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VANESSA CRISTINA DE OLIVEIRA
Caracterização da célula tronco hematopoética do saco vitelino em embriões
bovino
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Anatomia dos
Animais Domésticos e Silvestres da
Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia da Universidade de São Paulo
para obtenção do título de Mestre em
Ciências
Departamento:
Cirurgia
Área de Concentração:
Anatomia dos Animais Domésticos e
Silvestres
Orientador:
Prof. Carlos Eduardo Ambrósio
São Paulo
2012
Autorizo a reprodução parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte.
DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO-NA-PUBLICAÇÃO
(Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo)
T.2704 Oliveira, Vanessa Cristina de FMVZ Caracterização da célula tronco hematopoética do saco vitelino em embriões / Vanessa
Cristina de Oliveira. -- 2012. 89 f. : il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Departamento de Cirurgia, São Paulo, 2012.
Programa de Pós-Graduação: Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres. Área de concentração: Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres.
Orientador: Prof. Dr. Carlos Eduardo Ambrósio.
1. Célula tronco. 2. Saco vitelino. 3. Embrião. I. Título.
Folha de avaliação
Nome: OLIVEIRA, Vanessa Cristina.
Título: Caracterização da célula tronco hematopoética do saco vitelino em embriões
bovino.
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Anatomia dos
Animais Domésticos e Silvestres da
Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia da Universidade de São Paulo
para obtenção do título de Mestre em
Ciências
Aprovado em: ___/___/_____
Banca Examinadora
Prof. Dr.
Instituição: Julgamento:
Prof. Dr.
Instituição: Julgamento:
Prof. Dr.
Instituição: Julgamento:
DEDICO,
Aos meus pais Newton e Regina e ao meu irmão Gustavo por me
apoiarem sempre, por fazerem o possível e o impossível para me verem
feliz, por compartilharem os momentos difíceis e alegres, por me darem
a certeza de que tudo o que fazemos com amor, paciência, dedicação e
fé dará certo no final. Amo muito vocês!
Ao meu Amor Luis Henrique que sempre me apoiou e apostou que
tudo daria certo, obrigada por estar ao meu lado sempre, esta é apenas
mais uma conquista de muitas que estão por vir, sua participação dia a
dia é de extrema importância para mim, obrigada!
E ao meu Avô Benedito pelas sabias palavras, pelos ensinamentos,
por compartilhar sua grande experiência de vida e por sempre me
incentivar nas minhas escolhas. O senhor para mim é um grande
exemplo!
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador Prof. Dr. Carlos Eduardo Ambrósio, que me
ensinou a enfrentar desafios com coragem e otimismo, pelo incentivo a
pesquisa, oportunidade de crescimento e por confiar no meu trabalho,
só tenho a te agradecer... Aprendi muito com você, obrigada por tudo!!!
A Capes e a Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São
Paulo (FAPESP) pelo incentivo a pesquisa e pelas bolsas concedidas;
Ao Departamento de Cirurgia- Setor Anatomia dos Animais
Domésticos e Silvestres e ao Departamento Ciências Básicas (LMMD).
Aos Professores Dr. Flavio Vieira Meirelles, Dr. Felipe Perecin, Dra.
Daniele Martins e ao Dr. Antonio Augusto Mendes Maia, por me
receberem no LMMD e pela ajuda de sempre;
Ao seu Gaspar, Dra. Rose e Dra. Ilirian pela dedicação na ajuda
para realização e análise de microscopia eletrônica de transmissão;
Ao Frigorifico por nos fornecerem os úteros e ao Leonardo pelas
coletas realizadas;
A Dra. Celina .A. Furlanetto Mançanares pela ajuda de sempre,
por acreditar e confiar no meu trabalho, pelo companheirismo,
ensinamentos, incentivo, por me inserir na pesquisa e pela amizade de
sempre. É muito bom ter você ao meu lado, obrigada por contribuir
para meu crescimento profissional. Te adoro!!
A Dra. Lilian de Jesus Oliveira que me acolheu nos momentos mais
difíceis, por seus ensinamentos, pela valiosa ajuda principalmente na
hora de interpretar os resultados, obrigada por me acolher.
A Alicia por transmitir seus conhecimentos sobre as células
hematopoéticas;
Aos amigos Rodrigo, Aline, Ana Carolina, Juliano, Rafael, Mateus
e Gabriel por estarem sempre dispostos a ajudar, pelos ensinamentos e
pela amizade de sempre;
As minhas companheiras de casa Aline e Celina pela amizade,
companheirismo e dedicação, obrigada por aguentarem a falação todo
esse tempo e por participarem deste momento da minha vida!! Vocês são
insubstituíveis, obrigada por tudo!!!
Obrigada a todos os amigos da pós-graduação por dividirem estes
momentos, pela amizade, boas conversas, risadas, ajuda e pela
companhia de sempre;
Ao André e Thais pela hospitalidade em São Paulo, muito
obrigada por me receberem com tanto carinho;
Aos meus amigos Renata Mazi e Dirceu por sempre estarem
interassados nas minhas atividades da Pós Graduação, pelo incentivo
de sempre e pela adorável recepção em São Paulo.
A Natalia pela ajuda e companhia nos momentos instáveis no
exterior, sem você eu ficaria maluca. Obrigada por tudo... Nunca tive
uma irmã mais velha antes.....
Ao Prof. Dr. Jorge Piedrahita e a todos os integrantes do
laboratório, principalmente ao Renan Sper, Odessa Marks e Stefan por
me recebem com a maior boa vontade, por me ajudarem no período em
que fiquei nos Estados Unidos, foi uma valiosa experiência, obrigada
pela oportunidade.
A todos os meus familiares que sempre torceram por mim;
A todos que não encontraram seus nomes aqui e que de forma
direta ou indireta colaboraram para a concretização desta pesquisa
A pesquisa só engrandece minha crença na força de Deus, e por
isso agradeço a Ele, por me dar todos os dias a coragem necessária para
seguir em frente e por me mostrar que com sua ajuda, tudo é possível!
If you can dream it, you can do it.
Walt Disney
RESUMO
OLIVEIRA, V. C. Caracterização da célula tronco hematopoética do saco vitelino em embriões. [Characterization of hematopoietic stem cells of the yolk sac of bovine embryos]. 2012. 89 f. Dissertação (Mestrado em Ciências) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2012.
O saco vitelino é uma das membranas extra-embrionárias que desempenha um
papel importante para a sobrevivência inicial do embrião, atua como fonte de
nutrição durante o período em que a placenta verdadeira ainda não está
completamente formada. É uma provável fonte de células tronco, o qual abriga as
primeiras células do sangue durante o desenvolvimento em mamíferos, os
eritrócitos, os quais expressam fatores de transcrição que especificam estas células
a seu destino hematopoiético. O objetivo deste trabalho foi caracterizar as células
tronco hematopoéticas provenientes do saco vitelino de embriões bovinos, em
diferentes fases gestacionais, sendo estes coletados em abatedouro local. Para
descrição da análise macroscópica e cultivo celular das células do saco vitelino, os
embriões bovinos foram divididos em grupos de idade gestacional: Grupo I (25 a 29
dias), Grupo II (30 a 34 dias), Grupo III (35 a 39 dias), Grupo IV (40 a 44 dias) e
Grupo V (45 a 50 dias) em que permaneceram mais tempo em cultura e
apresentaram a formação de aglomerados celulares, diferente dos grupos IV e V (40
a 45 dias) em que permaneceram poucos dias em cultura e não apresentaram
aglomerados celulares. Esta divergência relaciona-se à idade gestacional (45 a 50
dias), período em que se inicia a regressão do saco vitelino. Em citometria de fluxo
os grupos I, II e III (25 a 39 dias) obtiveram características semelhantes, alta
expressão de marcadores hematopoéticos (CD34, CD90 e CD117). Para os grupos
IV e V (40 a 50 dias) observa-se um declínio da expressão de CD34 e CD117
(marcadores hematopoéticos) e no grupo V houve um acréscimo da expressão de
CD45 (marcador para leucócito) confirmando que estas células não estão mantendo-
se indiferenciadas As células demonstraram ser resistentes a criopreservação,
capazes de formar colônias em matriz de Metilcelulose, mostraram a formação de
colônias após 14 dias em cultivo e a morfologia para células sanguíneas (linfócitos e
monócitos) foi confirmada na citologia celular. Na expressão gênica obteve-se baixa
expressão do gene GATA3, níveis diferentes de expressão entre os grupos para o
marcador RUNX1 e ANXA5. Dessa forma, nossos achados mais significativos
comprovaram o isolamento de células hematopoéticas a partir do saco vitelino de
embriões bovinos, sugerindo que este é uma fonte laboriosa, porém viável e eficaz
para a obtenção de células tronco para futuras aplicações na terapia celular e
gênica.
Palavras- chave: Célula tronco. Saco vitelino. Embrião.
ABSTRACT
OLIVEIRA, V. C. Characterization of hematopoietic stem cells of the yolk sac of bovine embryos. [Caracterização da célula tronco hematopoética do saco vitelino em embriões]. 2012. 89 f. Dissertação (Mestrado em Ciências) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2012. The yolk sac is one of the extra-embryonic membranes which plays an important role
in early embryonic survival and serves as source of nutrition during the period where
in the placenta is not completely true formed. The yolk sac is a likely source of stem
cells, which have first blood cells during development in mammals, the red blood
cells, which express transcription factors that specify these hematopoietic cells to
their destination. This study aimed to identify and characterize hematopoietic stem
cells from the yolk sac of bovine embryos at different stages of pregnancy, which are
collected at a local slaughterhouse. For a description of the macroscopic and cellular
culture of yolk sac cells, are as follows bovine embryos were divided into groups of
gestational age: Group I (25 to 29 days), Group II (30 to 34 days), Group III (35 to 39
days ), Group IV (40 to 44 days) and Group V (45 to 50 days) which stayed longer in
culture and showed the formation of cell clusters, different from groups IV and V (40-
45 days) in few that remained days in culture and showed no cell clumps. This
divergence is related to gestational age (45 to 50 days), during which begins
regression of the yolk sac. In flow cytometry groups I, II and III (25 to 39 days) had
similar characteristics, high expression of hematopoietic markers (CD34, CD90 and
CD117). For the groups IV and V (40 to 50 days) it is observed a decrease in
expression of CD117 and CD34 (hematopoietic markers) and in group V were
increased expression of CD45 (leukocyte marker), confirming that these cells are not
keeping Undifferentiated cells are shown to be resistant to cryopreservation, capable
of forming colonies in methylcellulose matrix showed the formation of colonies after
14 days in culture morphology and to blood cells (lymphocytes and monocytes) was
confirmed by cytology cell. In gene expression was low GATA3 gene expression,
different levels of expression between the groups for the marker and RUNX1 ANXA5.
Our most significant findings confirmed the isolation and identification of
hematopoietic cells from the bovine embryo yolk sac, therefore, it is feasible and an
effective way of obtaining stem cells for future applications in cell therapy and gene.
