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1 Introduo

Bactrias so um domnio de micro-organismos unicelulares, procariontes(desprovidos de envoltrio nuclear e organelas membranosas), segundo o sistemataxonmico constituam o reino Moneras, juntamente com as chamadas "algas azuis"ou "cianofceas" - hoje mais corretamente chamadas cianobactrias, As bactriaspodem ser encontradas na forma isolada ou em colnias. Podem viver na presena dear (aerbias), na ausncia de ar (anaerbias) ou, ainda, ser anaerbias facultativas.As bactrias classificam-se morfologicamente de acordo com a forma da clula e como grau de agregao.

Quanto a formaCoco : De forma esfrica ou subesfrica.Bacilo : Em forma de bastonete (do gnero Bacillus)Vibrio : Em forma de vrgula (do gnero Vibrio)Espirilo : de forma espiral/ondulada (do gnero Spirillum)Espiroqueta : Em forma acentuada de espiral.

Quanto ao grau de agregaoApenas os Bacilos e os cocos formam colnias.Diplococo : De forma esfrica ou subesfrica e agrupadas aos pares.Estreptococos : Formam cadeia semelhante a um "colar".Estafilococos : Uma forma desorganizada de agrupamento, formando cachos.Sarcina : De forma cbica, formado por 4 ou 8 cocos simetricamente postos.Diplobacilos : Bacilos reunidos dois a dois.Estreptobacilos : Bacilos alinhados em cadeia.

2 Estruturas da clula procariota

A clula bacteriana, por ser procaritica, no possui organelos membranares nemDNA organizado em verdadeiros cromossomas, como os das clulas eucariotas.Os pili so microfibrilas proteicas que se estendem da parede celular em muitasespcies Gram-negativas. Tm funes de ancoramento da bactria ao seu meio eso importantes na patognese. Um tipo especial de pilus o pilus sexual, estruturaoca que serve para ligar duas bactrias, de modo a trocarem plasmdeos.Os plasmdeos so pequenas molculas de DNA circular que coexistem com onucleide. So comumente trocados na conjugao bacteriana. Os plasmdeos tmgenes, incluindo frequentemente aqueles que protegem a clula contra os antibiticos.H cerca de 20 mil ribossomos em um citoplasma bacteriano. Os ribossomosprocariotas so diferentes dos eucariotas e essas diferenas foram usadas paradesenvolver antibiticos que s afetam os ribossomos bacterianos.

O citoplasma preenchido pelo hialoplasma, um lquido com consistncia de gel,semelhante ao dos eucariotas, com sais, glicose e outros acares, RNA, protenasfuncionais e vrias outras molculas orgnicas.A membrana celular uma dupla camada de fosfolpidos, com protenas imersas.A parede celular bacteriana uma estrutura rgida que recobre a membranacitoplasmtica e confere forma s bactrias. uma estrutura complexa composta porpeptidoglicanos - polmeros de carboidratos ligados a protenas. Algumas espcies debactrias tm uma camada de polissacardeos que protege contra desidratao,fagocitose e ataque de bacterifagos, chamada de cpsula.O nucleide consiste em uma nica grande molcula de DNA com protenasassociadas, sem delimitao por membrana - portanto, no um verdadeiro ncleo. Oseu tamanho varia de espcie para espcie.

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O flagelo uma estrutura proteica que roda como uma hlice. Muitas espcies debactrias movem-se com o auxlio de flagelos. Os flagelos bacterianos socompletamente diferentes dos flagelos dos eucariotas.

3 Classificao das bactrias

Hans Christian Gram, um bacteriologista dinamarqus, estudou e definiu a tcnicapara corar bactrias, a colorao Gram, em 1884. Nesta ocasio, experimentalmente,corou lminas com esfregaos com violeta de genciana e percebeu que se asbactrias existentes nestes esfregaos uma vez coradas no desbotavam com lcool,se previamente fossem tratadas com iodo, avanando e aprimorando o mtodo, eleadicionou ainda outros corantes denominados contra-corantes, tais como safranina efucsina bsica. A forma da bactrias pode ser observada atravs de colorao deGram que divide as bactrias em dois grupos: Gram-positivas e Gram-negativas, istodepender da parede celular da bactria.A parede da clula Gram-negativa constituda por estruturas de mltiplas camadasbastante complexas, que no retm o corante. J a parede da clula Gram-positiva

consiste de nica camada que retm o corante aplicado, no adquirindo a coloraodo segundo corante.

Componente Gram Positivas Gram negativasPeptdeoglicano Espesso, muitas camadas Fina, camada nicacido teicico Sim No

Lipopolissacardeo No Sim

Observe melhorna figura abaixo:

http://www.infoescola.com/bioquimica/coloracao-de-gram/http://www.infoescola.com/reino-monera/bacterias/http://www.infoescola.com/elementos-quimicos/iodo/http://www.infoescola.com/microbiologia/bacterias-gram-positivas-e-gram-negativas/http://www.infoescola.com/microbiologia/bacterias-gram-positivas-e-gram-negativas/http://www.infoescola.com/elementos-quimicos/iodo/http://www.infoescola.com/reino-monera/bacterias/http://www.infoescola.com/bioquimica/coloracao-de-gram/

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4 Componentes da parede celular

4.1 Peptdeoglicano

formado por dois tipos de acares (o cido N-acetilmurmico e a N-acetilglucosamina) e alguns aminocidos. O peptidoglicano a estrutura que confererigidez parede celular de bactrias, determina a forma da bactria e a protege da liseosmtica, quando em meio hipotnico. O cido N-acetilmurmico e a N-acetilglucosamina esto ligados entre si por uma ligao glicosdica denominada(14). Por sua vez, oligopptidos ligam molculas de cido N- acetilmurmico entresi. Estes oligopptidos possuem tanto L- como D-aminocidos. Em consequncia dasligaes que ocorrem entre as cadeias de glicano e de aminocidos, a molcula dopeptidoglicano possui a forma de uma rede.

4.2 Lipopolissacardeos

Lipopolissacardeo (LPS) uma molcula de grandes dimenses constituda de umlpido e um polissacardeo (carboidrato) ligados por uma ligao covalente. LPS umdos componentes principais da membrana exterior de bactrias gram-negativas,contribuindo muito para a integridade estrutural da bactria, protegendo a membranade certos tipos de ataque qumico. O LPS uma endotoxina, provocando uma forteresposta por parte de sistemas imunitrios

4.3 cido teicico

Estes polmeros de glicerolfosfato ou ribitolfosfato esto localizados na camadaexterna da parede celular de bactrias Gram-positivas e estendem-se pela parede.

5 Bactrias lcool cido Resistentes

As bactrias cido-lcool resistentes no podem ser classificadas segundo o Gram, aqual a tcnica mais comum na microbiologia contempornea, entretanto podem sertingidas com alguns corantes concentrados combinados com calor. Uma vez tingidatem a capacidade de resistir a decolorao de uma combinao de lcool-cido, o qual o descolorante mais comum nos protocolos de colorao de bactrias, de onde vemo nome lcool-cido resistente.

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A alta concentrao de cido miclico na parede celular, como as bactrias do gneroMycobacterium, a causa da baixa absoro e alta reteno da colorao (fucsina). Aforma mais comum para poder identificar este tipo de bactrias atravs da tcnica decolorao de Ziehl-Neelsen, onde a bactria fica tingida em vermelho e se agrega umacolorao de contraste de azul de metileno a qual permite apreciar de melhor forma abactria contra um fundo azul. Outra tcnica o mtodo Kinyoun na qual a bactria colorida de vermelho claro e colocada contra um fundo verde. Bactrias cido-lcoolresistentes podem ser visualizadas por microscopia de fluorescncia usando corantesfluorescentes especficos (corante auramina-rodamina, por exemplo). Algumasbactrias podem tambm ser parcialmente cido-lcool resistentes.

6 Crescimento e Metabolismo

As bactrias se reproduzem por fisso binria, processo no qual uma clula parentalse divide para formar duas clulas-filhas. Devido a esse fato, dizemos que as bactriaspossuem crescimento exponencial (crescimento logaritmo), o tempo de duplicaovaria de 20 minutos para um E.coli e de 24hs para M. Tuberculosis. O ciclo de

crescimento das bactrias apresenta 4 fases.Lag: perodo varivel, onde ainda no h um aumento significativo da populao. Aocontrrio, um perodo onde o nmero de organismos permanece praticamenteinalterado. Esta fase apenas observada quando o inculo inicial proveniente deculturas mais antigas. A fase lag ocorre porque as clulas de fase estacionriaencontram-se em falta de vrias coenzimas essenciais e/ou outros constituintescelulares necessrios absoro dos nutrientes presentes no meio. A fase lagtambm observada quando as clulas sofrem traumas fsicos (choque trmico,radiaes) ou qumicos (produtos txicos), ou quando so transferidas de um meio ricopara outro de composio mais pobre, devido a necessidade de sntese de vriasenzimas. Assim, durante este perodo observa-se um aumento na quantidade de

protenas, no peso seco e no tamanho celular.

