aula8 desenho de primers

Universidade Federal de PelotasFaculdade de Agronomia Eliseu Maciel

Programa de Ps-Graduao em AgronomiaCENTRO DE GENOMICA E FITOMELHORAMENTO

IntroduoIntroduo BioinformticaBioinformtica

Professores:Luciano MaiaAntonio Costa de Oliveira

id4525199 pdfMachine by Broadgun Software - a great PDF writer! - a great PDF creator! - http://www.pdfmachine.com http://www.broadgun.com

DesenhoDesenho de de oligosoligos

DesenhoDesenho de de primersprimers

Primer designPrimer designou

ou

Luciano Maia

DesenhoDesenho de de primersprimers

DesenhoDesenho de de iniciadoresiniciadoresou

Qual a importncia do desenho de primers na biologia molecular??

Borer et al. (1974) Stability of ribonucleic acid double-stranded helices.J Mol Biol. 15;86(4):843-53.

Breslauer et al. (1986) Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 83(11): 37463750.

Entalpia (H) : Energia contida num sistema

Energia livre (G) : a energia til para realizar o trabalho para se obter tal sistema-chama energia livre de Gibbs.

Entropia (S):

Lembrando.termodinamica

Entropia (S): diferena entre H e G

Depende da complexidade do sistemaMaior complexidade = menor entropiaMenor complexidade = maior entropia

....desordem

H2 + Cl2 => 2 HCl + 184,9 kJ

H = -184,9 kJ

( TC, 1 atm) (25C, 1 atm)

Exotrmica


H2 + I2 + 51,8 kJ => 2 HI

H = +51,8 k

ExotrmicaAbsorve energia

EndotrmicaLibera energia


Reao exotrmica: reao qumica que libera calorenergia final dos produtos menor que a energia inicial dos reagentesDisso se conclui que a variao de energia negativa.Exemplo: COMBUSTIVEIS


Reao Endotrmica: reao qumica que absorve calora energia final dos produtos maior que a energia inicial dos reagentes Desta forma a variao de energia positiva

H2(g) + O2(g) = H2OEnergia liberada pela reao: H

H = - 68,3 kcal/mol

Energia gasta na organizao: S S = - 11,6 kcal/mol

Energia livre (G) - Saldo de energia (energia til para realizar trabalho):


G = H T . S G = - 68,300 + 11,6G = - 56,6 kcal/mol

G = espontnea a reao H

G = espontnea a reao H S (entropia desordem)

Breslauer et al. (1986) Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 83(11): 37463750.

De 25 para 37C

OBTENO DE PRIMERS

...

BASEADO NAS PROPRIEDADES TERMODINAMICAS DAS CADEIAS DE NUCLEOTIDEOS, SAL E TEMPERATURAS

R = 1.987 (cal/C mol) is the molar gas constant, = 50 109 concentration of the primer in its solutionT0 = 273.15 Ct = 21.6 C is an empirical temperature correction.

t may depend to ion concentration

OBTENO DE PRIMERS

OBTENO DE PRIMERS

Figure 2. The stability of a 25 base (CTG GTC TGG ATC TGA GAA CTT CAG G) varies with K+and Mg2+ concentrations. Competitive binding of ions to DNA is observed.

Regras simples para desenho de primersRegras simples para desenho de primers

Tm vs TaDEFINIES...GENERALIZAES...

Temperature melting

Tm = 4(G+C) + 2(A+T) Tm = 4(G+C) + 2(A+T)

Temperatura de anelamento.empirico.experimental

Ta = Tm 3 CTa = Tm 5 C ??!!

Devero ter entre 17-28 bases de tamanhodepende basicamente da TM e especifidade

A composio dever ter entre 40-60% de G+C (conteudo GC)exceto regies de final de UTR 3

Se possvel, a posio 3' terminar com G, C, CG ou GC:aumenta a estabilidade do emparelhamento

Regras simples para desenho de primersRegras simples para desenho de primers

TMs devero ser entre 55-65C

Se possvel, evitar que a 3 seja complementar ao 5para no formarem Loop

Se possvel, no deve haver complementaridade para no formar hairpin

Tm Primer length

G/C content GC clamp

Self-Complementary

GGCGGT ATG ATCCCGCTA GTT AC

GGCGG T A TA GTT ACCGCC G

C T AT

1)Hairpins : formado por interaes dentro do primer.