Keywords; Stem cell. Yolk sac. Embryo.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Esquema da distribuição das linhagens sanguíneas ................................... 36
Figura 2 – Desenhos esquemáticos e fotografias de saco vitelino de embriões bovino, dos
grupos I e II ................................................................................................................. 51
Figura 3 – Fotografia do desenvolvimento externo de embriões bovinos dos grupos (III, IV e
V).................................................................................................................................. 52
Figura 4– Microscopia Eletrônica de Transmissão das células não aderentes do saco
vitelino... ..................................................................................................................... 54
Figura 5 – Fotomicrografia das células não aderentes do saco vitelino de embriões bovinos
(aproximadamente 25 a 29 dias de gestação) ............................................................ 56
Figura 6 – Fotomicrografia das células não aderentes do saco vitelino de embriões bovinos
(30 a 34 dias) .............................................................................................................. 57
Figura 7 – Fotomicrografia das células não aderentes do saco vitelino de embriões bovinos
(aproximadamente com 35 a 39 dias de gestação) ..................................................... 59
Figura 8 – Fotomicrografia das células não aderentes do saco vitelino de embriões bovinos
(40 a 44 dias) .............................................................................................................. 60
Figura 9 – Fotomicrografia das células não aderentes do saco vitelino de embriões bovinos
(45 a 50 dias) .............................................................................................................. 62
Figura 10 – Ensaio Potencial de Formação de Colônia em Metilcelulose ................... 64
Figura 11 – Teste de viabilidade celular ...................................................................... 65
Figura 12 – Fotomicrografia das células não aderentes do saco vitelino (aproximadamente
25 a 34 dias de gestação) ........................................................................................... 67
Figura 13 –Imunofenotipagem por citometria de fluxo, embriões grupo I (25 a 29 dias) e
grupo II (30 a 34 dias), células analisadas com 5 dias e 15 dias em cultura ............... 69
Figura 14 – Histograma dos níveis de expressão das células cultivadas por 5 e 15 dias do
grupo I e grupo II (35 a 34 dias) .................................................................................. 70
Figura 15 – Imunofenotipagem por citometria de fluxo, embriões grupo III (30 a 34 dias)
células analisadas com 5 dias e 15 dias em cultura. ................................................... 71
Figura 16 – Histograma dos níveis de expressão das células cultivadas por 5 e 15 dias do
grupo III(35 a 39 dias) ................................................................................................. 71
Figura 17 – Imunofenotipagem por citometria de fluxo, embriões grupo IV (40 a 44 dias)
células analisadas com 5 dias e 15 dias em cultura .................................................... 72
Figura 18 – Histograma dos níveis de expressão das células cultivadas por 5 e 15 dias do
grupo IV (40 a 45 dias) ............................................................................................... 73
Figura 19 – Imunofenotipagem por citometria de fluxo, embriões grupo V (45 a 50 dias)
células analisadas com 5 dias e 15 dias em cultura. ................................................... 74
Figura 20 – Histograma dos níveis de expressão das células cultivadas por 5 e 15 dias do
grupo V (45 a 50 dias). ............................................................................................... 75
Figura 21- Histograma dos níveis de expressão do gene ANXA5 em todos os grupos
gestacionais (I, II, III, IV e V)..........................................................................................76
Figura 22- Histograma dos níveis de expressão do gene GATA3 em todos os grupos
gestacionais (I, II, III, IV e V)..........................................................................................77
Figura 23- Histograma dos níveis de expressão do gene RUNX1 em todos os grupos
gestacionais (I, II, III, IV e V)..........................................................................................77
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Dados elacionados aos grupos de embriões, Crown Rump Bovino (cm) e idade
embrionária aproximada.............................................................................................43
Tabela 2 - Especificação dos anticorpos utilizados...............................................................47
Tabela 3 - Anticorpos secundários utilizados.........................................................................47
Tabela 4- Sequencia dos primers sintetizados.......................................................................49
Tabela 5- Dados relacionados a expressão dos anticorpos para os grupos cultivados por
5dias......................................................................................................................... ..68
Tabela 6- Dados relacionados a expressão dos anticorpos para os grupos cultivados por 15
dias........................................................................................................................ .....68
Tabela 7- Analise de quantificação relativa, da expressão dos genes..................................75
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................. 19
2 REVISÃO DE LITERATURA ....................................................................... 21
2.1 DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO ..................................................... 21
2.2 MEMBRANAS FETAIS .............................................................................. 23
2.3 SACO VITELINO ........................................................................................ 25
2.3.1 Formação do saco vitelino ................................................................... 25
2.3.2 Funções do saco vitelino ...................................................................... 26
2.3.3 Aspectos macroscópicos e microscópicos ........................................ 28
2.4 HEMATOPOESE ....................................................................................... 30
2.5 COMPOSIÇÃO SANGUÍNEA.................................................................... .33
2.6 CÉLULAS-TRONCO HEMATOPOÉTICAS ................................................ 36
3 OBJETIVOS .................................................................................................. 41
3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................... 41
4 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................. 42
4.1 LABORATÓRIOS ....................................................................................... 42
4.2 COLETA DO MATERIAL E PROCEDIMENTOS ........................................ 42
4.3 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO ................................. 43
4.4 CULTIVO CELULAR .................................................................................. 44
4.4.1 Padronização do cultivo de células do saco vitelino ......................... 44
4.4.2 Ensaio de formação de colônias .......................................................... 44
4.4.3 Criopreservação .................................................................................... 45
4.5 ANÁLISE CITOLÓGICA (PANOTICO RÁPIDO) ........................................ 46
4.6 CARACTERIZAÇÃO IMUNOFENOTIPICA POR CITOMETRIA DE FLUXO
.......................................................................................................................... .46
4.7 EXPRESSÃO GÊNICA............................................................................. ...47
4.7.1 EXTRAÇÃO........................................................................................... ...47
4.7.2 Preparação do RNA total para amplificação e PCR quantitativo..... ...48
5 RESULTADO ................................................................................................ 50
5.1 ANÁLISE MACROSCÓPICA ..................................................................... 50
5.2 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO ................................. 53
5.3 CULTIVO CELULAR .................................................................................. 55
5.3.1 Estabelecimento do meio de cultivo celular específico ..................... 55
5.3.2 GrupoI (25 a 29 dias) ............................................................................. 55
5.3.3 Grupo II (30 a 34 dias) ........................................................................... 56
5.3.4 Grupo III (35 a 39 dias de gestação)..................................................... 58
5.3.5 Grupo IV (40 a 44 dias de gestação) .................................................... 60
5.3.6 Grupo V (45 a 50 dias de gestação) ..................................................... 61
5.4 ENSAIO DE FORMAÇÃO DE COLÔNIA .................................................. 63
5.5 CRIOPRESERVAÇÃO ............................................................................... 65
5.6 ANALISE CITOLÓGICA (PANÓTICO RÁPIDO) ........................................ 66
5.7 CITOMETRIA DE FLUXO........................................................................ .. .68
5.8 EXPRESSÃO GÊNICA.............................................................................. .75
6 DISCUSSÃO ................................................................................................. 78
7 CONCLUSÃO ............................................................................................... 82
REFERÊNCIAS ............................................................................................ 83
19
1 INTRODUÇÃO
O saco vitelino é ma membrana extraembrionária que desempenha um papel
importante para sobrevivência inicial do embrião em muitas espécies de mamíferos.
Esta membrana realiza a transferência de nutrientes para o embrião, além de produzir
proteínas necessárias para o seu desenvolvimento. Sua função é complexa,
participando da hematopoese, onde se desenvolvem os primórdios das células
sanguíneas e parte do sistema circulatório primitivo. Também faz transferência de
materiais maternos fetais tais como: aminoácidos, vitaminas e proteínas (LATSHAW,
1988; WOLF et al., 2003; RIVEROS, 2009; GALDOS-RIVEROS et al., 2010).
O saco vitelino é uma provável fonte de células tronco, o qual abriga as
primeiras células do sangue durante o desenvolvimento em mamíferos, os eritrócitos,
os quais expressam fatores de transcrição que especificam estas células a seu
destino hematopoiético (ROBB et al., 1995; SHIVDASANI; MAYER; ORKIN, 1995). De
maneira geral o termo célula tronco refere-se a células com habilidade em gerar
células filhas com características similares à célula mãe, bem como diferenciar-se em
células especializadas (WENCESLAU et al., 2011).
A célula tronco hematopoiética é definida como uma célula com grande
capacidade de auto renovação e potencial proliferativo, o que possibilita a sua
diferenciação em células progenitoras de todas as linhagens sanguíneas e a
reconstituição da população hematopoiética a partir de uma única célula. Este tipo
celular constitui 0,05% a 0,1% da medula óssea humana e das células
hematopoiéticas circulantes (GROTTO; NORONHA, 2003).
A hematopoese ou hemopoese (hemato ou hemo significa sangue, poiesis
significa fazer) é realizada no sistema hematopoético, o qual é constituído por
célulastronco hematopoéticas (CTH), células precursoras, células sanguíneas
morfofuncionalmente maduras e tecidos de sustentação da hematopoese
(microambiente hematopoético), localizado nas cavidades medulares de ossos chatos
e longos, baço, fígado, linfonodos e timo.
O sistema hematopoético é uma rede integrada de células que inicia o ciclo
contínuo de diferenciação de uma pequena população de CTH, que são pluripotentes,
e que dão origem a todas as células heterogêneas funcionais do sangue e do sistema
imune (GASPER, 2000).
20
As áreas ligadas à pesquisa em experimentação vêm estudando as células
tronco a mais de duas décadas. No entanto, é atualmente que a terapia celular vive
seu momento de máxima visibilidade, pois a plasticidade das mesmas faz da célula
tronco uma ferramenta terapêutica promissora, sendo utilizada na tentativa de
tratamentos de doenças relacionadas ao homem e aos animais (GROTTO;
NORONHA, 2003; COLOMÉ, 2007; OCARINO, 2008).
21
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO
Após a fecundação do óocito com o espermatozoide, forma-se o zigoto que
contém uma combinação de cromossomos sendo este metade da mãe e metade do
pai. O entrecruzamento dos cromossomas, por relocação dos segmentos dos
cromossomas paternos e maternos embaralha os genes, produzindo assim uma
recombinação do material genético. Após o processo de segmentação ocorre à
clivagem do zigoto, isto é, uma série de divisões mitóticas repetidas do zigoto,
resultando em um rápido aumento do número de células até a formação de células
chamada de blastômeros. Após 3 dias da fertilização ocorre uma compactação dos
blastômeros para a formação da mórula, após esse período há o aparecimento de
uma cavidade e o embrião se torna em um blastocisto. Nesta fase há uma clara
separação entre as células trofoblasticas (células que formaram a placenta) e o
embrioblasto pela cavidade celomática ou blastocistica que dará origem ao embrião
propriamente dito (MOORE; PERSAUD, 2004). Na fase de gastrulação inicia-se a
formação da linha primitiva e a diferenciação dos 2 folhetos embrionários o
ectoderma e o mesoderma.
A cavidade mesentoderma é denominada o intestino primitivo, em sua região
dorsal ocorre um achatamento, formando a placa neural que aparece por volta da
terceira semana de desenvolvimento. Após a formação da placa neural as células
ectodérmicas das bordas se multiplicam cobrindo a placa, formando as cristas
neurais que dão origem as células que formam a maior parte do sistema nervoso
periférico e sistema nervoso autônomo. A placa neural se dobra e forma o sulco
neural que tem pregas neurais de ambos os lados, as pregas neurais tornam-se
particularmente proeminentes na extremidade encefálica do embrião e constituem os
primeiros sinais do desenvolvimento do encéfalo.
Durante a quarta semana as pregas neurais começam a se fundir
convertendo a placa neural em tubo neural, onde se desenvolverá o sistema nervoso
central. Já o mesoderma forma três invaginações: a imaginação central que vai dar
origem a um eixo de sustentação contínuo denominado notocorda que forma a
22
coluna vertebral. As invaginações laterais formam os somitos e o conjunto de células
que revestem o tubo digestivo constitui o endoderma (JUNQUEIRA; CARNEIRO,
2004; GARCIA-NAVARRO, 2005). Neste estágio formam-se três folhetos
germinativos (ectoderma, mesoderma e endoderma) um tubo neural, uma notocorda
e um intestino primitivo – arquêntero (GARCIA-NAVARRO, 2005).
Cada uma das três camadas germinativas (ectoderma, mesoderma e
endoderma) dá origem a tecidos específicos e órgãos. O ectoderma dá origem à
epiderme, ao sistema nervoso central e periférico, à retina do olho e a varias outras
estruturas. O endoderma é a fonte dos revestimentos epiteliais das vias respiratórias
e do trato gastrointestinal, incluindo as glândulas que se abrem no trato
gastrointestinal e as células glandulares dos órgãos associados, tais como fígado e
o pâncreas. O mesoderma dá origem às capas de músculo liso, aos tecidos
conjuntivos e aos vasos associados a tecidos e órgãos. Também forma a maior
parte do sistema cardiovascular e é fonte de células sanguíneas e da medula óssea,
do esqueleto, dos músculos estriados e órgãos reprodutores e de excreção
(JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004; MOORE; PERSAUD, 2004).
Os eventos mais significativos no período de transição entre as fases de
gástrula em nêurula são os surgimentos do tubo neural, da notocorda, do
mesoderma e do celoma. A formação do tubo neural é um processo complexo e
multifatorial que envolve genes e fatores extrínsecos. O tubo neural separa-se logo
do ectoderma da superfície. As bordas livres do ectoderma se fundem, tornando
essa camada continua sobre o tubo neural e o dorso do embrião. Em seguida, o
ectoderma da superfície se diferencia na epiderme. O tubo neural é o primórdio do
sistema nervoso central, se desenvolve o mesoderma extraembrionário que se
prolifera formando colunas de mesoderma paraxial lateralmente à placa neural.
Cada coluna prossegue, lateralmente, com o mesoderma intermediário que se
adelgaça de modo gradual, formando uma camada de mesoderma lateral, no final
da terceira semana, as extremidades cefálicas das colunas paraxiais de mesoderma
já começam a se dividir formando dois a três pares de corpos cuboides
denominados somitos. Os somitos dão origem a maior parte do esqueleto axial, aos
músculos do tronco e dos membros e à derme da pele. O celoma intra-embrionário
surge como espaços ou vesículas, isolados entre camadas do mesoderma lateral e
constitui o primórdio das cavidades do corpo (MOORE; PERSAUD, 2004).
23
2.2 MEMBRANAS FETAIS
A placenta é um órgão materno fetal constituído por dois componentes: uma
parte fetal que é originada do saco coriônico e uma parte materna derivada do
endométrio. A placenta e o cordão umbilical funcionam como um mecanismo de
comunicação entre a mãe e o feto. Oxigênio e nutrientes saem do sangue materno,
passam pela placenta e vão para o feto a fim de nutri-lo, enquanto dióxido de
carbono e resíduos metabólicos são excretados para a porção materna. As
membranas fetais e a placenta realizam as seguintes funções e atividades: proteção,
nutrição, respiração, excreção e produção de hormônios (MOORE; PERSAUD,
2004).
O cório, o âmnio e o saco vitelino constituem as membranas fetais, que se
originam do zigoto, mas não fazem parte do embrião ou do feto (exceto partes do
saco vitelino e do alantoide). O cório é uma camada epitelial derivada da parede
externa do blastocisto, o trofoblasto. Durante o curso de implantação ele é
completado pela camada interna do mesênquima derivado do embrião. O âmnio é
uma camada derivada da divisão (roedores e primatas) ou dobramento (mamíferos)
do ectoderma embrionário. O alantoide é uma bexiga urinária extraembrionária que
se desenvolve a partir do intestino caudal. O saco vitelino se desenvolve como uma
estrutura anexa do intestino médio embrionário consiste de uma camada de epitélio
endodérmico seguido de um mesênquima fetal vascularizado (LEISER; KAUFMANN,
1994).
Parte do saco vitelino é incorporado ao embrião como o primórdio do intestino
primitivo. O alantoide forma um cordão fibroso denominado úraco, no feto, e
ligamento umbilical mediano, no adulto. Este se estende do ápice da bexiga ao
umbigo (MOORE; PERSAUD, 2004).
Ainda, o âmnio é uma bolsa em forma de saco que está repleta de líquido
amniótico e tem uma função protetora contra choques mecânicos (ALMEIDA, 1999).
O alantoide origina-se no 16° dia como um divertículo endodérmico do saco
vitelino que cresce em direção ao pedículo do embrião (MOORE; PERSAUD, 2004).
Nos marsupiais, o alantoide, juntamente com o saco vitelino, toma parte da
formação da placenta e em alguns destes animais pode entrar ou não em contato
com o cório. Já no embrião humano, o alantoide inicialmente participa da formação
24
do cordão umbilical e mais tarde sofre estreitamento, originando o úraco, o qual irá
constituir o ligamento umbilical mediano (no período pós-natal) (MOORE;
PERSAUD, 2004).
