Vera Luiza CapelozziDepartamento de PatologiaFaculdade de Medicina - Universidade de São Paulo – Brazil

e-mail: vcapelozzi@lim05.fm.usp.br

PATOLOGIA

O que é Imunohistoquímica: Impacto como Marcador Prognóstico

Imunofluorescência

• Técnica precursora IHQ: reações antígeno-anticorpo• Tecido fresco congelado, microscópio especial, pobre

definição morfológica • Anos 80-90: IHQ aplicação ampla na Patologia Cirúrgica• Detecção mais sensível: Acs monoclonais altamente

específicos, idênticos e em abundância • Cortes inicialmente congelados: fixação em formalina e

embebição em parafina

IHQ: Tipos de Anticorpos

• Monoclonais e policlonais– monoclonais: mais específicos– policlonais: reconhecem diversos epítopos

• injeção de um antígeno peptídico em animais• após a estimulação de resposta imune secundária• isolamento dos anticorpos a partir do soro

• Primários e secundários– primários: antígeno de interesse e são não-marcados– anticorpos secundários

• produzidos contra anticorpos primários • reconhecem IGs de uma espécie particular e

– são conjugados : biotina , fosfatase alcalina , peroxidase , Flúor Alexa ou Fluor DyLight

IHQ: Preparação das Amostras•Cortes:

• finos 4μm , micrótomo• lâminas

•Controles • padronização processamento e fixação

•“Controles internos”: • tecido (ou células) da mesma secção• secção do mesmo espécime da paciente

•“Controles externos”: • tecidos (ou linhas de células) de outras fontes •células negativas e outras positivas de expressão do antígeno em questão

IHQ: Direta e Indireta

• Direto (one-step)– anticorpo marcado (e.g.

Isotiocianato de Fluoresceína - FITC) conjugado

– reage diretamente com o antígeno no tecido

– simples e rápido– baixa sensibilidade: pequena

amplificação de sinal

• Ac primário não-marcado (primeira camada)– + Ag do tecido– + Ac secundário marcado (segunda camada)

• contra IgG da espécie animal na qual Ac primário foi produzido– segunda camada Ac marcada com corante fluorescente ou enzima

• Método mais sensível:– amplificação maior: reações Ac secundários com diferentes sítios

antigênicos do Ac primário– Número pequeno de Ac secundários conjugados (marcados) gerado

• Ex: Ac secundário marcado produzido contra IgG de coelho (comprado sem encomenda) reage com qualquer Ac primário produzido em coelhos

• Método direto: – produzir Acs marcados customizados contra cada antígeno de interesse

HE & IHQ

IHQ: Indicações na Patologia Cirúrgica

• tecido de origem de uma neoplasia indiferenciada• órgão de origem de uma neoplasia diferenciada• subtipagem de neoplasias (linfomas)• fatores prognósticos, terapêuticos e índices proliferativos

(por exemplo, hormônios)• identificação de estruturas, organismos e materiais

secretados pelas células• detecção de células neoplásicas metastáticas• diferenciação proliferação celular maligna e benigna

IHQ: Marcadores diagnósticos

• técnica excelente de detecção: local exato da proteína no tecido

• maior desvantagem – ao contrário do immunoblotting: coloração

checada contra um peso molecular – impossível mostrar que a coloração corresponde à

proteína de interesse – Acs primários devem validados por Western Blot

• Pan Citoqueratina: celulares epiteliais e todos carcinomas; alguns sarcomas• CD45 (LCA): marcador de leucócitos;• HMB45: marcador de melanoma e nevos azul, de Spitz e juncional, angiomiolipoma;• S100: células gliais e de Schwann, melanócitos, células de Langerhans e células reticulares interdigitantes• Vimentina: marcador de células de origem mesenquimal (sarcomas);• Actina: leiomiossarcoma (positivo), câncer papilar de mama (negativo) e outros;• Alfafetoproteína (AFP): tumores de células germinativas (seio endodérmico) e carcinoma hepatocelular;• BCL-2: linfoma folicular x hiperplasia reacional, subtipos de linfomas, carcinomas e sarcomas;• CA 125: ovário, vesícula seminal, colo uterino, endométrio, trato gastrintestinal, tireóide e mama;• Antígeno prostático específico (PSA): para câncer de próstata;• Receptores de estrogênio e progesterona: marcadores prognósticos em câncer de mama;• CD3 (Pan-T): linfomas de células T;• CK7: epitélios glandulares e transicional - subtipos de carcinomas, ductos biliares;• CD10 : células foliculares e linfoblastos, normais e neoplásicas, estroma endometrial e células renais;• CD15: granulócitos maduros, células de Hodgkin e de Reed-Sternberg e diversos adenocarcinomas• CD20 (Pan-B): linfomas de células B;• CD30 (Ki-1): linfoma de Hodgkin, linfoma de grandes células anaplásico e carcinoma embrionário;• CD117 (proto-oncogene c-KIT): estroma gastrointestinal (GIST), carcinomas e leucemias, mastócitos;• CK20: tumores gastrointestinais, carcinoma de células transicionais, tumor de células de Merkel;• Cromogranina A: diferenciação neuroendócrina;• Desmina: células musculares, estriadas ou lisas - tumores musculares lisos e estriados• E-caderina: carcinoma ductal x carcinoma lobular de mama• Erb-B2/Her-neu: mama, ovário e trato-gastrointestinal. Prognóstico e preditivo em carcinoma de mama;• KI-67: marcador de proliferação celular;• Proteína P53: produto do gene supressor tumoral marcador prognóstico• TTF-1: marcador de carcinomas de pulmão e tireóide e neoplasias neuroendócrinas.

