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VANDA LUCIA DOS SANTOS
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIULCEROGÊNICA,
ANTIDIARRÉICA E ANTIESPASMÓDICA DO EXTRATO
ETANÓLICO BRUTO E FASE ACETATO DE ETILA OBTIDOS DA
ENTRECASCA DO CAULE DE Maytenus rigida Mart.
(CELASTRACEAE) EM MODELOS ANIMAIS
UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
LABORATÓRIO DE TECNOLOGIA FARMACÊUTICA
“PROF. DELBY FERNANDES DE MEDEIROS”
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS
E SINTÉTICOS BIOATIVOS
João Pessoa - PB
2008
Livros Grátis
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VANDA LUCIA DOS SANTOS
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIULCEROGÊNICA,
ANTIDIARRÉICA E ANTIESPASMÓDICA DO EXTRATO
ETANÓLICO BRUTO E FASE ACETATO DE ETILA OBTIDOS DA
ENTRECASCA DO CAULE DE Maytenus rigida Mart.
(CELASTRACEAE) EM MODELOS ANIMAIS
ORIENTADORA: Profa. Dra. Leônia Maria Batista CO-ORIENTADORA: Profa. Dra. Bagnólia Araújo da Silva
João Pessoa – PB 2008
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos do Centro de Ciências da Saúde, do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica “Prof. Delby Fernandes de Medeiros” da Universidade Federal da Paraíba, como parte dos requisitos para a obtenção do título de DOUTOR EM PRODUTOS NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS. Área de concentração: FARMACOLOGIA
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F ICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL – UEPB
S237a Santos, Vanda Lucia dos. Avaliação da atividade antiulcerogênica,
antidiarréica e antiespasmódica do extrato etanólico bruto e fase acetato de etila obtidos da entrecasca do caule de Maytenus rigida Mart. (Celastraceae) em modelos animais / Vanda Lucia dos Santos. – 2008.
118 f. : il. color.
Digitado. Tese (Doutorado) – Universidade Federal da
Paraíba, Centro de Ciências da Saúde, 2008. “Orientação: Profa. Dra. Leônia Maria Batista, Departamento de Ciências Farmacêuticas”. “Co-Orientação: Profa. Dra. Magnólia Araújo da Silva, Departamento de Ciências Farmacêuticas”.
1. Úlcera Gástrica. I. Título.
21. ed. CDD 616.334
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VANDA LUCIA DOS SANTOS
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIULCEROGÊNICA, ANTIDIARRÉICA E
ANTIESPASMÓDICA DO EXTRATO ETANÓLICO BRUTO E FASE
ACETATO DE ETILA OBTIDOS DA ENTRECASCA DO CAULE DE
Maytenus rigida Mart. (CELASTRACEAE) EM MODELOS ANIMAIS
Aprovada em ______ / ______ /______
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________________ Profa. Dra. Leônia Maria Batista
Orientadora
_______________________________________________ Profa. Dra. Bagnólia Araújo da Silva
Co-orientador
_______________________________________________ Profa. Dra. Ana Beatriz A. de Almeida
(Universidade de Campinas) Examinadora Externa
_______________________________________________ Profa. Dra. Terezinha Gonçalves da Silva (Universidade Federal de Pernambuco)
Examinadora Externa
_______________________________________________ Profa. Dra. Márcia Regina Piuvezan (Universidade Federal da Paraíba)
Examinadora Interna
_______________________________________________ Profa. Dra. Margareth de Fátima Formiga Melo Diniz
(Universidade Federal da Paraíba) Examinadora Interna
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Embora ninguém possa voltar atrás e fazer um novo começo,
qualquer um pode começar agora e fazer um novo fim.
(Chico Xavier)
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Ao meu filho Matheus Albino, a maior razão de lutar por meus ideais; Ao meu esposo Robério, por ser presença constante na minha vida; Aos meus pais José Albino (in memoriam) e Eunice, por terem me ensinado a amar o que faço; Aos meus irmãos e irmãs por não terem medido esforços desde o início de minha vida universitária.
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AGRADECIMENTOS
A DEUS, por sempre ter me guiado, protegido e iluminado meus caminhos na busca de momentos de sabedoria; Ao meu amado filho Matheus Albino por ser o meu presente de Deus e ao meu esposo Robério por ter suportado a distância e dado o apoio necessário; Aos meus pais José Albino (in memoriam) e Eunice por terem acreditado em mim. A minha família, pelo amor, incentivo e por estar presente, mesmo que à distância no decorrer de toda esta caminhada; A minha irmã Goretti e seus filhos Michaelle e Philipe por terem me acolhido e serem presença constante nesta caminhada; A Profa. Leônia Maria Batista pela constante presença como orientadora, pelo exemplo de dedicação à ciência e acima de tudo pela amizade e confiança; A Profa. Bagnólia Araújo da Silva por ter me aceitado como orientanda, acreditando que eu seria capaz e pela amizade; A Profa. Dra. Alba Lígia M. Souza Brito e seus pupilos Anderson e Elisângela pela realização dos experimentos de muco e prostaglandina; A UNICAMP por ter cedido o laboratório e os animais para os experimentos de muco e prostaglandina; Ao Prof. José Maria Barbosa-Filho por ter cedido os resultados da pesquisa no NAPRALERT de Maytenus rigida Mart. e o laboratório para a preparação do extrato; Ao técnico Nonato pela preparação do extrato etanólico de Maytenus rigida Mart.; A Profa. Maria de Fátima Vanderlei de Souza e seus alunos pelo fracionamento do extrato e fornecimento da fase acetato de etila de Maytenus rigida Mart.; A Juliana da Nóbrega Carreiro (IC) e Rosimeire Ferreira dos Santos (Doutoranda) pela realização dos experimentos de investigação da atividade antiespasmódica; A amiga-irmã Dilma Trovão pela amizade, carinho e por ter cedido as fotos da planta; A amizade dos companheiros do Grupo de Úlcera: Heloína, Igara, Juliana, Jaqueline, Sabrina, Kelly e Guilherme pelo interesse e incansável auxílio nos experimentos e padronização dos novos modelos;
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A Elise e Vivian pela grande ajuda, apoio e incentivo no início deste trabalho e pela amizade firmada; A Alessandra, Josimar, Raissa, Thúlio e Rossana pelo companheirismo nas viagens Campina-João Pessoa, João Pessoa-Campina; Aos funcionários do Biotério do LTF em especial ao técnico e amigo Crispim pelo fornecimento dos animais, apoio técnico e competência; Aos docentes do curso de Pós-graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos pelo respeito, amizade e conhecimentos transmitidos; A todos os colegas do curso de Pós-graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos pelo respeito e amizade; A Tânia Maria Alves de Araújo, secretária da Pós-graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos da UFPB, pela eficiência e amizade incondicional. À Universidade Estadual da Paraíba (UEPB) em especial ao Departamento de Farmácia, pelo incentivo e investimento na qualificação e aperfeiçoamento do seu corpo docente, proporcionando minha liberação para a capacitação docente; Ao Programa de Qualificação Institucional da CAPES através do convênio firmado entre a UFPB/UEPB, que me deu esta oportunidade; A CAPES pelo apoio financeiro e pelo suporte técnico-científico através do Portal Periódicos A todos que direta ou indiretamente participaram da produção deste trabalho;
O meu muito obrigada!
Vanda Lucia dos Santos
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RESUMO
O gênero Maytenus (Celastraceae), comumente utilizado no tratamento de úlceras gástricas e dispepsia, é quimicamente caracterizado pela presença de metabólitos fenólicos como taninos, triterpenos e flavonóides. A espécie Maytenus rigida Mart., popularmente conhecida como “bom-nome”, “chapéu de couro” ou “pau-de-colher”, ocupa áreas da caatinga e agreste de Sergipe, Pernambuco e Paraíba, sendo utilizada na medicina tradicional como analgésica, antiinflamatória e para distúrbios gastrintestinais. Este estudo teve como objetivo investigar a atividade antiulcerogênica, antidiarréica e espasmolítica do extrato etanólico (EEOH) e a fase acetato de etila (AcOEt) obtidos da entrecasca do caule de M. rigida. Os testes antiulcerogênicos foram realizados usando os agentes lesivos HCl/etanol, estresse e antiinflamatório não esteroidal (AINE) em camundongos e etanol em ratos. No modelo HCl/etanol o EEOH (250, 500 ou 750 mg/kg) reduziu o índice de lesão ulcerativa (ILU) em 44, 70 e 78 %, respectivamente. O EEOH (250, 500 ou 750 mg/kg) ou a F. AcOEt (125, 250 ou 500 mg/kg) no modelo de etanol, inibiram o ILU em 52, 87, 95 % e 47, 81, 87 %, respectivamente. Resultados similares foram observados em modelo de úlcera induzida por estresse, em que a inibição do ILU foi 65, 86, 89 % e 60, 80, 87 % para EEOH e F. AcOEt, respectivamente, ou por AINE com inibição de 55, 81, 94 % e 41, 69, 80 % para EEOH e fase respectivamente. Em ratos com ligadura do piloro, o EEOH e a F. AcOEt não alteraram os parâmetros bioquímicos do suco gástrico. No modelo de úlcera induzida por ácido acético 30 %, o tratamento crônico com a fase promoveu cicatrização da úlcera (52 % de cicatrização). Na pespectiva de elucidação do mecanismo de ação envolvido no efeito citoprotetor, os dados mostram que a F. AcOEt induziu aumento da produção de muco gástrico dependente do óxido nítrico (NO); que envolve a participação dos compostos sulfidrilas; porém, o aumento da produção de muco independe da via das prostaglandinas uma vez que M. rigida não elevou os níveis de PGE2. Na avaliação da atividade antidiarréica, o EEOH (250, 500 ou 750 mg/kg) e a fase (125, 250 ou 500 mg/kg) inibiram em 32, 68, 80 e 40, 55, 73 %, respectivamente, a diarréia induzida por óleo de rícino e o trânsito intestinal normal em 24, 35, 37 % e 23, 33, 37 %, respectivamente, e o trânsito induzido por óleo de rícino em 43 e 42 % para EEOH (500 mg/kg) e fase (250 mg/kg), respectivamente. Na avaliação do efeito antiespasmódico, tanto o EEOH quanto a fase relaxaram o íleo de cobaia pré-contraído com KCl com valores de CE50=39,4±12,6 e 22,0±5,3 µg/mL, respectivamente, ou com carbacol com valores de CE50=11,6±2,5 e 16,6±4,4 µg/mL, para EEOH e fase, respectivamente. Estes dados indicam uma ação citoprotetora gástrica de M. rigida dependente da liberação de muco, da via do NO e com participação dos grupamentos sulfidrila, além de atividade antidiarréica e antiespasmódica, dando suporte a utilização desta espécie pela população nos transtornos gastrintestinais. Palavras-chave: Úlcera gástrica, Maytenus rigida, gastroproteção, atividade antidiarréica, atividade antiespasmódica
Avaliação da atividade antiulcerogênica, antidiarréica e antiespasmódica do extrato etanólico bruto e fase acetato de etila obtidos da entrecasca do caule de Maytenus rigida Mart. (Celastraceae) em modelos animais
SANTOS, V.L. Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos,
Tese de Doutorado, LTF/CCS/UFPB (2008)
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ABSTRACT
The genus Maytenus (Celastraceae), commonly used for the treatment of gastric ulcers and dyspepsia, is chemically characterized by the presence of phenolic metabolites as condensed tannins, triterpenes and flavonoids. The species Maytenus rigida Mart., popularly known as “bom-nome, “chapéu de couro” or “pau de colher”, occupies areas of “caatinga” and “agreste” from Sergipe, Pernambuco and Paraíba, are used in traditional medicine as analgesic, gastrointestinal disorders and anti-inflammatory. This study aims to investigate the antiulcerogenic, antidiarrheal and antispasmodic activities from the ethanol extract (EEOH) and the ethyl acetate phase (AcOEt) obtained from the stem bark of M. rigida. The antiulcer assays were performed using the following protocols: HCl/ethanol, stress and nonsteroidal anti-inflammatory drug (NSAID) in mice, and ethanol in rats. In the HCl/ethanol-induced ulcer model, the EEOH (250, 500 or 750 mg/kg) significantly reduced the ulcerative lesion index (ULI) in 44, 70 and 78 % respectively. The EEOH (250, 500 or 750 mg/kg) or AcOEt phase (125, 250 or 500 mg / kg) in the ethanol-induced ulcer model, inhibited respectively the ULI in 52, 87, 95 % and 47, 81, 87 %. Similar results were observed in the stress-induced ulcer model, where the inhibition of ULI were 65, 86, 89 % and 60, 80, 87 % for EEOH and AcOEt phase respectively, or AINE with inhibition of 55, 81 94 % and 41, 69, 80 % for EEOH and phase respectively. In rats with pylorus ligation, neither the EEOH (500 mg / kg) nor the AcOEt phase (250 mg / kg) (id) changed biochemical parameters of gastric juice. In the model of ulcer induced by 30% acetic acid, chronic treatment with the phase promoted healing of the ulcer (healing of 52%). In the elucidation of the mechanisms of action involved in the cytoprotectant effect, the data show that the AcOEt phase (250 mg/kg) induced increased production of gastric mucus depending on the nitric oxide (NO); involving the participation of the sulphydryl compound; but the increased production of mucus independent of the via of prostaglandins since M. rigida was unable to raise the levels of PGE2. In assessing the antidiarrheal activity, the EEOH (250, 500 or 750 mg/kg) or phase (125, 250 or 500 mg/kg) inhibited in 32, 68, 80 and 40, 55, 73% respectively, the castor oil-induced diarrhea and normal intestinal transit in 24, 35, 37% and 23, 33 and 37% respectively, and castor oil-induced transit in 43 and 42% for EEOH (500 mg/kg) and phase (250 mg / kg) respectively. In assessing the antispasmodic activity, both the EEOH (0.1 - 500 µ g/ml) and AcOEt phase (0.1 - 500 µg/ml) concentration-dependently and significantly relaxed the guinea pig ileum pre-contracted with KCl 40 mM with values of EC50 = 39,4 ± 12,6 µg/mL and EC50 = 22,0 ± 5,3 µg/mL, for EEOH and phase respectively, or with carbachol 10-6 M with values of EC50 = 11,6 ± 2,5 µg/mL and EC50 = 16,6 ± 4,4 µg/ml, for EEOH and phase respectively. These data collectively suggest a cytoprotectant gastric action of M. rigida dependent on the release of mucus, on the NO path and with participation of non-protein sulphydryl groups, besides they indicate antidiarrheal and antispasmodic activities, supporting the use of this species by the population for gastrointestinal disorders. Key-words: gastric ulcer, Maytenus rigida, gastroprotetion, antidiarrheal activity, antispasmodic activity.
