x jornada farmacÊutica e v amostra … · desenho dos primers produto de 688pb anÁlise da regiÃo...

X JORNADA FARMACÊUTICA E V AMOSTRA

Sueli Massumi NakataniLaboratório Central do Estado – LACEN-PR

Maio de 2010

DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIAS EM PCR EM TEMPO

REAL: OTIMIZANDO CUSTOS E PRODUTIVIDADE

domingo, 30 de maio de 2010

Laboratório Central do Estado -PR Seção de Biologia Molecular -1997

Programa do MS DST/AIDS Quantificação da carga viral do HIV

Hoje


Laboratório Central do Estado -PR Seção de Biologia Molecular -1997

Programa do MS DST/AIDS Quantificação da carga viral do HIV

Hoje 20 Diagnósticos Moleculares


Laboratório Central do Estado -PR


Por que PCR em tempo real?


Benefícios Aumento da sensibilidade / Especificidade

Automatização

Detecção na fase exponencial

Protocolo único Tempo de execução menor

Sem processamento pós-PCR

PCR EM TEMPO REAL


Evolução da PCREVOLUÇÃO DA PCR


EVOLUÇÃO DA PCR

• Inicialmente, a PCR é exponencial– O produto (P) aumenta exponencialmente

com o número de ciclos (n)• A quantidade de produto de PCR depende do

número de cópias de molde (M) presentes no início da reação – Se no início houver duas vezes mais

molde, se deve obter duas vezes mais produto

P = M (1+E)nOnde: P = Produto M = Molde E = Eficiência n = ciclos


Amplificação por PCR

• Para duas vezes mais molde no início, existe duas vezes mais produto de PCR, na fase exponencial.

• Para 4X Molde, existe 4X mais produto de PCR, etc.


Amplificação por PCREficiência

• Mas....a reação de PCR NÃO é 100% eficiente

– Normalmente a eficiência é de 80-90%

– Produtos de PCR menores amplificam com uma eficiência maiorP = M (1+E)n

Onde: P = Produto M = Molde E = Eficiência n = ciclos


• Os produtos de PCR não podem dobrar para sempre

• Limites– Quantidade de primer– Atividade da Taq Polimerase

• Uma vez atingido o plato...– Não há mais aumento na quantidade de

produto

• Detecção “end point”– Número fixo de ciclos e depois se verifica

a presença de produto em gel de agarose

AMPLIFICAÇÃO POR PCR Fase de Plato


Problemas na detecção no ponto final

•Precisão baixa•Baixa sensibilidade•Range < 2 logs•Baixa resolução•Não automatizado•Baseado somente no tamanho •Resultados não expressam em números•O corante brometo de etídeo não é quantitativo•Manipulação com produtos Pós-PCR


Fases da PCR

Área de detecção real time PCR

Área de de detecção no PCRtradicional


Amplificação por PCRDetecção “end point”

Plateau effect


Como quantificar a quantidade inicial de molde ???

• Use os dados da fase exponencial– Quantidade de produto é proporcional a

quantidade de molde inicial– Neste caso, é necessário avaliar o produto

de PCR a cada ciclo

• Usar FluorescênciaA fluorescência deve ser proporcional

quantidade de produto • Use uma máquina que verifique a

fluorescência em cada ciclo (Real Time-PCR)


PCR EM TEMPO REAL


Real Time PCRSyber Green

• Vantagem:– Barato – Flexível

• Desvantagem:– Pouco específico

– Todo e qualquer produto formado contribuirá para o aumento da fluorescência

– Primer dimers são um problema

– Necessita de uma otimização para que não haja formação de produtos inespecíficos na reação


Real Time PCRSyber Green

• Corante não-específico• Equivalente ao brometo

de etídio– Se liga a dupla fita de

DNA

• A quantidade de fluorescência é proporcional a quantidade de DNA

• Intensificação da emissão de fluorescência quando ligado à fita dupla de DNA


Real Time PCRTaqman probes

• Sonda marcada com um fluoróforo (reporter ) e um quencher

A sonda se liga ao produto de PCR durante a fase de annealing

o reporter emite fluorescência que é captada pelo quencher

• A atividade exonucleásica 5’-3’ da Taq polimerase hidroliza a sonda e permite que o reporter se afaste do quencher

Amplicon

Amplicon

Emission

EXTENSION

ANNEALING

Excitation

5’-3’ exonuclease

Reporter Quencher


Real Time PCRTaqman probes

• O acúmulo de reporter livre é proporcional a quantidade de produto de PCR

• A fluorescência é captada na fase de extensão

• Vantagem– Alta especificidade

Amplicon

Amplicon

Emission

EXTENSION

ANNEALING

Excitation

5’-3’ exonuclease

Reporter Quencher


Real Time PCRHibridization probes

• FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) utilizando hybridization probes adjacentes

