Aula de Bioquímica II

Tema:

Transcrição

Prof. Dr. Júlio César Borges

Depto. de Química e Física Molecular – DQFM

Instituto de Química de São Carlos – IQSC

Universidade de São Paulo – USP

E-mail: borgesjc@iqsc.usp.br

Dogma central da Biologia

Ácidos Ribonucléicos - RNA

Participam diretamente da síntese de proteínas

Ácidos Ribonucléicos - RNA

Tipos de RNA

Tipo de RNA Tamanho Função

RNA ribossômico (rRNA) Variado Síntese de proteínas; Conta com a ajuda de

proteínas ribossomais

RNA de tranferência

(tRNA) Pequeno

Transportar aminoácidos para os Ribossomos –

Funciona como um adaptador

RNA mensageiro

(mRNA) Variável Codifica a síntese de proteínas

Pequenos RNAs nucleares

(SnRNAs) Pequeno

Maturação do mRNA; transporte de proteínas;

outras

Transcrição – DNA RNA

Síntese de RNA dirigida pela complementaridade com o DNA

Fita molde 3‟ 5‟ Não-codificante

Fita codificante 5‟ 3‟

Ambas as fitas do DNA podem ser “Codificantes”

Transcrição

Síntese de RNA dirigida pela complementaridade com o DNA

A fita molde para a síntese de RNA é a 3‟ 5‟ ou não-codificante

- Fita codificante no DNA é correspondente ao RNA T U

Transcrição – DNA RNA

Reação de polimerização catalisada pelas RNA polimerases

RNA Polimerase DNA Dependente

- Síntese segue a direção 5‟ 3‟

- Similar às DNApol sem similaridade estrutural Evolução convergente

Síntese do RNA

Síntese dirigida por complementaridade com o DNA

RNA-polimerase DNA-dependente

Coordenada da Reação

Síntese do RNA

Síntese dirigida por complementaridade com o DNA

RNA-polimerase DNA-dependente

Reação de

Polimerização

Adição contínua de

NTPs livres na

extremidade 3‟ da fita

crescente nucleotídeo

livre está ativado

Especificidade requer pareamento complementar;

Envolve dois íons metálicos, usualmente Mg2+;

- Um ativa o grupo 3‟OH do ribonucleotídeo incorporado para o

ataque nucleofílico ao grupo fosfato alfa do NTP que entra;

- O outro orienta e estabiliza eletrostaticamente o grupo trifosfato

(grupo abandonador)

Transcrição

RNA polimerase DNA dependente RNApol

- Síntese dirigida pela complementaridade com a fita do DNA não-codificante

Fita molde = fita não-codificante

1º Fase: Iniciação

2º Fase: Elongação

3º Fase: Terminação

RNA polimerase (RNApol): holoenzima (subunidades)

RNA polimerase

O cofator 70 participa do complexo de iniciação - Ele varre o DNA à procura do promotor do gene

RNA polimerase

Transcrição RNA polimerase DNA dependente RNApol

RNA polimerase

Estrutura do complexo

Transcrição Elongação

A RNApol abre a dupla-hélice do DNA e a desespiraliza a sua frente

- A RNApol forma uma bolha de síntese duplex RNA-DNA

substratos são os NTPs hidrólise das ligações fosfodiéster fornece a energia necessária

dirige a termodinâmica da Reação

A fita de RNA sintetizada se

desliga do DNA molde e este se

hibridiza novamente com a sua

fita complementar

A RNApol segura o DNA pelos dois

lados da bolha de síntese

Transcrição

A RNApol possui alta processividade

- Polimeriza 20-50 ribonucleotídeos por segundo

Possui taxa de erro maior do que no DNA 1 base em 1000

os danos de erros da RNApol são limitados ao seu produto

Pode ocorrer a síntese de vários mRNAs

a partir de um mesmo Gene

Várias RNApol no mesmo gene molde

em intervalos regulares

Transcrição – Iniciação

Sinais de início e fim da transcrição de um gene no DNA

- flanqueiam a região a ser transcrita Fator sigma

Apresentam sequências consenso existe heterogeneidade

O início da transcrição é um ponto de regulação importante

- diferenças estão relacionadas com a “força e freqüência” da ativação do promotor

- ajuste fino evolutivo à necessidade do produto gênico

São sequências

assimétricas apenas uma

das fitas de DNA deve ser

reconhecida!!!

a identificação da

orientação para a Síntese

pela RNApol na direção

5‟3‟

Transcrição – Terminação

região rica em AT que precedida de uma sequência Palindrômica

- região AT forma interações DNA-RNA fracas

- forma grampos de RNA autocomplementar

efeito estérico na RNApol liberação do DNA

Efeito total dissociação simultânea do DNA-RNA-RNApol

- sequências consenso mais variáveis do que as de iniciação

Existem enzimas que catalisam a terminação

Dissociação DNA-RNA

Fator Rho: helicase que desenrola DNA-RNA separando o último do molde

Polimerização em procarioto

A RNApol liga fracamente ao DNA e desliza sobre ele antes de dissociar

- a RNApol reconhece o promotor por contatos deste com o Fator Sigma

O fator sigma ajuda a RNApol “abrir” a fita dupla de DNA na região do promotor sem

gasto de ATP

mudanças conformacionais na RNApol ativa a polimerização

- início da polimerização pela ligação de dois NTP complementares adjacentes

Após ~10 bases polimerizadas

Mudanças conformacionais e a progressão da RNApol saída do fator sigma

RNApol sofre outras pequenas mudanças conformacionais que permitem a progressão da

polimerização Elongação

- O desligamento do fator sigma “cria” um túnel de saída de RNA transcrito

- mudanças conformacionais adicionais garantem que a RNApol não se dissocia do DNA

antes do terminador

A polimerização prossegue até a RNApol encontrar o sinal de terminação

A RNApol dissocia-se do DNA e se liga novamente ao fator sigma

Polimerização em procarioto

Inibidores:

- Rifampicina é um antibiótico que inibe a elongação da cadeia

de RNA por se ligar na RNApol antes da iniciação;

- actinomicina D se intercala na dupla fita de DNA

Polimerização em procariotos

Muitas substâncias inibem a RNApol de bactérias

Polimerização em eucarioto é diferente de procarioto

A complexidade estrutural dos eucariotos impõem necessidades

Polimerização em Eucariotos

Complexidade da Transcrição em eucariotos

3 tipos de RNApol transcrição de diferentes tipos de RNA

- RNApol I e III muitos tRNAs, rRNAs e vários snRNAs

- RNApol II muitos genes codificadores de proteínas

Necessitam dos Fatores Gerais de Transcrição

- Transcription Fator for Polimerase II TFIIA, TFIIB, etc

- Identificam o promotor e forma uma placa-suporte para a RNApol

- Desempacotamento do DNA e outras estruturas da cromatina

- Ajudam a posicionar a RNApol corretamente no promotor

- Separação das fitas de DNA TFIIH (atividade helicase) gasto de ATP

- Liberam a RNApol no modo de extensão

- Complexo de iniciação de transcrição reunião de mais de 8 TFII

Polimerização em Eucariotos

Polimerização em Eucariotos

TATA-box ~ 30 bases a “upstream” do sítio de início do transcrito

- principal sequência consenso da RNApol II existem outras

Eucariotos contam com ativadores e repressores localizados a grandes distâncias da

sequência promotora

Polimerização em Eucariotos

Fatores Gerais de Transcrição

TFIID identifica o TATA-box – TATA-Binding protein = TBP

- 25 bases a upstream do sítio de início da transcrição

A ligação distorce o DNA dupla fita na região de ligação

- Marco físico para a transcrição

Sítio de “hospedagem” para outros fatores

Polimerização em Eucariotos

Fatores Gerais de Transcrição

Fosforilação da cauda da RNApol pelo TFIIH

(atividade kinase) ativação da RNApol no

modo extensão

Ligação de outras proteínas evita o

Desligamento da RNApolII do DNA a ser

transcrito fatores de extensão

Os TFII estão livres do complexo de iniciação

de transcrição para ativarem outro gene

Ligação na Cauda da RNApolII de fatores de

processamento do RNA transcrito

Polimerização em Eucariotos

Polimerização em Eucariotos

Fatores de extensão

- evitam a dissociação da RNApolII do DNA a ser transcrito

- auxiliam na superação de regiões muito compactas da cromatina complexos

remodeladores de cromatina

-Topoisomerases eliminam as supertorção gerada pelo avanço da RNApolII na extensão do

DNA.

Ativadores transcricionais

- ligam especificamente ao DNA e ajudam a atrair a RNApol II para o complexo de iniciação

de transcrição

- superar o empacotamento do DNA

- recrutamento dos mediadores

- recrutamento de enzimas modificadoras de cromatina remodeladores de cromatina e

acetilases de histonas

- aumento do acesso ao DNA na cromatina

Aumentam a taxa de síntese de mRNA

Síntese do RNA

O RNAs são editados ou sofrem processamento!!!

mRNAs

O mRNAs são editados de duas formas

Modificações no 5‟

Introdução do Cap

Reduz exposição à

Nucleases e

fosfatases Cap:

mRNA de eucarioto possui

um „cap‟ de 7-metilguanosina

adicionado ao nucleosideo 5‟ inicial

via uma ponte 5‟-5‟ trifosfato

mRNAs

O mRNAs são editados de duas formas:

Modificações no 3‟

Poliadenilação

- Estabiliza tradução

- Aumenta o tempo de vida do mRNA

Processamento de mRNA Genes de eucariotos consistem de sequências que são expressas (éxons) e que não são

expressas (introns) e que se alternam.

Processamento de mRNA Genes de eucariotos consistem de sequências que são expressas (éxons) e que não são

expressas (introns) e que se alternam.

Processamento do mRNA

O mRNAs podem ser processados de forma que as proteínas codificadas por eles podem ser

diferentes

Introns e Éxons

“Differential Splicing” Processamento Alternativo

- Permite o controle combinatório aumenta a diversidade protéica

Processamento do mRNA

O mRNAs podem ser processados de forma que as proteínas codificadas por eles podem ser

diferentes

SnRNAs

O papel dos pequenos RNAs nucleares (snRNA) na edição do RNA

snRNA < 300 pb Contém proteínas

Complexos snRNPs – Small nuclear ribonucleoproteins Particles “snurps”

Interação dos smRNAs com os RNAs levam à formação do Spliceossomo

SnRNAs

O papel dos pequenos RNAs nucleares (snRNA) na edição do RNA

Identificação e alinhamento do local de corte e catálise

A interação dos snRNA-RNA

ocorre por complementaridade

de bases

SnRNAs

O papel dos pequenos RNAs nucleares (snRNA) na edição do RNA

Identificação e alinhamento do local de corte e também Catálise

Mecanismo de Catálise