Evaluation of the antiulcerogenic, antidiarrheal and antispasmodic activities of crude extract ethanol and ethyl acetate phase obtained from the stem bark of Maytenus rigida Mart. (Celastraceae) in animals models
SANTOS, V.L. Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos,
Tese de Doutorado, LTF/CCS/UFPB (2008)
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1-
Tabela 2-
Tabela 3-
Tabela 4-
Tabela 5-
Tabela 6-
Tabela 7-
Tabela 8-
Tabela 9-
Tabela 10-
Composição da solução de Krebs modificado.........................
Efeito da administração oral do EEOH de M. rigida ou
lansoprazol nas lesões gástricas induzidas por HCl/etanol
em camundongos ...................................................................
Efeito da administração oral do EEOH e F. AcOEt de M.
rigida ou lansoprazol nas lesões gástricas induzidas por
etanol em ratos........................................................................
Efeito da administração oral do EEOH e F. AcOEt de M.
rigida ou cimetidina nas lesões gástricas induzidas por
estresse em camundongos......................................................
Efeito da administração oral do EEOH e F. AcOEt de M.
rigida ou cimetidina nas lesões gástricas induzidas por
piroxicam em camundongos ...................................................
Efeito da administração intraduodenal do EEOH e F. AcOEt
de M. rigida ou cimetidina sobre os parâmetros bioquímicos
do suco gástrico no modelo de ligadura do piloro em ratos ...
Efeito da administração oral da F. AcOEt de M. rigida ou
cimetidina por 14 dias consecutivos sobre o peso corporal e
dos órgão de ratos com úlcera induzida por ácido acético......
Efeito da administração oral do EEOH e F. AcOEt de M.
rigida ou loperamida na diarréia induzida por óleo de rícino
em camundongos ...................................................................
Efeito da administração oral do EEOH e F. AcOEt de M.
rigida ou atropina no trânsito intestinal de ratos .....................
Efeito da administração oral do EEOH e F. AcOEt de M.
rigida ou atropina no trânsito intestinal induzido por óleo de
rícino em ratos ........................................................................
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1-
Figura 2-
Figura 3-
Figura 4-
Figura 5-
Figura 6-
Figura 7-
Figura 8-
Figura 9-
Figura 10-
Figura 11-
Úlcera péptica: (A) úlcera esofágica, (B) úlcera gástrica e (C)
úlcera duodenal .........................................................................
Secreção do ácido gástrico pelas células parietais, mediado
por mecanismos neurócrino (ACh), parácrino (Histamina) e
endócrino (Gastrina), e inibição da secreção por
somatostatina e prostaglandina ................................................
Mecanismo da injúria da mucosa gástrica causada pela
inibição da COX ........................................................................
Tratamento da úlcera péptica ....................................................
Árvore adulta de Maytenus rigida Mart. (A) e em detalhes
frutos e folhas (B) e caule (C) ...................................................
Marcha fitoquímica para obtenção do EEOH e a F. AcOEt de
Maytenus rigida Mart. ................................................................
Ilustração da indução da úlcera com ácido acético 30 % .........
Estômagos de ratos tratados com solução salina 0,9 %/
solução salina 0,9 % (A), solução salina 0,9 %/EEOH (B),
solução salina 0,9 %/F. AcOEt (C), L-NAME/solução salina
0,9 % (D), L-NAME /EEOH (E) e L-NAME /F. AcOEt (F)...........
Estômagos de ratos tratados com solução salina 0,9 %/
solução salina 0,9 % (A), solução salina 0,9 %/EEOH (B),
solução salina 0,9 %/F. AcOEt (C), NEM/ solução salina 0,9 %
(D), NEM/EEOH (E) e NEM/F. AcOEt (F) ................................
Registros originais do efeito relaxante do EEOH de M. rigida
sobre as contrações tônicas induzidas por 40 mM de KCl (A)
e 10 mM de carbacol (B) em íleo isolado de cobaia .................
Registros originais do efeito relaxante da F. AcOEt de M.
rigida sobre as contrações tônicas induzidas por 40 mM de
KCl (A) e 10 mM de carbacol (B) em íleo isolado de cobaia ....
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LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1-
Gráfico 2-
Gráfico 3-
Gráfico 4-
Gráfico 5-
Gráfico 6-
Gráfico 7-
Efeito da administração oral da F. AcOEt de M. rigida ou
cimetidina, durante 14 dias, no modelo de indução de úlcera
gástrica por ácido acético 30% em ratos ..................................
Efeito do tratamento agudo com F. AcOEt de M. rigida ou
carbenoxolona no conteúdo de muco aderido à mucosa
gástrica em ratos ......................................................................
Efeito do tratamento com a F. AcOEt de M. rigida nos níveis
de PGE2 em ratos .....................................................................
Efeito da administração oral do EEOH, F. AcOEt de M. rigida
ou carbenoxolona na úlcera gástrica induzida por etanol em
ratos pré-tratados com L-NAME .........................................
Efeito da administração oral do EEOH, F. AcOEt de M. rigida
ou carbenoxolona na úlcera gástrica induzida por etanol em
ratos pré-tratados com NEM .....................................................
Efeito do EEOH de M. rigida sobre as contrações tônicas
induzidas por 40 mM KCl (■) ou 10 - 6 M de carbacol (□) em
íleo isolado de cobaia................................................................
Efeito da F. AcOEt de M. rigida sobre as contrações tônicas
induzidas por 40 mM KCl (■) ou 10 - 6 M de carbacol (□) em
íleo isolado de cobaia................................................................
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
µg/mL = micrograma por mililitro
ACh = Acetilcolina
AcOEt = Acetato de Etila
AINE = Antiinflamatório Não Esteroidal
ALU = Área de Lesão Ulcerativa
AMPc = Monofosfato cíclico de adenosina
ATP = Trifosfato de adenosina
bFGF = Fator de crescimento do fibroblasto b
Ca2+ = Íon cálcio
CaCl2.2H2O = Cloreto de cálcio di-hidratado
CCK = colecistocinina
CCK2 = receptor de colecistocinina 2
CEMIB = Centro de bioterismo da UNICAMP
CEPA = Comitê de Ética em Pesquisa Animal
CGRP = Peptídio relacionado ao gene da calcitonina
Cl- = Íon cloreto
cNOS = Sintase do óxido nítrico constitutiva
COX = Enzima cicloxigenase
COX-1 = Cicloxigenase 1
COX-2 = Cicloxigenase 2
d.p. = Desvio Padrão
DL50 = Dose letal 50 %
ECL = Células enterocromafins “like”
EEOH = Extrato etanólico
EGF = Fator de crescimento epidérmico
EROs = Espécies reativas de oxigênio
g = Grama
Gi = Proteína G inibidora da ciclase de adenilil
GMPc = Guanosina monofosfato cíclico
GPx = Glutationa peroxidase
GR = Glutationa redutase
Gs = Proteína G estimulatória da ciclase de adenilil
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GS = grupamento sulfidrila
GSH = Glutationa reduzida
GSSG = Glutationa oxidada
H. pylori = Helicobacter pylori
H+ = Próton
H+,K+-ATPase = Bomba de prótons
H2O2 = Peróxido de hidrogênio
HCl = Ácido clorídrico
HCO3- = Íon bicarbonato
HGF = Fator de crescimento do hepatócito
ICAM-1 = Molécula de adesão intercelular 1
i.p. = Intraperitoneal
ILU = Índice de Lesão Ulcerativa
IMCs = Contrações migratórias interdigestivas
iNOS = Sintase do óxido nítrico induzida
IP3 = 1,4,5-trifosfato de inositol
K+ = Íon potássio
kg = Quilograma
LABETOX = Laboratório de Ensaios Toxicológicos
L-NAME = NG-nitro-L-arginina metil-ester
LTC4 = Leucotrieno C4
LTF = Laboratório de Tecnologia Farmacêutica “Prof. Delby Fernandes de
Medeiros”
mg = Miligrama
mL = Mililitro
mM = Milimol
mm2 = Milímetro quadrado
NANC = Não adrenérgico não colinérgico
NaOH = Hidróxido de sódio
NAP = Peptídio natriurético atrial
NEM = N-ethyl–maleimide
NO = Óxido nítrico
NOS = Sintase óxido nítrico
O2••••- = Ânion superóxido
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OMS = Organização Mundial de Saúde
PG = Prostaglandina
PKA = Proteína cinase dependente de AMPc
PPIs = Inibidores da bomba de prótons
r.p.m. = rotação por minuto
SH = grupamento sulfidrila
SNAP = Proteína associada a sinaptossoma
SNAREs = soluble NSF attachment receptor
SNC = Sistema Nervoso Central
SOD = Superóxido desmutase
TGFββββ = Fator de crescimento tumoral beta
TGI = Trato gastrintestinal
TRH = Hormônio leberador de tirotropina
TSH = Hormônio estimulante da tireóide
UFPB = Universidade Federal da Paraíba
UNICAMP = Universidade Estadual de Campinas
v.o. = Via oral
VAMP = Proteína de membrana associada à vesícula
VEGF = Fator de crescimento endotélio vascular
VIP = Peptídeo vasoativo intestinal
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.....................................................................................
1.1 Considerações Gerais.........................................................................
1.2 Úlcera péptica......................................................................................
1.2.1 Secreção gástrica.............................................................................
1.2.2 Controle da secreção gástrica..........................................................
1.2.3 Fatores Agressores..........................................................................
1.2.4 Fatores protetores............................................................................
1.2.5 Terapêutica da úlcera péptica..........................................................
1.3 Espécie vegetal selecionada para o estudo........................................
1.3.1 Maytenus rigida Mart........................................................................
2 OBJETIVOS.........................................................................................
2.1 Objetivo geral......................................................................................
2.2 Objetivos específicos..........................................................................
3 MATERIAL E MÉTODOS....................................................................
3.1 Locais da pesquisa.............................................................................
3.2 Animais...............................................................................................
3.3 Espécie vegetal...................................................................................
3.4 Substâncias utilizadas.........................................................................
3.5 Solução nutritiva..................................................................................
3.6 Preparação da solução-estoque do EEOH e da F. AcOEt de
Maytenus rigida Mart., utilizada nos testes “in vitro”.................................
3.7 Aparelhagem.......................................................................................
3.8 Avaliação da atividade toxicológica de Maytenus rigida ....................
3.8.1 Triagem farmacológica comportamental e determinação da DL50 ..
3.9 Avaliação da atividade antiulcerogênica de Maytenus rigida..............
3.9.1 Lesões gástricas induzidas por HCl/etanol......................................
3.9.2 Lesões gástricas induzidas por etanol.............................................
3.9.3 Lesões gástricas induzidas por estresse (imobilização e frio)........
3.9.4 Lesões gástricas induzidas por antiinflamatório não esteroidal
(piroxicam).................................................................................................
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3.9.5 Avaliação dos parâmetros bioquímicos do suco gástrico no
modelo de ligadura do piloro.....................................................................
3.9.6 Lesão gástrica induzida por ácido acético 30 %..............................
3.10 Avaliação dos mecanismos de ação citoprotetores envolvidos na
atividade antiulcerogênica de Maytenus rigida.........................................
3.10.1 Determinação de muco aderido à parede gástrica........................
3.10.2 Determinação da prostaglandina E2 (PGE2)..................................
3.10.3 Avaliação da participação do óxido nítrico ....................................
3.10.4 Avaliação da participação dos grupamentos sulfidrila..................
3.11 Avaliação da atividade antidiarréica e antimotilidade intestinal de
Maytenus rigida.........................................................................................
3.11.1 Diarréia induzida por óleo de rícino................................................
3.11.2 Trânsito intestinal normal...............................................................
3.11.3 Trânsito intestinal induzido por óleo de rícino...............................
3.12 Avaliação da atividade antiespasmódica de Maytenus rigida..........
3.12.1 Efeito do EEOH e da F. AcOEt sobre as contrações tônicas
induzidas por KCl ou carbacol em íleo isolado de cobaia.........................
3.13 Análise estatística.............................................................................
4 RESULTADOS....................................................................................
4.1 Avaliação da atividade toxicológica de Maytenus rigida.....................
4.1.1 Triagem farmacológica comportamental e determinação da DL50...
4.2 Avaliação da atividade antiulcerogênica de Maytenus rigida..............
4.2.1 Lesões gástricas induzidas por HCl/etanol......................................
4.2.2 Lesões gástricas induzidas por etanol.............................................
4.2.3 Lesões gástricas induzidas por estresse (imobilização e frio).........
4.2.4 Lesões gástricas induzidas por antiinflamatório não esteroidal
(piroxicam).................................................................................................
4.2.5 Avaliação dos parâmetros bioquímicos do suco gástrico no
modelo de ligadura do piloro.....................................................................
4.2.6 Lesão gástrica induzida por ácido acético 30 %..............................
4.3 Avaliação dos mecanismos de ação citoprotetores envolvidos na
atividade antiulcerogênica de Maytenus rigida.........................................
4.3.1 Determinação do muco aderido à parede gástrica..........................
42
43
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58
18
4.3.2 Determinação da prostaglandina E2 (PGE2)....................................
4.3.3 Avaliação da participação do óxido nítrico (NO)..............................
4.3.4 Avaliação da participação dos grupamentos sulfidrila (SH).............
4.4 Avaliação da atividade antidiarréica de Maytenus rigida....................
4.4.1 Diarréia induzida por óleo de rícino.................................................
4.4.2 Trânsito intestinal normal.................................................................
4.4.3 Trânsito intestinal induzido por óleo de rícino..................................
4.5 Avaliação da atividade antiespasmódica de Maytenus rigida.............
4.5.1 Efeito do EEOH ou F. AcOEt sobre as contrações tônicas
induzidas por KCl ou por carbacol em íleo isolado de cobaia..................
5 DISCUSSÃO........................................................................................
6 CONCLUSÕES....................................................................................
7 PERSPECTIVAS..................................................................................
REFERÊNCIAS.........................................................................................
APÊNDICES.............................................................................................
Apêndice 1- Pharmacological studies of ethanolic extracts of Maytenus
rigida Mart (Celastraceae) in animal models………………………………..
Apêndice 2- Carta de submissão do artigo “Evaluation of the
antiulcerogenic activity obtained from the extract ethanolic of Maytenus
rigida Mart. in rodents”...............................................................................
ANEXOS...................................................................................................
Anexo 1- Protocolo experimental para triagem farmacológica
comportamental .......................................................................................
Anexo 2- Certidão de aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa
Animal do LTF/UFPB................................................................................