Log ou exponencial: nesta etapa, as clulas esto plenamente adaptadas, absorvendoos nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e se duplicando. Deve serlevado em conta tambm que neste momento, a quantidade de produtos finais demetabolismo ainda pequena. A taxa de crescimento exponencial varivel, deacordo com o tempo de gerao do organismo em questo. Geralmente, procariotoscrescem mais rapidamente que eucariotos. Nesta fase so realizadas as medidas detempo de gerao. Geralmente, ao final da fase log, as bactrias passam a apresentarfentipos novos, decorrentes do processo de comunicao denominado "quorumsensing".

Estacionria: Nesta fase, os nutrientes esto escasseando e os produtos txicos estotornando-se mais abundantes. Nesta etapa no h um crescimento lquido dapopulao, ou seja, o nmero de clulas que se divide equivalente ao nmero declulas que morrem. Na fase estacionria que so sintetizados vrios metablitossecundrios, que incluem antibiticos e algumas enzimas. Nesta etapa ocorre tambma esporulao das bactrias. Foram detectados alguns genes (sur) que sonecessrios sobrevivncia das clulas na fase estacionria. Alm destes, existemoutros genes (fatores s alternativos da RNA polimerase, protenas protetoras contradano oxidativo).

Declnio: A maioria das clulas est em processo de morte, embora outras aindaestejam se dividindo. A contagem total permanece relativamente constante, enquantoa de viveis cai lentamente. Em alguns casos h a lise celular. Culturas descontnuastendem a sofrer mutaes que podem repercutir na populao como um todo. As

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prprias condies ambientais tendem a promover variaes de carter fenotpico(reversvel) nas culturas.

O metabolismo um conjunto de eventos altamente regulado. A vida s possvel seh um alto nvel de regulao controlando cada evento celular. Tal nvel de regulao possvel pela propriedade das enzimas reconhecerem seus substratos de forma

especfica. Com base nesta propriedade, as enzimas obedecem a rotas pr-programadas: as vias biossintticas (anabolismo) e as vias catablicas (catabolismo).A absoro e utilizao de compostos orgnicos ou inorgnicos requeridos para ocrescimento e manuteno das funes celulares, a capacidade de sobrevivncia,funcionamento, replicao de clulas bacterianas e os processos qumicos envolvidosnesses eventos constituem o metabolismo bacteriano.

Metabolismo Hetreotrfico - sntese de ATP a partir da energia liberada pela oxidaode compostos orgnicos, transformando-os em molculas mais simples e utilizadascomo fonte de carbono;Metabolismo Autotrfico so capazes de utilizar CO2 como principal fonte decarbono, obter energia pela sntese de ATP pela oxidao de compostos inorgnicos

ou captao de energia luminosa.O modo pelo qual as bactria fazem esta transformao de energia define seuprocesso metablico. As bactrias que oxidam compostos qumicos empregam osprocessos de respirao aerbica, anaerbica ou fermentao, enquanto as queutilizam luz como fonte de energia fazem fotossntese.Para maioria dos organismos o oxignio aumenta o metabolismo e o crescimento, poisatua como aceptor de hidrognio nos passos finais de produo de energia. Devido aofato do oxignio gerar duas molculas txicas, o perxido de hidrognio e o radicallivre superxido, as bactrias necessitam de pelo menos duas enzimas para utiliz-lo,a superxido dismutase e a catalase.

A capacidade de crescer na presena ou na ausncia de oxignio divide as bactrias

em cinco gruposAerbicas estritas: Bactrias aerbicas estritas crescem apenas onde hdisponibilidade de oxignio, como por exemplo, as bactrias do gnero Pseudomonas.Microaerfilas: Bactrias microaerfilas requerem uma quantidade reduzida deoxignio; altas concentraes de oxignio lhes so txicas. As bactrias microaerfilassobrevivem em ambientes com alta concentrao de dixido de carbono e baixasconcentraes de oxignio, como por exemplo, as bactrias do gneroCampylobacter.Anaerbicas facultativas: Bactrias anaerbicas facultativas utilizam oxignio em seumetabolismo energtico, mas tambm podem crescer na ausncia de oxignio. Asbactrias Escherichia coli e espcies de Staphylococcus so encontradas no tratointestinal e urinrio onde h pouca disponibilidade de oxignio. Todas as bactriaspertencentes famlia Enterobacteriaceae so anaerbicas facultativas.

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Anaerbicas aerotolerantes: Bactrias anaerbicas aerotolerantes suportam apresena de oxignio, sem utiliz-lo em seu metabolismo. Por exemplo, a bactriaLactobacillus acidophillus.Anaerbicas estritas: Bactrias anaerbicas estritas no crescem na presena deoxignio que lhes txico. A maioria das espcies anaerbicas estritas encontradano solo ou em micro-ambientes em organismos animais que tenham se tornadoanaerbico, como ferimentos profundos ou ajuno das gengivas com os dentes. Soexemplos de organismos anaerbicos estritos as bactrias do solo Clostridium tetani(causadora do ttano), Clostridium botulinum (causadora do botulismo) e as bactriasassociadas com doenas periodontais, como Porphiromonas gengivallis e Prevotellaintermedia. A grande maioria das bactrias associadas aos intestinos de animais soanaerbicas estritas. Para o crescimento de bactrias anaerbicas estritas emlaboratrio so requeridos procedimentos especiais de cultivo, tais como a exclusototal do oxignio do meio e do ambiente de crescimento atravs do uso de agentesredutores que reajam com o oxignio gasoso. Na presena de oxignio, o radicalsuperxido (O2-) e perxido de hidrognio (H2O2) so formados como subprodutosdas atividades das enzimas oxidativas que participam da sntese de ATP. Nas

bactrias aerbicas estritas e na maioria das anaerbicas facultativas, o radicalsuperxido convertido em oxignio molecular (O2) e em perxido de hidrognio(H2O2) pela enzima superxido dismutase. O perxido de hidrognio convertido emoxignio molecular e gua pela enzima catalase (algumas espcies de bactriasanaerbias facultativas e de aerotolerantes no possuem a catalase). As bactriasanaerbicas estritas no sintetizam nem a catalase nem a superxido dismutase e somortas pelos efeitos txicos do superxido e do perxido de hidrognio.

Metabolismo dos fungos

Os fungos so microrganismos heterotrficos e, em sua maioria, aerbios obrigatrios.No entanto, certas leveduras fermentadoras, aerbias facultativas, se desenvolvem em

ambientes com pouco oxignio ou mesmo na ausncia deste elemento. Os fungospodem germinar, ainda que lentamente, em atmosfera de reduzida quantidade deoxignio. O crescimento vegetativo e a reproduo assexuada ocorrem nessascondies, enquanto a reproduo sexuada se efetua apenas em atmosfera rica emoxignioOs fungos produzem enzimas como lipases, invertases, lactases, proteinases,amilases etc., que hidrolisam o substrato tornando-o assimilvel. Alguns substratospodem induzir a formao de enzimas degradativas; h fungos que hidrolisamsubstncias orgnicas mais complexas (quitina, osso, couro, inclusive materiaisplsticos). Muitas espcies fngicas podem se desenvolver em meios mnimos,contendo amnia ou nitritos, como fontes de nitrognio. As substncias orgnicas, depreferncia, so carboidratos simples como D-glicose e sais minerais como sulfatos e

fosfatos. Oligoelementos (ferro, zinco, mangans, cobre, molibdnio e clcio) soexigidos em pequenas quantidades. Alguns fungos requerem fatores de crescimento,que no conseguem sintetizar, em especial, vitaminas (tiamina, biotina, riboflavina,cido pantotnico, etc).

7 Cultura e isolamento de microorganismos

Entre os principais componentes de um meio de cultura esto s fontes de carbono eenergia como os acares, as fontes de nitrognio, fsforo e sais minerais. Outroscomponentes mais especficos podem ser encontrados em um meio especifico paraum determinado organismo (meio seletivo), estes so os fatores de Crescimento comoas vitaminas, aminocidos, e outros mais. Por outro lado podemos ter num meioagentes/constituintes que inibam o crescimento de determinados microrganismos,sendo estes tambm considerados meios seletivos.