Nos carnívoros, o alantoide estende-se por toda a superfície interna do cório,
envolvendo-o e envolvendo completamente o saco amniótico (MOORE; PERSAUD,
2004).
Nos peixes e nos anfíbios, tanto o alantoide quanto o cório e o saco amniótico
estão ausentes. Nos répteis, nas aves e nos mamíferos primitivos, estão presentes o
alantoide, o saco amniótico e o cório (MOORE; PERSAUD, 2004).
Em mamíferos o alantoide se associa ao cório para formar a placenta e o
cordão umbilical, o cório faz parte da placenta e também está envolvido com a
nutrição e eliminação de resíduos (ALMEIDA, 1999; WOLPERT et al., 2000).
O mesênquima que preenche as vilosidades coriônicas origina os vasos
sanguíneos do embrião, os quais se comunicam com ele através do cordão
umbilical. O cório faz parte da placenta e também está envolvido com a nutrição e
eliminação de resíduos (WOLF et al., 2003).
É através do cordão umbilical que os nutrientes e o oxigênio chegam até o
feto, e por seu intermédio chegam até a mãe, atravessando a barreira placentária,
CO2, e os catabólitos fetais. Segundo Miglino (2009) o cordão umbilical bovino
apresenta duas artérias, duas veias e ducto alantoide. Pela veia umbilical, transporta
o sangue oxigenado para o feto a partir da placenta. As artérias umbilicais
conduzem sangue desoxigenado do feto para a placenta, onde os gases
atravessarão a barreira placentária se difundido para a mãe. O cordão umbilical
apresenta duas artérias umbilicais e uma veia umbilical, tecido conjuntivo mucoso
rico em ácido hialurônico, restos de alantoide e ducto vitelino (ALMEIDA, 1999).
25
2.3 SACO VITELINO
2.3.1 Formação do saco vitelino
Em humanos a implantação do blastocisto completa-se durante a segunda
semana do desenvolvimento embrionário. Á medida que este processo ocorre,
sucedem mudanças no embrioblasto produzindo um disco embrionário bilaminar
composto de duas camadas, o epiblasto e o hipoblasto (MOORE; PERSAUD, 2004).
O epiblasto é uma camada bem espessa, constituída por células colunares
altas, relacionadas com a cavidade amniótica. Já o hipoblasto consiste em pequenas
células cuboides adjacentes à cavidade exocelômica (MOORE; PERSAUD, 2004).
O trofoblasto também se diferencia em duas camadas sinciotrofoblasto e
citotrofoblasto. A camada citotrofoblasto é uma camada mais interna, sendo uma
camada de células mononucleadas, e é mitoticamente ativa, formando novas células
trofoblásticas que migram para a massa crescente de sinciotrofoblasto, onde se
fundem e perdem suas membranas celulares. A camada sinciciotrofoblasto é uma
massa multinucleada que se expande rapidamente onde nenhum limite celular é
visível (MOORE; PERSAUD, 2004).
Com a progressão da implantação do blastocisto, se desenvolve uma
pequena cavidade no embrioblasto que é o primórdio da cavidade amniótica, logo as
células amniogênicas (formadoras do âmnio) chamadas de amnioblastos, se
separam do epiblasto e se organizam para formar uma delgada membrana, o âmnio,
que envolve a camada amniótica (MOORE; PERSAUD, 2004).
O epiblasto forma o assoalho da cavidade amniótica e é continuo,
perifericamente, com o âmnio. O hipoblasto forma o teto da cavidade exocelômica e
é continuo com a delgada parede desta cavidade (MOORE; PERSAUD, 2004).
As células que migraram do hipoblasto para formar a membrana exocelômica
circundam a cavidade blastocística e revestem a superfície interna do citotrofoblasto.
A membrana e a cavidade exocelômica modificam-se rapidamente formando o saco
vitelino primitivo (MOORE; PERSAUD, 2004).
26
No 12° dia do embrião, as lacunas sinciciotrofoblásticas adjacentes fundem-
se para formar redes lacunares. As redes lacunares são os primórdios dos espaços
intervilosos da placenta. Os capilares endometriais em torno do embrião tornam-se
dilatados, formando os sinusóides. Em seguida, os sinusóides são erodidos pelo
sinciciotrofoblasto e o sangue materno flui para o interior das redes lacunares. O
sangue materno entra e sai das redes, estabelecendo a circulação uteroplacentária.
As células do estroma endometrial assim como as glândulas degeneradas,
em conjunto com o sangue materno, fornecem uma rica fonte de material para a
nutrição do embrião (MOORE; PERSAUD, 2004).
Enquanto ocorrem mudanças no trofoblasto e no endométrio, o mesoderma
extraembrionário cresce e surgem espaços celômicos extraembrionário isolados, no
seu interior. Estes espaços fundem-se rapidamente e forma-se uma grande
cavidade isolada, o celoma extraembrionário. Esta cavidade preenchida por fluido
envolve âmnio e o saco vitelino, exceto onde eles estão aderidos ao cório pelo
pedículo do embrião. Com a formação do celoma extraembrionário, o saco vitelino
primitivo diminui de tamanho e um pequeno saco vitelino secundário é formado. Este
saco vitelino menor é formado por células endodérmicas extraembrionárias que
migram do hipoblasto para o interior do saco vitelino primitivo. Durante a formação
do saco vitelino secundário, uma grande parte do saco vitelino primitivo destaca-se.
O saco vitelino contém liquido, mas não contém vitelo. Ele pode ter um papel na
transferência seletiva de nutrientes para o embrião. O trofoblasto absorve o fluido
nutritivo das redes lacunares no sinciciotrofoblasto que é, então, transferido ao
embrião (MOORE; PERSAUD, 2004).
2.3.2 Funções do saco vitelino
O saco vitelino é um anexo presente em embriões de todos os vertebrados,
sendo especialmente desenvolvido nos peixes, répteis e aves. Corresponde a uma
estrutura em forma de saco ligada a região ventral do embrião. É uma das
membranas que desempenham um papel importante para sobrevivência inicial do
embrião em muitas espécies de mamíferos. Nos mamíferos placentários ele é
27
reduzido, visto que a nutrição ocorre via placentária, também produzem as proteínas
necessárias para o seu desenvolvimento (SANTOS; AZOUBEL, 1996; MOORE;
PERSAUD, 2004).
Tiedemann (1979) em sua pesquisa com gatos afirmou que saco vitelino
destes possui vasos sanguíneos fenestrados e apresentam membrana basal
completa, sendo assim uma condição favorável para a passagem de proteínas e de
células sanguíneas.
Desempenha um papel essencial na transferência de nutrientes para o
embrião, durante a segunda e a terceira semanas do desenvolvimento humano,
enquanto a circulação uteroplacentária está sendo estabelecida. O saco vitelino é
essencial para o desenvolvimento embrionário, pois em fases iniciais ele é
responsável pelo armazenamento e transferência do vitelo (MOORE; PERSAUD,
2004).
O vitelo é um líquido armazenado pelo saco vitelino para suprir as
necessidades nutricionais do embrião até que o cordão umbilical ou a placenta
verdadeira estejam estabelecidos (MOORE; PERSAUD, 2004).
Sua função é complexa participando da hematopoese, pois através desta se
desenvolvem primeiras células sanguíneas e parte do sistema circulatório primitivo.
Este também faz transferência do material materno tais como aminoácidos,
vitaminas e proteínas (PALIS; YODER, 2001; WOLF et al., 2003; RIVEROS, 2009).
O saco vitelino seria assim uma provável fonte fornecedora de células-tronco,
o qual abriga as primeiras células do sangue durante o desenvolvimento em
mamíferos, os eritrócitos, os quais expressam fatores de transcrição que especificam
estas células a seu destino hematopoiético (ROBB et al., 1995; SHIVDASANI;
MAYER; ORKIN, 1995).
Pereda et al. (2010) descreveu que os eritrócitos do saco vitelino de humanos
além de transportar o oxigênio e o dióxido de carbono, realizam a função de nutrir o
embrião através do ducto vitelino, durante a quinta semana de gestação humana.
Bloom e Bartelmez (1940) e Rüsse (1992) descreveram que o saco vitelino é
o primeiro órgão hematopoético do embrião, além de demonstrar uma importante
atividade de macrofagocitose, biossíntese de proteínas e transporte de nutrientes
para o embrião, até que fígado embrionário esteja desenvolvido o suficientemente
para exercer estas funções (TIEDEMANN, 1979; TIEDEMANN; MINUTH, 1980;
MIGLINO, 2009; GALDOS-RIVEROS et al., 2010; PEREDA; MONGE; NIIMI, 2010).
28
Nos camundongos segundo Renfree et -.al. (1975) o saco vitelino desenvolve-
se semelhante ao da ratazana, envolvendo o âmnio por completo na maior parte da
gestação.
Em muitos roedores segundo os relatos de King (1982) o saco vitelino é ativo
na nutrição do embrião, persistindo no período fetal.
Segundo Riveros (2009) o saco vitelino apresenta interessantes informações,
tanto do ponto de vista morfológico como molecular. E destaca que o estudo deste
anexo embrionário é de fundamental importância para se compreender e evitar as
perdas embrionárias e frequentes nos estágios iniciais da gestação. Além disso, o
saco vitelino pode ser um modelo experimental para o desenvolvimento de novas
linhas de pesquisa relacionadas às células tronco, estudos proteômicos e terapia
utilizando células para o tratamento de doenças.
2.3.3 Aspectos macroscópicos e microscópicos do saco vitelino
O saco vitelino em fases iniciais de gestação apresenta uma porção que se
bifurca próximo ao ventre do embrião, formando assim duas extremidades longas e
finas, com o progresso da gestação seu comprimento vai diminuindo e as
extremidades do saco vitelino vão se tornando vestigiais e desaparecem. Em
embriões bovinos, o saco vitelino se desenvolve até o 30° dia de gestação e torna-
se macroscopicamente visível até o 50° dia de gestação.
No 25° dia o saco vitelino é mais evidente macroscopicamente pelo ducto
vitelínico, um centro e duas projeções e tem um comprimento total de
aproximadamente 10 cm, isso pode explicar a importância do saco vitelino,
particularmente durante este tempo, como um órgão para a geração das células
germinativas primordiais. Já no 30° dia o saco vitelino é menor do que antes, cerca
de 6 cm de comprimento ( ASSIS NETO et al., 2010).
Wrobel e Suess (1998) relataram que o saco vitelino de bovinos se
desenvolve com 18 a 23 dias de gestação. Já para Godkin et al.(1988) o saco
vitelino chegava ao seu desenvolvimento a cerca de 20 dias de gestação e em
seguida sofreria regressão.
29
Para Hafez e Hafez (2004) o saco vitelino nos animais domésticos inicia sua
regressão por volta da segunda ou terceira semana gestacional, à medida que o
alantoide se expande para se fusionar com o cório, na maioria das espécies
mamíferas.
O saco vitelino é ativo apenas durante o período embrionário e involui no
período fetal segundo Miglino et al.(2006).
Segundo Latshaw (1988) o saco vitelino nos ruminantes é vascular, grande e
completamente cercado pela cavidade extraembrionária. O saco vitelino em bovinos
se solta do cório pelo 20° dia de gestação e se reduz a uma estrutura sólida como
um cordão no 25° dia.
Em cutias (Dasyprocta aguti) e nas pacas (Agouti paca) relatado por
Conceição et. al. (2008) o saco vitelino é bem vascularizado e invertido.
Nos primatas o saco vitelino degenera rapidamente e não chega a ser
funcional (NODEN; DE LAHUNTA; FERROL, 1990). Em humanos, o saco vitelino
surge na sexta semana gestacional como uma estrutura esférica e cística, sendo
coberto por numerosos vasos superficiais pequenos, os quais se fundem na base do
ducto vitelino ligando-o à parte ventral do embrião, diretamente ao intestino médio e
à circulação sanguínea. (JONES; JAUNIAUX, 1995).
A parede do saco vitelino morfologicamente é constituída por três camadas:
um epitélio de revestimento endodérmico interno, um epitélio de revestimento
externo que corresponde ao mesotélio em contato direto com o exoceloma e um
tecido mesenquimal entre ambas as superfícies, que contém vasos sanguíneos e
tecido hematopoético (TAPIOL, 2001; PEREDA; MONGE; NIIMI, 2010).
Mançanares (2007) relata que o saco vitelino de embriões bovinos
apresentou-se como uma estrutura trilaminar divididas em 3 camadas: uma camada
única de células endodérmicas - endoderme, revestindo a cavidade vitelina; uma
camada simples mesotelial, voltada ao exoceloma - mesotélio; e uma camada
intermediária mesenquimal vascular - mesênquima. O endoderma é composto por
células endodérmicas, que se apresentam apoiadas pelo mesênquima embrionário e
mesotélio. Também observou eritroblastos primários no interior das ilhas vasculares
que estão localizadas no mesênquima embrionário. Notou que o epitélio do saco
vitelino apresentou-se globoso a colunar em uma única camada apoiadas pelo
mesênquima embrionário, este formando pequenas rugas na luz do saco vitelino.
30
Em cães o saco vitelino é uma membrana fetal composta morfologicamente
por três camadas: uma camada de endoderma, mesotélio e intermediário a eles uma
de mesênquima vascular. Persiste ate o nascimento como uma estrutura enrugada e
vascularizada e de grande importância como um mediador de trocas entre a mãe e o
Rüsse et al. (1992) observou em búfalos através da técnica de microscopia
eletrônica de varredura que o saco vitelino possui superfície de membrana, com
muitas hemácias e a descamação epitelial. Também observou o contato entre o
cordão umbilical e a membrana vitelínica.