59
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19
1 INTRODUÇÂO
1.1 Considerações gerais
Nos últimos 25 anos, poucas áreas de pesquisas têm progredido tão
rapidamente na América Latina quanto a de produtos naturais, em especial a
de plantas medicinais. Cerca de 30 % de todas as substâncias disponíveis
como agentes terapêuticos são produtos obtidos de naturais ou derivados
deles (CALIXTO, 2005).
O Brasil detém a maior biodiversidade do mundo, contando com uma
rica flora, a qual se estima existir aproximadamente 55 mil espécies vegetais,
que desperta grande interesse na comunidade científica de todo o mundo para
o estudo, conservação e utilização destes recursos, estando entre os
elementos favoráveis ao desenvolvimento de novos medicamentos (OMENA,
2007; NOLDIN ISAIAS; CECHINEL FILHO, 2006; SOUZA; FELFILI, 2006).
De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), 65 a 80 % da
população, principalmente em países em desenvolvimento, usam como
medicamentos extratos ou porções oriundas de plantas para tratar suas
enfermidades, devido à falta de recursos e o difícil acesso à medicina moderna
(CALIXTO, 2005).
Nos últimos anos tem havido um movimento de retorno ao uso dos
produtos naturais para fins terapêutico, cosmético e alimentar, principalmente
pelos efeitos colaterais provocados pelos fármacos sintéticos; por serem a
única fonte de medicamento especialmente em lugares isolados; e por
apresentarem moléculas potencialmente ativas, uma vez que já são
conhecidos cerca de 50.000 metabólitos secundários isolados de plantas,
muitos deles ainda sem qualquer avaliação quanto ao seu potencial terapêutico
(MONTANARI; BOLZANI, 2001; OMENA, 2007). Outro fator de destaque na
utilização crescente de produtos à base de plantas medicinais é a vigente
carência de recursos dos serviços de saúde e os elevados preços dos
medicamentos industrializados. No entanto, pela facilidade de obtenção e pelo
despreparo de quem as utiliza, são facilmente observados casos de intoxicação
com plantas medicinais (PARENTE; ROSA, 2001).
20
O processo de seleção da planta é de grande importância para o
sucesso de um estudo farmacológico. Os três principais tipos de abordagens
para seleção das espécies vegetais a serem farmacologicamente pesquisadas
são: abordagem randônica – escolha realizada de forma aleatória, tendo como
fator determinante a disponibilidade da planta; abordagem quimiotaxonômica
ou filogenética – seleção pelo conhecimento de uma dada classe química de
substâncias em um gênero ou família; abordagem etnofarmacológica – seleção
de acordo com o uso terapêutico evidenciado por um determinado grupo
étnico, com maior probabilidade de descobrir novas substâncias bioativas
(MACIEL et al, 2002 SCHMEDA-HIRSCHMANN; YESILADA, 2005; AGRA et
al., 2007).
As plantas medicinais representam assim, um elo entre a comunidade
tradicional e a comunidade científica, ocorrendo o compartilhamento de
informações e interesses buscando o desenvolvimento e aprimoramento das
políticas de saúde (CALIXTO, 2000).
Tratar a sintomatologia da úlcera péptica ou gastrite com plantas
medicinais é uma prática comum na medicina tradicional em todo o mundo
(SCHMEDA-HIRSCHMANN; YESILADA, 2005) e seguindo esse princípio, esse
trabalho visa contribuir para o uso seguro de plantas medicinais, pela pesquisa
científica com metodologias padronizadas, para a validação das plantas com
atividade sobre o trato gastrintestinal.
1.2 Úlcera péptica
A úlcera péptica é caracterizada por lesões severas compostas de
pontos hemorrágicos e necrotizantes que se estende pela da camada muscular
até a mucosa (KONTUREK; KONTUREK; BRZOZOWSKI, 2005). É geralmente
considerada como resultado do desequilíbrio entre os mecanismos de defesa
da mucosa gastroduodenal como muco, íon bicarbonato (HCO3-),
prostaglandinas (PGs), e os fatores prejudiciais da mucosa como etanol,
antiinflamatório não esteroidal (AINE), ácido clorídrico (HCl), secreção de
pepsinogênio, sendo uma afecção crônica e recorrente considerada como a
mais predominante das doenças gastrintestinais (MILANI; CALABRO, 2001;
KONTUREK; KONTUREK; BRZOZOWSKI, 2005).
21
A lesão pode está localizada na mucosa esofágica (úlcera esofágica), no
estômago (úlcera gástrica) ou na primeira porção do intestino delgado (úlcera
duodenal) (Figura 1) (PRADOS; MIGUEL, 2004).
(A) (B) (C)
Figura 1- Úlcera péptica: (A) úlcera esofágica, (B) úlcera gástrica e (C) úlcera duodenal. (www.gastroendo.com.br/gastroendo/index.php.op.; www.fluvium.org/imagenes/UlceraDuodeno.jpg.) acesso 12/12/2007
A úlcera gástrica acomete cerca de 5 % da população mundial, porém é
mais freqüente nos países orientais, especialmente no Japão, enquanto que a
úlcera duodenal é mais freqüente em populações ocidentais
(BANDYOPADHYAY et al., 2001; YUAN; PADOL; HUNT, 2006).
O sexo masculino é mais susceptível ao desenvolvimento das úlceras
pépticas, com uma proporção entre este sexo e o feminino para as duodenais
de cerca de 3:1, enquanto que para as gástricas é de 1,5:1 a 2:1. As mulheres,
são geralmente mais acometidas durante ou após a menopausa (CRAWFORD,
2000).
Os sinais e sintomas mais freqüentes associados à úlcera péptica são
sensação de mal estar, acidez estomacal, náusea e vômitos, podendo haver
complicações como hemorragia digestiva (rompimento dos vasos sanguíneos),
perfuração (rompimento da parede gastrintestinal) e a estenose (cicatriz
produzida em úlceras antigas provocando estreitamento do intestino)
(PRADOS; MIGUEL, 2004).
É consenso entre diferentes grupos de pesquisadores, que a presença
exacerbada de ácido é nocivo à mucosa gástrica, sendo este ácido o principal
agente responsável pela maioria dos processos patológicos que afetam o
estômago, o esôfago e o duodeno (PRADOS; MIGUEL, 2004).
22
1.2.1 Secreção gástrica
O suco gástrico é composto de muco fluido, eletrólitos, HCO3-, HCl,
pepsinogênio e fator intrínseco, sendo a secreção de HCl o principal
componente parietal do suco gástrico (HERSEY; SACHS, 1995; KONTUREK;
KONTUREK; OCHMANSKI, 2004).
O passo final na secreção ácida gástrica inclui a extrusão de prótons
(H+) e íons cloreto (Cl-) pela membrana apical da célula parietal. (GEIBEL,
2005; SCHUBERT, 2006). Nas células parietais em repouso, a bomba de
H+,K+-ATPase é armazenada em tubulovesículas citoplasmáticas na forma
inativa. Quando esta célula é estimulada, ocorre um aumento nos níveis de
segundos mensageiros, que aciona a translocação da bomba a partir destas
vesículas para invaginações na membrana apical da célula, ativando-a e
permitindo a troca de H+ por potássio (K+), utilizando energia proveniente da
hidrólise do trifosfato de adenosina (ATP). Ao mesmo tempo, Cl- entram nos
canalículos secretórios a partir do citoplasma por transporte passivo (SACHS et
al, 1995; MÖSSNER; CACA, 2005).
A translocação da H+,K+-ATPase é regulada por proteínas como os
membros da família Rab (Rab 11 e Rab 25) e receptores de ligação ao fator
sensível à N-etilmaleimida solúvel (SNAREs): sintaxina, proteína associada a
sinaptossoma 25 (SNAP 25) e proteína de membrana associada à vesícula 2
(VAMP-2), que desempenham papel crucial no transporte e na fusão,
respectivamente, das vesículas (SCHUBERT, 2006).
O ácido gástrico auxilia na digestão (solubiliza alimentos e mantem o pH
ideal para a função da enzima pepsina), ajuda na absorção de íons ferro, cálcio
(Ca2+) e vitamina B12, além de impedir o crescimento de bactérias e as
infecções entéricas (HOU, SCHUBERT, 2006). Sua regulação é complexa e
envolve vias neural, hormonal, parácrina e endócrino (KONTUREK;
KONTUREK; OCHMANSKI, 2004; SCHUBERT, 2006).
1.2.2 Controle da secreção gástrica
As células oxínticas ou parietais, medeiam a secreção de HCl no
estômago, pela secreção de acetilcolina (ACh), gastrina, histamina (YAO;
23
FORTE, 2003), somatostatina, PGs, peptídeo natriurético atrial (NAP),
colecistocinina (CCK) e o peptídeo vasoativo intestinal (VIP) (WALDUM;
BRENNA; SANDVIK, 1998; SCHUBERT, 2003; YAO, FORTE, 2003). Estes
três últimos têm grande importância na liberação parácrina de somatostatina no
antro e no fundo do estômago (YAO, FORTE, 2003; HOU; SCHUBERT, 2006).
A ACh interage com receptores muscarínicos M3 expressos nas células
parietais, G e enterocromafins “like” (ECL). Estes receptores são acoplados a
proteína Gq/11 que quando ativados induzem a formação de inositol 1,4,5-
trifosfato e diacilglicerol via fosfolipase C, favorecendo aumento na
concentração de Ca2+ intracelular, fundamental na liberação de gastrina e
histamina pelas células G e ECL, respectivamente. Na célula parietal o
aumento do Ca2+ intracelular, ativa a proteína cinase C que promove a fusão da
H+,K+- ATPase com a membrana apical destas células, favorecendo a liberação
de H+ do interior da célula parietal para o lúmen gástrico (CAULFIELD;
BIRDSALL, 1998; AIHARA et al., 2005) (Figura 2).
Figura 2- Secreção do ácido gástrico pelas células parietais, mediado por
mecanismos neurócrino (ACh), parácrino (Histamina) e endócrino (Gastrina), e
inibição da secreção por somatostatina e prostaglandina (Modificado de
RAFFA; RAWLS; BEYZAROV, 2006),
A gastrina, liberada pelas células G da mucosa antral, estimula a
secreção gástrica por ação direta nos receptores CCK-2 presentes nas células
SSoommaattoossttaattiinnaa
PPrroossttaaggllaannddiinnaa
24
parietais, via proteína Gq/11, semelhante à ação da ACh. Indiretamente a
gastrina estimula a produção (ao aumentar a atividade da enzima histidina
descarboxilase), estocagem e liberação de histamina pelas células ECL ao
ativar receptores CCK-2 presentes nestas células (Figura 2). Esta última é a
principal via da estimulação da secreção ácida gástrica produzida pela gastrina.
A gastrina também aumenta indiretamente a secreção de pepsinogênio, fluxo
sanguíneo e a motilidade gástrica (HOU; SCHUBERT, 2006; CUI; WALDUM,
2007).
A histamina se difunde do seu local de liberação até a célula parietal
onde interage com receptores H2 presentes na membrana das células parietais
(Figura 2). Estes receptores acoplados a proteína estimulatória (Gs) ativam o
sistema adenilato ciclase- AMPc, levando a ativação da proteína cinase
dependente de AMPc (PKA) do tipo I, iniciando a cascata de eventos de
fosforilação. Estes eventos culminam com rearranjos na membrana e no
citoesqueleto da célula parietal e aumento na condutância elétrica através do
epitélio, promovendo ativação da H+,K+-ATPase. A histamina pode interagir
também com receptores H3 que “in vitro” estimula secreção de H+
possivelmente mediada pala inibição da somatostatina e “in vivo” por uma
possível ação nos receptores H3 no cérebro, exercendo efeito inibitório sobre a
secreção de H+ (YAO; FORTE, 2003; KONTUREK et al., 2004a).
A somatostaina produzida nas células D regula a secreção ácida por
ação direta sobre receptor SST2 acoplado à proteína inibitória (Gi), atenuando
a atividade da ciclase de adenilil. Indiretamente, a somatostatina impede a
formação do ácido por ação nas células G e ECL, suprimindo a liberação de
gastrina e histamina, respectivamente (LINDSTRÖM et al, 2001; SCHUBERT,
2003; YAO, FORTE, 2003; KONTUREK et al., 2004a; SCHUBERT, 2006).
Além do controle da secreção ácida, somatostatina pode também inibir o
peristaltismo gastintestinal, a secreção biliar, a proliferação celular e o fluxo
sanguíneo (SUN et al., 2002).
As PGs da série E são especialmente importantes na regulação da
secreção gástrica de ácido, pepsinogênio e muco (KATO et al., 2005).
25
1.2.3 Fatores agressores
O ácido gástrico não é o único responsável pelo aparecimento da lesão
na mucosa gástrica, outros irritantes chamados desestabilizadores da barreira
da mucosa gástrica agem pelo contato direto a exemplo do uso crônico de
AINEs, a bactéria Helicobacter pylori (H. pylori), o fumo, o álcool, e eventos
sistêmicos como estresse (GRACIOSO et al., 2002; KWIECIEN;
BRZOZOWSKI; KONTUREK, 2002 ).
Aproximadamente 15 – 30 % dos usuários regulares de AINEs
apresentam reações adversas, sendo o mais comum a úlcera gastroduodenal e
sangramento. A importância das PGs na defesa da mucosa é evidenciada pela
capacidade dos AINEs induzirem danos na mucosa gástrica, correlacionado
com a habilidade em suprimir a síntese de PGs gástricas (LICHTENBERGER,
2001; WALLACE, 2001).
A bactéria H. pylori é referida atualmente como responsável por 90 %
das úlceras duodenais e 80 % das úlceras gástricas. Em países desenvolvidos,
a infecção é menos comum do que nos países em desenvolvimento (LADEIRA;
SALVADOR; RODRIGUES, 2003; PRADOS; MIGUEL, 2004). Ela coloniza o
estômago de aproximadamente 50 % da população mundial, ao sintetizar
lipases e proteases que degradam a camada de muco (LADEIRA; SALVADOR;
RODRIGUES, 2003).
Os indivíduos com úlcera duodenal e infecção por H. pylori apresentam
diminuição da secreção de somatostatina e aumento na secreção de gastrina,
pela ação de citocinas como o interferon-γ liberado no infiltrado inflamatório
(SCHUBERT, 2006). Esta bactéria infecta o corpo do estômago resultando em
gastrite crônica, úlcera péptica e câncer gástrico, por promover alterações no
teor de vitamina C no suco gástrico, nos níveis de metabolitos reativos de
oxigênio nos tecidos e proliferação de células epiteliais, que são importantes na
patogênese do câncer gástrico (KARAMAN et al., 2008).
