Design de Primers..

Serve como um ponto de partida para a replicação de DNA. A DNA polimerase não é capaz de iniciar a síntese de uma nova cadeia de DNA a partir de zero, podendo apenas adicionar a uma cadeia de nucleotídeos existentes.

Primers determinam o sucesso de uma PCR!

Specificity?

Proper annealing to

the template?

Comprimento do Primer

Determina especificidade e afeta seu anelamento com o DNA molde!

• Muito curto -> baixa especificidade, resultando em amplificação não específica

• Muito longo -> diminui a eficiência de ligação ao DNA molde em temperatura normal de anelamento devido à maior probabilidade de formação de estruturas secundárias, como grampos.

• Comprimento ideal:18-24 bp para PCR comum30-35 bp para PCR multiplex

Tamanho do amplicon

150-1000 bp para PCR comum, evitar >3 kb 50-150 bp para qPCR, evitar >400 bp

Evitar amplicons muito curtos para poder distingui-los de possíveis dímeros de primers!

Temperatura de melting (Tm)

A temperatura na qual 50% da dupla

fita de DNA se dissocia para fita

simples.

• Determinado pelo comprimento,

composição de base e concentração

dos primers e pela concentração de sal

no PCR mix • Cálculo aproximado: Tm = 2(A+T) + 4(G+C) °C (indicado para

<18mer)

• Utilizado para cálcular a temperatura de anelamento (Ta):

Ta Opt = 0.3 x(Tm of primer) + 0.7 x(Tm of PCR product) – 25

• Regra geral: Ta = Tm-5°C

Ta ótima • 52°C - 60°C • Ta baixo aumenta a eficiência da PCR mas diminui a

especificidade• Ta alto aumenta a especificidade mas diminui eficiência da

PCR. • Ta >65°C pode ser recomendado para a amplificação de alvos

com elevado conteúdo de GC.

Diferenças de Ta entre o par de primers• Incompatibilidade significativa do par de primers pode levar à

má amplificação • Desejável diferença Ta <5°C

Temperatura de anelamento (Ta)

Para determinar a Ta ótima sempre testar os primers pela 1ª vez em pelo menos 3 diferentes temperaturas (ex. a Ta indicada pelo fabricante ou calculada +/- 2°C) e correr gel!

Escolher a máxima temperatura em que há apenas 1 banda (e do tamanho esperado!) e a amplificação ainda é satisfatoria!

Especificidade e homologia cruzada

Especificidade • Determinada principalmente pelo comprimento do primer

assim como sua sequência • A adequação da especificidade do primer é relativo à

natureza do DNA molde utilizado na reação de PCR.

Homologia Cruzada• Pode ser um problema quando o molde de PCR é o DNA

genômico ou consiste de fragmentos de genes mistos. • Os iniciadores contendo a sequência altamente repetitiva

são propensos a gerar produtos de amplificação não específicos, quando a amplificação de DNA genômico.

Para evitar amplificação não específica..

Além da temperatura e comprimento ideal dos primers:

• BLAST dos iniciadores contra banco de dados NCBI de sequência não-redundante é uma maneira comum de evitar projetar primers que podem amplificar regiões homólogas inespecíficas.

• Para PCR: Iniciadores que flanqueiam a junção intron-exon, para evitar a amplificação não-específica devido à contaminação por cDNA.

• Para qPCR: Iniciadores que flanqueiam a junção exon-exon para evitar amplificação inespecífica devido à contaminação por gDNA.

Conteúdo G/C do Primer • Conteúdo ideal de G/C: 45-55% • Conteúdo semelhante para o par de primers • Recomendado C ou G na extremidade 3’ (aumentar eficiência ligação)

Runs (streches de base única, ex aaaaaaa)• Repetições longas aumenta o potencial de anelamento inespecífico • O número máximo aceitável de repetições é de 4 bp

Conteúdo CG e repetições

Repetições (streches de di-nucleotídeos consecutiva, ex. acacacac)• Repetições aumenta o potencial de anelamento incorreto/inespecífico • O número máximo de repetições aceitável é de 4 di-nucleotídeos

Complementaridade - Estruturas 2árias dos primers

Grampos • Formados por interações intra-

moleculares no mesmo primer

Auto-dímero (homodímero) • Formado por interações inter-

moleculares entre dois iniciadores iguais

Cross-dímero (heterodímero) • Formado por interações inter-

moleculares entre os primers sense e antisense

• Atrapalham a ligação primer-molde, levando a pouca ou nenhuma amplificação

• Análise de ΔG aceitável (energia livre necessária para quebrar a estrutura)

Softwares..

Primer3 (gratuito)

Primer BLAST (NCBI) – importante principalmente para fazer scan genômico e avaliar possíveis anelamentos inespespecíficos