2.4 HEMATOPOESE
Durante o desenvolvimento inicial do embrião as primeiras células sanguíneas
aparecem na parede do mesoderma do saco vitelino. Neste mesoderma também
são formadas as ilhas vasculares que posteriormente são colonizadas pelos
hemangioblastos. Os hemangioblastos possuem a capacidade de se diferenciarem
em linhagens endoteliais e hematopoéticas e se renovam de forma que mantém um
pool de células necessárias para a produção contínua de todas as células do sangue
(HYTTEL et al., 2009).
As células que estão na periferia se diferenciam formando os angioblastos
que por si só formam as células endoteliais e as células externas formam as células
sanguíneas primitivas, estas células unidas formam os vasos sanguíneos, este
processo recebe o nome de vasculogênese. Esta relação das células endoteliais
com as células hematopoéticas levanta a hipótese de que elas se originaram de um
precursor comum o hemangioblasto (CHOI et al., 1998; HYTTEL et al., 2009).
As primeiras células sanguíneas a serem formadas no saco vitelino são os
eritrócitos nucleados, estes eritrócitos primitivos evoluem em poucos dias e tornam-
se mais maduros e originam os eritrócitos anucleados (MIKKOLA; ORKIN, 2006).
O termo hemangioblasto foi mais notado quando se observaram que as
células de linhagens endoteliais e hematopoéticas compartilhavam a expressão de
um número de diferentes genes (YOUNG; BAUMHUETER; LASKY, 1995).
31
Estudos foram realizados em camundongos, e constataram que o
hemangioblasto tem fatores que expressão do gene Trans-acting T-cell-specific
transcription factor (GATA-3) (BOLLEROT; POUGET; JAFFREDO, 2005).
O gene GATA3 é um membro da família GATA e junto com os genes GATA-1
e GATA-2 são altamente expressos em células hematopoéticas. É muito importante
na diferenciação e função das células Th2 no qual é um fator de transcrição
especifico e que tem a função de controle na diferenciação da população linfocitária
Th no sistema imune (MOWEN; GLIMCHER, 2004; SAKAGUCHI et al., 2006).
O gene GATA-3 é muito importante nas funções regulatórias, esta envolvido
com a formação de ilhas sanguíneas e é um marcador especifico do hemangioblasto
(YOKOMIZO et al., 2007). É expresso em populações de células tronco
hematopoéticas primitivas (KU et al., 2012) e também em tecidos não
hematopoéticos como: órgãos, sistema nervoso central, glândula mamaria, fígado e
pele durante o período da embriogênese (OOSTERWEGEL et al., 1992; GEORGE
et al., 1994; LABASTIE et al., 1995). São importantes nas funções regulatórias
durante o comprometimento de progenitores linfoide na linhagem T e em etapas
especificas do desenvolvimento tímico (HENDRIKS et al., 1999).
O gene Annexin A5 (ANXA 5) é expresso por células-tronco e é responsável
pela ativação apoptótica celular (ANAZETTI E MELO, 2007).
As primeiras células sanguíneas a serem formadas no saco vitelino são os
eritrócitos nucleados, estes eritrócitos primitivos evoluem em poucos dias e tornam-
se mais maduros e originam os eritrócitos anucleados (MIKKOLA; ORKIN, 2006).
Após este período as células hematopoéticas são encontradas na região
intraembriônica da aorta gônadal mesonefrica (AGM), que surge logo após o
desenvolvimento do saco vitelino, as células presentes na aorta gônadal
mesonefrica passa a colonizar o fígado fetal e posteriormente alojam-se
definitivamente na medula óssea. Esta transição do saco vitelino até a aorta gônadal
mesonefrica pode ser definida como hematopoese primitiva e o momento que se
aloja na medula óssea é definido como hematopoese definitiva.
O termo hematopoese pode ser definido como a capacidade de gerar células
maduras definitivas através das células primitivas (MCGRATH; PALIS, 2005;
MIKKOLA; ORKIN, 2006; HYTTEL et al., 2009).
Bollerot et al., (2005) relatou que para que a hematopoese definitiva ocorra, a
expressão de Runt-related transcription factor 1 (RUNX-1) é de fundamental
32
importância. O gene RUNX1 também conhecido como gene da leucemia mieloid
aguda 1(AML1do inglês: acute myeloid leukemia 1) atua na diferenciação das
células hematopoéticas, assim como na diferenciação de células mieloides e
eritroídes, agem na proliferação e na manutenção das células hematopoéticas e no
desenvolvimento de células T. Também agem na diferenciação de células
granulocíticas, monocíticas e linfoides, e são muito importantes para a maturação de
megacariócitos, assim como na diferenciação de células T e B (ICHIKAWA et al.,
2004). RUNX1 é uma subunidade de fatores de transcrição que se liga ao DNA e é
necessário para a expressão de hematopoiese definitiva e não primitiva (KU et al.,
2012)
Embriões de camundongos deficientes do gene RUNX1 desenvolvem ilhas
sanguíneas no saco vitelino, o fígado destes apresentaram eritrócitos nucleares
primitivos, mas isso na ausência de células mielóides, eritroídes e magacarióides,
mostrando assim um bloqueio da hematopoiese definitiva do embrião, assim pode-
se analisar que o RUNX-1 possui um papel de fundamental importância para a
hematopoiese definitiva (OKUDA et al.,1996; WANG et al., 1996).
O gene RUNX-1 também pode atuar em estágios não definitivos, North et al.,
(1999) utilizaram células endoteliais do saco vitelino, artérias vitelínicas, umbilicais e
aorta dorsal como modelos experimentais e demonstraram a expressão de RUNX-1 ,
em que foi constatado eritrócitos primitivos no saco vitelino, sugerindo que esta
expressão seja em estágios iniciais do desenvolvimento.
Em outro experimento Lacaud et al., (2002) analisou a expressão de RUNX-
1 em corpos embrióides e notou a expressão no início do estágio de
desenvolvimento.
Yoshimoto; Yoder (2009) descreveram o desenvolvimento do embrião de
camundongo com o fator de transcrição Runx-1 que é requerido para a formação de
células tronco hematopoéticas e suas progenitoras. É considerado necessário para a
emergência de grupos de CTH no endotélio hemogênico. Mostraram que dentro do
endotélio, a expressão de Runx1 é essencial para a formação de célula tronco
hematopoéticas e progenitoras por um período de três dias, durante o
desenvolvimento do embrião de camundongo com estágio de desenvolvimento de
8.25 a 11.5 dias.
Após este período as células hematopoéticas são encontradas na região
intraembriônica da aorta gônadal mesonefrica (AGM), que surge logo após o
33
desenvolvimento do saco vitelino, as células presentes na aorta gônadal
mesonefrica passa a colonizar o fígado fetal e posteriormente alojam-se
definitivamente na medula óssea. Esta transição do saco vitelino até a aorta gônadal
mesonefrica pode ser definida como hematopoese primitiva e o momento que se
aloja na medula óssea é definido como hematopoese definitiva.
O termo hematopoese pode ser definido como a capacidade de gerar células
maduras definitivas através das células primitivas (MCGRATH; PALIS, 2005;
MIKKOLA; ORKIN, 2006; HYTTEL et al., 2009).
2.5 COMPOSIÇÃO SANGUÍNEA
As células do sangue têm vida curta e são constantemente renovadas pela
proliferação mitótica de células localizadas nos órgãos hemocitopoéticos. As
primeiras células sanguíneas do embrião surgem muito precocemente, no
mesoderma do saco vitelino. Posteriormente, o fígado e o baço funcionam como
órgãos hemocitopoéticos temporários, porém no segundo mês de vida intrauterina a
clavícula já começou a se ossificar e tem inicio da formação de medula óssea
hematógena em seu interior. À medida que a ossificação pré- natal do resto do
esqueleto avança, a medula óssea se torna cada vez mais importante como órgão
hemocitopoético (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).
Na vida pós-natal, os eritrócitos, granulócitos, linfócitos, monócitos e
plaquetas se originam a partir de células tronco da medula óssea vermelha.
Conforme o tipo de glóbulo formado, o processo recebe os nomes de eritropoese,
granulocitopoese, linfocitopoese, monocitopoese e megacariocitopoese. Muitos
linfócitos se formam na própria medula óssea, porém existe proliferação destas
células nos órgãos linfáticos, a partir de linfócitos originados da medula óssea. As
células do sangue passam por diversos estágios de diferenciação e maturação na
medula óssea, antes de passarem para o sangue. Admite-se que todas as células
do sangue derivam de um único tipo celular da medula óssea, por isso chamada
célula tronco multipotentes. Estas células proliferam e formam duas linhagens: a das
células linfoides, que formarão os linfócitos, e as células mielóides, que originará os
34
eritrócitos, granulócitos, monócitos e plaquetas. Durante sua diferenciação, os
linfócitos são transportados pelo sangue para os linfonodos, timo, baço e outros
órgãos linfáticos, onde proliferam (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004) (Figura 1).
Os eritrócitos ou hemácias dos mamíferos adultos, são anucleados, contem
grande quantidade de hemoglobina e são as células mais numerosas do sangue.
Nos humanos os eritrócitos são em formato de disco bicôncavo, nos mamíferos
possui uma forma esferoide, nas aves e nos répteis são ovais e nucleados, sua vida
varia de 60 a 120 dias (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004; SANAI et al., 2004;
GARCIA-NAVARRO, 2005).
Os granulócitos têm núcleo de forma irregular e mostram no citoplasma
grânulos específicos que aparecem envoltos por membrana. Distinguem-se três
tipos de granulócitos: neutrófilos, eosinófilos e basófilos. O núcleo dos agranulócitos
tem forma mais regular e o citoplasma não possui granulações específicas. Há dois
tipos de agranulócitos: os linfócitos e os monócitos. Os neutrófilos têm núcleos
formados por dois a cinco lóbulos ligados entre si por finas pontes de cromatina. A
célula muito jovem tem núcleo não segmentado em lóbulos, sendo chamado de
neutrófilos com núcleo em bastonete ou simplesmente bastonete curvo. O neutrófilo
é uma célula em estágio final de diferenciação, realizando uma síntese proteica
muito limitada. Os eosinófilos são muito menos numerosos do que os neutrófilos,
mas em relação ao tamanho são praticamente iguais. Seu núcleo em geral é
bilobulado e possuem grânulos no citoplasma (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).
Os basófilos tem núcleo volumoso, com forma retorcida e irregular, o
citoplasma é carregado de grânulos maiores do que dos outros granulócitos. O
monócitos são células que após a migração para os tecidos se diferenciam em
macrófagos, possuem células grandes, seu núcleo tem forma irregular e um
citoplasma abundante. Os linfócitos possuem células esféricas, o núcleo acompanha
a forma da célula, seu tempo de vida é muito variável podem viver apenas alguns
dias, como podem viver durante muitos anos, os linfócitos se diferenciam em linfócito
T e linfócito B (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).
Segundo Gunsilius, Gastl e Petzer (2001) as células sanguíneas podem ser
classificadas em células linfoides (T, B e natural killers) e mielóides (granulócitos,
monócitos, eritrócitos e megacariócitos).
Rodrigues (2003) em sua pesquisa relatou que foram encontrados no sangue
do cordão umbilical de bovinos a presença de células blásticas, células precursoras
35
eosinófilas, basófilicas e eritrocíticas e células pertencentes à linhagem
granulócitica: neutrófilos, eosinófilos e basófilos. Também foram observados
linfócitos no sangue do cordão umbilical de bovinos azebuados, esses linfócitos
apresentaram núcleo com forma redonda ou oval, cromatina grosseira e o
citoplasma escasso. Relatou que os linfócitos encontrados eram compatíveis
àqueles já descritos para linfócitos maduros presentes no sangue de mamíferos e
alguns linfócitos apresentaram o núcleo em forma de “trevo de quatro folhas”.
Capone et al. (1964) estudando a caracterização ultraestrutural de células de
bovinos sangue do cordão umbilical, notou que os granulócitos do sangue do
cordão umbilical apresentaram um diâmetro médio de cerca de 5 a 7μm e em
diferentes estágios de maturidade. Os neutrófilos apresentaram um núcleo
segmentado com dois ou três lóbulos com cromatina densa e um diâmetro médio de
3.5μm. Já os eosinófilos apresentaram um diâmetro de cerca de 7μm e mostrar um
núcleo segmentado, com cromatina condensada. Os basófilos também foram
encontrados no sangue do cordão umbilical de bovino, estas células apresentaram
um diâmetro de cerca de 6,4 μm e mostrar um núcleo redondo com cromatina
dispersa e nucléolos excêntrico. Já os linfócitos apresentaram núcleo redondo,
citoplasma com algumas mitocôndrias e inúmeros ribossomos dispersos. Alguns
linfócitos apresentaram o núcleo em forma de “trevo de quatro folhas” igualmente
relatado por Rodrigues (RODRIGUES, 2003).
Junqueira e Carneiro (2004); afirmam que durante a maturação das células de
linhagem eritrocítica ocorrem os seguintes fatores: o volume da célula e o núcleo
diminuem de tamanho, a cromatina torna-se cada vez mais condensada, até que o
núcleo se apresenta picnótico e finalmente são expulsos da célula, os nucléolos
diminuem de tamanho e depois se tornam invisíveis no esfregaço. Há uma
diminuição dos polirribossomos e um aumento de hemoglobina no citoplasma, a
quantidade de mitocôndrias e de outras organelas diminui. De acordo com o grau de
maturação, as células eritrocíticas são chamadas de: proeritroblastos, eritroblastos
basófilos, eritroblastos policromáticos, eritroblastos ortocromáticos, reticulócitos e
hemácias, assemelhando-se ao descrito por Carr, Rodak e Trad (2000).
36
Figura 1 - Esquema da distribuição das linhagens sanguíneas
1
Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki/Ficheiro:Illu_blood_cell_lineage_(pt).png
2.6 CÉLULAS-TRONCO HEMATOPOÉTICA
O termo célula- tronco refere-se a células com habilidade em gerar células-
filhas com características similares à célula- mãe, bem como diferenciar-se em
células especializadas (WENCESLAU et al., 2011).