1.2.4 Fatores protetores
A mucosa gástrica é revestida por uma camada aderente e contínua de
muco viscoso, formado por 3 a 5 % de glicoproteínas como a mucina que lhe
26
confere a propriedade formadora de gel e viscosidade e 95 % de água com
pequenas quantidades de lipídeos, ácidos nucléicos e outras proteínas como
as imunoglobulinas (ALLEN; FLEMSTRÖM, 2005). O muco secretado pelas
células mucosas do colo, forma uma barreira física que separa a superfície das
células apicais do lúmem gástrico e junto com o HCO3- formam a primeira linha
de defesa contra o acesso de ácido luminal e pepsina (FLEMSTRÖM et al.,
1999; FLEMSTRÖM; ISENBERG, 2001; ALLEN; FLEMSTRÖM, 2005;
BRZOZOWSKI et al., 2005).
O bicarbonato é formado pela ação da enzima anidrase carbônica que
dissocia carbonato em HCO3- e H+ nas células epiteliais e parietais. Ele
mantém o pH na superfície mucosal próximo à neutralidade, gerando um
gradiente em que o pH na superfície da célula epitelial é consideravelmente
mais elevado que no lúmem gástrico (FLEMSTRÖM; ISENBERG, 2001;
ALLEN; FLEMSTRÖM, 2005).
O epitélio duodenal secreta HCO3- em velocidade maior que as demais
porções do intestino delgado distal, provavelmente devido a uma seletividade
de HCO3- pelos canais apicais nesta parte do intestino. Esta secreção é
aumentada por uma baixa no pH do lúmem duodenal, uma resposta mediada
por reflexos neurais (via VIP e ACh) e a produção mucosal de PGs por ação
direta nas células produtoras de HCO3-, via receptores EP3 duodenais e EP1
gástrico (ALLEN; FLEMSTRÖM, 2005).
As PGs são mediadores lipídeos sintetizados a partir do ácido
araquidônico, pela ação das enzimas cicloxigenases (COX) e liberadas por
estímulos químicos ou mecânico (SCHUSTER, 1998; BOTTING, 2006). A COX
existe em três isoformas, a COX-1, a COX-2 (VANE, et al., 1994) e a COX-3
que são catalisadoras da conversão do ácido araquidônico em PGs (VANE et
al., 1994; CHANDRASEKHARAN et al., 2002). A COX-1 é expressa
constitutivamente, sendo responsável pela geração de PGs envolvidas na
homeostasia, proteção da mucosa gástrica, regulação da hemodinâmica renal
e estimulação da agregação plaquetária (POONAM; VINAY; GAUTAM, 2005;
SAWATZKY; MEGSON; ROSSI, 2005). Já a COX-2 normalmente é encontrada
em níveis celulares baixos, tendo sua expressão induzida por citocinas,
mitógenos e endotoxinas de células inflamatórias e é responsável pela
produção elevada de PGs que ocorre durante o processo inflamatório
27
(SAWATZKY; MEGSON; ROSSI, 2005; BOTTING, 2006). A inativação das
COXs 1 e 2 resulta no dano gastrintestinal (Figura 3) (GRETZER et al., 1998;
BOTTING, 2006).
AINES
INIBIÇÃO DA COX1 INIBIÇÃO DA COX2
ESTIMULAÇÃO DA ICAM-1
ATIVAÇÃO DE NEUTRÓFILOS E
PRODUÇÃO DE RADICAL LIVRE
INJÚRIA MICROVASCULAR
FORMAÇÃO DA ÚLCERA
INIBIÇÃO DA PRODUÇÃO DE FATORES DE CRESCIMENTO
INIBIÇÃO DO MECANISMO DE REPAO EPITELIAL
INJÚRIA EPITELIAL
INIBIÇÃO DA BARREIRA MUCO/BICARBONATO
DANO DIRETO SOBRE A MUCOSA
Figura 3- Mecanismo da injúria da mucosa gástrica causada pela inibição da
COX. (GUDIS; SAKAMOTO, 2005).
A ação citoprotetora das PGs ocorre principalmente pelas PGs da série
E (PGE2) (BOTTING, 2006), como conseqüência de vários mecanismos:
apoptose de células inflamatórias – via receptores EP2 e EP4 (HOSHINO et al,
2003), aumento da produção de muco (receptores EP1 e EP4) e secreção de
bicarbonato gástrico e duodenal (receptores EP1 e EP3 respectivamente)
(TAKEUCHI et al., 1999; OHNISHI et al., 2001), inibição da motilidade gástrica
(receptor EP3), diminuição da secreção gástrica (receptor EP3) e aumento do
fluxo sanguíneo mucosal (receptor EP3)(KATO et al., 2005).
Outro fator importante na proteção da mucosa gástrica é o óxido nítrico
(NO), uma molécula gasosa gerada a partir do aminoácido L-arginina pela ação
da enzima sintase do óxido nítrico (NOS) (Figura 9). A NOS pode se apresentar
em duas isoformas: a constitutiva (cNOS) normalmente expressa em células e
tecidos normais, cuja expressão e atividade não é afetada no processo
inflamatório; e a induzível (iNOS) que é expressa de forma elevada na
inflamação aguda e crônica (GUO et al., 2003). O NO é um neurotransmissor
28
inibitório não adrenérgico não colinérgico (NANC) (GUO et al., 2003; TODA,
HERMAN, 2005) e apresenta dualidade: em baixas concentrações ele regula
funções homeostáticas, enquanto que em altas concentrações age como
molécula citotóxica (MARTIN; JIMÉNEZ; MOTILVA, 2001).
No músculo liso gastrintestinal, o NO promove relaxamento por
mecanismo direto ao ativar a enzima ciclase de guanilil solúvel que produz o
monofosfato cíclico de guanosina (GMPc) e indiretamente por causar
hiperpolarização da membrana, diminuindo assim o peristaltismo e o
esvaziamento gástrico (TODA; HERMAN, 2005). Intervém também em outras
funções do trato gastintestinal (TGI) como inibição da secreção ácida,
regulação do fluxo sanguíneo mucosal, ajuda a manter a barreira muco-
bicarbonato e a integridade tecidual, apresenta atividade antioxidante ao
inativar espécies reativas de oxigênio (EROs) geradas pela injúria gástrica e
atividade antiinflamatória por inibir a adesão de leucócitos ao endotélio,
promover vasodilatação e hiperemia na área próxima a inflamação, assim
favorecendo o processo de cicatrização (MARTIN; JIMÉNEZ; MOTILVA, 2001).
Nos sistemas biológicos existem condições favoráveis para reações
oxidativas, pela existência de lipídeos insaturados nas membranas celulares e
pelas reações oxidativas que ocorrem no metabolismo normal, levando a
produção de radicais livres (RL) como as EROs. Porém, as células possuem
sistemas de equilíbrio entre a produção e a eliminação desses radicais.
Quando há um desequilíbrio entre o sistema pró-oxidante e o sistema
antioxidante, tem-se o estresse oxidativo que pode resultar na morte celular
(JORDÃO JUNIOR et al., 1998).
Os principais sistemas antioxidantes compreendem as vitaminas A, C e
E, glutationa reduzida (GSH), grupamentos sulfidrila livres e enzimas
antioxidantes - superoxido dismutase (SOD), catalase, glutationa peroxidase
(GPx) e glutationa redutase (GR). As enzimas antioxidantes constituem o
principal mecanismo de defesa antioxidante intracelular, pois eliminam ânio
superóxido (O2•-), peróxido de hidrogênio (H2O2) e hidroperóxidos que
poderiam oxidar os substratos celulares (ANTUNES NETO et al., 2007)
A glutationa é o tiol não protéico mais abundante. A capacidade padrão
de redução dos tióis intracelulares, particularmente a glutationa, mantém o
meio intracelular em estado reduzido. Este detém o estresse oxidativo por
29
reduzir H2O2 a água, tranformando-se em glutationa oxidada (GSSG), reação
esta catalizada pela glutationa peroxidase (TOUYZ, 2004).
A integridade da mucosa gástrica é mantida também por um contínuo
processo de morte e proliferação celular, que envolve a migração de células
cicatrizantes, do fator de crescimento epidérmico (EGF), do fator de
crescimento de fibroblasto b (bFGF), do fator de crescimento transfomante-β
(TGF-β) e do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF), que além de
estimular a proliferação celular, podem afetar locomoção, contratilidade,
diferenciação celular e angiogênese (WALLACE; GRANGER, 1996; BISWAS et
al., 2003).
A microcirculação, localizada abaixo do epitélio, é responsável pelo
suprimento de oxigênio e nutrientes da mucosa gástrica e remoção, diluição e
neutralização de substâncias tóxicas. Quando a microvasculatura é danificada,
as células endoteliais iniciam o reparo e construção de uma nova rede
vascular. A resposta microcirculatória na defesa mucosal é mediada pelo
sistema nervoso extrínseco e intrínseco que liberam o peptídeo relacionado ao
gene da calcitonina (CGRP), que via liberação de NO promove vasodilatação
(TORNAWSKI, 1995; WALLACE; GRANGER, 1996; MARTIN; WALLACE,
2006).
1.2.5 Terapêutica da úlcera péptica
O tratamento da úlcera péptica (Figura 4) é freqüentemente dirigido para
a utilização de medicamentos que diminuam a acidez gástrica (anti-secretores),
fortaleçam as defesas mucosais do estômago e duodeno (citoprotetores),
erradicação da bactéria H. pylori e processos cirúrgicos (quando a úlcera é
hemorrágica, obstrutiva ou perfurativa) (LIPOF; SHAPIRO; KOZOL, 2006;
UMAMAHESWARI et al., 2006).
Inicialmente se acreditava que sem ácido não haveria úlcera. Assim a
inibição farmacológica do ácido passou a exercer papel dominante no
tratamento da úlcera péptica. Esta inibição pode ser realizada pela utilização de
substâncias que neutralizam a acidez ou que inibem a sua secreção.
Os antiácidos são capazes de neutralizar o ácido gástrico pela sua
natureza básica, com conseqüente elevação do pH gástrico. Apresentam
30
eficácia limitada, por isto seu uso tem diminuído nos últimos anos. Quando
utilizados em quantidades suficientes e por um período relativamente longo,
podem cicatrizar as úlceras duodenais, sendo menos eficazes na úlcera
gástrica. Os principais representantes são: os sais de alumínio e de magnésio.
Como os sais de magnésio causam diarréia e os de alumínio causam
constipação, são utilizados em associação para preservar a função intestinal
(MÖSSNER; CACA, 2005).
Figura 4- Tratamento da úlcera péptica (adaptado de RAFFA; RAWLS;
BEYZAROV, 2006).
Os anti-secretores são os agentes que inibem a secreção de ácido
gástrico. As principais classes de anti-secretores são: (1) antagonistas H2 que
agem pela ligação com os receptores H2 da histamina na célula parietal
impedindo a estimulação da secreção de ácido gástrico induzida pela
histamina, gastrina e ACh; a secreção de pepsina também diminui com a
redução no volume de suco gástrico. É frequente a ocorrência de recidivas
quando se interrompe o tratamento com estas drogas. Os principais
representantes são: cimetidina, ranitidina, famotidina e nizatidina; (2) inibidores
da bomba de prótons (PPIs) que são pró-fármacos e agem na etapa final da
secreção do ácido. São ativados pelo ácido e ligam-se irreversivelmente às
enzimas H+,K+-ATPase, bloqueando-as. Esta inibição é independente do modo
de estimulação da célula parietal. Apresenta como principais representantes:
31
omeprazol, lansoprazol, pantoprazol e rabeprazol (RANG et al., 2007;
MÖSSNER; CACA, 2005).
Com o avanço das pesquisas na área de úlcera se percebeu que as
lesões ulcerativas não ocorriam apenas pelo excesso de ácido, mas também
pela diminuição dos fatores protetores da mucosa. Hoje, é consenso que o
desequilíbrio entre fatores protetores e agressores exerce um papel importante
na integridade da mucosa e na patogenia da lesão (KONTUREK et al., 2004a),
passando-se então a utilização de drogas que aumentem esta defesa.
Os citoprotetores potencializam os mecanismos de proteção da mucosa
e/ou proporcionam uma barreira física sobre a superfície da úlcera. Ligam-se a
proteínas da matrix da mucosa gástrica, protegendo a lesão contra o ácido e a
pepsina. São exemplos: o sucralfato - complexo de alumínio e sacarose
sulfatada, que na presença de ácido libera o alumínio, adquire carga negativa e
liga-se a proteínas e glicoproteínas de carga positiva. Também estimula a
produção de PGs e a secreção de muco e bicarbonato; a carbenoxolona - um
derivado de produto natural retirado da raiz do alcaçuz, aumenta a produção de
muco; o misoprostol - um análogo das PGs I1, inibe secreção de ácido no
estado basal e em resposta ao alimento, histamina e gastrina, aumenta o fluxo
sanguíneo e a secreção de muco e bicarbonato (MÖSSNER; CACA, 2005;
RANG et al., 2007).
A infecção da mucosa gástrica pelo H. pylori é considerada hoje um
importante agente etiológico da úlcera péptica (CHOI et al., 2007). Para
erradicar esse microorganismo, utiliza-se uma combinação de antibióticos,
sendo a adesão ao tratamento um fator de suma importância, prevenindo a
recorrência da úlcera, pois restaura a capacidade da mucosa produzir
bicarbonato e manter a integridade (KONTUREK et al, 2004b). As combinações
mais utilizadas na clínica são dois antimicrobianos com PPIs, ou com
antagonista H2 ou quelatos de bismuto (MARMO, NETO, 2005; MÖSSNER;
CACA, 2005).
O grande alvo dos pesquisadores na atualidade é a busca de drogas
antiulcerogênicas mais eficazes, que apresentem menos efeitos colaterais e
menos índices de recidivas que as drogas existentes no mercado e os produtos
naturais são os principais alvos. Assim, extratos e princípios ativos originários
de plantas podem levar ao desenvolvimento de novas drogas, sendo
32
importante avaliá-los como alternativa às terapêuticas antiulcerogênica
consagradas e que não são livres de efeitos adversos e/ou provocar recidivas.
1.3 Espécie vegetal selecionada para o estudo
Na família Celastraceae são encontrados 88 gêneros e 1300 espécies
distribuídas principalmente em climas tropicais e subtropicais (SPIVEY,
WESTON; WOODHEAD, 2002). As folhas e a casca do caule de muitas
espécies de Celastraceae são utilizadas na medicina tradicional por suas
propriedades analgésica, antiinflamatória, antiulcerogênica entre outras
(CORRÊA, 1984).
Dentre os gêneros pertencentes a esta família, destaque é dado ao
gênero Maytenus que quimicamente é caracterizado pela presença de
metabólitos secundários como flavonóides, triterpenos, sesquiterpenos,
alcalóides e taninos condensados que podem justificar o uso popular
(BRUNING ; WAGNER, 1978; GONZÁLES et al., 1982; CHÁVEZ et al., 1997;
LEITE et al, 2001; JORGE et al, 2004; OLIVEIRA et al., 2006; TIBERT et al.,
2007).
