Prof. Dra. Adriana Prof. Dra. Adriana DantasDantasDisciplina: Disciplina: BioinformáticaBioinformáticaUERGS, Bento UERGS, Bento Gonçalves, RSGonçalves, RS

Prof. Dra. Adriana Prof. Dra. Adriana DantasDantasDisciplina: Disciplina: BioinformáticaBioinformáticaUERGS, Bento UERGS, Bento Gonçalves, RSGonçalves, RS

CCTGATGGATCGCGTACGTTGTACGCACAGTGTCGAAAAAGCATACGGGGACTGCACGTACACGTAGCACGGCGTCGATTTTGACGTGCACGTGTCAGTGCGATGAGTGAGTGACACACAGTGCAGCGTGTGTACCCATGCGCGAAGTATGT

CTGGACT

CCTGATGGATCGCGTACGTTGTACGCACAGTGTCGAAAAAGCATACGGGGACTGCACGTACACGTAGCACGGCGTCGATTTTGACGTGCACGTGTCAGTGCGATGAGTGAGTGACACACAGTGCAGCGTGTGTACCCATGCGCGAAGTATGT

Homem

GTGGATGGATCGCGGCAGTTGTACGCACAGTGTCGAACAAGCATACGGGGACTGCACCCCGATGTAGCACGGCGTCGATTTTGACGTGCACGTGTCAGTGCGAAATCTGAGTGAAGGATCAGTGCAGCGTGGAGCGCGCATGAAAAATAGGA

Bactéria

CACACATTGTATCGACAGTTGTACGCACAGTGTCGAGGGCGACTACGGGGACTGCACCCCGAAATAGCACGGCGTCGCATGATACGTGCACGTGTCAGTGCGAAATCTGAGTGAAGGATCAGTGCAGCGGGCAGATGTAATATATATGATTT

Vírus

MARCADORES BASEADOS EM RESTRIÇÃO E HIBRIDAÇÃO DE SEQUÊNCIAS DE DNA

Reação de polimerase em cadeia (PCR)RNARNA

RFLP

VNTR(Minissatélites)

RAPD

MICROSSATÉLITES - SSR

AFLP

cDNA+AFLP

ESTs

SNPs

Marcadores organelas (cpDNA, rDNA)

Marcadores específicos (SCAR, CAPS, SSCP, STMS, RFLP-PCR)

Marcadores moleculares Marcadores moleculares baseados em DNA/RNAbaseados em DNA/RNA

Xu & Korban, 2000Xu & Korban, 2000

Gene Vf (Sarna)

AFLP

LOCALIZAR MARCAS COM CARACTERÍSTICAS LOCALIZAR MARCAS COM CARACTERÍSTICAS AGRONÔMICAS DE INTERESSEAGRONÔMICAS DE INTERESSE

840 marcadores:

475 AFLPs

235 RAPDs

129 SSRs

840 marcadores:

475 AFLPs

235 RAPDs

129 SSRs

Como validar as marcas?Como validar as marcas?

Desenvolvimento de um SCAR Desenvolvimento de um SCAR (S(Sequence characterized amplified RAPDequence characterized amplified RAPD))

1) identificação de um iniciador que confere polimorfismo a dois bulks de DNA com fenótipos contrastantes,

2) o isolamento e a clonagem do fragmento amplificado em um vetor (plasmideo),

3) sequenciamento do fragmento isolado,

4) desenho dos iniciadores de tamanho maior que os decâmeros

5) teste final (Paran e Michelmore, 1993).

SELEÇÃO ASSISTIDA POR MARCADORES SELEÇÃO ASSISTIDA POR MARCADORES (SAM)(SAM)

Marcador Primer Gene Referencia RAPDS OPM18900 CACCATCCGT Vf Koller et al.,1994 OPU01400 ACGGACGTA Vf Koller et al.,1994 OPD20500 ACCCGGTCAC Vf Yang & Kruger, 1994 OPC081100 TGGACCGGTG Vf Tartarini 1996 OPC09900 CTCACCGTCC Vf Tartarini 1996 OPAL07580 CCGTCCATCC Vf Tartarini 1996 OPAM192200 CCAGGTCTTC Vf Tartarini 1996 OPA15900 TTCCGAACCC Vf Durham and Korban 1994 OPO141700 AGCATGGCTC Vf King et al. 1998 OPAF132000 CCGAGGTGAC Vf King et al. 1998 OPAG051900 CCCACTAGAC Vf King et al. 1998 OPAG12800 CTCCCAGGGT Vf King et al. 1998 SSR

CH05e03 For:CGAATATTTTCACTCTGACTGGG Rev:CAAGTTGTTGTACTGCTCCGA

Vbj M.Gygax (Frey et al.,2004)

CH02B10 For: CAAGGAAATCATCAAAGATTCAAG Rev: CAAGTGGCTTCGGATAGT

Vr Hemmat et al.,2002

CHVf1 For: ATCACCACCAGCAGCAAAG Rev: CATACAAATCAAAGCACAACCC

Vf C.Gessler (Frey et al.,2004)