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Alm de meios seletivos existem tambm meios que permitem diferenciarmicrorganismos (meios diferenciadores ou diferenciais), o exemplo mais simples aexistncia de um indicador de pH que permite verificar se, por exemplo, um acarpresente no meio metabolisado pois, ao ser, implica a produo de metablitos queacidificam o meio alterando o seu pH e consequentemente a alteram a cor doindicador de pH.Os meios de cultura so classificados quanto ao estado fsico em slidos, quandocontm agentes solidificantes, principalmente gar (cerca de 1 a 2,0 %). Os semi-slidos, quando a quantidade de gar e ou gelatina de 0,075 a 0,5 %, dando umaconsistncia intermediria, de modo a permitir o crescimento de microrganismos emtenses variadas de oxignio ou a verificao da motilidade e tambm paraconservao de culturas. Os lquidos, sem agentes solidificantes, apresentam-se comoum caldo, utilizados para ativao das culturas, repiques de microrganismos, provasbioqumicas, e dentre outros.Os meios de cultura podem ainda ser classificados quanto composio qumicapodem ser simples (meios bsicos) ou complexos Bsicos so aqueles que permitemo crescimento bacteriano, sem satisfazer contudo nenhuma exigncia em especial (Ex.

caldo e gar simples), e complexos quando cumprem com as exigncias vitais dedeterminados microrganismos, como meio de infuso de crebro e corao, gar sucode tomate, gar sangue, meio de Loeffler (com soro bovino), gar chocolate (garsimples fundido, adicionado de sangue e aquecido a 80 C), etc.

De acordo com a finalidade bacteriolgica ou micolgica os meios especiais podemser classificados em:Meios de Enriquecimento - quando proporcionam nutrientes adequados aocrescimento de microrganismos presentes usualmente em baixos nmeros ou decrescimento lento, bem como microrganismos exigentes e fastidiosos. Esses meiostm a propriedade de estimular o crescimento de determinados microrganismos, masexistem alguns que tambm podem inibir o crescimento de outros. Ex. Caldo

Tetrationato e Selenito-Cistina para cultivo de Salmonelas (lquidos), Caldo Tioglicolatopara Clostridium perfringens.Diferenciais - quando contm substncias que permitem estabelecer diferenas entremicrorganismos muito parecidos, tais como meio de Teague ou Eosina Azul deMetileno (diferencial para coliformes), gar MacConkey para a diferenciao deenterobactrias, gar sangue, gar Baird-Parker para isolamento e diferenciao decocos Gram positivos (slidos).Seletivos - os que contm substncias que inibem o desenvolvimento de determinadosgrupos de microrganismos, permitindo o crescimento de outros. Exemplo: meios comtelurito de potssio (para isolamento de Corynebacterium diphtheriae), garSalmonella-Shigella (SS) e gar MacConkey, meios com sais biliares e verde brilhantepara isolamento seletivo de Salmonella, meios com 7,5% de cloreto de sdio, meio

Baird-Parker, para isolamento de Staphylococcus aureus, meios com antibiticos paraisolamento de diversos microrganismos (TSC, SFP, meio de Blaser, meio de Skirrow,etc.). A maioria deles tambm diferencial, permitindo diferenciar as colnias (slidos)dos microrganismos.Meios de triagem - meios que avaliam determinadas atividades metablicas permitindocaracterizao e identificao perfunctria ou presuntiva de muitos microrganismos(gar trplice acar e ferro, meio Instituto Adolfo Lutz, uria, etc.);Identificao - prestam-se para a realizao de provas bioqumicas e verificao defunes fisiolgicas de organismos submetidos a identificao (meiosOxidao/Fermentao, gar Citrato, Caldo nitrato, meio semi-slido, caldo triptofano,meio de Sulfito Indol Motilidade, etc.;Dosagem - empregados nas determinaes de vitaminas, antibiticos e aminocidos;Contagem - empregados para a determinao quantitativa da populao microbiana(Agar de Contagem em Placas, TSC, Agar Batata Dextrose, gar Baird-Parker, etc.);

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Estocagem ou manuteno - utilizados para conservao de microrganismos nolaboratrio, i.e. garantem a viabilidade de microrganismos (gar Sabouraud, Meioscom leite, gar suco de tomate, gar sangue, gar Simples, meio semi-slido, etc.)

8 Mtodos de estocagem e preservao

O armazenamento inadequado de culturas por longos perodos afim de utilizar empesquisa e/ou produo pode resultar contaminao, perda de viabilidade e mutao(perda das caractersticas fisiolgicas), para isso, necessita de mtodos eficazes quegarantam a preservao das caractersticas determinantes do microorganismo a longoprazo, que favorece a diminuio do crescimento e das atividades metablicas oumesmo o crescimento em meio mnimo de resduos metablicos, pois estes podemcomprometer a viabilidade da cultura.- curto prazo :repique contnuo- mdio prazo: preservao em leo mineral, preservao em gua, congelamento a -20C, secagem em slica, solo e papel de filtro- longo-termo: liofilizao, congelamento a -80C, criopreservao em nitrognio

lquido.Repique contnuo- diminuio do metabolismo (meios mnimos como Agar simples e baixa temperatura);- temperatura de estocagem: temperatura ambiente de 2-3 meses; geladeira (4 a 7 C)de 4-6 meses- freqncia entre as transferncias: determinao emprica- minimizar o n de repiques evitar a seleo de mutantes- examinar a pureza em cada transferncia- conservar em duplicataVantagens: baixo custo, no requer equipamentos especializados, o manuseio simples.

Desvantagens: riscos de contaminao e possvel perda da linhagem, perda decaractersticas morfolgicas, fisiolgicas ou patogenicidade, seleo de clulasatpicas (variantes ou mutantes), superviso especializada, mo-de-obra, espaorelativamente grande para a armazenamento.

Preservao em leo mineralVantagens: menor custo de equipamento, evita contaminao por carosDesvantagens: necessidade de mais transferncias at que a cultura revigore, requerespao para armazenamento.

Preservao em gua (Castellani)Vantagens: boa taxa de viabilidade, evita contaminao por caros

Desvantagens: limitado a organismos que aderem ao gar (Castellani), dificuldade daretirada dos cubos na reativao, crescimento durante a estocagem, requer espao p/armazenamento, riscos de contaminao.

Secagem em slica, solo e papel de filtroVantagens: simples e de baixo custo, no requer equipamento especial, estabilidadeelevada, caros no sobrevivem.Desvantagens: mtodos limitados a bactrias e fungos filamentosos esporulados, riscode contaminao devido ao manuseio sucessivo, papel: poucos dados sobre osucesso do mtodo.

Liofilizao

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Vantagens: vedao total da amostra, longa viabilidade, estabilidade elevada emmuitas espcies, produo em larga escala, no requer armazenamento especial(somente ao abrigo da luz), fcil distribuio e transporte.Desvantagens: muitas espcies no sobrevivem ao processo, viabilidadeocasionalmente insatisfatria, mo-de-obra especializada, requer equipamentossofisticados.

Congelamento e criopreservao em nitrognio lquidoVantagens: condies estveis por longos perodos, vedao completa, evitandocontaminao, utilizao para esporulados e no esporulados.Desvantagens: viabilidade ocasionalmente insatisfatria, requer equipamentosofisticado, suprimento contnuo de N2, boa infra-estrutura caso de acidentes devazamento.

9 Mtodos de esterilizao, desinfeco e assepsia

Esterilizao: o processo pelo qual todos os microrganismos viveis so eliminados

ou destrudos, inclusiva os esporos de bactrias, a forma de vida mais resistente.Desinfeco: A desinfeco envolve a destruio de microrganismos patognicosassociados a objetos inanimados, geralmente por meio fsico ou qumico. Todos osdesinfetantes so efetivos contra as formas vegetativas dos microrganismos, mas nonecessariamente contra seus esporos.

Assepsia: A assepsia envolve a inativao ou destruio por meio qumico dosmicrorganismos associados ao animal. Antisspticos podem ser bactericidas oubacteriostticos; o estado formador irreversvel, mas o ltimo reversvel. Parapropsitos ordinrios, os termos desinfetantes e antisspticos so usados comosinnimos.