Atualmente são conhecidas cerca de 80 espécies distribuídas em todo o
território brasileiro (JORGE et al, 2004; JOFFILY; VIEIRA, 2005), algumas
citadas na literatura por exercer atividade antiulcerogênica como a M. ilicifolia
(SOUZA-FORMIGONI et al, 1991; JORGE et al, 2004), M. truncata (SILVA et
al., 2005), M. aquifolium (SOUZA-FORMIGONI et al, 1991; GONZALEZ et al.,
2001) e M. robusta (ANDRADE et al, 2007).
1.3.1 Maytenus rigida Mart.
Maytenus rigida Mart. (Figura 5) popularmente conhecida como “bom-
nome”, “chapéu de couro” ou “pau-de-colher” é uma árvore de pequeno porte,
que apresenta cascas lisa fosca, cinza escuro manchado de cinza claro e
branco. Mantém a folhagem na época de estiagem, só a perdendo no rigor da
seca mais intensa. Ocupa áreas muito secas da caatinga e agreste de Sergipe,
Pernambuco e Paraíba. Ocorre em aglomerados e é de fácil reconhecimento
33
por suas folhas verde escuro contrastando com o cinza do seu caule
(ANDRADE-LIMA, 1989).
A entrecasca do seu caule faz parte da composição do vinho de jurema
utilizado nos cultos afro-indígenas (MOTA; ALBUQUERQUE, 2002) e de
acordo com a medicina tradicional o chá é utilizado para problemas renais,
como antiinflamatório, analgésico, cicatrizante, para gastrite, úlcera gástrica,
hipotensora, hepatoprotetora e antidiarréica (CARRICONDE, 2004).
Em levantamento de plantas medicinais do nordeste brasileiro, Agra et
al. (2007), citam a utilização popular do bom-nome para úlcera externa,
infecção e inflamação e câncer, na forma de decocto, infusão ou maceração.
Almeida et al. (2005) fazem referência ao uso popular desta espécie para
impotência sexual e reumatismo.
Figura 5- Árvore adulta de Maytenus rigida Mart. (A) e em detalhes frutos e
folhas (B) e caule (C) (Fotos cedidas por Dilma M. B. M. Trovão).
A
B C
34
Estudos fitoquímicos desta espécie mostram vários constituintes
químicos como: alcalóides com atividade inseticida (DELLE; MARINI;
BERNAYS, 1984), quinonas (ALMEIDA et al., 2005) triterpenos da série lupano
(OLIVEIRA et al., 1999; ALMEIDA et al., 2005) e n-Alcanos (OLIVEIRA,
SALATINO, 2000). Segundo Estevam (2006) no extrato alcoólico obtido da
entrecasca do caule de M. rigida foram determinados os seguintes
constituintes: lupeol (triterpeno), β-sitosterol (esteróide), ácido gálico (tanino),
epicatequina e 4-metil-epigalocatequina (flavonóides).
Estudos farmacológicos realizados com extratos obtidos de M. rigida
mostraram atividade antinociceptiva confirmando sua indicação popular (DIAS
et al. 2007), indícios de droga psicoativa, ou seja, estimulante do Sistema
Nervoso Central (SNC) no extrato aquoso (OMENA, 2007) e atividade
antioxidante dos extratos clorofórmio, acetato de etila e hidroalcoólico
(ESTEVAM, 2006).
Diante da necessidade de buscar novos produtos como alternativa
terapêutica no tratamento da úlcera gástrica e mediante as atividades
biológicas apresentadas pelos constituintes químicos já identificados nesta
espécie, além da atividade antiulcerogênica comprovada em outras espécies
pertencentes à família Celastraceae, Maytenus rigida Mart. foi selecionada para
estudo frente à atividade antiulcerogênica. O critério de escolha para a
utilização do extrato etanólico e fase acetato de etila obtidos de M. rigida, foi o
etnofarmacológico e quimiotaxonômico.
35
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
� Investigar a atividade antiulcerogênica, antidiarréica e
antiespasmódica de Maytenus rigida Mart. (Celastraceae), na
perspectiva de encontrar uma nova alternativa terapêutica.
2.2 Objetivos Específicos
� Realizar triagem farmacológica comportamental com o extrato
etanólico (EEOH) obtido da entrecasca do caule de M. rigida em
ratos e camundongos;
� Determinar a dose letal 50 % (DL50) do EEOH;
� Avaliar a atividade antiulcerogênica do EEOH e da fase acetato de
etila (AcOEt) em modelos clássicos de indução de úlcera gástrica em
ratos e camundongos;
� Definir a dose do extrato e da fase que produz o melhor efeito
antiulcerogênico;
� Avaliar os parâmetros bioquímicos da secreção gástrica mediante o
tratamento com o EEOH e com a F. AcOEt;
� Investigar os possíveis mecanismos de ação envolvidos com a
atividade antiulcerogênica pela produção de muco, prostaglandina,
óxido nítrico e compostos sulfidrila;
� Avaliar o efeito cicatrizante da F. AcOEt no modelo de indução de
úlcera por ácido acético 30 % em ratos;
36
� Avaliar os efeitos do EEOH e da F. AcOEt em modelo de atividade
antidiarréica em camundongos e sobre a motilitidade intestinal de
ratos.
� Investigar um possível efeito antiespasmódico do EEOH em íleo
isolado de cobaia.
37
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Locais da pesquisa
Este trabalho foi desenvolvido nos Laboratórios de Ensaios
Toxicológicos (LABETOX) e de Fisiologia Funcional Prof. Thomas George do
Laboratório de Tecnologia Farmacêutica Prof. Delby Fernades de Medeiros
(LTF) e no Laboratório de Pesquisa de Produtos Naturais da Universidade
Estadual de Campinas (UNICAMP), com o apoio financeiro da Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
3.2 Animais
Para a realização do presente trabalho foram utilizados ratos (Ratus
norvegicus, variedade Wistar) adultos, machos pesando entre 180 e 250 g,
camundongos (Mus musculus, variedade Swiss) adultos, de ambos os sexos
pesando entre 25 e 35 g e cobaias (Cavia porcellus) adultos, de ambos os
sexos pesando entre 300 e 500 g. Os animais foram fornecidos pelo Biotério
Prof. Thomas George do Laboratório de LTF/UFPB e do centro de Bioterismo
da Unicamp (CEMIB). Os animais foram mantidos em temperatura constante
(21 ± 2º C), com umidade relativa do ar entre 30 % e 70 %, ciclo claro-escuro
de 12 horas e tratados com água e alimentados com ração Purina tipo pellets
ad libitum.
Os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética
em Pesquisa Animal-CEPA/LTF/UFPB sob protocolo nº 0513/05. Os
experimentos foram conduzidos de acordo com as normas internacionais para
o estudo com os animais de laboratório (ZIMMERNANN, 1983).
3.3 Espécie vegetal
O material botânico utilizado na investigação da atividade
antiulcerogênica em animais foi a entrecasca do caule de Maytenus rigida
Mart., coletada no município de Aroeira - Paraíba em 2004 e foi classificada
pela Dra. Maria de Fátima Agra, do Setor de Botânica do LTF da Universidade
38
Federal da Paraíba. Um exemplar desta espécie está depositado no Herbário
Lauro Pires Xavier da UFPB sob registro Agra et al. 3316 (JPB).
O extrato etanólico (EEOH) e a fase acetato de etila (AcOEt) obtidos da
entrecasca do caule de M. rigida, de acordo com a marcha fitoquímica de
extração (Figura 6), foram fornecidos pelos Profs. Drs. José Maria Barbosa
Filho e Maria de Fátima Vanderlei de Souza do LTF/UFPB.
Figura 6. Marcha fitoquímica para a obtenção do EEOH e a F. AcOEt de M.
rigida Mart..
3.4 Substâncias utilizadas
Para a realização dos experimentos, foram utilizadas as seguintes
substâncias: cloreto de sódio P.A. (QUIMEX-MERCK, Brasil), cimetidina
(SIGMA Chemical Co, EUA), lansoprazol 30 mg (ACHÉ, Brasil), carbenoxolona
(SIGMA Chemical Co, EUA), loperamida (Janssen Cilag Farmacêutica Ltda,
Brasil), atropina (SIGMA Chemical Co, EUA), etanol (MERCK, Alemanha),
piroxicam 20 mg (HEXAL, Brasil), óleo de rícino, N-etilmaleimida (SIGMA
Chemical Co, EUA), N-nitro-L-arginina-metil-éster (SIGMA Chemical Co, EUA),
hidróxido de sódio (QUIMEX-MERCK, Brasil), carvão ativado, fenoftaleína
(RIEDEL-DE HAËN, Alemanha), alcian blue (SIGMA Chemical Co, EUA) e
Material seco e pulverizado da casca do caule de M. rigida (3500 g)
Maceração em etanol (EtOH) a 95% (3x) Concentração em rotaevaporador à pressão reduzida
Obtenção do extrato etanólico bruto (EEOH) de M. rigida (491 g)
Hexano
Fase Hexânica (23 g) (4,7 %) Fase alcoólica 1
Clorofórmio
Fase Clorofórmica (12 g) (2,5 %)
Acetato de Etila
Fase Acetato de Etila (AcOEt - 244 g) (49,7 %)
Fase alcoólica 2
Fase alcoólica 3
39
goma arábica (Galênica, Brasil), ketamina (König do Brasil, Brasil), xilazina
(Vallée S/A, Brasil), cloridrato de carbamilcolina - carbacol (Merck, Alemanha),
cloreto de potássio (Reagen) e óleo de castor (Cremophor®) (Sigma-Aldrich). A
mistura carbogênica (95 % de O2 e 5 % de CO2) foi obtida da White Martins.
O EEOH, a F. AcOEt e demais substâncias foram solubilizados em
solução salina 0,9 % e preparadas imediatamente antes de cada experimento.
3.5 Solução nutritiva
Para os experimentos realizados in vitro foi utilizada a solução nutritiva
de Krebs modificada por Sun e Benishin (1994), cuja composição está descrita
na Tabela 1. O pH da solução era ajustado para os valores entre 7,2 e 7,4.
Quando a solução nutritiva era adicionada às cubas para órgãos isolados,
mantinha-se a temperatura de 37° C e aeração com carbogênio (95 % de O2 e
5 % de CO2).
Tabela 1 – Composição da solução de Krebs modificado (SUN; BENISHIN,
1994).
Substância Concentração (mM)
NaCl 117,0
KCl 4,7
MgSO4.7H2O 1,3
NaH2PO4.H2O 1,2
CaCl2.2H2O 2,5
Glicose 11,0
NaHCO3 25,0
40
3.6 Preparação da solução-estoque do EEOH e da F. AcOEt de Maytenus
rigida Mart., utilizada nos testes “in vitro”
O EEOH ou F. AcOEt foi solubilizado em Cremofor (3 %), essa solução
era diluída em água destilada até a concentração de 10 mg/mL e estocada a 0
°C, sendo novamente diluída em água destilada de acordo com a necessidade
de cada protocolo experimental. A concentração final de Cremofor nas cubas
nunca excedeu 0,01 % (V/V). Nesta concentração o Cremofor foi desprovido
de efeito contrátil ou relaxante no íleo isolado de cobaia.
3.7 Aparelhagem
Para registro das contrações isométricas o íleo foi suspenso em cubas
de vidro (6 mL) aquecidas à temperatura de 37° C por bombas termostáticas
modelo 597 (FISATOM, Brasil) e modelo Polystat 12002 (Cole-Parmer, Vernon
Hills, IL, EUA). As contrações isométricas foram registradas através de
transdutores de força modelo FORT-10 conectados a um amplificador modelo
TMB4M (ambos da World Precision Instruments, Sarasota, FL, EUA), que por
sua vez estava conectado a uma placa conversora analógico/digital instalada
em um microcomputador rodando o programa BioMed versão Rv2 (BioData,
João Pessoa, PB, Brasil). Os valores de pH eram ajustados através de um
pHmetro digital modelo PG 2000 (GEHAKA, São Paulo, SP, Brasil). As
substâncias e as drogas-teste foram pesadas em balança analítica modelo
AG200 e os animais em balança semi-analítica (ambas da GEHAKA, São
Paulo, SP, Brasil).
3.8 Avaliação da atividade toxicológica de Maytenus rigida
Inicialmente, o EEOH obtido da entrecasca do caule de M. rigida foi
submetido a um estudo de avaliação de toxicidade pela triagem
comportamental e determinação da DL50. Além de inferir as doses do EEOH
que seriam utilizadas nos estudos farmacológicos.
41
3.8.1 Triagem farmacológica comportamental e determinação da DL50
(SOUZA BRITO, 1994; ALMEIDA et al., 1999)
Foram utilizados camundongos machos e fêmeas (n = 10) que após
jejum de 12 horas, foram tratados com solução salina 0,9 % (10 mL/kg), EEOH
de M. rigida nas doses de 625, 1250, 2500 e 5000 mg/kg v.o. ou 250, 500,
1000 e 2000 mg/kg intraperitoneal (i.p.) Uma série de parâmetros
comportamentais descritos no protocolo experimental (anexo A) foram
observados durante as 4 primeiras horas com intervalos de 30 minutos, 1, 2, 3,
4 horas. A ocorrência de alguma alteração comportamental dos animais, em
decorrência do tratamento, permitiria inferir uma relação com a atividade no
sistema nervoso central e periférico e, conseqüentemente, sinais de toxicidade.
Os animais foram avaliados por 24, 48 e 72 horas com a finalidade de verificar
se haveria alguma morte e assim determinar a DL50 do EEOH de M. rigida.
3.9 Avaliação da atividade antiulcerogênica de Maytenus rigida
Na avaliação da atividade antiulcerogênica de EEOH e F. AcOEt
administrados por via oral (v.o.), foram utilizados modelo de indução aguda de
úlcera gástrica que mimetizam a úlcera no homem pelos agentes lesivos:
HCl/etanol, etanol, estresse (por imobilização e frio) e antiinflamatório não
esteroidal (piroxicam). Para corroborar aos dados, foi realizada a avaliação dos
parâmetros bioquímicos do suco gástrico (pH, concentração de H+ e volume do
suco gástrico) utilizando para isto modelo de ligadura do piloro, em que o
EEOH ou a F. AcOEt foram administrados por via intraduodenal.