As células-tronco, também conhecidas por stem cell ou célula mãe foram
descritas pela primeira vez Friedenstein, Gorskajak e Kulagina (1976), os quais
caracterizaram estas células como células-tronco fibroblásticas capazes de formar
colônias. Possuem morfologia fibroblastóide com alta capacidade de replicação e
após estimulo apropriado podem se diferenciar em todos os tipos celulares.
As áreas ligadas à pesquisa em experimentação vêm estudando as células-
tronco há mais de duas décadas. No entanto atualmente que a terapia celular vive
seu momento de máxima visibilidade, pois essa plasticidade torna a célula tronco
uma ferramenta terapêutica promissora, sendo utilizada na tentativa de tratamentos
37
de doenças patológicas relacionadas ao homem e aos animais (GROTTO;
NORONHA, 2003; COLOMÉ, 2007; OCARINO, 2008).
O estudo com células tronco embrionárias humanas é permitido no Brasil
desde a aprovação da lei de biossegurança pela Câmara dos Deputados no primeiro
semestre de 2005.
A célula tronco hematopoética é definida como uma célula com grande
capacidade de autorrenovação e potencial proliferativo, o que possibilita a sua
diferenciação em células progenitoras de todas as linhagens sanguíneas e a
reconstituição da população hematopoiética a partir de uma única célula. Constituem
de 0,05% a 0,1% da medula óssea humana e das células hematopoiéticas
circulantes (GROTTO; NORONHA, 2003).
Células tronco hematopoéticas têm a propriedade de diferenciar-se em todos
os elementos do sangue (hemácias, leucócitos e plaquetas), mantendo ao mesmo
tempo, a capacidade de autorrenovação que permite a manutenção de uma
quantidade de células-tronco suficientes para a produção destes elementos
figurados durante toda a vida de um indivíduo. O processo de produção contínua
dos elementos figurados do sangue é chamado de hematopoese, que possui
substituição dos mesmos em um tempo de vida determinado, como exemplo as
hemácias que tem a duração de 120 dias aproximadamente e outros linfócitos, como
os linfócitos T que podem durar por anos, segundo Bittencourt e Rocha (2006).
A hematopoese pode ser primitiva que começa no período embrionário, no
mesoderma do saco vitelino, sendo transitória, gerando apenas os eritrócitos, já a
hematopoese definitiva ocorre logo após a hematopoese primitiva, na região
aorticagonodal- mesonéfrica e gera todos os tipos de células sanguíneas
(JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004; BITTENCOURT; ROCHA, 2006).
A hematopoese ou hemopoese (hemato ou hemo significa sangue, poiesis
significa fazer) é realizada no sistema hematopoético, o qual é constituído por
células tronco hematopoéticas (CTH), células precursoras, células sanguíneas
morfofuncionalmente maduras e tecidos de sustentação da hematopoese
(microambiente hematopoético), localizado nas cavidades medulares de ossos
chatos e longos, baço, fígado, linfonodos e timo. O sistema hematopoético é uma
rede integrada de células que inicia o ciclo contínuo de diferenciação de uma
pequena população de CTH, que são pluripotentes, e que dão origem a todas as
38
células heterogêneas funcionais do sangue e do sistema imune, fundamentando a
teoria monofilética da origem do sangue (GASPER, 2000).
Por obter esta certa plasticidade tem se realizado muitos estudos sobre
células- tronco. Em cães a presença de células-tronco hematopoiéticas tem sido
observada na medula óssea (BRUNO et al., 1999; BRUNO et al., 2001) e no sangue
do cordão umbilical (NAKAGE; SANTANA, 2006).
Nakage e Santana (2006) analisaram em sua pesquisa a célula
hematopoética em cães e concluíram que a capacidade de reconstituição
hematopoética e a plasticidade das células-tronco permitem o emprego do modelo
canino em várias propostas científicas e terapêuticas, pois propiciam informações
pré-clínicas ao homem.
Em particular o conhecimento sobre células tronco evoluíram, tanto na
capacidade de expansão quanto na diferenciação (HERZOG; CHAI; KRAUSE, 2003;
ALVES; CARRONDO; CRUZ, 2007). Estudos iniciais em primatas e humanos
estabeleceram que as CTH estão presentes no sangue periférico, parênquima
hepático do embrião, medula óssea e sangue do cordão umbilical (BROXMEYER et
al., 1989; GLUCKMAN et al., 1989; SIENA et al., 1989; FORRESTER et al., 1991;
BROXMEYER et al., 1992; SCHOTS et al., 1996; ARMITAGE et al., 1997;
ABONOUR et al., 1998; KESSINGER; SHARP, 1998; PEREZ-SIMON et al., 1998) .
Muitas técnicas têm sido utilizadas para confirmar se as células tem potencialidade
tronco, uma das principais técnicas utilizadas é a citometria de fluxo em que os
principais marcadores de células tronco hematopoéticas são: CD34, CD45, c-kit e
CD90 para células embrionárias, e marcadores para células maduras do sangue
como CD3, CD14 e CD62 L.
O CD3 é um marcador formado por quatro cadeias distintas, essas moléculas
se associam como uma molécula chamada de receptor de células T, que leva a
ativação dos linfócitos T. O marcador CD14 (aglomerado de diferenciação 14) é
expresso por macrófagos, também expresso em células dendríticas. E CD62L (L-
selectin) é uma molécula de adesão celular encontrada em linfócitos, normalmente
linfócito T e monócitos (MCKINNEY-FREEMAN et al., 2009).
O antígeno CD34 (Cluster of Differentiation 34) é uma glicoproteína de
transmembrana que é expresso em todas as células de progenitores
hematopoéticos, também em células endoteliais, fibroblastos e células do sistema
nervoso. Está presente na membrana celular e é responsável pela adesão celular é
39
tendo um importante papel como marcador de fenótipo (SUTHERLAND; STEWART;
KEATING, 1993).
O CD117 (Mast stem cell growth factor receptor) é um marcador que esta
associado com uma CTH mais progenitora é, que representa o homólogo humano
das glicoproteínas transmembrana prominina 5 (PROML 1) de camundongos, é um
receptor de citocina expresso na superfície de células tronco hematopoéticas,
desempenha um papel importante no desenvolvimento hematopoético (MIETTINEN;
LASOTA, 2005; NARDI; ALFONSO, 2006).
O marcador CD45 (protein tyrosine phosphatase) é expressa em todas as
linhagens hematopoéticas, exceto eritrócitos maduros e plaquetas (SASAKI;
SASAKI-IRIE; PENNINGER, 2001). Bollerot, Pouget e Jaffredo (2005) relataram que
o hemangioblasto expressa o gene CD45 para células tronco hematopoéticas.
CD90 é expresso em células tronco hematopoéticas, nas células
mesenquimais, células mielóides, células natural killer e eritrócitos (OLIVEIRA, 2006;
COVAS, 2007).
McKinney-Freeman et al. (2009) que analisaram marcadores de células
tronco hematopoiéticas em fígado, placenta, medula óssea, e aorta gônadal (AGM)
de murinos e após compararam com células tronco embrionárias diferenciadas in
vitro. Relataram que as células mais primitivas expressaram CD34 e perderam a
expressão de CD45. Já as células mais maduras apresentaram a expressão de
CD45 e perderam a expressão de CD34.
Segundo Tárnok, Ulrich e Bocsi (2010) relataram a marcação de CD45 e c-kit
para as espécies murina e humana. Em humanos relatou marcação positiva em
fígado e medula óssea para ambos. O marcador CD117 (c-kit) teve marcação
positiva para medula óssea de murinos, já o CD45 foi positivo para os dois.
Yamasaki et al., (2011) caracterizou a população de células tronco
hematopoéticas do saco vitelino de embriões de ratos, através da expressão dos
marcadores CD45 e c- kit (CD117). As idades gestacionais foram aferidas através do
Crown rump de 9,5 a 14,5 cm. Notou-se alta expressão de CD117 e baixa expressão
de CD45 e nesta idade estas células mostraram capazes de formar colônias.
As CTH possuem maior potencial proliferativo para o transplante, seguidas
das células do cordão umbilical, medula óssea do adulto e sangue periférico, isso
em estudos realizados em humanos por Lansdorp (1995); Rebel et al. (1996);
Mayani e Lansdorp (1998); Verfaillie (2002).
40
A CTH tem origem mesenquimal e, durante o período de vida intrauterino,
está presente no saco vitelino embrionário e, posteriormente, desloca-se por via
hematógena para o fígado, baço, linfonodos e timo fetal. Na metade do período de
vida intrauterino, a hematopoese passa a ocorrer na medula óssea, que se torna o
principal sítio hematopoético no final da gestação até a vida adulta (JAIN, 1986).
As CTH são as únicas células do sistema hematopoético que exibem
potencial proliferativo extensivo e capacidade de se diferenciar em todas as células
do sistema linfo-hematopoético continuamente até a morte (GASPER, 2000;
HERZOG; CHAI; KRAUSE, 2003).
Gasper (2000) relata que a maioria das CTH está na fase de repouso (G0) do
ciclo celular e há pouca atividade mitótica no compartimento das células-tronco, no
qual ocorre a autorrenovação das referidas células e a manutenção da hematopoese
pela proliferação clônica. Morfologicamente, as CTH assemelham-se aos pequenos
linfócitos, tendo alta razão núcleo-citoplasma, nucléolo proeminente e citoplasma
basofílico destituído de grânulos. Estudos realizados demonstraram a utilização do
sangue do cordão umbilical como fonte de células progenitoras hematopoéticas,
sendo assim utilizadas na reconstituição da hematopoiese em pacientes, após
tratamento envolvendo radioterapia e a quimioterapia (BURGIO; GLUCKMAN;
LOCATELLI, 2003). Com o sucesso deste estudo, conta-se que mais de 2.000
transplantes estão sendo realizados, e que existam mais de 70.000 unidades
congeladas de células progenitoras hematopoiéticas disponíveis para o uso.
41
3 OBJETIVOS
Caracterizar as células tronco hematopoiéticas do saco vitelino de bovinos em
diferentes idades gestacionais.
3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Identificar o melhor estágio de desenvolvimento dos embriões e fetos
bovinos para coleta de células hematopoéticas do saco vitelino;
- Isolar e identificar as células hematopoéticas do saco vitelino em diferentes
períodos gestacionais;
- Testar diferentes métodos de cultivo e estabelecer o meio de cultivo ideal;
- Padronizar as linhagens de células-tronco não aderentes e averiguar o
potencial celular e a replicação das células do saco vitelino;
- Testar a capacidade de formação de colônias;
- Testar o congelamento e descongelamento das células obtidas no cultivo;
- Caracterizar morfologicamente as células hematopoiéticas do saco vitelino,
através da microscopia eletrônica de transmissão e analise citológica;
- Analise das células não aderentes em diferentes períodos de 25 a 50 dias
de gestação através da citometria de fluxo;
- Analise da Expressão Gênica.
42
4 MATERIAL E MÉTODO
Os procedimentos foram subdividos em:
4.1 LABORATÓRIOS
O presente estudo foi o realizado no setor de Anatomia dos Animais
Domésticos da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da Universidade
de São Paulo – Pirassununga.
4.2 COLETA DO MATERIAL E PROCEDIMENTOS
A coleta foi realizada em frigorifico local, onde foram coletados 83 úteros de
vacas prenhas foram coletados. Após a coleta o útero foi incisado na região da
curvatura maior do corno gravídico para a exposição e coleta do saco vitelino Com o
auxílio de uma lupa estereomicroscópica Zeiss, os embriões foram analisados e
medidos (Crown Rump - CR) segundo a metodologia determinada por Evans e Sack
(1973) e Assis Neto et al. (2010) . Com o auxilio de um paquímetro o embrião foi
mensurado da distancia da cabeça até a ultima vértebra sacral (ASSIS NETO et al.,
2010) este foi fotografado com câmara digital Sony Mavica 3.2 MP, e após a analise
macroscópica o saco vitelino foi dissecado. Para a descrição da análise
macroscópica e cultivo celular das células do saco vitelino, os embriões bovinos
foram divididos em grupos I, II III, IV e V (Tabela 1), através do CR e idade estimada
baseada nos trabalhos de Evans e Sack (1973) e Assis Neto et al. (2010).
43
Tabela 1 - Dados relacionados aos grupos de embriões, Crown Rump Bovino (cm) e idade embrionária aproximada.
Adaptado da tabela de Assis Neto et. al (2010).
4.3 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO
As células tronco hematopoéticas do saco vitelino foram centrifugadas e o
pellet foram imersos em solução de glutaraldeído a 2,5% para a fixação e inclusão
em Agar. Após a fixação, as células foram lavadas em solução de PBS por duas
vezes de 5 minutos a 1000 rpm, pós-fixadas em tetróxido de ósmio (osmium
tetroxide 4% w/w solution in Water, Polyscience, Inc. USA), overnight, lavados em
solução salina e imersos em acetato de uranila (Polyscience, Inc. USA) overnight.
As células foram lavadas novamente e desidratadas em concentrações
crescentes de acetona (30 a 100%). No qual permaneceram por 1 hora, sob
agitação na mistura de 3:1 de acetona e resina (Araldite resin, grade 502,
Polyscience, Inc. USA + DDSA, Polyscience, Inc. USA + DMP-30, Polyscience, Inc.
USA), por 1 hora na mistura de 1:1 de acetona e resina e por mais 1 hora na resina
pura.