9.1 Esterilizao por calor mido

- AutoclavagemFaz-se atravs da autoclave cujo funcionamento idntico ao da panela de pressosendo a temperatura necessria para esterilizaao de 121C, e o tempo deesterilizao de cerca de 15 minutos. Este tempo de esterilizao dever seraumentado quando se enche bastante a autoclave com meios para esterilizar- TindalizaoEste mtodo consiste numa esterilizao fraccionada em que o meio sofre 3aquecimentos em 3 dias consecutivos, para destruio de formas vegetativasbacterianas que evoluem de esporos. Utiliza temperaturas inferiores a 100C, e faz-se

em banho-maria, onde se mergulham os frascos de meio a esterilizar hermticamentefechados, durante cerca de 1h, repetindo-se o tratamento em 3 dias consecutivos.- Pasteurizao:Esterilizao utilizando uma temperatura inferior a 100 C, geralmente 57 a 60 C embanho-maria. Ocorre eliminao de microrganismos sensveis ao calor, entre estes,estirpes patognicas, sem adulterao das qualidades do produto a pasteurizar.

9.2 Esterilizao por calor seco

Colocar o material por um periodo prolongado numa estufa a 180C, no mnimo 2horas. Este tipo de esterilizao utilizado para material de vidro, para material dedisseco, mas no muito efetivo contra aquelas bactrias e fungos que produzemesporos resistentes secura.

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9.3 Irradiao

Outro modo no qual a energia serve como um agente antimicrobiano o uso daradiao. Radiao definida como energia emitida da atividade de um tomo edispersa a uma alta velocidade atravs da massa ou espao. caracterizada por umfaixa de comprimento de ondas conhecida como espectro eletromagntico. Emboraexistam outras formas de radiao, a mais simples de conseguir e manipular: aradiao ultravioleta. Na prtica cotidiana a fonte de raios ultravioleta a lmpadagermicida, que gera radiao a 254 nm. A radiao ultravioleta no to penetrantequanto a radiao ionizante. Isso porque a radiao ultravioleta passa livremente peloar, relativamente pela gua, e muito pouco por slidos, ento os objetos a seremdesinfetados necessitam estar diretamente expostos para ao completa. Como aradiao UV passa entre a clula, e inicialmente absorvida pelo DNA. Danosespecficos moleculares ocorrem nas bases pirimidnicas (Tiamina e Citosina) queforma ligaes anormais. Como resultado a clula para de crescer e morre. Alm dasmutaes genticas a radiao UV tambm gera substncias txicas fotoqumicasconhecidas como radicais livres. eficiente: destruio de clulas e esporos de e

fungos, formas vegetativas de bactrias, protozorios e vrus.Desvantagens e precaues: Alm da baixa penetrao em materiais slidos comovidro, tecidos, massas, meios difusos, objetos densos, os materiais precisam serespalhados de forma que a maior quantidade de luz possvel incida sobre eles. Outroponto negativo que a radiao UV prejudicial nos tecidos humanos, como tambmcausa queimaduras, danos na retina, cncer e rugas na pele (envelhecimento celular).Uso: Desinfeco do ar, ambientes, alguns lquidos, reduo de microrganismos do ar,desinfeco de alimentos e gua.

9.4 Filtrao

A filtrao envolve a remoo de microrganismos de solues lquidas ou de gases

atravs do atravessamento de membranas filtrantes. Estas podem ser de vriosmateriais (mais vulgarmente, acetato de celulose ou de policarbonato) e tm dimetrosde poro muito pequenos (usualmente 0,2 m) onde as clulas microbianas ficamretidas.

9.5 Esterilizao Qumica

Com substncias volteis, lcool etlico a 70%, com sais metlicos ou compostosorgnicos de metais (mertiolato e mercurocromo), com halogneos (cloro sob a formade hipoclorito de clcio e o iodo), os cidos e lcalis aumentam a concentraohidrogeninica do meio e aceleram a taxa de mortalidade dos microorganismos. Oscompostos de amnio quaternrios so atxicos e extremamente enrgicos sobre

bactrias e vrus.- Formaldedo: Como desinfetante mais utilizado a formalina, soluo em gua a10% ou em lcool a 8%, sendo bactericida aps exposio de 30 minutos e esporicidaaps 18 horas. No pode ser utilizado como agente de assepsia, pois corrosivo,txico, irritante de vias areas, pele e olhos.- Iodo: Alm do uso como antissptico pode ser usado na desinfeco de vidros,ampolas, metais resistentes oxidao e bancadas. A formulao pode ser de lcooliodado, contendo 0,5 e 1,0 % de iodo livre em lcool etlico de 77% (v/v), quecorresponde a 70% em peso. O (PVPI) Iodopovidona pode ser utilizado na assepsiadas mos, regies para injeo, campos cirrgicos etc. No se recomenda o uso emmucosas (ex. boca, olhos, nus etc.).- Cloro: O hipoclorito est indicado para desinfeco e descontaminao desuperfcies e de artigos plsticos e borracha. Tambm utilizado em superfcies dereas como lavanderia, lactrio, copa, cozinha, balces de laboratrio, banco de

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sangue, pisos etc. um agente desinfetante de amplo espectro, barato, no txicodentro de suas especificaes (utilizar equipamento de proteo individual comomscara, culos, luvas e aventais).- lcool: O lcool amplamente usado como desinfetante, tanto o lcool etlico, 70%(p/v), como o isoproplico, 92% (p/v), por terem atividade germicida, menor custo epouca toxicidade, sendo que o lcool etlico tem propriedades germicidas superioresao isoproplico. O seu uso restrito pela falta de atividade esporicida, rpidaevaporao e inabilidade em penetrar na matria proteica. recomendvel paradesinfeco de nvel mdio, com tempo de exposio de 10 minutos, sendorecomendveis trs aplicaes intercaladas pela secagem natural. A concentraoideal da faixa de 60% a 90%. O mecanismo de ao do lcool depende de suaconcentrao. Diferentemente de outros desinfetantes o lcool mais concentrado ouabsoluto no exerce maior poder de desinfeco. Em concentraes de lcoolsuperiores a 50%-70% eles dissolvem membranas lipdicas, desestabiliza a tenso dasuperfcie celular, comprometendo a integridade da membrana levando as clulas alise. J as concentraes 60% a 70% lcool entra no nucleoplasma (meio quecontorna o material gentico) desnatura protenas atravs de coagulao, outro fato

importante que o lcool 70% possui maior tempo de ao (evapora mais devagar). Agua necessria para a coagulao das protenas, e, portanto a concentrao idealpara a atividade microbicida de 70% lcool. O lcool no esporicida a temperaturaambiente. No entanto, eficaz contra formas vegetativas de muitas bactrias eesporos de fungos.- Clorexidina: O composto clorexidina (Hibiclens, Hibitane) um complexo orgnicocontendo cloro e anis fenlicos. Seu mecanismo de ao ocorre nas duasmembranas celulares pela diminuio da tenso superficial e da estrutura proteicaatravs de desnaturao. Em concentraes moderado-altas um bactericida parabactrias tanto gram-positivas quanto gram-negativas, porm ineficaz contra esporos.Sua ao em fungos e vrus varivel. A clorexidina tem vantagens sobre outrosantisspticos devido seu carter suave/benigno, baixa toxicidade, ao rpida e baixa

absoro tecidual. o antissptico mais utilizado no controle de StaphylococcusMRSA (cepas bacterianas resistentes a antibiticos) em hospitais. Dentre as suasprincipais aplicaes, destacam-se: degermao das mos e antebrao da equipe;preparo da pele (pr-operatrio e procedimentos invasivos);lavagem simples dasmos.- Triclosan: Apresenta ao contra bactrias Gram positivas e a maioria das Gram-negativas, exceto para a Pseudomonas aeruginosa, e apresenta pouca ao contrafungos. O triclosan pode ser absorvido atravs da pele ntegra, mas semconsequncias sistmicas relevantes. A sua ao antimicrobiana se faz num perodointermedirio e tem uma excelente ao residual. Sua atividade minimamenteafetada pela presena de matria orgnica. O triclosan encontrado em formulaesde sabonetes em barra e lquidos, e um dos agentes utilizados na degermao de

mdicos cirurgies em muitos hospitais.