Os animais foram eutanasiados por deslocamento cervical. O estômago
aberto ao longo da grande curvatura, lavado e colocado sobre placa para
quantificação macroscópica das lesões, com o auxílio de lupa OLYMPUS
Optical TL3 - SZ40. As lesões foram expressas como índice de lesão ulcerativo
(ILU), conforme número e severidade (SZELENYI; THIEMER, 1978):
- nível 1: pontos hemorrágicos e ulcerações até 1 mm;
- nível 2: ulcerações com 2 mm;
- nível 3: ulcerações profundas a partir de 3 mm.
ILU = Σ (lesões nível 1 x 1) + (lesões nível 2 x 2) + (lesões nível 3 x 3)
42
Foi utilizado também o modelo crônico de úlcera induzida por ácido
acético, no qual os animais foram tratados por 14 dias com a F. AcOEt de M.
rigida para verificar a capacidade de cicatrização da úlcera pela fase.
Os mecanismos de ação envolvidos na gastroproteção foram
investigados a partir da quantidade de muco gástrico, PGs, participação de NO
e dos compostos sulfidrilas.
3.9.1 Lesões gástricas induzidas por HCl/etanol (MIZUI; DOUTEUCHI,
1983)
Camundongos foram submetidos a um jejum de 24 horas (com acesso à
água ad libitum), divididos em 7 grupos (n = 6) e tratados com solução salina
0,9 % 10 mL/kg (controle negativo), lansoprazol 30 mg/kg (controle positivo),
EEOH 125, 250, 500 ou 750 mg/kg ou fase acetato 125, 250 ou 500 mg/kg
(grupos experimentais). Após 1 hora do tratamento, as lesões gástricas foram
induzidas pela administração de uma solução HCl/etanol (0,2 mL v.o.). Uma
hora após a administração do agente lesivo, os animais foram eutanasiados
por deslocamento cervical, os estômagos removidos e abertos ao longo da
grande curvatura e determinado o índice de lesão ulcerativa (SZELENYI;
THIEMER, 1978).
3.9.2 Lesões gástricas induzidas por etanol (MORIMOTO et al, 1991)
Ratos, submetidos a um jejum de 24 horas (com acesso à água ad
libitum), foram divididos em 7 grupos (n = 6) e tratados com solução salina 0,9
% (10 mL/kg), lansoprazol (30 mg/kg), EEOH (125, 250, 500 ou 750 mg/kg) ou
F. AcOEt (125, 250 ou 500 mg/kg). Após 1 hora do tratamento, as lesões
gástricas foram induzidas pela administração etanol absoluto (4 mL/kg v.o.).
Uma hora após a administração do etanol, os animais foram eutanasiados por
deslocamento cervical, os estômagos foram removidos e abertos ao longo da
grande curvatura e determinado o índice de lesão ulcerativa que foi calculado
de acordo com a metodologia descrita por Szelenyi; Thiemer (1978).
43
3.9.3 Lesões gástricas induzidas por estresse (imobilização e frio)
(LEVINE, 1971 com modificação)
Camundongos, submetidos a um jejum de 24 horas (com acesso à água
ad libitum), foram divididos em 6 grupos (n = 6) e tratados com solução 0,9 %
(10 mL/kg), cimetidina (100 mg/kg), EEOH (125, 250, 500 ou 750 mg/kg) ou F.
AcOEt (125, 250 ou 500 mg/kg). Após 30 minutos do tratamento, os animais
tiveram suas patas dianteiras e traseiras imobilizadas, foram colocados em
contensores de PVC (9 cm de comprimento x 3,5 cm de diâmetro) e
submetidos a uma temperatura de 4 ± 1 ºC por um período de 3 horas para
indução das úlceras gástricas. Após este período, os animais foram
eutanasiados por deslocamento cervical, os estômagos foram removidos e
abertos ao longo da grande curvatura e as lesões foram quantificadas e
determinado o índice de lesão ulcerativa (ILU) de cada animal.
3.9.4 Lesões gástricas induzidas por antiinflamatório não esteroidal
(piroxicam) (PUSCAS et al., 1997)
Camundongos, após jejum de 36 horas (com acesso à água ad libitum),
foram divididos em 6 grupos (n = 6) e tratados com solução salina 0,9 % (10
mL/kg), cimetidina (100 mg/kg), EEOH (250, 500, ou 750 mg/kg) ou F. AcOEt
(125, 250 ou 500 mg/kg). Após 30 minutos do tratamento, as lesões gástricas
foram induzidas com a injeção de piroxicam (30 mg/kg) pela via subcutânea.
Quatro horas após a administração do antiinflamatório, os animais foram
eutanasiados por deslocamento cervical, os estômagos foram removidos e
abertos ao longo da grande curvatura e as lesões foram quantificadas para que
se determinasse o índice de lesão ulcerativo (ILU) de cada animal.
3.9.5 Avaliação dos parâmetros bioquímicos do suco gástrico no modelo
de ligadura do piloro (SHAY et al., 1945)
Ratos, após jejum de 36 horas (com acesso à água ad libitum), foram
divididos em grupos (n = 8) e sob anestesia (ketamina/xilazina) sofreram uma
incisão longitudinal logo abaixo da apófise xifóide para a localização e
44
amarradura de piloro. As administrações do EEOH (500 mg/kg), F. AcOEt (250
mg/kg), cimetidina 100 mg/kg (controle positivo) ou solução salina 0,9 %
(controle negativo) foram realizadas logo após a amarradura, por via
intraduodenal, e as incisões foram suturadas. Quatro horas após a cirurgia os
animais foram eutanasiados por deslocamento cervical e a incisão reaberta;
após ligadura da cárdia (para preservação do conteúdo gástrico), o estômago
foi retirado. O conteúdo estomacal foi coletado para em seguida determinar os
parâmetros de volume gástrico, pH e concentração de ácido total. O conteúdo
do estômago foi pesado e, em seguida, calculado o volume do suco gástrico
expresso em g/4h. O pH foi verificado com o auxílio de um pHmetro digital PG
2000 (GEHAKA, Brasil) após centrifugação do conteúdo estomacal a 3000 rpm
por 10 minutos. Foram retirados 10 mL do sobrenadante, sendo esse
distribuído em alíquotas de 5 mL em 2 erlenmeyer para que fosse prosseguida
a titulação do suco gástrico e determinada a concentração de H+ expressa em
mEq/mL/4h. Para a titulação foi utilizada solução de hidróxido de sódio (NaOH)
0,01 N e fenolftaleina como solução indicadora com auxílio de uma bureta
digital Solarus® (HIRSCHMANN LABORGERATE, U.S.A).
3.9.6 Lesão gástrica induzida por ácido acético 30 % (TAKAGI; OKABE;
SAZIKI, 1969)
Ratos, após jejum de 36 horas (com acesso à água ad libitum), foram
divididos aleatoriamente nos grupos Sham, solução salina 0,9 %, cimetidina e
F. AcOEt (n = 10) e sob anestesia (ketamina/xilazina), foi realizada uma incisão
longitudinal logo abaixo da apófise xifóide. A parede anterior do estômago foi
exposta e 50 µL de ácido acético a 30 %, foram injetados na camada
subserosa da junção do fundo com o antro, com auxílio de uma seringa (Figura
7), com exceção do grupo Sham. Um dia após a cirurgia foram iniciados os
tratamentos por v.o., uma vez ao dia, durante 14 dias com a F. AcOEt 250
mg/kg, cimetidina 100 mg/kg (controle positivo) e solução salina 0,9 % 10
mL/kg (controle negativo). Ao final do tratamento, os animais foram
eutanasiados por deslocamento cervical e seus estômagos foram removidos e
abertos no sentido da grande curvatura, para a determinação da área da lesão
45
ulcerativa - ALU (mm2) com a ajuda de um paquímetro, utilizando a seguinte
equação:
ALU = altura da úlcera X largura da úlcera
Após o sacrifício, os órgãos vitais como coração, fígado, baço e rins foram
pesados e feito a relação entre o peso de cada órgão e o peso corporal de
cada animal para avaliação de um possível efeito tóxico do extrato neste
período de tratamento.
Figura 7- Ilustração da indução da úlcera com ácido acético 30 %
3.10 Avaliação dos mecanismos de ação citoprotetores envolvidos na
atividade antiulcerogênica de Maytenus rigida
3.10.1 Determinação de muco aderido à parede gástrica (RAFATULLAH et
al., 1990 com modificações)
Ratos em jejum de 24 horas foram divididos em 4 grupos (n=5): Sham
(grupo não tratado), controle negatico (solução salina 0,9 % v.o), contole
positivo (carbenoxolona 100 mg/kg v.o.) e experimental (F. AcOEt 250 mg/kg
v.o.). Em seguida os animais foram anestesiados (quetamina/xilazina) e
sofreram uma incisão longitudinal logo abaixo da apófise xifóide para a
localização e amarradura do piloro. Quatro horas após a cirurgia os animais
foram eutanasiados por deslocamento cervical e a incisão reaberta, o
estômago foi retirado, a porção glandular do estômago foi separada, pesada e
imersa por 2 horas em 10 mL de solução de alcian blue de acordo com a
metodologia descrita por Rafatullah et al. (1990) com modificações. O excesso
46
de alcian blue foi removido lavando-se o estômago por duas vezes sucessivas
com 7 mL de solução de sacarose 0,25 mol/L; a primeira por 15 minutos e a
segunda por 45 minutos. O corante complexado ao muco aderido à parede
gástrica foi extraído com 10 mL de cloreto de magnésio 0,5 mol/L, agitando-se
intermitentemente por um minuto a cada 30 minutos durante 2 horas. Em 4 mL
da mistura foi adicionados 4 mL de éter etílico e, então, a solução foi submetida
à agitação por 2 minutos. A emulsão obtida foi centrifugada por 10 minutos a
3600 rpm e o precipitado foi descartado. As absorbâncias foram lidas em
espectrofotômetro a 598 nm. A leitura foi feita após realização de uma curva
padrão com várias concentrações de alcian blue. Os resultados foram
expressos em µg de Alcian blue/mL/g de tecido.
3.10.2 Determinação de prostaglandina E2 (PGE2) (CURTIS et al., 1995)
Ratos em jejum de 24 horas foram divididos aleatoriamente em 5
grupos: sham, solução salina 0,9 %, solução salina 0,9 % + indometacina, F.
AcOEt, e F. AcOEt + indometacina. Nos animais dos grupos 2 e 3 foi
administrado v.o. solução salina 0,9 % e nos animais dos grupos 4 e 5
receberam F. AcOEt. Após trinta minutos a indometacina (inibidor da síntese de
PGs) na dose de 20 mg/kg subcutânea foi administrada aos grupos 3 e 5. Uma
hora após o tratamento inicial os ratos foram eutanasiados, os estômagos
retirados e abertos, a mucosa raspada até sua total remoção. O conteúdo foi
pesado, picotado e logo suspenso em uma solução de 1 mL de tampão sódio
fosfato (10mM, pH 7,4); a solução assim obtida foi incubada a 37 °, por um
período de 20 min. A PG presente no tampão foi determinada por “kit”
imunoenzimático (RPN 222-Amersham) em espectrofotômero a 450 nm.
3.10.3 Avaliação da participação do óxido nítrico (SIKIRIC et al., 1997 com
modificações)
Ratos Wistar machos em jejum de 24 horas (com acesso a água ad
libitum) foram divididos em 8 grupos (n = 8) de acordo com os respectivos pré-
tratamentos. Os quatro grupos controle receberam injeção intraperitonial de
solução salina 0,9 % (10 mL/kg) e nos outros quatro grupos foi administrado N-
47
nitro-L-arginina-metil-ester (L-NAME) (10 mg/kg), um inibidor da NO-sintase.
Após 30 min, os grupos receberam por via oral os respectivos tratamentos,
solução salina 0,9 %, EEOH (500 mg/kg), a F. AcOEt (250 mg/kg) ou
carbenoxolona (100 mg/kg). Após 50 min, os animais foram tratados oralmente
com etanol absoluto. Os animais foram eutanasiados após 1 hora e os
estômagos removidos e abertos na grande curvatura. As lesões foram
avaliadas e o índice de lesão ulcerativa foi calculado.
3.10.4 Avaliação da participação dos grupamentos sulfidrila (MATSUDA et
al., 1999)
Ratos em jejum prévio de 24 horas (com acesso a água ad libitum)
foram divididos em oito grupos (n = 8) de acordo com os respectivos pré-
tratamentos. Os quatro grupos controle receberam injeção subcutânea de
solução salina 0,9 % (10 mL/kg) e os outros quatro grupos receberam por esta
mesma via N-etilmaleimida (NEM) 10 mg/kg, um bloqueador de grupamentos
sulfidrila. Após 30 min, os grupos receberam por v.o. os respectivos
tratamentos, solução salina 0,9 %, EEOH (500 mg/kg), a F. AcOEt (250 mg/kg)
ou carbenoxolona (100 mg/kg). Após 50 min, os animais foram tratados
oralmente com 1 mL de etanol absoluto. Os animais foram eutanasiados após
1 hora e os estômagos removidos e abertos na grande curvatura. As lesões
foram avaliadas e o índice de lesão ulcerativa foi calculado.
3.11 Avaliação da atividade antidiarréica e antimotilidade intestinal de
Maytenus rigida
3.11.1 Diarréia induzida por óleo de rícino (AWOUTERS et al, 1978)
Camundongos, em jejum de 12 horas (com acesso a água ad libitum),
foram divididos em grupos (n = 6) e tratados com solução salina 10 mL/kg
(controle negativo), loperamida (10 mg/kg), EEOH (250, 500 ou 750 mg/kg) ou
F. AcOEt (125, 250 ou 500 mg/kg). Após 1 hora dos tratamentos, foi
administrado 0,7 mL de óleo de rícino por animal por via oral. Os animais
foram colocados em caixas individuais forradas com papel branco. Após a
48
% de inibição =
administração do agente indutor da diarréia, foi realizada a contagem do
número de bolos fecais e observado a consistência dos bolos fecais por até 4
horas, classificando-os de acordo com a consistência em líquidos ou sólidos.
Foi então determinado o número de episódios líquidos e o número total de
bolos fecais.
3.11.2 Trânsito intestinal normal (STICKNEY; NORTHUP, 1959)
Ratos, em jejum de 12 horas (com acesso a água ad libitum), foram
divididos em grupos (n = 6) e tratados com solução salina 0,9 % (10 mL/kg),
atropina (2 mg/kg), EEOH (250, 500 ou 750 mg/kg) ou F. AcOEt (125, 250 ou
500 mg/kg). Após 30 minutos, foi administrado 0,5 mL por animal de uma
solução de carvão ativado (5 %) em goma arábica (5 %) e os animais
eutanasiados por deslocamento cervical, 30 minutos após a administração do
carvão ativado. A cavidade abdominal foi aberta e o intestino delgado
removido. Com auxílio de uma régua, foi determinado o comprimento total do
intestino delgado de cada animal (distância entre o piloro até a válvula
ileocecal), e a distância percorrida pelo marcador. Foi calculada a porcentagem
do percurso do carvão em função do comprimento total do intestino.