CH02c06 For: TGACGAAATCCACTACTAATGCA Rev: GATTGCGCGCTTTTTAACAT

Vr Baldi et al.,2004

CH02C02a For: CTTCAAGTTCAGCATCAAGACAA Rev: TAGGGCACACTTGCTGGTC

Vr2 Patocchi et al., 2003

CH02B07 For: CCAGACAAGTCATCACAACACTC Rev: ATGTCGATGTCGCTCTGTTG

Vd Calenge et al., 2005

Primers específicos Vf Vfa1 For: TCTATCTCAGTAGTTTCTATAATTCC

Rev:GTAGTTACTCTCAAGATTAAGAACTT Vf Xu & Korban (2002)

Vfa2 For: CTCAATCTCAGTAGTTTCTATGGA Rev: CCCCCGAGATTAAGAGTTG

Vf Xu & Korban (2002)

Vfa3 For:ATATTAGTAGTTTCTATAATCTGAAGG Rev:CCCCCGAGATTAAGAGATG

Vf Xu & Korban (2002)

Vfa4 For:TATCTCAATCTCAGTAGTAATAGTATC Rev:GACCTTGGAAACCACAATC

Vf Xu & Korban (2002)

AL07/SCAR 450 464

For: TCCTTACTGAGGAGGAAACCAG Rev: CAAGGGAACTGATCTTTCGTTG

Tartarini et al. (1999)

ARGH ARGH 25/CH02B07 For:CAAACATCATCGTAATTTTGACG

Rev:CATACTCTTCATGAGGATAATTC Vd Baldi et al.,2004

ARGH37 For:TGCACGACATTAGCAACACTG Rev:GAAACAACTTCTTTTGAGAGTTC

Vr2 Baldi et al.,2004

ARGH17 For:TTGCCGACGTTCGTGATGCT Rev:GATATCCTTTGTTTGGACAACC

Vr2 Baldi et al.,2004

ARGH 34/CHVf1

For:TGTATGACCAGCCGAAGGTG REv:CCAGGACAACAATGTACCTC

Vf1 Baldi et al.,2004

O conhecimento de sintenia permite o acesso de reprodução, por exemplo, todos os alelos de todos os cereais, e não de única espécie.

Transferência de genes para trigo do arroz. Gene foi encontrada em arroz por sintenia e, posteriormente, isolado e modificado pela alteração da seqüência de DNA que caracterizou genes do trigo antes de substituir o gene modificado de arroz.

Este método pode ser aplicado a qualquer gene de qualquer cereal, três principais de trigo, arroz e milho

Mais importante, no entanto, atualmente existe a possibilidade de combinar os conhecimentos de bioquímica, fisiologia e genética e transferência de uma cultura para outra por meio de sintenia.

Reação em cadeia da polimerase (PCR) Amplificar milhares de vezes um fragmento de DNA.

Iniciadores é uma etapa chave para um PCR bem sucedido

Necessita do conhecimento prévio da sequência de DNA alvo

Uso de iniciador com parâmetros específicos, como: Temperatura, tamanho, composição e conteúdo GC

Parâmetros são calculados utilizando-se softwares específicos a fim de que os iniciadores se unam à sequência de DNA de interesse.

O desenho dos iniciadores é dividido em várias fases:

Busca e escolha das sequências de interesse;

Alinhamento das sequências; Determinação do consenso; Seleção da região consenso mais

conservada; Escolha e teste dos iniciadores.

A Tm (Temperature melting) mínimo 57°C, máximo 63°C e ótima de 60°Cmínimo 57°C, máximo 63°C e ótima de 60°C

Percentual de GC contido na seqüência alvo de DNA usualmente é de 40% a 60% GC na constituição da fita justifica-se pelo fato de haver uma

ligação mais forte entre esses nucleotídeos (através de três pontes de hidrogênio) comparada às duas pontes em AT.

Torna-se mais difícil de separar as fitas nas ligações GC que em AT.

Tamanho dos fragmentos amplificados (amplicon) varia de 100 a 300 nucleotídeos.

Comprimento estipulado para os iniciadores mínimo de 19, máximo de 22 e ideal de 20 pares de bases.

Homepage Map Viewer: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview

Selecione Homo sapiens Pesquisa (humano) a partir do menu pull-down, digite na caixa de FMR1 em seguida, selecione Go.

Na página de resultados, quatro entradas são retornados (4 hits).

FMR1 foi mapeado em três diferentes mapas: Genes_cyto, Genes_seq e Morbid

Selecione o mapa Genes_seq para ver a estrutura do gene FMR1.

Dois links à direita do mapa Genes_seq são de uso em recuperar os 5 'e 3' DNA de acompanhamento,  

No topo da página, Download / Ver Seqüência /

Prec isamos ter uma sequencia de cDNA mas precisamos ter também a seqüência de nucleotídeos que se encontra 5 'ou 3' de um gene ou os íntrons para análises adicionais.

Pois a seqüência genômica disponível a partir do banco de dados público não pode ter essa anotação ou pode ser tão grande que torna difícil para recuperar apenas uma região de interesse,

Ferramentas Map Viewer torna mais fácil de definir, visualizar e baixar seqüência genômica em vários formatos

Usamos o visualizador de Mapa para procurar genes candidatos em uma região

O Map Viewer oferece suporte a consultas por qualquer loco posicionado em um mapa

Feito pelo número de acesso ou qualquer outro link que possa definir a sua faixa de interesse (loco no mapa).