• Probes são marcados

• A fluorescência é captada na fase de anneling

FITC Red 640

FRET Emission

P

Excitation

Amplicon

94oC

55oC

72oC


Real Time PCRMolecular Beacons

Hybridisation probes em forma de “loop”

Quando não anelado ao DNA, a estrutura em loop mantém o reporter e quencher próximos. Não há fluorescência

Durante o annealing, o reporter e quencher são separados e a fluorescência emitida é proporcional a quantidade de produto

Amplicon

Excitation

ANNEALING


Sistemas mais descritos nas literaturas


TRESHOLD -CT


Quais os passos necessários para o desenvolvimento de um teste de PCR em tempo

real?


Desenho dos primers e sondasSONDA PRIMEREscolha do gene de interesseEscolha do gene de interesseAmplicons de 50-150bpAmplicons de 50-150bpConteúdo G/C de 20-80%Conteúdo G/C de 20-80%

Evitar repetição consecutiva da mesma baseRepetições de mais do que 4 Gs devem ser evitadas

Evitar repetição consecutiva da mesma baseRepetições de mais do que 4 Gs devem ser evitadasTM 68-70ºC TM-58-60ºCNenhum G na extremidade 5’Selecionar a fita que contenha mais Cs do Gs

Os 5 nucleotídeos da extremidade 3’ nãoDevem ter mais de que dois Gs ou Cs


SONDA-FLUORÓFORO-QUENCHER

O desenho da sonda depende do sistema escolhido TaqMan, FretConcentração da sonda 150-300nMA seleção dos fluoróforos deve ser compatíveis comequipamento Escolha adequada do quencher –preferencial paraNEF-MGBSelecionar fluoróforos com alto coeficiente de excitaçãoSistema Multiplex- verificar se não há sobreposição dentro do mesmo espectro de ação


QUANTIFICAÇÃO ABSOLUTA

1- Realização da curva padrão Plasmídeo Diluição de amostra

2- Correlacionar com valores previamente conhecidos Painel Internacional de Curva Padrão


DESENVOLVIMENTO DE QUANTIFICAÇÃODE CARGA VIRAL DO VÍRUS DA HEPATITE B

1-Escolha da região do genoma de interesse Região S2- Desenho dos primers e sondas3- Método de extração4- Padronização da curva5- Curva padrão com Painel Internacional Opti Quant® (Acrometrix)6- Análises Estatísticas de validação -Precisão -Especificidade -limite de detecção -Coeficiente de variação7- Controle Interno


DESENVOLVIMENTO DE QUANTIFICAÇÃODE CARGA VIRAL DO VÍRUS DA HEPATITE B


Comparação entre Cobas TaqMan e TaqMan LACEN-PR para HBV

Correlação de Pearson(r):0,9589(p<0,0001)


Comparação entre Cobas Amplicor e TaqMan LACEN-PR para HBV

Correlação de Pearson (r):0,8497 (p<0,0001)


Comparação entre Cobas Amplicor e Cobas TaqMan para HBV

Correlação de Pearson (r):0,8578 (p<0,0001)


Custo Benefício Entre qPCR e Método Comercial


GENOTIPAGEM DO VHC

ESTABELECE O TEMPO DE TRATAMENTO

VALOR PROGNÓSTICO


MÉTODOS DE GENOTIPAGEM

LiPA – hibridização reversa (Stuyver, 1993)

Trugene – seqüenciamento da região 5’UTR

Abbot HCV ASR – PCR em tempo real


ANÁLISE DAREGIÃO NS5B

SEQÜÊNCIAS CONSENSO


DESENHO DOS PRIMERSPRODUTO DE 688pb




EXTRAÇÃO DO RNAKIT NUCLISENS MINIMAG






RTPCR

DETECÇÃO






PURIFICAÇÃO DO PRODUTO DE PCR

QUANTIFICAÇÃO DO DNA PURIFICADO DILUÍDO 20NGSEQÜENCIAMENTO ABI 3130

RTPCR

DETECÇÃO






PURIFICAÇÃO DO PRODUTO DE PCR

QUANTIFICAÇÃO DO DNA PURIFICADO DILUÍDO 20NGSEQÜENCIAMENTO ABI 3130

ANÁLISES DAS SEQÜÊNCIAS

BIOEDITCODONCODESEQSCAPE

RTPCR

DETECÇÃO





Região NS5B para as sondas 1a, 1b, 3a e 2a, 2b, 2c


Reação “one-step” modificado


limite de detecção

Sensibilidade analítica painel da Optiquant gen 1b

Sensibilidade relativa amostras clínicas gen 3a gen 2b gen 1a

250 UI/ml

125 UI/ml

250 UI/ml

500 UI/ml


9 amostrasRNA VHC

Não detectável

194 amostrasGenótipo 1



Total319 amostras

310 amostrasRNA VHC

detectável

190 amostrasdetectadas



Genotipagem por PCR em Tempo Real


Comparação dos métodos de seqüenciamento e PCR em tempo real para a genotipagem do