10 Anlise microbiolgica

De acordo com as Boas Prticas em Farmcia, os produtos farmacuticos devempossuir qualidade compatvel com especificaes determinadas por cdigos oficiais,visando assegurar seu uso. A qualidade microbiolgica das matrias-primasempregadas nas formulaes de medicamentos e cosmticos fator primordial parase alcanar eficincia e segurana. A Farmcia Magistral representa um importantesegmento do mercado farmacutico brasileiro. A Anvisa, por meio da Resoluo33/2000, instituiu as Boas Prticas de Fabricao em Farmcia, buscando estabelecerrgidos parmetros de qualidade em todas as etapas de fabricao de um produtomanipulado de forma magistral. Produtos no estreis so aqueles nos quais seadmite a presena de carga microbiana, embora limitada. O objetivo imediato de uma

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anlise microbiolgica comprovar a ausncia de microrganismos patognicos edeterminar o nmero de microrganismos viveis, em funo dos tipos de utilizao doproduto, por exemplo para uso tpico ou oral. Cargas microbianas elevadas podemcomprometer a estabilidade do produto, conseqentemente, pode haver perda daeficcia teraputica, por degradao do princpio ativo, por alterao de parmetrofsico fundamental para a sua atividade, como pH .Uma matria-prima que merece especial ateno devido ao amplo uso emformulaes farmacuticas e cosmticas a gua, a qual tambm utilizada emdiferentes tipos de limpeza e operaes unitrias nas farmcias. Pode recebertratamento de purificao distinto conforme a aplicao que se deseja, sendo osmtodos mais utilizados, destilao e deionizao. Deionizao tem sido muito usado,principalmente frente economia nos gastos com gua e energia em relao destilao. A pureza da gua est relacionada ausncia de patgenos e a umacarga mnima de microrganismos no patognicos, estabelecidos pela UNITEDSTATES PHARMACOPEIA (2000); BRITISH PHARMACOPOEA (2000); AMERICANPUBLIC HEALTH ASSOCIATION (1995). Na anlise microbiolgica da gua para finsfarmacuticos, tem-se como limites de aceitao em termos de contagem padro em

placas de bactrias heterotrficas, no mais que 102 UFC /mL (UNITED STATESPHARMACOPEIA, 2000), coliformes totais:

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- Deteco de mecanismos envolvidos na resistncia quinolonas em bacilos Gram-negativos e cocos Gram-positivos- Deteco da resistncia a glicopeptdeos em cocos Gram-positivos.

12 Mecanismos de resistncia bacteriana

Ao discutirmos a resistncia bacteriana conveniente considerar tanto os mecanismosde ao dos antimicrobianos quanto as propriedades necessrias para a sua eficcia.Os antimicrobianos devem ser capazes de:1. alcanar os alvos moleculares, que so primariamente intracelulares. Para isso, oantimicrobiano, em quantidades suficientes, precisa ultrapassar a membrana celularbacteriana;2. interagir com uma molcula-alvo de modo a desencadear a morte da bactria;3. evitar a ao das bombas de efluxo que jogam os antimicrobianos para fora daclula bacteriana;4. evitar a inativao por enzimas capazes de modificar o frmaco no ambienteextracelular ou no interior da clula bacteriana.

Com freqncia bactrias utilizam mais de uma estratgia para evitar a ao dosantimicrobianos; assim, a ao conjunta de mltiplos mecanismos pode produzir umacentuado aumento da resistncia aos antimicrobianos. A resistncia a determinadoantimicrobiano pode constituir uma propriedade intrnseca de uma espcie bacterianaou uma capacidade adquirida. Para adquirir resistncia, a bactria deve alterar seuDNA, material gentico, que ocorre de duas formas:1. induo de mutao no DNA nativo;2. introduo de um DNA estranho - genes de resistncia - que podem ser transferidosentre gneros ou espcies diferentes de bactrias.Os genes de resistncia quase sempre fazem parte do DNA de plasmdeosextracromossmicos, que podem ser transferidos entre microrganismos. Alguns genesde resistncia fazem parte de unidades de DNA denominadas transposons que se

movem entre cromossomos e plasmdeos transmissveis. O DNA estranho pode seradquirido mediante transformao, resultando em trocas de DNA cromossmico entreespcies, com subseqente recombinao interespcies.

Alterao de permeabilidade

A permeabilidade limitada constitui uma propriedade da membrana celular externa delipopolissacardeo das bactrias Gram-negativas. A permeabilidade dessa membranareside na presena de protenas especiais, as porinas, que estabelecem canaisespecficos pelos quais as substncias podem passar para o espao periplasmtico e,em seguida, para o interior da clula. A permeabilidade limitada responsvel pelaresistncia intrnseca dos bacilos Gram-negativos penicilina, eritromicina,

clindamicina e vancomicina e pela resistncia de Pseudomonas aeruginosa aotrimetoprim. As bactrias utilizam esta estratgia na aquisio de resistncia. Assim,uma alterao na porina especfica da membrana celular externa de P. aeruginosa,pela qual o imipenem geralmente se difunde, pode excluir o antimicrobiano de seualvo, tornando P. aeruginosa resistente ao imipenem.

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Alterao do stio de ao do antimicrobiano

A alterao do local-alvo onde atua determinado antimicrobiano, de modo a impedir aocorrncia de qualquer efeito inibitrio ou bactericida, constitui um dos maisimportantes mecanismos de resistncia. As bactrias podem adquirir um gene que

codifica um novo produto resistente ao antibitico, substituindo o alvo original.Staphylococcus aureus resistente oxacilina e estafilococos coagulase-negativosadquiriram o gene cromossmico Mec A e produzem uma protena de ligao dapenicilina (PBP ou PLP) resistente aos -lactmicos, denominada 2a ou 2', que suficiente para manter a integridade da parede celular durante o crescimento, quandooutras PBPs essenciais so inativadas por antibimicrobianos -lactmicos.Alternativamente, um gene recm-adquirido pode atuar para modificar um alvo,tomando-o menos vulnervel a determinado antimicrobiano. Assim, um genetransportado por plasmdeo ou por transposon codifica uma enzima que inativa osalvos ou altera a ligao dos antimicrobianos como ocorre com eritromicina eclindamicina.

Bomba de efluxo

O bombeamento ativo de antimicrobianos do meio intracelular para o extracelular, isto, o seu efluxo ativo, produz resistncia bacteriana a determinados antimicrobianos. Aresistncia s tetraciclinas codificada por plasmdeos em Escherichia coli resulta desteefluxo ativo.

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Mecanismo enzimtico

O mecanismo de resistncia bacteriano mais importante e freqente a degradaodo antimicrobiano por enzimas. As -lactamases hidrolisam a ligao amida do anelbeta-lactmico, destruindo, assim, o local onde os antimicrobianos -lactmicos ligam-se s PBPs bacterianas e atravs do qual exercem seu efeito antibacteriano. Foram

descritas numerosas -lactamases diferentes. Essas enzimas so codificadas emcromossomos ou stios extracromossmicos atravs de plasmdeos ou transposons,podendo ser produzidas de modo constitutivo ou ser induzido. A resistncia quaseuniversal de S. aureus penicilina mediada por uma -lactamase induzvel,codificada por plasmdeo. Foram desenvolvidos -lactmicos capazes de se ligaremirreversivelmente s -lactamases, inibindo-as. Esses compostos (cido clavulnico,sulbactam, tazobactam) foram combinados com as penicilinas para restaurar suaatividade, a despeito da presena de -lactamases em estafilococos e hemfilos.

Nas bactrias Gram-negativas, o papel das -lactamases na resistncia bacteriana complexo e extenso. Verifica-se a presena de quantidades abundantes de enzimas;muitas delas inativam vrios antimicrobianos -lactmicos, e os genes que codificamessas -lactamases esto sujeitos a mutaes que expandem a atividade enzimtica eque so transferidos de modo relativamente fcil. Alm disso, as -lactamases debactrias Gram-negativas so secretadas no espao periplasmtico, onde atuam emconjunto com a barreira de permeabilidade da parede celular externa, produzindoresistncia clinicamente significativa a antimicrobianos. As - lactamases de espectroastendido (ESBL), mediadas por plasmdeos, inativam as cefalosporinas de terceiragerao e os monobactmicos como ocorre em cepas de Klebsiella pneumoniae. As-lactamases mediadas por cromossomos so produzidas em baixos nveis por P.aeruginosa, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens e outros bacilos Gram-negativos; quando esses microrganismos so expostos a antimicrobianos -lactmicos, so induzidos altos nveis de -lactamases, produzindo resistncia s

cefalosporinas de terceira gerao, cefamicinas e combinaes de -lactmicos/cidoclavulnico ou sulbactam.O uso indiscriminado de antimicrobianos exerce uma enorme presso seletiva para amanuteno e ampliao da resistncia bacteriana. O uso extenso de antimicrobianos seguido de frequncia aumentada de bactrias resistentes que passam a sedisseminar em conseqncia de medidas insuficientes de preveno de infeces.Embora no se possa eliminar o uso de antimicrobianos, a administrao racionaldesses agentes no apenas exige uma seleo criteriosa do antimicrobiano e dadurao da terapia, como tambm sua indicao apropriada.