As células foram colocadas em moldes de silicone, contendo resina pura, e na
estufa a 60° C, por 72 horas, para ocorrer a polimerização da resina. Para a
localização das áreas adequadas, os blocos contendo as amostras foram cortados
em um ultramicrótomo. Cortes semifinos de 1 m de espessura foram obtidos e
corados a quente com uma solução aquosa de borato de sódio 1% em água
destilada, contendo 0,25 % de azul de Toluidina para observação ao microscópio de
Grupos
embriões
Crown Rump (Cm) Idade Embrionária
(dias)
Numero de embriões
coletados
GRUPO I 0,3 cm a 0,9 cm 25 a 29 dias 15
GRUPO II 1,0 cm a 1,4 cm 30 a 34 dias 13
GRUPO III 1,5 cm a 2,0 cm 35 a 39 dias 20
GRUPO IV 2,1 cm a 2,5 cm 40 a 44 dias 15
GRUPO V 2,6 cm a 3,1 cm 45 a 50 dias 20
44
luz. Os cortes ultrafinos de cerca de 60 nm de espessura foram colhidos em telas de
cobre e constratados pelo acetado de uranila 2% em água destilada por 5 minutos e
pelo citrato de chumbo 0,5% em água destilada durante 10 minutos. As observações
e eletromicrografias sub-celulares foram realizadas no microscópio eletrônico ZEISS
EM-94S2 e JEOL CX-II-100.
4.4 CULTIVO CELULAR
4.4.1 Padronização do cultivo de células do saco vitelino
As membranas placentárias foram separadas e o saco vitelino isolado e
acondicionado separadamente em placas de Petri. O saco vitelino foi lavado varias
vezes em solução de PBS-L com antibiótico a 5% e em seguida macerado
manualmente (fragmentação mecânica), com auxílio de uma lâmina de bisturi até a
obtenção de um homogeneizado dos fragmentos de tecidos, em torno de 3mm de
diâmetro.
Os fragmentos do saco vitelino foram submetidos ao processo de digestão
enzimática com Colagenase IV 0,5% (Sigma) por 1 hora até a obtenção de
suspensão celular, sendo posteriormente inativada com meio de cultura.
Após a digestão as células foram colocadas em meio de cultura Stem Pro®-
34 SFM (Serum Free Medium- Life Technologies) no qual contém as citocinas
necessárias para o crescimento de células-tronco hematopoéticas.
As células foram colocadas em placas de 24 poços em incubadora de 37o C
com umidade relativa próxima de 80% e atmosfera gasosa de 5°C de CO2.
4.4.2 Ensaio de formação de colônias
Para determinação da eficiência da formação de colônias as células foram
cultivadas durante 2 dias em meio StemPro®-34 SFM (Serum free medium) e
45
colocadas em matriz de Metilcelulose® (MethoCult H4434) por um período de 14
dias. O protocolo utilizado foi adaptado por Pessolato (2011) para células humanas
que corresponde a um valor numérico de 10-50 BFU-E por 105 células plaqueadas,
após este período em cultura as colônias foram analisadas e coradas com Cristal
Violeta.
4.4.3 Criopreservação
A cultura de células provenientes do cultivo do saco vitelino contendo 1x104
foi centrifugada e o “pellet” celular ressuspendido em meio de congelamento
composto por 70% de Meio Stem Pro®-34 SFM (serum free medium), suplementado
com 20% de SFB, 10% de DMSO e 1% estreptomicina/penicilina. Este foi distribuído
em criotubos (1 ml para cada criotubo) posteriormente transferidos para o aparelho
Mister Frost (Nalgen) e mantidos em freezer -80°C overnight. Após 24 horas os
criotubos foram acondicionados em nitrogênio líquido, onde permaneceram
armazenados em temperatura de -196ºC para posterior utilização.
Os criotubos foram retirados cuidadosamente do tambor de nitrogênio líquido,
e descongelados em banho Maria à temperatura de 37°C. Em seguida as células
foram transferidas para tubos tipo Falcon e adicionados meio de cultivo Stem Pro®
34 SFM (Serum Free Medium). As amostras foram centrifugadas a 10000 rpm por 5
minutos, o sobrenadante descartado, o “pellet” ressuspendido em 2 ml de meio de
cultivo, e consequentemente transferido com o meio para as placas de cultivo
acondicionadas em estufa a 37,0o C.
Após 24 horas as placas foram retiradas da estufa, estas foram fotografadas
para analise morfológica. A viabilidade celular foi determinada mediante a contagem
de células vivas versus células mortas na câmara de Neubauer com o corante
Tripan Blue.
46
4.5 ANALISE CITOLÓGICA
Para analise citológica as células do saco vitelino de embriões bovino com
idade gestacional estimada de 35 dias foram cultivadas por 4 dias e após este
período, centrifugadas com 1ml de meio especifico Stem Pro® 34 SFM (Serum Free
Medium) sendo que 10µl destas suspensão foram espalhadas em lamina histológica
e colocadas para secar em temperatura ambiente por 10 minutos. Após a secagem
as laminas foram coradas por Panótico Rápido, sendo submersas nas soluções de
Triarilmetano, Xantenos e Tiazina, 5 segundos em cada solução e posteriormente
lavadas em água corrente. As lâminas foram analisadas e descritas.
4.6 CARACTERIZAÇÃO IMUNOFENOTÍPICA DAS CÉLULAS DO SACO VITELINO
POR CITOMETRIA DE FLUXO
Células em suspensão provenientes do saco vitelino de todos os grupos de
idades gestacionais (I, II, III, IV e V) foram cultivadas por 5 e 15 dias em meio Stem
Pro® 34 SFM, após este período as células foram centrifugadas e ressuspendidas
em meio Stem Pro® 34 SFM e posteriormente 105 células foram distribuídas em
tubos para citometria de fluxo para cada um dos marcadores a serem analisados
(Tabela 2). Em cada tubo foi colocado 1 mL de tampão FACS [DBPS (Dubelco´s
Phosphate Buffer Solution) contendo 0,1% de BSA, centrifugadas 600 x g por 8
minutos para lavagem. As células foram incubadas com o anticorpo primário (diluído
a 1:100) para análise da expressão de cada uma das populações de células do
sistema imune de acordo com tabela 2 por 30 minutos a temperatura ambiente.
Após a incubação as células foram lavadas uma vez com 1 mL tampão FACS para a
retirada do excesso de anticorpo e incubadas com anticorpo secundário (diluído a
1:300) por 30 min. As células foram lavadas com tampão FACS e fixadas com
solução 4% de paraformaldeído tamponado. As amostras foram analisadas
utilizando FACSAria (BD) a analise foi realizada no programa FCS Express V4
(DeNovo software). As populações foram estimadas pela porcentagem das células
expressando cada um de marcadores em relação ao total de células adquiridas.
47
Para realizar este procedimento foram utilizados um painel de 7 anticorpos (Tabela2)
e 2 anticorpos secundários (Tabela 3).
Tabela 2 – Especificação dos anticorpos utilizados, para a caracterização das células hematopoéticas
do saco vitelino de embriões bovinos
Tabela 3 – Anticorpos secundários utilizados para caracterização das células hematopoéticas do saco
vitelino de embriões bovinos
4.7 EXPRESSÃO GÊNICA
4.7.1 Extração
O RNA total foi extraído utilizando-se o kit TRIzol (Invitrogen), tratado com
DNase I (Invitrogen), a concentração de RNA total celular foi determinada através da
utilização do espectrofotômetro Nanodrop 1000 (Thermo Scientific, Waltham, MA) e
Anticorpo Host Imunoglobulina Mono/poli Fabricante
CD3 Mouse (IgG1) Monoclonal VMRD (MM1-A)
CD14 Mouse (IgG) Monoclonal VMRD (MM-61A)
CD62L Mouse (IgG) Monoclonal VMRD (BAQ-92ª)
CD45 Mouse (IgG2a) Monoclonal Santa Cruz
CD34 Goat (IgG) Policlonal Santa Cruz (SC-7045)
CD90 Goat (IgG) Policlonal Santa Cruz (SC-6071)
CD117 Human (IgG1) Monoclonal Chemicon (MAB1162)
Anticorpo Secundário Espécie Empresa (Código)
Anti-mouse IgG- Diluição 1:300 Goat Dako FITC (F0474)
Anti-goat IgG- Diluição 1:300 Rabbit Invitrogen (A11075)
48
integridade determinada pela Agilent 2100 Bioanalyzer 6000 Pico LabChip kit
(Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia, EUA) . O RNA extraído foi
armazenado a -80 °C até o momento da análise.
4.7.2 Preparação do RNA total para amplificação e PCR quantitativo em
tempo real
Após a extração do RNA este foi convertido em cDNA com o kit Enzima
Trascriptase reversa superscript III (Invitrogen), segundo recomendações do
fabricante. A amplificação do cDNA foi realizada utilizando-se os seguintes pares
de primers desenhados para os transcritos GATA-3, RUNX-1, ANXA-5 e GAPDH,
(Tabela 4). As reações de PCR em tempo real foram realizadas no termociclador
ABI-7500 utilizando-se o kit SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems). Todos
os genes considerados para uma dada amostra foram amplificados numa mesma
placa de PCR. Previamente ao início das análises, as condições de amplificação
(e.g. concentração de primer, temperatura de anelamento etc) foram testadas para
se definir o melhor padrão de reação. Os valores de expressão gênica foram
expressos em relação à expressão do gene endógeno GAPDH. Os dados foram
analisados utilizando-se o programa SDS v. 2.3 (Applied Biosystems) de acordo
com as especificações do fabricante.
Os testes de normalidade dos resíduos e homogeneidade das variâncias
foram realizados para cada variável. Todas as analises foram feitas por ANOVA
utilizando o procedimento GLIMMIX de SAS versão 9.2 (SAS/STAT, SAS Institute
Inc., Cary, PROC GLM (GENERAL MIXED MODELS) metodo least square
means. O nível de significância considerado foi de P < 0,05.
49
Tabela 3 – Sequência dos primers sintetizados
Genes Forward Reverse
GAPDH (cow) 5’- TCACCAGGGCTGCTTTTAAT -3’ 5’- CAGCCTTCTCCATGGTAGTGA-3’
RUNX-1 (cow) 5’- ACAGCCCCAACTTCCTCTGCTC -3’ 5’- GTTTGTGAAGACGGTGATGGTCAG -3’
GATA -3 (cow) 5’- TTAACATCGACGGTCAAGGCAAC-3’ 5’- AGAGGTGTGGGCTGGAGTGC -3’
ANXA-5 (cow) 5’- CTGACTTCCCTGGATTCGATGAG 3’ 5’- GCATGCTTCAGTTCATAGGCATCA-3’
50
5 RESULTADOS
5.1 ANÁLISE MACROSCÓPICA
Em embriões bovinos o saco vitelino se desenvolve até o dia 30 de gestação
e torna-se macroscopicamente visível até o dia 50 de gestação. Pode-se notar que
o saco vitelino esta localizado na cavidade exocelômica, possui uma porção central
que é em formato de saco com duas extremidades, próximo ao cordão umbilical e
está em conexão com o intestino primitivo (Figura 2A).
No inicio do desenvolvimento do embrião no mesoderma aparecem às
primeiras células sanguíneas, onde são formadas as ilhas vasculares, que após
são colonizadas pelos hemangioblastos (Figura 2B).
Pudemos observar no grupo I (25 a 29 dias) com CR de 0,3 a 0,9 cm, que o
saco vitelino estava localizado na região ventral do embrião em formato de saco e
podem-se notar as ilhas vasculares (Figura 2C).
As características do saco vitelino nos grupos I (25 a 29 dias de gestação), II
(29 a 34 dias) e III (35 a 40 dias de gestação) são semelhantes em que se pode
observar o saco vitelino como uma estrutura grande em forma de saco partindo da
porção ventral do embrião e dividindo-se em duas partes alongadas (Figura 3C-F e
Figura 3A e B).
Os grupos IV e V (45 a 50 dias) com CR 2,6 a 3,5 cm (centímetros) além de
obter as mesmas características citadas anteriormente, nesta fase ocorrem à
involução do saco vitelino, observamos que o saco vitelino se apresenta mais
compacto e não tão próximo da região ventral do embrião (Figura 3C- G).
O saco vitelino após o período de 50 dias começa a entrar em processo de
involução e em seguida degeneração, em bovinos o saco vitelino é funcional ate 50
dias.
51
Figura 2 – Desenhos esquemáticos e fotografias de saco vitelino de embriões bovino, dos grupos I e II
Legenda: A, representação esquemática do saco vitelino, notar a região central do saco vitelino (Svc),
suas extremidades (Sve) e a conexão com o intestino primitivo (Ip); B, esquema e uma ilha sanguíneas (Iv), observar as camadas que formam o saco vitelino, endoderma (seta grossa), mesênquima (M) e mesotélio (seta fina); Em C, embrião do grupo I (25 a 29 dias), observar o embrião (e) e a disposição do saco vitelino (Sv) na região ventral do embrião; D extremidades do saco vitelino (Sv) com ilhas sanguíneas (setas); E e F embrião grupo II (30 a 34 dias), notar a porção central (Svc) e extremidades (Sve) do saco vitelino.
A B
52
Figura 3 – Fotografia do desenvolvimento externo de embriões bovinos dos grupos (III, IV e V).
Legenda: Em A e B embrião grupo III (35 a 39 dias), em A, notar o saco vitelino na região ventral do embrião (Sv); B, observar o saco vitelino em conexão com intestino primitivo (Ip), mostrando a porção central do saco vitelino (Svc) e extremidades (Sve); C e D, embrião grupo IV ( 40 a 44 dias), notar o saco vitelino (Sv) e pontilhado o cordão umbilical ; E, embrião grupo V (45 a 50 dias), saco vitelino porção central (Svc)e as extremidades alongadas (Sve); Em F e G, embrião grupo V observar as extremidades (Sve) do saco vitelino e a porção central em conexão com intestino primitivo (Ip) ; G, observar a porção central (Svc) em formato de) e pontilhados mostrando as extremidades (Sve).
53
5.2 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO
A análise das células não aderentes por microscopia eletrônica de
transmissão foi realizada em células provenientes do saco vitelino de embriões
bovinos dos grupos de idade gestacional (I, II e III), esses grupos foram
selecionados devida a sua estabilidade em cultura, estes foram cultivados por 5 dias
e após o pellet dessas células foi incluído para analise.