κ=0,6222; p=0,002


Análises Filogenéticas


Comparação dos métodos de genotipagem por PCR em tempo real e LiPA

κ=0,6933; p<0,0001


Números de amostras com subtipos discordantes, indefinidos ou resultados incompletos pelo LiPA (5'UTR) quando comparados com genotipagem por PCR em tempo real da região NS5B do

VHC

κ=0,1111; p<0,2218


Valores por reação para cada teste de genotipagem por PCR em tempo real


Algoritmo sugerido para laboratório de saúde pública para a realização da

genotipagem do VHC por PCR em tempo real




R$ 42,28




R$ 42,28

R$ 59,56




R$ 42,28

R$ 59,56

R$ 58,34


Cytomegalovirus

pneumonite

encefalite

gastroenterite

Cório-retinite

hepatite


30dias >100dias100dias

Herpes virus

Varicella zoster Cytomegalovirus

HHV-6Epstein-Barr virus

NeutropeniaMucositeGVHD agudo

↓imunidade celularGVHD agudo e crônico

RISCO DE INFECÇÃO TMO

Vírus respiratório

Fase I Fase IIIFase II

↓ imunidadecelular e humoralGVHD crônico


STATUS SOROLÓGICO

D+/R- D+/R+ D-/R+ D-/R-

44% 30% 22% 11%


Pesquisa Quantitativa do Cytomegalovirus

Gene ien – expressa na replicação viral

Controle interno plasmidial

Limite de detecção de 10 à 500.000 cópias/ml


Pesquisa Quantitativa do Cytomegalovirus


Identificação do Mycobacterium tuberculosis por PCR em Tempo Real

•Dificuldades na identificação de M. tuberculosis de amostras diretas em amostras extra pulmonares

•Presentes em baixa densidade e em baixo número em bacteremias intermitentes (Kiehn, T. JCM, 1986)


Amostras Sensibilidade Especificidade VPP% VPP%Escarro 72,7 97,5 91,4 90,7LBA 82,1 97,4 89,4 82,1Urina 11.1 95,2 14,2 93,7Líquor 5,8 100 100 95,1Sangue 0 100 0 96,1Lavado gástrico

66,6 100 100 90

NAUCK, R,2004

Sensibilidade, Especificidade, Valor preditivo positivo e negativo de amostras pulmonares e extrapulmonares

Amostras Pulmonares : 3817 amostrasAmostras extra pulmonares : 622 amostras



Desenvolvimento da detecção do M. tuberculosis conforme Takahashi, T (JCM, 2006),baseado no gene MPT64


PCR convencional : 4,5%qPCR : 8,2%


Amostras de 139 LCRs: 3 detectadas por PCR convencional 7 detectadas por PCR Tempo Real


•PCR em Tempo Real (Triplex) para a detecção de Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae e Haemophilus influenzae

•N.meningitidis gene ctrA-transporte de cápsula polissacarídica

•Streptcoccus pneumoniae gene lytA responsável pela produção de autolisina

•Haemophilus influenzae gene bexA responsável pela expressão da cápsula polissácarídica

Meningites Bacterianas


Aumentar a sensibilidade da identificação bacteriana

Implantação no LACEN-PR através da CGLAB-MS e Instituto Adolf Lutz

Implantado em Janeiro de 2008

Meningites Bacterianas


PadronizaçãoMeningites Bacterianas


PadronizaçãoMeningites Bacterianas

0

100

200

300

400

Cultura Látex qPCR

Comparação entre Latex e PCR em tempo real

Nº am

ostras LCR

Posi6vo Nega6vo

40 369 56 351 112 299


PadronizaçãoComparação entre Latéx e PCR em Tempo Realem amostras de soro

0

13

25

38

50

Latex PCR em tempo realposi6vo nega6vo

8,3%29,16%


PadronizaçãoDiagnóstico da Gripe Pandêmica H1N1

Pesquisa por PCR em Tempo RealProtocolo do CDC:

4 genes:

Gene da MatrizNucleoproteínaHemaglutinina

RnaseP


PadronizaçãoDiagnóstico da Gripe Pandêmica H1N1


PERSPECTIVAS

Desenvolvimento de novos diagnósticos


Obrigada pela atenção!


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