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12.1 Gram-positivos - resistncia aos antimicrobianos

Staphylococcus aureus

O Stahylococcus aureus considerado um patgeno humano oportunista efreqentemente est associado a infeces adquiridas na comunidade e no ambientehospitalar. As infeces mais comuns envolvem a pele (celulite, impetigo) e feridas emstios diversos.Algumas infeces por S. aureus so agudas e podem disseminar para diferentestecidos e provocar focos metastticos. Episdios mais graves, como bacteremia,pneumonia, osteomielite, endocardite, miocardite, pericardite e meningite, tambmpodem ocorrer.Formas de resistncia :A resistncia penicilina foi detectada logo aps o incio deseu uso na dcada de 40. Essa resistncia era mediada pela aquisio de genes quecodificavam enzimas, inicialmente conhecidas como penicilinases, e agora chamadas-lactamases. Na dcada de 1950, a produo de penicilinases pelos S. aureuspassou a predominar nas cepas isoladas de pacientes hospitalizados.Em 1960, a meticilina foi lanada no mercado como alternativa teraputica para cepasprodutoras de penicilinase, uma vez que essa droga no sofre ao dessa enzima.

Porm, j em 1961, relatos de cepas tambm resistentes meticilina passaram a serdescritos e foram identificados os denominados Staphylococcus aureus resistentes meticilina (MRSA).

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Enterococcus spp.

Enterococcus so bactrias gram-positivas, normalmente encontradas no intestino eno trato genital feminino. Existem 14 espcies descritas de Enterococcus spp., sendoo E. faecalis e o E. faecium as duas que normalmente promovem colonizao einfeces em humanos.E. faecalis= constituem 85 a 90% dos Enterococcus spp. identificados, sendo essaespcie a menos propensa ao desenvolvimento de resistncia.E. faecium= o menos prevalente, de 5 a 10%, mas apresenta maior propenso aodesenvolvimento de resistncia.A emergncia desse patgeno nas ltimas duas dcadas, entre muitos fatores, sedeve em parte sua resistncia intrnseca aos antimicrobianos comumente utilizados,como: aminoglicosdeos, aztreonam, cefalosporinas, clindamicina, oxacilina.

E. faecium menos sensvel aos antimicrobianos beta-lactmicos do que E. faecalisdevido baixa afinidade das PBPs (protenas de ligao da penicilina) a essescompostos.

Streptococcus pneumoniae

Streptococcus pneumoniae o principal agente etiolgico de infeces respiratriasadquiridas da comunidade (otites, sinusites e pneumonias). As pneumonias podem seracompanhadas de bacteremias, principalmente em pessoas idosas ou muito jovens.Outras infeces graves como meningite, endocardite, peritonites, osteomielite, artritesptica so tambm associadas a esse agente.

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No Brasil, estudo publicado por Brandileone e colaboradores em 2006, com cepasinvasivas de Streptococcus pneumoniae que faziam parte do programa nacional devigilncia epidemiolgica nacional revelaram dados interessantes. Foram testadas6470 cepas de Streptococcus pneumoniae colecionadas no Brasil no perodo de 1993a 2004. O nmero de cepas resistentes penicilina variou de 10.2 a 27.9%.Em 1993 havia 9.1% de cepas com resistncia intermediria e 1.1% de cepasresistentes e em 2004 estas taxas subiram para 22.0% e 5.9% respectivamente. Amaioria destes isolados era de pacientes menores que cinco anos e pertenciam aosorotipo 14 que faz parte da vacina conjugada, 7-valente.De 2000 a 2004 os Streptococcus pneumoniae isolados de meningite mostraramresistncias mais altas para cefotaxima (2,6%) comparadas s de no meningite(0,7%). Outras taxas de resistncia foram apontadas no trabalho: sulfametoxazol-trimetroprim (65%), tetraciclinas (4,6%), eritromicina (6,2%), cloranfenicol (1,3%) erifampicina (0,7%), sendo que nenhuma destas cepas apresentou resistncia levofloxacina. Em outro estudo, os dados para meningites por Streptococcuspneumoniae, relacionados sensibilidade penicilina e ceftriaxone no Brasil,fornecidos pelo Laboratrio de Referncia Nacional - IAL, ao SINAN Sistema de

Informao Nacional de Agravo de Notificao apontam em 2005 para uma populaode 270 isolados estudados uma taxa de 26% de resistncia intermediria penicilina ede 17% de alta resistncia a esta droga acompanhada de uma taxa de 4,2% de altaresistncia ceftriaxone.

12.2 Gram-negativos - resistncia aos antimicrobianos

Aminoglicosdeos

A modificao enzimtica o mecanismo mais comum de resistncia aosaminoglicosdeos. Este tipo de mecanismo pode resultar em alto grau de resistncia aestes agentes antimicrobianos. Os genes responsveis por esta resistncia

encontram-se geralmente em plasmdios ou transposons. Atualmente, mais de 50enzimas modificadoras de aminoglicosdeos j foram descritas e classificadas como:N-acetiltransferases;O-adeniltransferases;O-fosfotransferases.Os aminoglicosdeos contm em sua estrutura grupos amino ou hidroxila, os quaispodem ser modificados pelas enzimas acima, produzidas por isolados bacterianos. Osaminoglicosdeos modificados nestes grupamentos perdem a habilidade de se ligar aoribossomo e, consequentemente, de inibir a sntese protica bacteriana.Outros mecanismos de resistncia aos aminoglicosdeos como alterao no stio deao (subunidade 30S do RNA ribossomal) e alteraes na permeabilidade damembrana celular externa tambm so descritos.

Quinolonas

A resistncia s quinolonas est associada a alguns mecanismos de resistncia,como:Alterao de permeabilidade e hiperexpresso de bombas de efluxo;Alteraes do stio de ao (topoisomerases);Resistncia mediada por plasmdeos;Alterao enzimtica da molcula do antimicrobiano.A alterao de permeabilidade e efluxo so comuns a outras classes antimicrobianas esero discutidos em tpicos subseqentes.Mutaes das Topoisomerases BacterianasAs quinolonas inibem a ao da DNA girase e topoisomerase IV, impedindo areplicao do DNA bacteriano. A resistncia a estes antimicrobianos adquirida por

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mutaes espontneas em genes cromossmicos, levando a alteraes no stio deao (topoisomerases).Esta resistncia ocorre gradualmente e de maneira acumulativa, ou seja, mutaessimples no stio principal de ao da droga so associadas a moderados graus deresistncia, enquanto mutaes adicionais no stio primrio e/ou secundrio levam aalto grau de resistncia. Em E. coli e P. aeruginosa, a maioria das mutaes ocorre emuma pequena poro do principal alvo de ao das quinolonas, o gene gyrA. Essaparte do gene denominada regio determinante de resistncia s quinolonas(Quinolone Resistance Determinant RegionQRDR)

-lactmicos

Trs mecanismos bsicos de resistncia aos -lactmicos tm sido descritos:Alterao do stio de ligao, que no caso seriam as protenas ligadoras de penicilina(PBPs);Alterao da permeabilidade da membrana externa bacteriana eDegradao da droga atravs da produo de b-lactamases.

Alterao do stio de aoA alterao de PBPs o principal mecanismo de resistncia bacteriana aos -lactmicos nos cocos Gram-positivos e em algumas bactrias fastidiosas Gram-negativas, como a Neisseria gonorrhoeae. Apesar de j ter sido demonstrado emamostras de Haemophilus influenzae e P. aeruginosa, esse mecanismo raro embacilos Gram-negativos.Alterao da permeabilidade da membrana externa bacterianaA dificuldade de penetrar pela membrana externa um dos poucos mecanismos deresistncia bacteriana no qual uma alterao estrutural pode conferir resistncia adiversas classes de antimicrobianos. A impermeabilidade da membrana externa ocorrequando bactrias mutantes passam a no produzir os habituais canais da membranaexterna bacteriana (porinas), locais por onde penetram os -lactmicos. Este

mecanismo de resistncia mais comumente observado entre amostras de P.aeruginosa.

Carbapenens

A resistncia aos carbapenens em microrganismos Gram-negativos pode serdecorrente de:Diminuio da permeabilidade da membrana externa aos antimicrobianos, pela perdaou expresso reduzida de protenas de membrana externa;Hiperexpresso de bombas de efluxo, que reduzem a concentrao de antimicrobianono interior das clulas;Produo de enzimas (-lactamases) que degradam os carbapenems.