2)Self Dimer : Dmero de primers senso2)Self Dimer : Dmero de primers senso

3)Cross Dimer: Dmero de primers antisenso

Self-Complementary

GGCGGT ATG ATCCCGCTA GTT AC

GGCGG T A TA GTT ACCGCC G

C T AT

G: a energia requerida para quebrar a estrutura secundria.Valores de G muito negativos indicam grampos estveis e indesejados

3end Hairpin: G -2 kcal/molInternal hairpin: G -3 kcal/mol

1)Hairpins : formado por interaes dentro do primer.

3end Self Dimer: G -5 kcal/molInternal Self Dimer: G -6 kcal/mol

3end Crossf Dimer: G -5 kcal/molInternal Cross Dimer: G -6 kcal/mol

2)Self Dimer : Dmero de primers senso

3)Cross Dimer: Dmero de primers antisenso

>seqncia_exemploATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCATCGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGA

Viso geral do desenho Viso geral do desenho de de primerprimer

GGDGATATCGGAGGGCGGGA

>sequenciaexemplo

REGIO AMPLIFICADA

PRIMER FOWARD PRIMER REVERSE

Desenho de primersDesenho de primers

PROGRAMAS ON-LINE http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi

Padro ouro

Facilidade de usoDisponibilidade on line

ROZEN, S.; SKALETSKY, H. Primer3 on the WWW for general users and forbiologist programmers. Methods in molecular biology, v.132, p.365-386, 2000.

Desenho de primers Desenho de primers Exemplo como usar Exemplo como usar Primer3Primer3

PROGRAMAS ON-LINE (2)http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi


1) Localizar sequencia


2) Identificar posicoes alvo na sequencia, onde o primer dever flanquear

start stop Accession Locus O1815258 1818561 NM_001063247.11815258 1815581 exon + CDS 324 bp1815582 1816285 intron + 704 bp1815582 1816285 intron + 704 bp1816286 1816530 exon + CDS 245 bp1816531 1816611 intron + 81 bp1816612 1816765 exon + CDS 154 bp1816766 1817042 intron + 277 bp1817043 1817257 exon + CDS 215 bp1817258 1817350 intron + 93 bp1817351 1817468 exon + CDS 118 bp1817469 1817684 intron + 216 bp1817685 1817895 exon + CDS 211 bp1817896 1818132 intron + 237 bp1818133 1818194 exon + CDS 62 bp1818195 1818305 intron + 111 bp1818306 1818524 exon + CDS 219 bp1818525 1818561 exon + UTR 37 bp


>gi|115466225:1-1585 Oryza sativa (japonica cultivar-group) Os06g0133900 (Os06g0133900) mRNA, complete cdsATGGCGGCGACCATGGCGTCCAACGCCGCGGCTGCGGCGGCGGTGTCCCTGGACCAGGCCGTGGCGGCGT CGGCGGCGTTCTCGTCGCGGAAGCAGCTGCGGCTGCCCGCCGCGGCGCGCGGGGGGATGCGGGTGCGGGT GCGGGCGCGGGGGCGGCGGGAGGCGGTGGTGGTGGCGTCCGCGTCGTCGTCGTCGGTGGCAGCGCCGGCG GCGAAGGCGGAGGAGATCGTGCTCCAGCCCATCAGGGAGATCTCCGGGGCGGTTCAGCTGCCAGGGTCCA AGTCGCTCTCCAACAGGATCCTCCTCCTCTCCGCCCTCTCCGAGGGCACAACAGTGGTGGACAACTTGCT GAACAGTGAGGATGTTCACTACATGCTTGAGGCCCTGAAAGCCCTCGGGCTCTCTGTGGAAGCAGATAAA GTTGCAAAAAGAGCTGTAGTCGTTGGCTGTGGTGGCAAGTTTCCTGTTGAGAAGGATGCGAAAGAGGAAG TGCAACTCTTCTTGGGGAACGCTGGAACTGCAATGCGACCATTGACAGCAGCCGTGACTGCTGCTGGTGG AAATGCAACTTATGTGCTTGATGGAGTGCCACGAATGAGGGAGAGACCGATTGGTGACTTGGTTGTCGGG TTGAAACAACTTGGTGCGGATGTCGACTGTTTCCTTGGCACTGAATGCCCACCTGTTCGTGTCAAGGGAA TTGGAGGACTTCCTGGTGGCAAGGTTAAGCTCTCTGGTTCCATCAGCAGTCAGTACTTGAGTGCCTTGCT