Os resultados foram expressos em porcentagem de inibição da distância
percorrida pelo marcador em relação ao comprimento total do intestino delgado
do grupo experimental em relação ao grupo, controle de acordo com a
equação:
(Distância do grupo controle – Distância grupo experimental)
Distância do grupo controle
3.11.3 Trânsito intestinal induzido por óleo de rícino (STICKNEY;
NORTHUP, 1959)
Ratos, em jejum de 12 horas (com acesso a água ad libitum), foram
separados em grupos (n = 6) e tratados com solução salina 0,9 % (10 mL/kg),
atropina (2 mg/kg), EEOH (500 mg/kg) ou F. AcOEt (250 mg/kg), após 30
minutos foi administrado 0,7 mL de óleo de rícino por animal e após 30 minutos
X 100 % de inibição =
49
foi administrado 0,5 mL de solução de carvão ativado (5 %) em goma arábica
(5 %). Após 30 minutos os animais foram eutanasiados por deslocamento
cervical, a cavidade abdominal aberta e o intestino delgado removido. Com
auxílio de uma régua, foi determinado o comprimento total do intestino delgado
de cada animal (distância entre o piloro até a válvula ileocecal), e a distância
percorrida pelo marcador. Os resultados foram expressos em porcentagem da
distância percorrida pelo marcador em relação ao comprimento total do
intestino delgado.
3.12 Avaliação da atividade antiespasmódica de Maytenus rigida
3.12.1 Efeito do EEOH e da F. AcOEt sobre as contrações tônicas
induzidas por KCl ou por carbacol em íleo isolado de cobaia (DANIEL;
KWANC; JANSSEN, 2001)
As cobaias foram mantidas em jejum por um período de 18 a 24 horas,
com acesso à água ad libitum antes do início dos experimentos. Após este
período foram eutanasiadas por deslocamento cervical seguida de secção dos
vasos cervicais. O abdômen foi aberto e um segmento do íleo de
aproximadamente 15 cm de comprimento foi retirado e colocado em uma placa
de Petri contendo solução nutritiva de Krebs modificado a 37 °C sob aeração
com carbogênio. Após cuidadosa dissecação, o segmento do íleo foi
seccionado em fragmentos de 2 a 3 cm de comprimento, suspensos
individualmente em cubas de vidro e deixados em repouso por 30 minutos,
tempo necessário para perfeita estabilização da preparação, durante este
período a solução nutritiva foi trocada a cada 15 minutos.
Após o período de estabilização, duas contrações submáximas similares
foram obtidas com KCl (40 mM) ou carbacol (10-6 M). Durante a fase tônica
sustentada da segunda resposta, tanto o EEOH como a F. AcOEt foram
aplicados de maneira cumulativa.
O relaxamento foi expresso como a percentagem reversa da contração
induzida por KCl ou carbacol. Os valores de concentração do EEOH ou da F.
AcOEt que produz 50 % de seu efeito máximo (CE50) foram obtidos por regressão
não-linear a partir das curvas concentrações-resposta obtidas
50
3.13 Análise estatística
Para os modelos que investigam a atividade antiulcerogênica,
antidiarréica e motilidade intestinal, os resultados estão expressos como a
média ± desvio padrão (d.p.) e foram submetidos à análise de variância de uma
via (ANOVA), seguido do pós-teste de Dunnett (para comparação dos grupos
tratados com o grupo controle negativo) ou teste de Tukey-Kramer (para
comparação entre os grupos tratados e escolha da melhor dose do EEOH e F.
AcOEt). O nível de significância considerado foi 95 % (P< 0,05). O programa
estatístico utilizado foi o GraphPad Prism versão 3,02 (GraphPad Software Inc.,
San Diego CA, U.S.A.).
Os resultados obtidos na avaliação da atividade antiespasmódica estão
expressos como a média ± e.p.m e foram analisados estatisticamente
empregando-se o teste “t” de Student ou análise de variância (ANOVA) “one-
way” seguido do teste de Bonferroni, em que os valores de p < 0,05 foram
considerados significantes. Os valores de CE50 (NEUBIG et al., 2003) foram
calculados por regressão não-linear e foram analisados pelo programa
GraphPad Prism versão 3,02 (GraphPad Software Inc., San Diego CA, U.S.A.).
51
4 RESULTADOS
4.1 Avaliação da atividade toxicológica de Maytenus rigida
4.1.1 Triagem farmacológica comportamental e determinação da DL50
Observando os parâmetros citados por Almeida e colaboradores (1999),
os animais não apresentaram alterações de comportamento após a
administração do EEOH obtido da entrecasca do caule de M. rigida, nas doses
utilizadas até 5000 v.o. e até 2000 mg/kg i.p., durante o tempo de observação
preconizado. Esses resultados indicam que o EEOH apresentou baixa
toxicidade nas condições avaliadas.
Foi observado que não houve mortes de animais durante as 72 horas
após a administração do EEOH, não sendo possível a determinação da DL50.
4.2 Avaliação da atividade antiulcerogênica de Maytenus rigida
Souza Brito (1994) preconiza que estudos farmacológicos envolvendo
extrato vegetal ou seus derivados deverá ser avaliado até a dose máxima de
1000 mg/kg. Diante disso, as doses do EEOH (250, 500 e 750 mg/kg) e F.
AcOEt (125, 250 e 500 mg/kg) obtido de M. rigida foram definidas em função
de sua capacidade de inibirem as lesões gástricas.
4.2.1 Lesões gástricas induzidas por HCl/etanol
No modelo de indução por HCl/etanol por via oral em camundongos os
tratamentos com EEOH nas doses 250, 500 ou 750 mg/kg ou lansoprazol (30
mg/kg) v.o. inibiram significantemente as lesões ulcerativas em 44, 70, 78, 74,
% respectivamente, quando comparado ao controle negativo (Tabela 2).
52
Tabela 2- Efeito da administração oral do EEOH obtido de M. rigida ou
lansoprazol nas lesões gástricas induzidas por HCl/etanol em camundongos
Tratamento Dose
(mg/kg)
ILU
(Média ± d.p)
Inibição
(%)
Solução salina 0,9 % - 27 ± 2,4 -
Lansoprazol 30 7 ± 1,2** 74
EEOH 125 24± 1,9 11
250 15 ± 2,9** 44
500 8 ± 1,5** 70
750 6 ± 1,4** 78
ILU= Índice de Lesão Ulcerativa ANOVA F(5,30) = 120; (P<0,05), seguido do teste de Dunnett, comparado ao controle negativo, **P<0,01.
4.2.2- Lesões gástricas induzidas por etanol
Os resultados obtidos para a espécie M. rigida nesse modelo de indução
pela administração de etanol (v.o) em ratos demonstraram que o EEOH (250,
500 ou 750 mg/kg) ou o lansoprazol (30 mg/kg) inibiu significantemente as
lesões ulcerativas em 52, 87, 95 e 65 % respectivamente, quando comparado
ao controle negativo (Tabela 3a).
Os resultados obtidos no modelo de indução de úlcera induzida por
etanol, para avaliar a F. AcOEt (125, 250 ou 500 mg/kg) ou o lansoprazol (30
mg/kg), demonstraram que ocorreu uma inibição significativa das lesões
ulcerativas em 47, 81, 87 e 58 % respectivamente, quando comparado ao
controle negativo (Tabela 3b).
53
Tabela 3- Efeito da administração oral do EEOH, F. AcOEt de M. rigida ou
lansoprazol nas lesões gástricas induzidas por etanol em ratos
Tratamentos Dose (mg/kg)
ILU (Média ± d.p)
Inibição (%)
(a) Solução salina 0,9 % - 130 ± 7,9 -
Lansoprazol 30 45 ± 7,3** 65
EEOH
125
250
500
750
119 ± 11,3
63 ± 5,9**
17 ± 2,7**
7 ± 2,6**
8
52
87
95
(b) Solução salina 0,9 %
Lansoprazol
F. AcOEt
-
30
125
137 ± 6,9
57 ± 7,1**
73 ± 8,3**
-
58
47
250
500
26 ± 4,0**
18 ± 2,7**
81
87
ILU= Índice de Lesão Ulcerativa ANOVA F(5,30) = 387 para o EEOH e F(4,25) = 354 para a F. AcOEt; (P<0,05), seguido do teste de Dunnett, comparado ao controle negativo *P<0,05 e **P<0,01.
Portanto, o EEOH e a F. AcOEt obtidos de M. rigida apresentaram
significativa atividade antiulcerogênica frente aos danos da mucosa gástrica
provocados por HCl/etanol e etanol em camundongos e ratos respectivamente.
4.2.3 Lesões gástricas induzidas por estresse (imobilização e frio)
No modelo de indução de úlcera gástrica por estresse (imobilização e
frio) em camundongos, os resultados da administração oral do EEOH (250, 500
ou 750 mg/kg) ou cimetidina (100 mg/kg) mostram que houve inibição de 65,
54
86, 89 e 69 %, respectivamente, quando comparado ao controle negativo
(Tabela 4a).
Os resultados obtidos na avaliação da F. AcOEt (125, 250 ou 500 mg/kg)
ou cimetidina (100 mg/kg), no modelo de úlcera induzida por estresse,
demonstraram que ocorreu uma inibição significativa das lesões ulcerativas em
60, 80, 87 e 62 % respectivamente, quando comparado ao controle negativo
(Tabela 4b).
De acordo com estes dados, o EEOH e a F. AcOEt obtidos de M. rigida
apresentaram significativa atividade antiulcerogênica frente aos danos
gástricos agudos provocados pelo estresse por imobilização e frio em
camundongos.
Tabela 4- Efeito da administração oral do EEOH e F. AcOEt de M. rigida ou
cimetidina nas lesões gástricas induzidas por estresse em camundongos
Tratamento Dose
(mg/kg)
ILU
(Média ± d.p)
Inibição
(%)
(a) Solução salina 0,9 % - 161 ± 10,6 -
Cimetidina 100 50 ± 5,4** 69
EEOH 250 57 ± 5,0** 65
500 22 ± 2,9** 86
750 18 ± 2,8** 89
(b) Solução salina 0,9 %
Cimetidina
F. AcOEt
-
100
125
60 ± 2,7
23 ± 2,9**
24 ± 3,3**
-
62
60
250
500
12 ± 2,8**
8 ± 2,8**
80
87
ILU= Índice de Lesão Ulcerativa ANOVA F(4,25) = 552 para o EEOH e F(4,25) = 298 para a F. AcOEt; (P<0,05), seguido do teste de Dunnett, comparado ao controle negativo, **P<0,01.
55
4.2.4 Lesões gástricas induzidas por antiinflamatório não esteroidal
(piroxicam)
No modelo de indução de úlcera gástrica por antiinflamatório não
esteroidal (piroxicam) em camundongos, os resultados da administração oral
do EEOH (250, 500 ou 750 mg/kg) ou de cimetidina (100 mg/kg) mostram que
houve inibição de 55, 81, 94 e 60 %, respectivamente, quando comparado ao
grupo controle negativo (Tabela 5a).
Semelhante experimento foi utlilizado para avaliar os efeitos da
administração da F. AcOEt (125, 250 e 500 mg/kg) ou de cimetidina (100
mg/kg) em camundongos submetidos aos danos gástricos provocados pelo
piroxicam. Os resultados obtidos demonstraram que ocorreu uma inibição
significativa das lesões ulcerativas em 41, 69, 80 e 64 % respectivamente,
quando comparado ao controle negativo (Tabela 5b).
Estes resultados mostram que o EEOH e F. AcOEt obtidos de M. rigida
apresentaram significante atividade antiulcerogênica, frente a formação aguda
das lesões na mucosa gástrica induzidas pelo antiinflamatório não esteroidal
piroxicam.
56
Tabela 5- Efeito da administração oral do EEOH e F. AcOEt de M. rigida ou
cimetidina nas lesões gástricas induzidas por piroxicam em camundongos
Tratamento Dose
(mg/kg)
ILU
(Média ± d.p)
Inibição
(%)
(a) Solução salina 0,9 % - 47 ± 4,7 -
Cimetidina 100 19 ± 2,4** 60
EEOH 125 21 ± 2,9** 55
250 9 ± 2,3** 81
500 3 ± 1,2** 94
(b) Solução salina 0,9 %
Lansoprazol
F. AcOEt
-
125
125
39 ± 1,9
14 ± 2,2**
23 ± 2,9**
-
64
41
250
500
12 ± 1,7**
8 ± 2,1**
69
80
ILU= Índice de Lesão Ulcerativa ANOVA F(4,25) = 199 para o EEOH e F(4,25) =180 para a F. AcOEt; (P<0,05), seguido do teste de Dunnett, comparado ao controle negativo, **P<0,01.
4.2.5 Avaliação dos parâmetros bioquímicos do suco gástrico no modelo
de ligadura do piloro
No modelo de ligadura do piloro, foram avaliados parâmetros
bioquímicos do conteúdo estomacal como volume gástrico, pH e acidez total,
após a administração intraduodenal da solução salina 0,9 %, cimetidina (100
mg/kg), EEOH (500 mg/kg) ou F. AcOEt (250 mg/kg) em ratos.
Os dados obtidos mostraram que o EEOH e a F. AcOEt não
promoveram alterações nos parâmetros bioquímicos observados, diferente da
57
cimetidina que elevou o pH, o volume gástrico e diminuiu a concentração ácida
total (Tabela 6).
Tabela 6- Efeito da administração intraduodenal do EEOH e F. AcOEt de M.
rigida ou cimetidina sobre os parâmetros bioquímicos do suco gástrico no
modelo de ligadura do piloro em ratos
Tratamento Dose
(mg/Kg)
pH
Concentração
de H+
(mEq /mL /4 h)
Volume
gástrico (g)
Solução salina 0,9 % - 2,73± 0,22 9,63 ± 0,52 0,72 ± 0,08
Cimetidina 100 5,73 ± 0,52** 3,30 ± 0,53** 0,48 ± 0,05**
EEOH 500 3,05 ± 0,39 9,43 ± 0,47 0,73 ± 0,05
F. AcOEt 250 3,07 ± 0,45 9,27 ± 0,63 0,79 ± 0,03
ANOVA: F(3,20) = 71 para pH; F (3,20) = 192 para concentração de H+; F(3,20) = 39 para volume gástrico (P<0,05), seguido do teste de Dunnett comparado ao controle negativo **P<0,01.