CD56

CK-7

TTF1

Caspase-9

Bcl-2 MMP-9

P63 Vimentina IL-4 CD3

CD1a

CD68

AE1+AE3

Câncer de Pulmão: Tipos HistológicosClassificação WHO 2004 – Tipos Maiores1

SCLC13.0%

LCC5.0%

Adenocarcinoma38.3%

19.7%SqCC

Outros*24.0%

Percentual distribuido entre casos classificaveis, 2001-20042

1. Brambilla E, et al. Eur Respir J. 2001;18:1059-1068.2. SEER Database. Lung and Bronchus Cancer (Invasive), 1975-2004.

*Inclui CA adenoescamoso, CA sarcomatoides, Carcinoides, CA glândulas salivares, e Carcinomas inclassificáveis

Carcinoma Não-Pequenas Células (NSCLC): Tipos Histológicos

AdenocarcinomaCarc Cels EscamosasCarc Grandes CélulasNão Especificado (NOS)

14%

19%

38%

29%

1. Brambilla E, et al. Eur Respir J. 2001;18:1059-1068.2. SEER Database. Lung and Bronchus Cancer (Invasive), 1975-2004.

NSLCL: 70% Apresentação

como Doença Avançada

Kris MG, et al. ASCO 2011. CRA7506. Johnson BE, et al. IASLC WCLC 2011. Abstract O16.01

Mutação presente em 54% (280/516) (95% CI: 50% to 59%) Referência para tratamento especifico direcionado ao alvo determinado

Análise molecular de adenocarcinomas

Sem mutaçãoKRAS22%

EGFR17%EML4-AKL

7%

DoubleMutants 3%

BRAF 2%PIK3CA 2%

HER2MET AMPMEK1NRASAKT1

Alvos emergentes “tratáveis” em Adenocarcinoma de pulmão

Outro(Indeterminado)

Gene Evento Frequencia, %

FGFR1 Amplificação 20-25

FGFR2 Mutação 5

PIK3CA Mutação 9

PTEN Mutação-deleção 18

CCND1 Amplificação 8

CDKN2A Deleção/mutação 45

PDGFRA Amplificacão-mutação

9

EGFR Amplificação 10

MCL1 Amplificação 10

BRAF Mutação 3

DDR2 Mutacão 4

ERBB2 Amplificação 2

Alvos emergentes “tratáveis” emCA Celulas Escamosas de pulmão

Bang Y, et al. ASCO 2010. Abstract 3.Hammerman P, et al. IASLC WCLC 2011. Abstract PRS.1

Alvos moleculares potencialmente “tratáveis”

K-rasEGFRB-rafHER2PIK3CAALKMETOther

TTF1 p63

Travis WD; USCAP 2012

IHQ: Marcadores DiagnósticosAdenocarcinoma

Carc Cels Escamosas

HuberAmsterdam, 26. 9. 2011

IHQ, FISH, PCR: Marcadores Preditivos e Diagnósticos

Herbst RS, Hirsch FR. Lancet 373 (2009)

Gene copy number by FISH for epidermal growth factor receptor

Protein expression by immuno-histochemistry for epidermal growth factor receptor

Mutation in epidermal growthfactor receptor

Qual Material?

•O que o Tipo de Procedimento na Obtenção da Biópsia pode Oferecer?

- biópsia por agulha em múltiplos pontos ou “core” biópsia mínima : como definir histologia e análise molecular? - fatores que influenciam as análises moleculares

•Como Atender ao que o Patologista pode fazer?

Como Facilitar o que quer saber o Oncologista?

Patologia Cirúrgica: Rotina

Kevin L, USCAP 2012

Kevin L, USCAP 2012

Optimizando o Diagnóstico em Biópsias Pequenas

Histologia:• grupo de células incluso maligno • “não pequenas” células • não favorece adenocarcinoma pela morfologia

Recomendável IHC para confirmar origem pulmonarResultados: • TTF1 neg, CK7 pos• Tumor insuficiente recortes: Napsin A, CK20, sinaptofisina, cromogranina, e P40...

