Z.; TURSKI, L. "Limbic seizures produced by pilocarpine in rats: behavioural, electroencephalographic and neuropathological study." Behav Brain Res, 9(3): 315-35, 1983. TURSKI, W. A.; CAVALHEIRO, E. A.; COIMBRA, C.; DA PENHA, B. M.; IKONOMIDOU-TURSKI, C.; TURSKI, L. Only certain antiepileptic drugs prevent seizures induced by pilocarpine. Brain Res, v.434, p.281-305, 1987. UCHIDA, N.; BUCK, D. W.; REITSMA, M. J.; MASEK, M.; PHAN, T. V.; TSUKAMOTO, A. S.; GAGE, F. H.; WEISSMAN, I. L. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proceedings of National Academic Science USA, 97(26): 14720-14725, 2000. URE, J. A.; PERASSOLO, M. Upadate on the pathophysiology of the epilepsies. Journal of Neurological Sciences, 177, 1-17, 2000. WAGNER, J.E.; BARKER, J. N.; DeFORK, T. E.; BAKER, K. S.; BLAZAR, B. R.; EIDE, C.; GOLDMANN, A.; KERSEY, J.; KRIVIT, W.; MACMILLAN, M. L.; ORCHARD, P. J.; PETERS, C.; WEISDORF, D. J.; RAMSAY, N. K. C.; DAVIES, S. M. Transplantation of unrelated donor umbilical cord blood in 102 patients with malignant and nonmalignant diseases: influence of CD34 cell dose and HLA disparity on treatment-related mortality and survival. Blood, v.100(5): 1611-1618, 2002. WASTERLAIN, C.G.; SHIRASAKA, Y. Seizures, brain damage and brain development, Brain Dev. 16, pp. 279–295, 1994. WIESER, H. G. Selective Amigdalo-Hipocampectomy for Temporal Epilepsy. Epilepsia, 29(2): 100-113, 2000.
WILLING, A. E.; LIXIAN, J.; MILLIKEN, M.; POULOS, S.; ZIGOVA, T.; SONG, S.; et al. Intravenous versus intrastriatal cord blood administration in a rodent model of stroke. J Neurosci Res, 1,73(3):296-307, 2003.
WILLING, A. E.; VENDRAME, M.; MALLERY, J.; et al. Mobilized peripheral blood cells administered intravenously produce functional recovery in stroke. Cell Transplant, 12(4):449-454, 2003.
WOBUS, A. M.; WALLUKAT, G.; HESCHELER, J. Pluripotent embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes express chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation, 48, 173, 1991.
78
WU, S.; SASAKI, A.; YOSHIMOTO, R.; KAWAHARA, Y.; MANABE, T.; KATAOKA, K.; ASASHIMA, M.; YUGE, L. “Neural Stem Cells Improve Learning and Memory in Rats with Alzheimer’s Disease.” Pathobiology. 75(3):186-94, 2008.
VAN HAUTE, I.; LOOTENS, N.; De SMET, S.; De BUCK, C.; VERDEGEM, L.; VANHEUSDEN, K.; PINXTEREN, J.; VANDEKERCKHOVE, B. Viable CD34+ stem cell content of a Cord blood graft: which measurement performed before transplantation is most representative? Transfusion , v.44(4), 547-554, 2004.
VELISK L., KUBOVA, H.; POHL, M.; STANKOVA, L.; MARES, P., SCHICKEROVA, R. Pentylenetetrazol-induced seizures in rats: an ontogenetic study. Naunyn Schniedebergs Arc Pharmacol, (346):588-591, 1992.