3) Sequencia

TTGGAGGACTTCCTGGTGGCAAGGTTAAGCTCTCTGGTTCCATCAGCAGTCAGTACTTGAGTGCCTTGCT GATGGCTGCTCCTTTGGCCCTTGGGGATGTGGAGATCGAAATCATTGACAAACTAATCTCCATTCCTTAC GTTGAAATGACATTGAGATTGATGGAGCGTTTTGGTGTGAAGGCAGAGCATTCTGATAGTTGGGACAGAT TCTATATTAAGGGAGGGCAGAAGTACAAATCTCCTGGAAATGCCTATGTTGAAGGTGATGCCTCAAGCGC GAGCTATTTCTTGGCTGGTGCTGCAATCACTGGAGGCACTGTGACAGTTCAAGGTTGTGGTACGACCAGT TTGCAGGGTGATGTCAAATTTGCTGAGGTACTTGAGATGATGGGAGCAAAGGTTACATGGACTGACACCA GTGTAACCGTAACTGGTCCACCACGTGAGCCTTATGGGAAGAAACACCTGAAAGCTGTTGATGTCAACAT GAACAAAATGCCTGATGTTGCCATGACCCTTGCCGTTGTTGCACTCTTCGCTGATGGTCCAACTGCTATC AGAGATGTGGCTTCCTGGAGAGTAAAGGAAACCGAAAGGATGGTTGCAATTCGGACCGAGCTAACAAAGC TGGGAGCATCGGTTGAAGAAGGTCCTGACTACTGCATCATCACCCCACCGGAGAAGCTGAACATCACGGC AATCGACACCTACGATGATCACAGGATGGCCATGGCCTTCTCCCTCGCTGCCTGCGCCGACGTGCCCGTG ACGATCAGGGACCCTGGTTGCACCCGCAAGACCTTCCCCAACTACTTCGACGTTCTAAGCACTTTCGTCA GGAACTGAACTGAGCTTTTAAAAGAGTGAGGTCTAGGTTCTGTTG

A) Sem especificar uma regio alvoA) Sem especificar uma regio alvo


4) Inserir (copiar/colar) sequencia na pagina do Primer3


5) Configurar informaes/restries para o Primer3


6) Resultado (Parte 1)

B) Especificar uma regio alvoB) Especificar uma regio alvo


Especificando uma regiao para ser flanqueada

start stop Accession Locus O1815258 1818561 NM_001063247.11815258 1815581 exon + CDS 324 bp1815582 1816285 intron + 704 bp1816286 1816530 exon + CDS 245 bp1816531 1816611 intron + 81 bp1816612 1816765 exon + CDS 154 bp1816766 1817042 intron + 277 bp1816766 1817042 intron + 277 bp1817043 1817257 exon + CDS 215 bp1817258 1817350 intron + 93 bp1817351 1817468 exon + CDS 118 bp1817469 1817684 intron + 216 bp1817685 1817895 exon + CDS 211 bp1817896 1818132 intron + 237 bp1818133 1818194 exon + CDS 62 bp1818195 1818305 intron + 111 bp1818306 1818524 exon + CDS 219 bp1818525 1818561 exon + UTR 37 bp

Start = 324 End = 324 + 704 = 1.028



Start = 324 End = 324 + 704 = 1.028

1) Especificando uma regio



Start = 324 End = 324 + 704 = 1.028



PROGRAMAS stand-alone

Vector NTI

Facilidade de usoDisponibilidade programa livre


Vector NTI

1) Obter sequencia gravar em arquivo fasta


Vector NTI

2) Abrir arquivo fasta contendo no Vector

Desenho de primers Desenho de primers -- VectorNTIVectorNTI

3) Interface do arquivo carregado no VectorNTI


4) Selecao de uma regiao para o desenho de primers


5) Menu para localizao de Primers


6) Menu para localizao de Primers


7) Resultados (1)


7) Resultados (2)


7) Resultados (3)

Selecionando uma regiao para localizar primers no Vector


1) Marcar regiao Start = 324 End = 324 + 704 = 1.028

Desenho de primers Desenho de primers -- VectorNTIVectorNTI1) Marcar regiao Start = 324 End = 324 + 704 = 1.028

Desenho de primers Desenho de primers -- VectorNTIVectorNTI2) Resultado Start = 324 End = 324 + 704 = 1.028

?????

[email protected]

aula8 desenho de primers

Documents