Laudo:• “carcinoma não pequenas células, NOS”, • clínico pergunta: tumor de uma paciente com antecedentes de câncer de mama...... se for, recomendável pesquisa de Her2neu

Se pensarmos:• mais a favor de adenocarcinoma• precisamos saber se trata de AIS

Se não:• como temos certeza da ausência de diferenciação escamosa• recomendamos pesquisa de EGFR e ALK

Mudanças na Histologia do Câncer de Pulmão

Pequenas Células (SCLC)-15% de todo câncer de pulmão- incidência em declínio

Não-Pequenas Células (NSCLC)- 80% de todo câncer de pulmão- tipos de NSCLC :

- células escamosas - adenocarcinoma - grandes células

Carcinoma não-pequenas células

Adenocarcinoma

- padrão glandular-mucina positiva (50%)

- CK7+/CK20-- TTF1+ Napsin A

Carcinoma células escamosas

-queratinização celular-pontes intercelulares-escamas córneas

- CK7-/CK20-- P63+ CK5/6+

WHO

Comum, mas não 100%

WHO

Comum, mas não 100%

NSCLC – NOS – MICROSCOPIA ÓPTICA

NSCLC – FAVORECE ADENOCARCINOMA

TTF1 TTF1

NSCLC- FAVORECE ADENOCARCINOMA CONFIRMADO PELA MOLECULAR

Travis W, USCAP 2012

NSCLC- DIAGNÓSTICO MICROSCOPIA ÓPTICABIÓPSIAS PEQUENAS / CITOLOGIA

Travis W, USCAP 2012

NSCLC- DIAGNÓSTICO MICROSCOPIA ÓPTICABIÓPSIAS PEQUENAS / CITOLOGIA

NSCLC- DIAGNÓSTICO MICROSCOPIA ÓPTICA-BIÓPSIAS PEQUENAS / CITOLOGIA

Travis W, USCAP 2012

MUTAÇÃO EGFR – ANTICORPOS ESPECÍFICOS DE SINALIZAÇÃO

Travis W, USCAP 2012

EGFR – EXON 21 – L858R- ANTICORPO MUTAÇÃO ESPECÍFICA

Brevet M et al. J Mol Diagn 12: 169-76, 2010

EGFR – EXON 19 – DELEÇÃO- ANTICORPO MUTAÇÃO ESPECÍFICA

Brevet M et al. J Mol Diagn 12: 169-76, 2010

Kris MG, et al. ASCO 2011. CRA7506. Johnson BE, et al. IASLC WCLC 2011. Abstract O16.01

Mutação presente em 54% (280/516) (95% CI: 50% to 59%) Referência para tratamento especifico direcionado ao alvo determinado

Análise molecular de adenocarcinomas

Sem mutaçãoKRAS22%

EGFR17%EML4-AKL

7%

DoubleMutants 3%

BRAF 2%PIK3CA 2%

HER2MET AMPMEK1NRASAKT1

Quantificação da Expressão do EGFR FLEX

Baixa EGFRIHC score <200

N=776; 69%

IHC score=112

Alta EGFRIHC score ≥200

N=345; 31%

IHC score=270IHC score=0*

Aproximadamente 1/3 pacientes estão no grupo EGFR alta expressão

*This field Pirker, WCLC 2011, Abst O01.06

Amsterdam, 26. 9. 2011Huber

EGFR-Anticorpo – FLEX

Chemotherapy (CT) Cetuximab

Cisplatin 80 mg/mCisplatin 80 mg/m22 day 1 day 1

Vinorelbine 25 (30) mg/mVinorelbine 25 (30) mg/m22 days 1, days 1, 8 8

Every 3 weeks, up to 6 cyclesEvery 3 weeks, up to 6 cycles

initial dose 400 initial dose 400 mg/mmg/m22

then 250 mg/mthen 250 mg/m22 weeklyweekly

Chemotherapy

Cetuximabuntil PD or intolerable toxicity

Chemotherapy + Cetuximab

NSCLCwet IIIB/IV

EGFR- expressing

MaintenanceMaintenance

Pirker R et al. J Clin Oncol 2008, 18S (abstract 3), Lancet 2009;373: 1525–31Amsterdam, 26. 9. 2011

HuberHuber

Median OS 1-year survival

CT + cetuximab(n=557) 11.3 mo 47%

CT(n=568)

10.1 mo 42%

Pirker R ea. ASCO 2008, Lancet 2009;373: 1525–31CT, chemotherapy; HR, hazard ratio; OS, overall survival

FLEX: sobrevida

No effect of kRAS-Mutation and EGFR-FISHO'Byrne P ea. ASCO 2009

Amsterdam, 26. 9. 2011Huber

Huber

Number of patients at riskCT + cetuximab 178 128 24 086 61

Ove

rall

surv

ival

(%)

Months

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

180 6 12 24 30

Sobrevida com Alta Expressão EGFR (N=345)

*When adjusted for prognostic factors: HR 0.67 [95% CI 0.52–0.87], p=0.002; †Logrank

CT 167 108 11 058 36

Survival

Median 1-year 2-year

CT + cetuximab

12.0 mo 50% 24%

CT 9.6 mo 37% 15%

HR*=0.73 [95% CI 0.58–0.93], p=0.011†

Number of patients at riskCT + cetuximab 178 128 24 086 61

CT 167 108 11 058 36

Number of patients at riskCT + cetuximab 178 128 24 086 61

Amsterdam, 26. 9. 2011Huber

Medicina Personalizada do PacienteCâncer de Pulmão Avançadodeve ser Direcionadapara Histologia e Genética (IHQ, ISH, PCR)

CONCLUSÃO

OBRIGADA!!