PCR - consiste em fazer cópias de DNA “in vitro”, usando os elementos básicos do processo de replicação natural do DNA.

Técnica “inventada” em 1985 por Kary B. Mullis

A técnica já existia, entretanto, a DNA polimerase utilizada (E. coli) era destruída durante os ciclos de aquecimento e era necessário adição consecutiva a cada novo ciclo

Foi o primeiro a sugerir a utilização de uma DNA Polimerase “termoestável”

1969 – T. Brock e H. Freeze relataram a

descoberta de uma nova espécie de

bactéria – Thermus aquaticus –

sobrevive na água a temperatura média

de 75ºC

• Polimerização: 5’ 3’

Todas as DNA polimerases requerem:

Primer de oligonucleotídeo

Deoxinucleotídeos trifosfato (dNTPs)

Cátion divalente -usualmente Mg2+

DNA molde

http://www.youtube.com/watch?v=QVeVIM1yRMU

PCR requer 7 componentes essenciais:

DNA polimerase termoestável

Um par de oligonucleotídeos para iniciar a síntese de DNA (primers)

Deoxinucleotídeos trifosfato (dNTPs)

Cátion divalente: toda DNA polimerase

Requer cátion divalente, usualmente Mg2+

Tampão para manter o pH

Cátions monovalentes, usualmente K+ (KCl)

DNA molde

A localização da seqüência alvo é feita pelos iniciadores (primers). Oligonucleotídeos com 17 “mers” são usualmente seletivos o suficientepara localizar um sítio único em um genoma de alta complexidade, talcomo o genoma humano.

O pareamento dos “primers” com a seqüência alvo na template se faz pelo estabelecimento de pontes de hidrogênio, obedecendo o pareamento convencional descrito por Watson e Crick:

A T

C G

Desnaturação do DNA molde (template) por aquecimento

Pareamento dos primers à seqüência alvo fita simples

Extensão dos iniciadores pela DNA polimerase termoestável

1. Desnaturação:

• 94ºC – 96ºC

• Separa a dupla fita do template em duas fitas simples

2. Pareamento:

• 37ºC – 65ºC

• Primers ligam-se em locais específicos do DNA molde

3. Extensão:

• 72ºC

• DNA polimerase usa os dNTPs adicionando-os a nova fita de acordo com a regra de pareamento – polimerização.

Primers:

A concentração ótima de “primer” é

entre 0,1 e 0,5 mM

Ambos os membros do par devem ser

usados na mesma concentração.

Excesso de “primers” induz

aparecimento de produtos

inespecíficos e formação de dímeros de

“primers”.

http://www.youtube.com/watch?v=8-dsnlNsCao