13 Microbiologia clnica dos principais patgenos causadores de infeceshospitalares

Infeco comunitria x hospitalar

Publicaes do Ministrio da Sade-MS (1998) e da Agncia Nacional de VigilnciaSanitria-ANVISA (2006) conceituam infeco comunitria como aquela constatada ouem incubao no ato de admisso do paciente, desde que no relacionada cominternao anterior no mesmo hospital. Pode, tambm, ser considerada aquela queest associada a uma complicao ou extenso da infeco j presente na admisso(a menos que haja troca de microrganismos ou sinais ou sintomas fortementesugestivos da aquisio de nova infeco) e a infeco em recm-nascido, cujaaquisio por via transplacentria conhecida ou foi comprovada e que se tornou

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evidente logo aps o nascimento (exemplo: herpes simples, toxoplasmose, rubola,citomegalovirose, sfilis e AIDS). O Ministrio da Sade, 2006, definiu infeceshospitalares (IH), como aquelas desenvolvidas pelos pacientes aps a admisso nohospital, desde que relacionadas internao ou a procedimentos hospitalares.Pacientes mais debilitados, como recm nascidos prematuros, esto mais sujeitos aessas infeces e com maior potencial de gravidade. A IH manifestada durante ainternao do paciente ou aps a alta e decorre do contato com o ambiente hospitalarou em virtude de procedimentos invasivos, como cirurgias e perfuraes por agulhasde soros e cateteres. Trata-se de um problema registrado em todo o mundo. Estudosrealizados pelo Centro para Controle de Doenas de Atlanta (Centers for DiseasesControl and Prevention, USA) mostram que a infeco hospitalar prolonga apermanncia de um paciente no hospital por, pelo menos, quatro dias, ao custoadicional de 1.800 dlares, o que equivale a R$ 3,6 mil (Ministrio da Sade, 2007;Sociedade Brasileira de Infectologia, 2007; COSEMS/MG, 2008). O diagnstico deinfeces hospitalares dever valorizar informaes oriundas de evidncias clnicas,derivadas da observao direta do paciente ou da anlise de seu pronturio;resultados de exames de laboratrio, ressaltando-se os exames microbiolgicos, a

pesquisa de antgenos e anticorpos; evidncias de estudos com mtodos de imagem;endoscopia; bipsia e outros. (Ministrio da Sade, 1998; ANVISA, 2006).Pacientes admitidos em Unidade de Terapia Intensiva (UTI), esto sujeitos a riscos de5 a 10 vezes maiores de adquirir infeco que aqueles de outras unidades deinternao do hospital, alm de mais vulnerveis intrinsecamente infeco, sofreqentemente expostos aos fatores de risco tais como: procedimentos invasivos,cirurgias complexas, drogas imunossupressoras, antimicrobianas e as interaes coma equipe de sade e os fmites (COUTO & NOGUEIRA, 1997). Simples aes, comohigienizao das mos, e at cuidados mais sofisticados relacionados esterilizaode equipamentos e ao uso de produtos especialmente desenvolvidos para evitarinfeces podem minimizar o impacto desse importante problema de sade pblica napopulao de crianas submetidas assistncia sade (Ministrio da Sade, 2006).

Microrganismos Relevantes em Infeco Hospitalar

A infeco hospitalar (IH) considerada um grave problema clnico, crescente tantoem incidncia quanto em complexidade, com implicaes sociais e econmicasdiversas. Dentre os microrganismos relevantes em IH esto vrios gneros e espciesde cocos Gram positivos, bastonetes Gram negativos e alguns fungos leveduriformes.

Cocos Gram positivos

Staphylococcus aureus um coco Gram positivo, considerado patgeno humanooportunista, freqentemente associado s infeces hospitalares. De acordo com o

National Nosocomial Infections Surveillance do Center for Disease Control andPrenvention (CDC), desde 1999, a proporo de S. aureus resistentes meticilina (S.aureus meticilinaresistentes - MRSA) ultrapassa 50% entre os pacientes internadosem Unidade de Terapia Intensiva (UTI). No Brasil, o nmero de infeces hospitalarescausadas por S. aureus resistentes meticilina, tambm elevado, correspondendode 40% a 80%, principalmente nas UTIs. Pesquisas recentes mostraram altos ndicesde mortalidade em pacientes que desenvolveram bacteremia por MRSA (49% a 55%),ndices esses maiores que aqueles envolvendo S. aureus sensveis meticilina(MSSA), 20% a 32%.O gnero Enterococcus inclui bactrias Gram positivas, catalase negativa, bile-esculina positiva, que crescem em meio hipertnico (caldo 6,5% NaCl). Espcies dognero que apresentam resistncia vancomicina (VRE) so reconhecidas como umdos principais patgenos causadores de infeces hospitalares, sendo, atualmente,

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notvel sua presena em infeces urinrias, infeces de stio cirrgico ebacteremias.

Bastonetes Gram negativos no fermentadores da glicose

Bastonetes ou cocobacilos Gram negativos (BGN), aerbios, no fermentadores deglicose, so bactrias aerbias, no esporuladas, incapazes de fermentar glicosecomo fonte de energia pela via fermentativa. So microrganismos oportunistas devegetais e animais, exibem mnimas exigncias nutricionais e toleram grandesvariaes de temperatura. Dentre outros, so includos neste grupo os gnerosPseudomonas, Burkholderia, Acintobacter, Stenotrophomonas e Sphingomonas.O gnero Pseudomonas, representado por BGN finos, aerbios da famliaPseudomoneacea, responsvel pela maioria das infeces por no fermentadores(NF), sendo a glicose utilizada somente atravs da via oxidativa. Bactrias do gruposo patgenos de plantas e somente algumas espcies esto associadas a doenasnos seres humanos. A patognese dos processos, que podem ocorrer em diferentesstios, deve ser discutida no contexto de uma infeco oportunista, sendo necessria a

quebra de barreiras, ou a presena de defeitos especficos de alguns dos mecanismosde defesa imune. Essas bactrias so capazes de formar biofilmes, o que contribuipara sua sobrevivncia e replicao em tecidos humanos e dispositivos mdicos. Asmanifestaes clnicas mais prevalentes so pneumonias, infeces associadas acateter vascular central, infeces do trato urinrio, dentre outras.

Enterobactrias

A famlia Enterobacteriaceae constitui um grande grupo heterogneo de bastonetesGram negativos (mais de 20 gneros e mais de 100 espcies). Como caractersticasgerais, os membros dessa famlia so bacilos Gram negativos, fermentadores deglicose, comumente oxidase negativa, anaerbios facultativos, reduzem nitrato a

nitrito, no formam esporos. Podem ser moveis ou imveis e capsulados ou no.Fazem parte da microbiota indgena do intestino e infectam qualquer stio, desde quehaja condies favorveis. Como mencionado, E. coli responsvel pela maioria dasITUs, nas quais tambm se destacam os gneros: Klebsiella, Proteus e Enterobacter.Nas infeces nosocomiais, bactrias do gnero Klebsiella esto entre os maisprevalentes.

Fungos

A incidncia de infeces hospitalares por fungos tem aumentado substancialmentenas ltimas dcadas, acarretando altos ndices de mortalidade, que atingem at 60%dos bitos por IHs. Espcies do gnero Candida tm sido os agentes mais

freqentemente isolados, correspondendo, aproximadamente, a 80% das infecesfngicas de origem hospitalar, e quarta causa de infeco da corrente sangunea,conduzindo ao bito em torno de 25 a 38% dos pacientes que desenvolvemcandidemia.At alguns anos atrs Candida albicans era a espcie de maior interesse clnico.Contudo, paralelamente ao aumento geral das candidemias, observou-se aumento dasinfeces da corrente sangnea por espcies de Candida no-albicans, como: C.parapsilosis, C. tropicalis, C. glabrata, C. krusei, C. guilhermondii e C. lusitaniae. Emgeral, as leveduras envolvidas em colonizao de mos de profissionais da rea desade e cateteres podem ser virulentas e oferecer riscos de infeco.

14 Imunoterapia passiva e ativa: Vacinas para patgenos causadores deinfeces hospitalares

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Doenas bacterianas podem ser prevenidas pelo uso de imunizaes que induzemuma imunidade ativa ou passiva. A imunidade ativa induzida por vacinas preparadasde bactrias ou de seus produtos, j a imunidade passiva dada pela administraode anticorpo pr-formado em preparaes denominadas imunoglobulinas.