Foram encontradas diversas populações celulares (Figura 4A-C), porém
predominou uma população composta por células com núcleos grandes, irregulares
e alongados, presença de nucléolos e citoplasma bem definido (Figura 4D). No
citoplasma foram encontradas diversas mitocôndrias alongadas e dispersas, retículo
endoplasmático rugoso, complexo de Golgi bem desenvolvido, estruturas com
características de desmossomos, projeções citoplasmáticas e na membrana pode-se
observar prolongamentos de membrana (Figura 4 E- G).
54
Figura 4 – Fotomicrografia e Eletromicrografia de Transmissão das células não aderentes do saco vitelino
Legenda: Em A e B fotomicrografias, observar em A vista panorâmica do corte semifino; B notar núcleo das células (setas). Em C-G eletromicrografias de transmissão, notar em C núcleos das células (setas); D, detalhe de uma célula, mostrando o núcleo grande e formato irregular (N), núcleolo (Nu), mitocôndrias (m), complexo de Golgi (G) e projeções citoplasmáticas (seta); E, citoplasma contendo mitocôndrias (m), complexo de Golgi bem definido (seta), núcleo (N) e nucléolo (Nu); F, citoplasma com mitocôndrias dispersas (m), reticulo endoplasmático rugoso (*), estrutura com característica de desmossomos (seta grossa); G, notar prolongamentos de membrana (setas), núcleolo (Nu) e núcleo (N).
N
55
5.3 CULTIVO CELULAR
5.3.1 Estabelecimento do meio de cultivo celular específico e cultivo primário
das células não aderentes do saco vitelino
As células provenientes do saco vitelino dos grupos (I, II,III, IV e V) foram
plaqueadas. Estas células foram mantidas em cultivo por 24 horas, seguida por troca
de meio, através da retirada e reposição de 1 ml do meio nas placas de cultura.
5.3.2 Grupo I (25 a 29 dias)
As células do grupo I se manteve viáveis por 30 dias em cultivo. Com 24
horas de cultivo observaram-se células flutuantes pequenas com formato circular
(Figura 5A), após 48/72 horas foram encontradas inúmeras células flutuantes e
aglomerados celulares (Figura 5B). No período de 4 a 10 dias estas células se
multiplicaram formando grandes aglomerados em forma de cachos ou colônias
(Figura 5C e D). Com 15 a 25 dias as células se mantiveram flutuantes e os
aglomerados celulares diminuíram de tamanho devido ao tempo em que essas
células se encontravam em cultura (Figura 5 E e F).
As células permaneceram em cultivo por 30 dias, e após este período as
células apresentaram-se com sugestiva morte celular, pois observou-se o tamanho
reduzido das mesmas, membrana irregular e núcleo picnotico.
56
Figura 5 – Fotomicrografia das células não aderentes do saco vitelino de embriões bovinos (aproximadamente 25 a 29 dias de gestação).
Legenda: Em A, células cultivadas por 24 horas, notar células pequenas flutuantes com formato circular
(setas); B, células com 48/72 horas em cultivo observar grande aglomerado celular; C e D, células no período de 4 a 10 dias em cultura, notar alta confluência e grande quantidade de aglomerados celular em suspensão; E e F, células cultivadas no período de 15 a 25 dias;notar em E, a diversificação celular; F, grande aglomerado celular. 20X; 40X.
5.3.3 Grupo II (30 a 34 dias)
Este grupo permaneceu com células viáveis durante 22 dias em cultura. Com
24 horas em cultivo, as células apresentaram diversidade de tipos celulares (Figura
6A) e células com características de hemácias (Figura 6B), como o saco vitelino
possui uma diversidade de tipos celulares quanto células aderentes, como células
não aderentes, após 48/72 dentre as células flutuantes pudemos observar células
com características mesenquimais (Figura 6C). As células mantiveram um alto
potencial proliferativo (Figura 6D), no período de 4 a 15 dias, pode-se evidenciar
uma grande quantidade de aglomerados celulares (Figura 5E-G), e com 22 dias os
D
E
E F
C B
D
C B A
D E
E
F
57
aglomerados celulares e o numero de células diminuiu e as células apresentaram
morfologia sugestiva de morte celular.
Figura 6 – Fotomicrografia das células não aderentes do saco vitelino de embriões bovinos (30 a 34 dias).
Legenda: Em A, células com 24 horas em cultivo, diversidade de tipos celulares; B, células com características de hemácias; C, células com 48/72 horas células aderentes com características mesenquimal; D, alta confluência formando aglomerados celulares; E, F e G, células 4 a 15 dias em cultivo, notar vários aglomerados celulares.10X; 20X; 40X.
A
B A C
D E F
58
5.3.4 Grupo III (35 a 39 dias de gestação)
Este grupo permaneceu 20 dias em cultura sendo que com 24 horas em
cultivo, apresentaram vários tipos celulares (Figura 7A), 48/72 horas observou-se
algumas células grandes com formato arredondado e outras com características de
hemácias (Figura 7B) e aos 4 dias de cultivo notou-se a formação de aglomerados
celulares (Figura 7C). No período de 8 dias, pudemos evidenciar maior quantidade
de células (Figura 7D), com 20 dias em cultivo essas células apresentaram sugestiva
morte celular, pois as células reduziram seus tamanhos.
59
Figura 7 – Fotomicrografia das células não aderentes do saco vitelino de embriões bovinos
(aproximadamente com 35 a 39 dias de gestação).
Legenda: Em A as células cultivadas por 24 horas, observar a variedade de tipos celulares; B, células cultivadas por 48//72 horas notar células com formato arredondado e algumas com características de hemácias; C, células no período de 4 dias observar formação de aglomerados celulares; D, células com 8 dias em cultivo, notar maior proliferação celular. 20x; 40X.
60
5.3.5 Grupo IV (40 a 44 dias de gestação)
Este grupo permaneceu 15 dias em cultura. Após 24 horas em cultivo as
células não aderentes se apresentaram em grande quantidade (Figura 8A), 48/72
horas notou-se maior quantidade de células (Figura 8B e 8C). Com 8 dias em cultura
notamos dentre as células não aderentes do saco vitelino a formação de células
aderentes com características mesenquimais (Figura 8D). Após 15 dias em cultura
observa-se que as células diminuem de tamanho e perdem suas características
morfológicas encontradas anteriormente, apresentando sugestiva morte celular.
Figura 8 – Fotomicrografia das células não aderentes do saco vitelino de embriões bovinos (40 a 44
dias)
Legenda: Em A, observar a população de células não aderentes; B e C, diversidade celular, hemácias (seta); D,células com características mesenquimais (seta) e células não aderentes 20X; 40X.
A B
C D
61
5.3.6 Grupo V (45 a 50 dias de gestação)
Com 24/72 horas pode-se evidenciar células em suspensão em grande
quantidade, semelhantes as encontradas nos outros grupos. No período de 4 a 8
dias em cultura pode-se evidenciar células com características de hemácias. Com 10
dias em cultivo as células diminuíram de tamanho, estas células permaneceram em
cultura por 15 dias. Após este período as características destas sugerem morte
celular, pois estas apresentavam-se em menor quantidade. Este grupo não foi
observado quanto a formação de aglomerados celulares (Figura 9).
62
Figura 9 – Fotomicrografia das células não aderentes do saco vitelino de embriões bovinos (45 a 50 dias).
Legenda: Em A, células cultivadas por 48/72 horas notar células em suspensão em grande
quantidade; B, células cultivadas por 4 dias notar células com características de hemácias (seta); C, células cultivadas por 8 dias células diminuem de tamanho; D, células cultivadas por 15 dias características de possível morte celular. 20X; 40X.
63
5.4 ENSAIO DE FORMAÇÃO DE COLÔNIA
As células foram plaqueadas em Metilcelulose com 2 dias antes do
plaqueamento as células apresentaram-se com formato arredondado (Figura 10 A),
e algumas com formato fibroblastóides (Figura 10 B) e com 5 dias após o
plaqueamento pode-se observar pequenas colônias individuais (Figura 10C e 10D).
Com 14 dias em cultivo estas colônias cresceram e permaneceram na placa e assim
pudemos testar a coloração de cristal violeta, na qual somente as células vivas
foram coradas (Figura 10 E e F).
64
Figura 10 – Ensaio Potencial de Formação de Colônia em Metilcelulose.
Legenda : Em A células com 2 dias em cultura antes do plaqueamento em Metilcelulose; B célula
aderente com formato fibroblastóide; C aglomerado celular em formato de colônias; D formação de colônia; E e F colônias de células coradas com Cristal Violeta.
65
5.5 CRIOPRESERVAÇÃO
A manutenção da viabilidade da célula submetida ao processo de
criopreservação depende basicamente de sua capacidade de resistir a dois tipos de
lesão: a desidratação e o dano mecânico decorrente da formação de cristais de gelo
no seu interior. A viabilidade celular foi de 100%, utilizando o corante Tripan Blue.
Após o descongelamento as células mantiveram as mesmas características
morfológicas (Figura 11).
Figura 11 – Teste de viabilidade celular.
Legenda: Em A células cultivadas por 4 dias antes do congelamento; B, células com 72 horas após
descongelamento, notar em A e B que as características morfológicas se das células não aderentes do saco vitelino se mantiveram. 20X
A B
66
5.6 ANALISE CITOLÓGICA (PANÓTICO RÁPIDO)
Foi realizada a analise citologia dos grupos (I, II, III), as células utilizadas
estavam em cultura por 15 dias. O panótico rapido revelou que a cultura possuía
vários tipos de células com morfologia semelhante a células brancas do sangue, tais
como: monócitos, linfócitos, basófilos e células com morfologia de células-tronco
caracterizada pela presença de núcleo grande com cromatina e citoplasma pequeno
(Figura 12A). As células com caracteristicas de linfocitos apresentaram-se
caracteristicas de citoplasma escasso e nucleo escuro (Figura 12B- D). Já os
monocitos apresentaram núcleos ovoide e grande, cromatina condensada e
citoplasma escasso (Figura 12D).
Com isso o panótico rápido indicou que essas células quando mantidas muito
tempo em cultura podem se diferenciarem, já que com 15 dias apareceram células
com características de linfócitos, monócitos e células com característica
progenitoras.
67
Figura 12 – Fotomicrografia das células não aderentes do saco vitelino de embriões bovinos
(aproximadamente 25 a 34 dias de gestação - Grupo I e II).
Legenda: Em A notar células semelhantes a célula tronco, pela presença de núcleo grande e cromatina e citoplasma pequeno; B e C, células semelhantes à linfócitos, observar o núcleo escuro e esférico com citoplasma escasso. D, notar linfócitos (seta fina) e monócitos com núcleo ovoide, citoplasma escasso e cromatina condensada (seta grossa) 40x.
C D
B A
68
5.7 CITOMETRIA DE FLUXO
Os animais foram divididos em grupos de idade gestacional (I, II, III, IV e V) as
células foram cultivadas e analisadas por citometria de fluxo com 5 e 15 dias em
cultura, utilizando um painel de 7 anticorpos: CD3, CD14, CD62L, CD45, CD34,
CD90 e CD117 (c-kit), para analise da expressão (Tabelas 5 e 6).
Tabela 5- Dados relacionados a expressão dos anticorpos para os grupos cultivados por 5 dias
Tabela 6- Dados relacionados a expressão dos anticorpos para os grupos cultivados por 15 dias.
Pudemos observar que os grupos I, II (figura 14) e III (figura 16) através das
analise por citometria de fluxo tiveram características semelhantes, pois teve a
expressão significativa de marcadores hematopoéticos, mas em contrapartida
aumentou os marcadores de células maduras do sangue (CD3, CD14 e CD62L)
como linfócitos e monócitos. A expressão de marcadores hematopoéticos pode estar
Grupos
embriões
CD3
CD62L
CD14
CD117
CD45
CD34
CD90
GRUPO I 0 9,4 0,9 0,4 2,9 1,8 10,8
GRUPO III 19,1 11,9 12,1 12,1 6,2 9,5 0,2
GRUPO IV 18,5 8,3 62,8 62,8 7,6 81,4 0,3
GRUPO V 7,9 7,3 38,1 38,1 16,9 19,6 0,1
Grupos
embriões
CD3
CD62L
CD14
CD117
CD45
CD34
CD90
GRUPO I 42,8 35 35,2 36 32,1 52,7 46
GRUPO III 35,1 19,8 22,5 31, 3 7,9 84,7 59,9
GRUPO IV 52,3 30,7 39,8 54,1 19,3 1,8 10,8
GRUPO V 48,2 29,7 35,6 0,2 34,2 1,7 8,9
69
relacionada à idade embrionária, já que os embriões destes grupos são mais jovens
e o saco vitelino possui maior funcionalidade.
No grupo IV (Figura 18) e V (Figura 20) também ocorreu um aumento da
expressão das proteínas com o tempo em cultura, mas ocorreu uma diminuição da
expressão da proteína de marcadores específicos de célula tronco hematopoética
como CD34 e CD117. E o marcador CD45 que é especialmente referente a
leucócitos apresentou-se em alta no grupo V, mostrando que estas células podem
não estar mais indiferenciadas. Este ocorrido pode estar relacionado à idade
embrionária, pois como relatado anteriormente quanto maior o embrião o saco
vitelino vai perdendo sua funcionalidade.
Figura 13 – Imunofenotipagem por citometria de fluxo, embriões grupo I (25 a 29 dias) e grupo II (30 a
34 dias), células analisadas com 5 dias e 15 dias em cultura.
Legenda: Marcação positiva dos marcadores específicos de células tronco hematopoéticas (CD117, CD45, CD34 e CD90). Em contra partida, revelaram alta expressão para marcadores de superfície como linfócitos (CD3), monócitos (CD14, CD62L).
70
Figura 14 – Histograma dos níveis de expressão das células cultivadas por 5 e 15 dias do grupo I e grupo II (25 a 34 dias).