VENDRAME, M.; CASSADY, J.; NEWCOMB, J.; BUTLER, T.; PENNYPACKER, K. R.; Zigova, T.; et al. Infusion of human umbilical cord blood cells in a rat model of stroke dose-dependently rescues behavioral deficits and reduces infarct volume. Stroke, 35:2390-2395, 2004. VENDRAME, M.; GEMMA, C.; De Mesquita, D.; COLLIER, L.; BICKFORD, P. C.; SANBERG, C. D. et al. Anti-inflammatory effects of human cord blood cells in a rat model stroke. Stem Cells Dev, 14: 595-604, 2005. VENTURIN, G. T. Efeito do transplante de células mononucleares da medula óssea na freqüência de crises e no desempenho cognitivo de ratos com epilepsia induzida por lítio-pilocarpina. Dissertação de Mestrado. Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Departamento de Neurociências. 2008, pp 91.Porto Alegre. BR-RS. VERFAILLIE, C. M. Hematopoietic stem cells for transplantation. Nature Immunology, v.3, 314-317, 2002. ZHAO. Z. M.; LI, H. J.; LIU, H. Y.; LU, S. H.; YANG, R. C.; ZHANG, Q. J.; et al. Intraspinal transplantation of CD34+ human umbilical cord blood cells after spinal cord hemisection injury improves functional recovery in adult rats. Cell Transplant, 13(2):113-122, 2004.
79
ANEXO TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARESCIDO PARA DOAÇÃO DE SANGUE DE CORDÃO UMBILICAL HUMANO E PLACENTÁRIO
Nome do(s) responsável(eis), data de nascimento e RG: ______________________________________________________________________________________________________________________________________________
Foi esclarescido que:
O sangue de cordão umbilical e placentário – SCUP – deverá ser coletado somente após a secção do cordão umbilical, não trazendo portanto nenhum prejuízo à mãe e ao (à) filho(a);
O SCUP nosso(a) filho(a) deverá ser utilizado para realização de pesquisas de células progenitoras hematopoiéticas aprovados pelo comitê de ética do Hospital ou Universidade vinculado ao BSCUP. O critério de utilização deverá ser o do centro de pesquisas a que está destinado;
Todas as informações referentes à mãe, ao(à) filho(a) e ao SCUP coletado, deverão ser tratadas de forma sigilosa, garantindo o anonimato;
No momento do parto deverá ser colhida amostra do sangue da mãe para a realização de testes de detecção de doenças infecciosas transmissíveis pelo sangue. A critério do centro de pesquisas de referência, outros testes poderão ser realizados nesta amostra.
Qualquer resultado alterado nos exames realizados, será comunicado à mãe pelo médico responsável do BSCUP;
O prontuário hospitalar da mãe e do(a) filho(a) poderão ser consultados a qualquer momento pelo BSCUP ou pelo centro de pesquisas, para obtenção de dados clínicos e história médica necessários;
▪ o BSCUP fica autorizado a detectar a unidade de SCUP caso não sejam atendidos aos critérios de armazenamento, ou seja excedido o seu prazo de validade;
▪ não receberemos nenhuma remuneração, compensação material ou financeira, ou privilégio pela doação da unidade de SCUP; ▪ a doação é livre e voluntária sendo facultada a desistência até o momento da coleta, sem que isto cause prejuízo ao atendimento da mãe e di recém-nascido;
80
▪ este consentimento prévio não obriga o hospital, a maternidade, ou o BSCUP a colher o SCUP do(a) nosso(minha) filho(a), se houver impedimentos técnicos para a coleta;
▪ lemos, compreendemos e estamos satisfeitos com todas as informações recebidas. Pudemos formular todas as perguntas convenientes e todas as dúvidas forma esclarescidas. ▪ Em conseqüência, damos o nosso consentimento para coleta do SCUP do(a) nosso(a) filho(a) e aceitamos as condições acima descritas.
Declaro que recebi cópia do presente Termo de Consentimento.
Assinatura do(s) responsável(eis) legal(ais):
___________________________________
___________________________________
Assinatura e carimbo do médico responsável pelo BSCUP:
_______________________________________________
Local: __________________________________________
Data: __________/__________/___________