14.1 Imunidade ativa

A vacina contra pneumococos constituda de polissacardeos purificados deStreptococcus pneumoniae dos seguintes sorotipos: 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V,10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F e 33F. uma vacina polivalente, preparada a partir de polissacardeos capsularesbacterianos purificados, no contendo nenhum componente vivel. Ela indicadacomo agente imunizante contra infeces pneumoccicas causadas por qualquer dos23 sorotipos de Streptococus pneumoniae includos na vacina, os quais soresponsveis por cerca de 80 a 90% das doenas pneumoccicas graves, tais comopneumonias, meningites, bacteremias e septicemias. aplicada pela via intramuscularou subcutnea, em dose nica de 0,5 ml. Indicada para crianas acima dos dois anos

de idade pertencentes aos grupos de risco de contrair infeco pneumoccica. Soeles: doentes com anemia falciforme, asplenia anatmica ou funcional,esplenectomizados, sndrome nefrtica e doena de Hodgkin. Em adultos indicadanas seguintes situaes: doena cardiopulmonar crnica, doena renal ou heptica emesmo nos indivduos sadios acima de 65 anos. Nos doentes que iro se submeter aesplenectomia eletiva, a vacina deve ser administrada 14 dias antes da cirurgia.A proteo conferida s crianas menores de dois anos no das melhores e noest bem estabelecida. Neste caso a vacinao no est indicada, devido s reaescolaterais, embora nos doentes falcmicos e asplnicos devam ser pesados os riscose benefcios advindos da vacinao.

A vacina antimeningoccica produzida a partir de polissacrides capsulares de

Neisseria meningitidis. Esta bactria, com base em seu polissacride, pode serclassificada em 13 sorogrupos, sendo os mais importantes: A, B, C, D, X, Y, Z, 29-E eW-135. Atualmente existem vacinas monovalentes contra os meningococos A e C,vacinas bivalentes (associando-se A e C) e uma vacina tetravalente, contendoantgenos contra os meningococos A, C, Y e W-135.A vacina aplicada pela via subcutnea, na dose de 0,5 ml. Tem boa eficcia emadultos (90%), porm com resposta limitada nas crianas. Nos menores de dois anosa vacinao contra o meningococo A requer a aplicao de uma segunda dose, trs aquatro meses aps a primeira, e a vacinao contra o meningococo C no tem semostrado eficaz. As vacinas com antgenos W-135 e Y tm se mostrado antignicasem crianas acima de dois anos. O uso destas vacinas deve-se restringir apenas ssituaes epidmicas.

A vacina contra Haemophilus influenzae do tipo B uma vacina indicada para aimunizao de rotina, de crianas entre 2 meses e 5 anos de idade, contra as doenascausadas por esta bactrias. A vacina preparada com o polissacardeo capsularpurificado do Haemophilus influenzae tipo B, ou seja, um polmero de ribose, ribitol efosfato poliribosil, conjugado com a protena tetnica (PRP-T). Esta bactria revestida com uma cpsula polissacardica que a torna resistente ao ataque dosleuccitos. Neste caso a vacina estimula a produo de anticorpos anti-capsulares,promovendo uma imunidade ativa contra a bactria. A aplicao deve ser feita pela viasubcutnea ou intramuscular na dose de 0,5 ml de acordo com as especificaes dofabricante.Est indicada para imunizao de rotina em crianas de 2 meses a 5 anos de idade,contra doenas invasivas causadas por Haemophilus influenzae tipo B (meningite,epiglotite, septicemia, celulite, artrite, pneumonia).A vacina est contra-indicada para

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crianas abaixo de 2 meses de idade, gestantes, indivduos com hipersensibilidade aqualquer componente da vacina, especialmente protena tetnica e estado febril einfeco aguda, uma vez que estes sintomas podem ser confundidos com eventuaisefeitos colaterais da vacina.

A vacina antitetnica, tambm denominada toxide tetnico (TT), de aplicaointramuscular, contm 10 a 20 UI do toxide, adsorvido em hidrxido de alumnio.Estindicada para indivduos com idade acima de sete anos. A vacina antitetnica (TT) sdeve ser utilizada na falta da vacina dupla do tipo adulto (dT). A imunizao bsicaconsiste na aplicao de trs doses, com intervalo de dois meses entre a primeira e asegunda; a terceira dose seis a doze meses aps a segunda.

A vacina dupla contm os toxides diftrico e tetnico, de aplicao intramuscular,sendo apresentada nas formas infantil (DT) e adulto (dT). A forma infantil (DT) constituda de 30 UI de toxide diftrico e 10 a 20 UI do toxide tetnico. A vacina dotipo adulto (dT) compe-se de 2 a 4 UI de toxide diftrico e 10 a 20 UI de toxidetetnico. Salienta-se que a vacina dupla infantil (DT) contm a mesma quantidade de

toxides tetnico e diftrico que a vacina trplice (DTP). J a dupla tipo adulto (dT)contm menor quantidade de toxide diftrico.

A vacina trplice (DTP) constituda de antgenos protetores contra a difteria, acoqueluche e o ttano. Os antgenos incluem suspenso de 32.000.000 deBordetella pertussis (4UI), 30UI (unidades internacionais) de toxide diftrico e 10 a 20UI de toxide tetnico. Os toxides possuem elevado poder imunognico,principalmente quando associados aos adjuvantes minerais, entre eles o hidrxido dealumnio. O desempenho imunognico da vacina anti-pertussis no to eficientequanto o dos toxides, porm sua eficcia bem estabelecida, diminuindo afreqncia e a gravidade da coqueluche em propores considerveis.A aplicao da vacina deve ser feita pela via intramuscular, nas dosagens de 0,5 a 1,0

ml, de acordo com a procedncia do produto. A aplicao intramuscular deve serprofunda, na regio gltea ou no msculo vasto lateral da coxa. Em crianas acima dedois anos, pode ser usada a regio deltide. A vacinao bsica consiste na aplicaode trs doses, a partir dos dois meses de idade, com intervalos de dois meses entre asdoses. O primeiro reforo deve ser aplicado 12 meses aps a ltima dose davacinao bsica e o segundo reforo aps 18 meses do primeiro reforo.

A vacina contra tuberculose, denominada BCG, produzida a partir de cepasatenuadas do Mycobacterium bovis. A produo no Brasil na forma liofilizada,devendo ser mantida em geladeira, entre +2 e +8C, e ao abrigo da luz solar direta,pois inativada pelos raios solares. As crianas podem e devem ser vacinadas a partirdo nascimento, de preferncia no berrio, por via intradrmica, no brao direito, na

altura da insero inferior do msculo deltide, com seringa e agulha apropriadas edescartveis. Quando o local da aplicao estiver sujo, deve-se lavar com gua esabo.A dose preconizada para todas as idades de 0,1 ml de uma s vez, sendo apopulao prioritria os menores de um ano de idade. Havendo condiesoperacionais, indica-se a realizao da reao de Mantoux (PPD) prvia, em crianascom mais de trs meses. Sendo negativa, aplicamos o BCG intradrmico. O BCG bemaplicado leva viragem do PPD em cerca de 75% a 80% dos casos e isto pode serconfirmado realizando-se a reao de Mantoux aps seis meses da aplicao do BCG.Nos casos que se mostram negativos, o reforo deve ser realizado apenas se aprimeira aplicao foi tecnicamente incorreta, ou se no houve reao no local daaplicao.Aps a aplicao da vacina, os sintomas mais freqentes so o aparecimento dendulo no local da aplicao, que evolui para lcera e crosta, com durao mdia de

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oito a 10 semanas. Nos casos de aplicao profunda, dose maior ou resposta imuneexagerada, a cicatrizao pode ser retardada. As complicaes so bastante raras,porm podem ocorrer linfadenites simples ou supuradas, lceras necrticas,abscessos locais ou distncia, erupo maculosa, reao lupide, eritema nodoso epolimorfo, lpus vulgar e ostete de localizaes diversas.Do deve ser aplicado em crianas com peso inferior a 2.000 g e com afecesdermatolgicas extensas e em atividade. Como no h dados disponveis sobre osefeitos do BCG em adultos infectados pelo vrus da imunodeficincia humana (HIV),sintomticos ou no, a vacinao no deve ser recomendada para esses casos. Aaplicao precoce do BCG visa reduzir a incidncia da tuberculose, especialmente asformas graves da doena, tais como a tuberculose menngea e a tuberculose miliar,que aparecem com maior freqncia at os quarto anos de idade.

14.2 Imunidade passiva

Antitoxina do ttano: usada tanto para o tratamento quanto para preveno dottano. No tratamento, o objetivo neutralizar qualquer toxina livre para evitar o

progresso da doena e, sendo assim, administrada imediantamente. Na preveno, administrada em pessoas que esto inadequadamente imunizadas e que apresentamferidas contaminadas.Antitoxina botulnica: usada no tratamento de botulismo, pois neutraliza a toxinalivre, evitando que a doena progrida. Contm anticorpos contra as toxinas botulnicasA, B e E, que so os tipos de ocorrncia mais comum.Antitoxina diftrica: usada no tratamento da difteria, pois neutraliza a toxina livre,evitando que a doena progrida.