fraccionamento/separação celular. células sanguíneas

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Fraccionamento/ Separação Celular

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Page 1: Fraccionamento/Separação Celular. Células Sanguíneas

Fraccionamento/Separação

Celular

Page 2: Fraccionamento/Separação Celular. Células Sanguíneas

Células Sanguíneas

Page 3: Fraccionamento/Separação Celular. Células Sanguíneas

MacrofagosMonócitos

NeutrófilosPMN

Eosinófilos

Basófilos

Linfócitos

T

B

NK

CD4

CD8

Células do Sistema Imune

Page 4: Fraccionamento/Separação Celular. Células Sanguíneas

- Eritrocitos (RBC)

- Células sem núcleo ou outros organelos

- Sobrevivem em circulação ate 120 dias

- Constituídos por hemoglobina (90%) e de forma bicôncava

- Plaquetas (platelets)

- Células homeostáticas para a coagulação sanguínea, responsáveis pela libertação de substancias vaso constritoras

- Polimorfonucleados = Eosinofilos + basofilos + neutrofilos

- Formam-se na medula óssea

- têm uma vida de 3 a 4 h após a qual se fixam nos tecidos

- São atraídos para tecidos inflamados/infectados por factores quimiostáticos. Matam envolvendo o agente infeccioso e libertando os grânulos citoplasmáticos (mieloperoxidase)

- Importância destacada nas reacções alérgicas agudas e crónicas

Page 5: Fraccionamento/Separação Celular. Células Sanguíneas

- Macrofago

- Célula fagocitaria derivada do monocito

- Exerce funções no sistema imunitário inato e adquirido

- Estão presentes nos pulmões, baço, fígado, e nódulos linfáticos onde, grosso modo, combatem bactérias, vírus, e protozoários intracelulares.

- NK - células natural killer - Sao linfócitos largos e granulares que não expressam IG ou receptores T mas são capazes de reconhecer e destruir células tumorais ou infectadas por vírus.

Page 6: Fraccionamento/Separação Celular. Células Sanguíneas

Linfocitos

-Células especializadas no reconhecimento dos antigénios

- Dividem se em dois tipos:

- Células B – desenvolvem-se na medula óssea e diferenciam se em células produtoras de anticorpos, imunoglobulinas (IG) - imunidade humoral

- Células T - diferenciam-se no timo e nas suas funções incluem apoiar células B na produção de IG e actividade microbicida quer por contacto celular directo ou pela libertação de citoquinas - imunidade celular

• CD4 células helper (Th)

• CD8 citotóxicas (Tc)

Page 7: Fraccionamento/Separação Celular. Células Sanguíneas

Separação de células sanguíneas

• Centrifugação

• Panning• Separação imunomagnética• Cromatografia de afinidade

• Citometria de fluxo• FACS (fluorescence-activated cell sorter)

Page 8: Fraccionamento/Separação Celular. Células Sanguíneas

Centrifugação

A suspensão de células vai ter partículas com diferentes - tamanho - carga -

densidade

Separação pela aplicação de força centrifuga elevada (600 mil x g)

Aplicações:

• técnica preparativa para separar um dado componente para estudo

• técnica analítica para determinar propriedades físicas (pm; densidade, forma) ou pesquisar a presença de macro moléculas

Page 9: Fraccionamento/Separação Celular. Células Sanguíneas

Centrifugação Diferencial

Envolve a separação do material solúvel entre o material celular insolúvel

A força centrífuga e o tempo de centrifugação são ajustadas de forma a assegurar que o material

insolúvel fica no pellet e o material solúvel (proteínas) fica no sobrenadante Ex:

sangue/plasmaCentrifugação em Gradiente

Envolve a separação de partículas com base na sua massa e forma mas numa solução de

densidade (de sacarose) e/ou de concentração (de sais) crescente

A amostra é colocada no cimo do tubo e durante a centrifugação migram de acordo com a sua velocidade

de sedimentação

Page 10: Fraccionamento/Separação Celular. Células Sanguíneas
Page 11: Fraccionamento/Separação Celular. Células Sanguíneas