71
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Por
cent
agem
de
célu
las
posi
tiva
s (%
)
Grupo III
5 dias
15 dias
Figura 15 – Imunofenotipagem por citometria de fluxo, embriões grupo III (30 a 34 dias) células
analisadas com 5 dias e 15 dias em cultura
Legenda:. A Analise respondeu positivamente aos marcadores específicos de células tronco hematopoéticas (CD117, CD45, CD34 e CD90). Em contra partida, revelaram alta expressão para marcadores de superfície como linfócitos (CD3), monócitos (CD14, CD62L).
Figura 16 – Histograma dos níveis de expressão das células cultivadas por 5 e 15 dias do grupo III (35 a 39 dias).
72
Figura 17 – Imunofenotipagem por citometria de fluxo, embriões grupo IV (40 a 44 dias).
Legenda: Células analisadas com 5 dias e 15 dias em cultura. Com 5 dias em cultura respondeu positivamente aos marcadores (CD117 e CD34). Em contra partida, com 15 dias revelaram expressão para marcadores de superfície como linfócitos (CD3), monócitos (CD14, CD62L) e diminuiu a expressão dos marcadores (CD34, CD117).
73
Figura 18 – Histograma dos níveis de expressão das células cultivadas por 5 e 15 dias do grupo IV(40 a 45 dias).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90P
orc
en
tag
em
de c
élu
las p
osit
ivas (
%)
Grupo IV
5 dias
15 dias
74
Figura 19 – Imunofenotipagem por citometria de fluxo, embriões grupo V (45 a 50 dias) células
analisadas com 5 dias e 15 dias em cultura.
Legenda: Amostras de 5 dias em cultura teve-se baixa expressão de (CD3, CD62L, CD14, CD45, CD34 e CD90) e obteve-se expressão para CD117. Com 15 dias revelaram um grande aumento da expressão para marcadores de superfície como linfócitos (CD3), monócitos (CD14, CD62L) e CD45 e diminuição da expressão de CD34 e CD117.
75
Figura 20 – Histograma dos níveis de expressão das células cultivadas por 5 e 15 dias do
grupo V (45 a 50 dias).
5.8 EXPRESSÃO GÊNICA
Para analise da expressão gênica foram utilizadas células do saco vitelino
com 15 dias em cultura em todos os períodos gestacionais dos grupos (I, II, III, IV e
V).
Utilizamos 3 genes ANXA5, GATA3 e RUNX1 foi realizada analise de
quantificação relativa em comparação ao controle endógeno GAPDH (tabela 7).
Tabela 7- Analise de quantificação relativa, da expressão dos genes.
Grupos embriões
ANXA5 GATA3 RUNX1
GRUPO I 4,06 1,54 4,55
GRUPO II 3,82 - 0,39 1,73
GRUPO III - 0,76 - 8,26 -2,43
GRUPO IV 0,26 -5,5 -2,42
GRUPO V 4,99 -1,59 1,7
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50P
orc
en
tag
em
de c
élu
las p
osit
ivas (
%)
Grupo V
5 dias
15 dias
76
A analise revelou expressões em diferentes idades gestacionais, o gene
Anexina 5 é um marcador de célula tronco e é responsável pela ativação apoptótica
celular, este mostrou-se expresso nos grupos (I, II e IV), os grupos (III e V) não
tiveram níveis de expressão ( Figura 21).
Já o gene GATA 3 é um marcador de hemangioblasto, este foi pouco
expresso no grupo I e nos demais grupos não teve expressão (Figura 22).
O gene RUNX1 foi expresso no grupo I, II e V e não foi expresso nos grupos
III e IV (Figura 23) é um fator de transcrição que regula a diferenciação de células
progenitoras hematopoéticas em células sanguíneas maduras, mostrando que as
células dos grupos I, II e V encontram-se nessa fase.
Figura 21- Histograma dos níveis de expressão do gene ANXA5 em todos os grupos de idade
gestacional (I, II, III, IV e V).
77
Figura 22- Histograma dos níveis de expressão do gene GATA 3 em todos os grupos de idade
gestacional (I, II, III, IV e V).
Figura 23- Histograma dos níveis de expressão do gene RUNX1 em todos os grupos de idade
gestacional (I, II, III, IV e V).
78
6 DISCUSSÃO
O desenvolvimento embrionário em bovinos começa desde a fecundação até
o 50° dia de gestação, o saco vitelino se desenvolve com 18 a 23 dias de gestação,
é um disco trilaminar constituído de trofoblasto, mesoderma e endoderma, é
funcional até o 50° dia de gestação, após este período entra em processo de
involução e degeneração (LATSHAW, 1987; WROBEL; SUESS, 1998; ASSIS NETO
et al., 2009; MORINI, 2009; WENCESLAU et al., 2011). Em nossos achados não foi
possível visualizar desaparecimento do saco vitelino, já que a proposta era até o
período do 25° a 50° dia de gestação, as características observadas foram que no
estágio de 45 a 50 dias de gestação em que o saco vitelino apresentava-se mais
compacto e não tão próximo à região ventral do embrião, esta característica também
foi relatada por Alberto (2006) em saco vitelino de embriões bovinos na mesma
idade gestacional. Latshaw (1998) e Noden De Lahunta e Ferrol (1990) salientaram
que em equinos e carnívoros domésticos a funcionalidade do saco viltelino é
prolongada quando comparada aos bovinos.
Mançanares (2007) e Assis Neto et al. (2010) analisaram o saco vitelino de
embriões bovinos e relataram que no 25° dia, este é mais evidente
macroscopicamente, formado por uma porção central em formato de saco e
ventralmente sua porção final é constituída por duas projeções alongadas, nossos
achados estão de acordo estes autores.
Para a compreensão desta membrana embrionária previamente descrita
macroscopicamente em bovinos (; GODKIN et al., 1988; WROBEL; SUESS, 1998;
MIGLINO et al.,2006; MANÇANARES, 2007; ASSIS NETO et al., 2010) , foi desenvolvido
o cultivo celular seguindo o protocolo descrito por Pessolato (2011) em ovinos, a
partir destes as células puderam ser isoladas e cultivadas.
As características encontradas foram similares as observadas e descritas por
Pessolato (2011) em saco vitelino de ovinos e Choi et al. (1998) em células tronco
embrionárias de ratos. Sendo essas em cultura proporcionalmente divididas em
células aderentes e não aderentes. Neste estudo observamos a cultura de embriões
com idades gestacionais de 25 a 50 dias, notamos que quanto menor a idade em
embrionária, mais tempo em cultura essas células permaneceram e evidenciamos
79
nos grupos de idade 25 a 34 dias a formação de aglomerados celulares na porção
não aderente.
Em analise por microscopia eletrônica de transmissão as células oriundas do
saco vitelino apresentaram núcleo grande, irregular e alongado com a presença de
nucléolos. O citoplasma apresentou-se bem definido com inúmeras organelas
celulares tais como: mitocôndrias, complexo de golgi, desmossomos e retículo
endoplasmático rugoso. Estas características foram confirmadas através dos relatos
de Wenceslau et al. (2011) em fígado de cães; Pessolato (2011) em saco vitelino de
ovinos e Cesar (2008) em medula óssea de camundongos. Diferente dos nossos
achados, Rodrigues (2003) ressaltou que células do cordão umbilical de bovinos
azebuados apresentaram ausência de nucléolo e núcleo com um formato oval.
O ensaio de potencial de colônias em matriz de Metilcelulose® (MethoCult
H4434) revelou colônias 14 dias após o plaqueamento das células, o mesmo foi
relatado por Kaufman (2001) em humanos que utilizou células tronco embrionárias
humanas e diferenciou para progentitoras hematopoéticas através da medula óssea
de camundongos S17, estas células encontravam-se em cocultura com saco vitelino,
foram colocadas em Metilcelulose e pode-se observar colônias após 14 dias em
cultura. Em contrapartida Pessolato (2011) realizou a formação de colônias em
Metilcelulose de saco vitelinos de embriões ovinos e relatou que 1 dia após o
plaqueamento já era possível a visualização de colônias. Luis et al. (2009) afirmou
que células provenientes do sangue de ratos irradiados formaram colônias após 7
dias em cultura.
Para analisar as colônias com 14 dias em cultura, submetemos a coloração
com Cristal Violeta, de acordo com Luis et al. (2009) que avaliou a hematopoese do
sangue periférico de ratos irradiados, sendo este ensaio em Metilcelulose.
Outra característica importante observada foi através da Análise Citológica
(Panótico Rápido) em que pudemos evidenciar células com características de
linfócitos e monócitos, essa particularidade também foi relatado por Rohon et al.
(2012) que observou o aspirado da medula óssea humana, no tratamento da
leucemia mielomonocitica crônica, e encontrou os mesmos tipos celulares com
similares características.
Para caracterização imunofenotipica das células tronco hematopoéticas do
saco vitelino utilizamos marcadores específicos de células tronco hematopoéticas:
CD34, CD90, CD117 e CD45 de acordo com os relatos de Grotto e Noronha (2003)
80
e Okamoto e Campos (2004) em humanos. Para as células maduras do sangue
foram utilizados os marcadores como: CD3, CD14 e CD62L. As analises foram
realizadas em diferentes grupos de idades embrionárias, constamos que o grupo I, II
e III teve alta expressão de marcadores de células tronco hematopoéticas (CD90,
CD34 e CD117) semelhante aos relatos de Mendl et al. (2006) que analisou células
tronco hematopoéticas da pele de ratos recém nascidos e notou-se alta expressão
de CD34 e CD117. Já os grupos IV e V perderam a expressão dos marcadores
CD117 e CD34 quando mantidas mais tempo em cultura. Observamos que em todas
as idades gestacionais o marcador CD45 teve um aumento de expressão quando
estas células foram cultivadas por mais tempo concordando assim com os relatos de
McKinney-Freeman et al. (2009) que analisaram marcadores de células tronco
hematopoéticas (fígado, placenta, medula óssea, e aortagonadal - AGM) de murinos
e compararam com células tronco embrionárias diferenciadas in vitro. Relataram que
as células mais primitivas expressaram CD34 e perderam a expressão de CD45. Já
as células mais maduras apresentaram a expressão de CD45 e perderam a
expressão de CD34.
Nos resultados apresentados observa-se a expressão significativa de CD117
corroborando com os resultados encontrados por Tárnok, Ulrich e Bocsi (2010) em
medula óssea de murinos e Yamasaki et al. (2011) que caracterizaram a população
de células tronco hematopoéticas do saco vitelino de embriões de ratos, através da
expressão dos marcadores CD45 e CD117. Notou-se alta marcação de CD117 e
baixa expressão de CD45 e nesta idade estas células mostraram capazes de formar
colônia.
Na expressão gênica o gene ANXA5 foi expresso nos grupos I, II e V, esse
gene é expresso em células tronco e é responsável pela ativação apoptótica celular,
sugerindo assim que esse grupos estão entrando em fase de transição entrando na
fase apoptótica concordando com os relatos de Pessolato, 2011; Anazatti e Melo,
2007.
O gene RUNX 1 foi expresso em 3 grupos (I, II e V), segundo Yao et al., 2007
é um gene expresso por hemangiblasto em um estágio secundário de diferenciação.
Com isso pudemos observar que como essas células estavam mantidas por 15 dias
em cultura, estas poderiam estar iniciando seu processo de diferenciação.
81
Segundo Bollerot, Pouget e Jaffredo (2005) o gene GATA 3 é um marcador
especifico de célula hematopoética, em nossos achados só obtivemos a expressão
em uma idade gestacional no grupo I nos demais grupos esse não foi expresso.
A célula tronco hematopoética é definida como uma célula com grande
capacidade de autorrenovação e potencial proliferativo, o que possibilita a sua
diferenciação em células progenitoras de todas as linhagens sanguíneas e a
reconstituição da população hematopoiética a partir de uma única célula. Em nossos
estudos pudemos constatar que o saco vitelino é uma fonte viável de células tronco,
pois foi possível isolar com sucesso as células tronco hematopoéticas dos embriões
de todas as idades gestacionais (25 a 50 dias) e pode-se notar marcações de
proteínas hematopoéticas especificas através da analise imunofenotipica. Com isso
pudemos constatar que o saco vitelino de embriões bovinos é uma importante fonte
de célula tronco relevante para a Terapia Celular.
82
7 CONCLUSÃO
A partir das metodologias empregadas neste projeto, pode-se comprovar o
isolamento e manutenção de células hematopoéticas do saco vitelino de embriões
bovinos, onde a diversidade de resultados obtidos esteve relacionada com os
diferentes agrupamentos por fase gestacional, sendo que os grupos I, II, III de
período inicial (25 a 39 dias) se mantiveram mais tempo em cultivo quando
comparados aos grupos IV e V de estágio gestacional avançado (40 a 50 dias) já
que nesta fase evidencia-se a regressão do saco vitelino e consequentemente seu
período de manutenção em cultivo foi menor.
As células foram capazes de se agrupar em colônias e os resultados de
citometria de fluxo comprovam a expressão de marcadores hematopoéticos e para
células maduras do sangue pela expressão de Runx1 nos resultados de expressão
gênica e corroborando com os achados citológicos de monócitos e linfócitos.
Com isso nossos achados mais significativos comprovaram o isolamento de
células hematopoéticas a partir do saco vitelino de embriões bovinos, sugerindo que
este é uma fonte laboriosa, porém viável e eficaz para a obtenção de células tronco
para futuras aplicações na terapia celular.
83
REFERENCIAS
ABONOUR, R.; SCOTT, K. M.; KUNKEL, L. A.; ROBERTSON, M. J.; HROMAS, R.; GRAVES, V.; LAZARIDIS, E. N.; CRIPE, L.; GHARPURE, V.; TRAYCOFF, C. M.; MILLS, B.; SROUR, E. F.; CORNETTA, K. Autologous transplantation of mobilized peripheral blood CD34+ cells selected by immunomagnetic procedures in patients with multiple myeloma. Bone Marrow Transplant, v. 22, n. 10, p. 957-963, 1998.
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