Separação de linfócitos em gradiente de densidade

Numa centrifugação sedimentam primeiro as partículas mais densas, que por sua vez impedem as menos

densas de sedimentar

• EX: centrifugação de gradiente de Ficoll-HypaqueFicol: polisacarideo

– Agrega eritrócitos tornando-os mais densosMetrizamida (composto denso contendo iodo)

– Densidade ajustável em função da concentração

Page 12: Fraccionamento/Separação Celular. Células Sanguíneas

density

Ficoll-hypaque

Célulasmononucleares

Soroplaquetas

Eritrócitos + leucócitos polimorfonucleares (granulócitos) – mais densos

Células mononucleares (linfócitos + monócitos) – menos densos - recuperados à superfície

Page 13: Fraccionamento/Separação Celular. Células Sanguíneas

PANNING

• Aderência celular a uma superfície sólida

– Monócitos e macrófagos são naturalmente aderentes(medula óssea)

– Outras células podem aderir se a superfície estiver conjugada com anticorpos apropriados

(anti IG- separam B de T)

Page 14: Fraccionamento/Separação Celular. Células Sanguíneas

Separação Imunomagnética

• forma rápida de separação de grandes quantidades de linfócitos

• acoplamento de esferas magnéticas a anticorpos monoclonais que reconhecem moléculas da superfície das células

• os anticorpos acoplados às esferas magnéticas, são misturados com as células a separar. A mistura passa por uma coluna magnética, que reterá as células ligadas ao anticorpo

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Separação Imunomagnética

Page 16: Fraccionamento/Separação Celular. Células Sanguíneas

Cromatografia

Princípio:

As moléculas dissolvidas numa solução podem associar-se ou dissociar-se de uma superfície sólida.

Se a solução se mantiver em fluxo as moléculas podem-se separar de acordo com as interacções com

o suporte

Em coluna

Page 17: Fraccionamento/Separação Celular. Células Sanguíneas

Cromatografia de afinidade

Baseada na capacidade de uma proteína/componente se ligar especificamente a

outra partícula (anticorpo)

• As colunas contêm esferas ligadas covalentemente a anticorpos específicos da

proteína de interesse – coluna de imunoafinidade

• As partículas são depois eluídas por ex. por uma solução concentrada de ligando, pH

diferente do de ligação.

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Page 19: Fraccionamento/Separação Celular. Células Sanguíneas

FACSFluorescence-activated cell sorter

• Permite separar subpopulações de linfócitos com base nas dierentes proteínas expressas á superfície (B, TCD4, TCD8)

• Cada tipo celular é marcado com um anticorpo específico que se encontra acoplado a um corante fluorescente.

• O citómetro de fluxo detecta e conta individualmente as células que passam através do laser

Page 20: Fraccionamento/Separação Celular. Células Sanguíneas

Purificação positiva e negativa

• Purificação Positiva (as células são separadas por apresentarem uma dada característica)

• Purificação Negativa– Panning– Imuno-separação magnética– Centrifugação gradiente densidade– Formação de rosetas (Linf T/B)– Citometria de Fluxo– Citotoxicidade mediada por Anticorpo/complemento

(Linf T CD4/CD8)– RIA (Radioimmunoassay)– ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)

Page 21: Fraccionamento/Separação Celular. Células Sanguíneas

Preservação

• Tecidos (sangue, medula ossea, outros tecidos linfoides)

- Criopreservação - 80 ºC (3 meses; perda progressiva das características)

• Células (culturas celulares, células previamente

separadas)

- Crioprotecção - 40 ºC (semanas) - 80 ºC (anos)

– No caso dos linfócitos ocorrem sempre algumas alterações ao nível das moléculas de superfície

(fenotipagem antes da utilização)