4.2.6 Lesão gástrica induzida por ácido acético 30 %
No modelo de indução de úlcera gástrica por ácido acético 30 %, em
ratos foi realizado o tratamento durante 14 dias consecutivos com solução
salina 0,9 %, cimetidina (100 mg/kg) ou F. AcOEt obtida da M. rigida (250
mg/kg). Os resultados demonstraram que nos animais tratados com a F. AcOEt
(250 mg/kg) ou cimetidina (100 mg/kg) ocorreu uma redução na área da lesão
gástrica em 52 % e 50 %, respectivamente, quando comparado ao grupo
controle negativo (Gráfico 1). O grupo Sham, com animais em que não foram
induzido a úlcera, como esperado apresentou 0 % de lesão, sendo considerado
como controle normal.
58
0
25
50
75
Sham
Cimetidina 100 mg/kg
Fase AcOEt 250 mg/kg
Solução salina 0,9 %
50 % **
52 % **
**
Tratamentos
Áre
a de
Les
ão U
lcer
ativ
a
(AL
U)
mm
2
Gráfico 1- Efeito da administração oral da F. AcOEt de M. rigida ou cimetidina,
durante 14 dias, no modelo de indução de úlcera gástrica por ácido acético 30
% em ratos.
ANOVA F(3,20) = 26; (P<0,05), seguido do teste de Dunnett, comparado ao controle, **P<0,01.
Partindo do mesmo modelo de indução de úlcera pelo ácido acético, foi
avaliado também o efeito da F. AcOEt obtida de M. rigida sobre o peso corporal
e sobre os órgãos vitais como coração, fígado, baço e rins dos ratos. Os dados
obtidos mostraram que não houve alteração significativa no peso dos órgãos e
no peso corpóreo (Tabela 7).
59
Tabela 7- Efeito da administração oral da F. AcOEt de M. rigida ou cimetidina
por 14 dias consecutivos sobre o peso corporal e dos orgãos de ratos com
úlcera induzida por ácido acético
Tratamentos
Solução salina
0,9 % Sham
Cimetidina
(100 mg/kg)
F. AcOEt
(250 mg/kg)
Peso corporal
coração
fígado
baço
rins
239,7 ± 14,28
0,45 ± 0,08
3,73 ± 0,26
0,25 ± 0,04
0,79 ± 0,01
278,4 ± 10,41**
0,45 ± 0,02
3,79 ± 0,26
0,24 ± 0,02
0,77 ± 0,01
225,7 ± 18,05
0,45 ± 0,02
3,87 ± 0,25
0,24 ± 0,03
0,77 ± 0,06
224,7 ± 20,60
0,43 ± 0,03
3,69 ± 0,19
0,28 ± 0,05
0,82 ± 0,08
ANOVA F(3,20)= 17 para peso corporal, F(3,20) = 0,78 para coração, F(3,20) = 0,71 para fígado, F(3,20) = 3 para baço e F(3,20) = 1 para rins, **P<0,01, seguido do teste de Dunnett, comparado ao controle (solução salina 0,9 %).
4.3 Avaliação dos mecanismos de ação citoprotetores envolvidos na
atividade antiulcerogênica de Maytenus rigida
4.3.1 Determinação do muco aderido à parede gástrica
Para verificar o envolvimento do muco na citoproteção produzida por
carbenoxolona 200 mg/kg e a F. AcOEt 250 mg/kg foi determinado o muco
aderido à mucosa gástrica, pela determinação da concentração de acian blue
em ratos após ligadura do piloro. Os resultados demonstram que a
carbenoxolona 200 mg/kg e a F. AcOEt 250 mg/kg, administrados oralmente
aumentaram a produção de muco de forma significativa, quando comparados
com o grupo controle negativo (solução salina 0,9 %) (Gráfico 2).
60
0
10
20
30
40
50
60solução salina 0,9 %
carbenoxolona 100 mg/kg
Fase AcOEt 250 mg/kg
**
*
Tratamentos
Qu
anti
dad
e d
e al
cian
blu
e ad
erid
o a
par
ede
gás
tica
[mg
/pes
o d
a p
orç
ão g
lan
du
lar
(g)]
Gráfico 2- Efeito do tratamento agudo com F. AcOEt de M. rigida ou
carbenoxolona no conteúdo de muco aderido à mucosa gástrica em ratos.
ANOVA F(2, 20)= 14; (P<0,05), seguido do teste de Dunnett, comparado ao controle negativo, *P<0,05 e **P<0,01.
4.3.2 Determinação de prostaglandina E2 (PGE2)
Com a finalidade de avaliar o envolvimento da PGE2 na citoproteção
promovida pela F. AcOEt, foi verificado se a amostra vegetal era capaz de
modular a produção desta prostaglandina. Os dados mostram que a F. AcOEt
(250 mg/kg) manteve os níveis de PGE2 semelhante ao do grupo controle
negativo (solução salina 0,9 %). No entanto, quando a fase foi administrada no
grupo pré-tratado com indometacina (30 mg/kg) (um inibidor não seletivo da
síntese de prostaglandina), ocorreu uma redução significativa na produção de
PGE2 quando comparado ao grupo Sham, semelhante ao grupo solução salina
0,9 % pré-tratado com indometacina (Gráfico 3).
Estes dados indicam a não participação da PGE2 na citoproteção
promovida por M. rigida.
61
0
1
2
3Solução salina 0,9 %
Solução salina 0,9 % + Indometacina
Fase 250 mg/kg
Fase 250 mg/kg + Indometacina
Sham
+ ++
*****
Tratamentos
[PG
E2]
ng
/mg
pro
tein
a
Gráfico 3: Efeito do tratamento com a F. AcOEt de M. rigida nos níveis de
PGE2 em ratos.
ANOVA, F(4,16)= 10, (P<0,05), seguido do teste de Tuckey, comparado ao Sham, **P<0,01, ***P<0,001, comparado ao seu controle, +P<0,05, ++P<0,01.
4.3.3 – Avaliação da participação do óxido nítrico (NO)
Na avaliação do envolvimento do NO no efeito gastroprotetor do extrato e
da F. AcOEt, os ratos foram pré-tratados com L-NAME, um inibidor da sintase
do óxido nítrico. Como esperado, foi observado um aumento nas lesões
ulcerativas induzidas pelo etanol nos ratos pré-tratados com L-NAME (Figura
8).
Os dados obtidos no modelo que investiga a participação de NO na
proteção induzida por EEOH 500 mg/kg e F. AcOEt 250 mg/kg, mostram que
nos ratos dos grupos previamente tratados com solução salina 0,9 % e depois
tratados com EEOH, F. AcOEt ou carbenoxolona, ocorreu uma inibição
significativa do ILU em 48, 49 e 58 % respectivamente. Entretanto, quando
foram avaliados os grupos pré-tratados com o L-NAME (bloqueador da sintase
de oxido nítrico) e posteriormente tratados com EEOH, F. AcOEt ou
carbenoxolona foi observado uma exacerbação do ILU com inibição de apenas
33, 35 e 40 % respectivamente, quando comparados ao seu controle negativo.
(Gráfico 4).
62
Figura 8- Estômagos de ratos tratados com solução salina 0,9 %/solução
salina 0,9 % (A), solução salina 0,9 %/EEOH (B), solução salina 0,9 %/F.
AcOEt (C), L-NAME/solução salina 0,9 % (D), L-NAME/EEOH (E) ou L-
NAME/F. AcOEt (F).
0
100
200
300
Salina
Carbenoxolona 100 mg/kg
Extrato 500 mg/kg
Fase 250 mg/kg
** ** **
Salina L-NAME
** **
58 %48 % 49 %
40 %
33 % 35 %
******
******
Tratamentos
ILU
(Mé
dia
± d
p)
Gráfico 4. Efeito da administração oral do EEOH, F. AcOEt de M. rigida ou
carbenoxolona na úlcera gástrica induzida por etanol em ratos pré-tratados
com L-NAME.
ANOVA F(7,56) = 312; (P<0,01), seguido do teste de Dunnett, comparado ao controle negativo, **P<0,01, ***P<0,001.
A B C
D E F
63
O pré-tratamento com L-NAME reduziu a proteção exercida pelo EEOH
e F. AcOEt obtidos da M. rigida, sugerindo o envolvimento de NO citoproteção.
4.3.4 Avaliação da participação dos grupamentos sulfidrila (SH)
Na avaliação do envolvimento dos grupamentos sulfidrilas no efeito
gastroprotetor do extrato e da fase, os ratos foram pré-tratados com NEM, um
bloqueador dos grupamentos sulfidrila endógenos. Como esperado, foi
observado um aumento nas lesões ulcerativas induzidas pelo etanol nos ratos
pré-tratados com NEM (Figura 9).
Ao avaliar os dados obtidos neste modelo, foi observado que os animais
dos grupos previamente tratados com solução salina 0,9 % e depois tratados
com EEOH, F. AcOEt ou carbenoxolona, ocorreu uma inibição significativa do
ILU em 57, 56 e 58 % respectivamente. Entretanto, quando foram avaliados os
grupos pré-tratados com o NEM (bloqueador de grupamentos sulfidrila) e
tratados com EEOH, F. AcOEt e carbenoxolona, foi observado uma
exacerbação do ILU com apenas 31, 33 e 39 % de inibição quando
comparados ao seu controle negativo (Gráfico 5).
Os resultados demonstraram que a via dos grupamentos sulfidrila está
envolvida na ação citoprotetora promovida M. rigida.
Figura 9- Estômagos de ratos tratados com solução salina 0,9 %/solução salina 0,9 % (A), solução salina 0,9 %/EEOH (B), solução salina 0,9 %/F. AcOEt (C), NEM/solução salina 0,9 % (D), NEM/EEOH (E) e NEM/F. AcOEt (F)
A B C
D E F
64
0
100
200
salina
carbenoxolona 100 mg/kg
fase 250 mg/kg
** ** **
extrato 500 mg/kg
NEMSalinaTratamentos
58% 57% 56%
39%
31%33%
******
******
ILU
(M
édi
a±± ±±
dp
)
Gráfico 5. Efeito da administração oral do EEOH, F. AcOEt de M. rigida ou
carbenoxolona na úlcera gástrica induzida por etanol em ratos pré-tratados
com NEM. ANOVA F(7,56) = 364.25, (P<0,05), seguido do teste de Dunnett,
comparado ao controle negativo, **P<0,01, ***P<0,001.
4.4 Avaliação da atividade antidiarréica de Maytenus rigida
4.4.1 Diarréia induzida por óleo de rícino
No modelo de diarréia induzida por óleo de rícino em camundongos, os
resultados da administração do EEOH (250, 500 ou 750 mg/kg) ou loperamida
(10 mg/kg) mostram que houve inibição de 32, 68, 80 e 68%, respectivamente,
quando comparados ao controle negativo em relação ao número total de fezes.
O EEOH inibiu também o número de fezes líquidas (Tabela 8a).
No modelo de diarréia induzida por óleo de rícino, os resultados obtidos
para a F. AcOEt (125, 250 ou 500 mg/kg) e loperamida (10 mg/kg)
demonstraram que ocorreu uma inibição significativa do número total de fezes
de 40, 55, 73 e 80 % respectivamente, quando comparado ao controle
negativo. Esta fase diminuiu também o número de fezes líquidas (Tabela 8b).
65
Estes resultados mostram que tanto o extrato quanto a F. AcOEt
produziram efeito antidiarréico em camundongos neste modelo de indução, nas
doses utilizadas, como pode ser observado pela redução no número de fezes
líquidas e o número de fezes totais.
Tabela 8- Efeito da administração oral do EEOH e F. AcOEt de M. rigida ou
loperamida na diarréia induzida por óleo de rícino em camundongos
Tratamento Dose
(mg/kg)
Fezes líquidas
(Média ± d.p)
Fezes totais
(Média ± d.p)
Inibição
(%)
(a) Solução salina 0,9 %
Loperamida
EEOH
-
10
250
500
750
17 ± 2,0
4 ± 1,4**
13 ± 1,9**
3 ± 0,8**
3 ± 0,9**
25 ± 1,9
8 ± 2,4**
17 ± 2,7**
8 ± 1,8**
5 ± 1,2**
68
32
68
80
(b) Solução salina 0,9 % - 9,4 ± 1,1 12,0 ± 1,9
Loperamida 10 0 ± 0,0** 2,4 ± 0,9** 80
F. AcOEt 250 5,2 ± 0,4** 7,2 ± 0,8** 40
500 3,0 ± 0,7** 5,4 ± 0,9** 55
750 2,4 ± 0,9** 3,2 ± 1,1** 73
ANOVA F(4,20) = 79 feses totais e F(4,20) = 91 fezes líquidas para o EEOH; F(4,20)
= 52 para fezes totais e F(4,20) = 101 para fezes líquidas para a F. AcOEt; (P<0,05), seguido do teste de Dunnett, comparados ao controle, **P<0,01.
4.4.2 Trânsito intestinal normal
No modelo de motilidade intestinal em ratos, os resultados da
administração oral de atropina (2 mg/kg) e o EEOH (250, 500 ou 750 mg/kg)
mostram que houve inibição de 25, 24, 35 e 37 %, respectivamente, do
66
percentual da distância percorrida pelo carvão ativado no intestino do rato,
quando comparado ao controle negativo (Tabela 9a).
No modelo de motilidade intestinal, os resultados obtidos para a F.
AcOEt (125, 250 ou 500 mg/kg) e atropina (2 mg/kg) demonstraram que
ocorreu uma inibição significativa da distância percorrida pelo carvão ativado
no intestino do rato, de 23, 33, 37e 37 % respectivamente, quando comparado
ao controle negativo (Tabela 9b).
Estes resultados mostram que tanto o EEOH quanto a F. AcOEt nas
doses utilizadas são capazes de inibir o trânsito intestinal normal de rato e que
isto pode contribuir para o efeito antidiarréico e antiulcerogênico.
Tabela 9- Efeito da administração oral do EEOH e da F. AcOEt de M. rigida ou
atropina no trânsito intestinal de ratos.
Tratamento Dose
(mg/kg)
% de distância
percorrida pelo carvão
(Média ± d.p)
Inibição
(%)
(a) Solução salina 0,9 % - 84 ± 5,9 -
Atropina 2 63 ± 4,9** 25
EEOH 125 64 ± 2,6** 24
250 55 ± 3,9** 35
500 53 ± 3,6** 37
(b) Solução salina 0,9 %
Atropina
F. AcOEt
-
2
125
78 ± 4,5
49 ± 4,4**
60 ± 2,6**
-
37
23
250
500
52 ± 3,5**
49 ± 1,2**
33
37
ANOVA F(4,20) = 47 para o EEOH e F(4,20) =71 par a F. AcOEt; **P<0,01, seguido do teste de Dunnett, comparado ao controle solução salina 0,9 %.
67
4.4.3 Trânsito intestinal induzido por óleo de rícino
Os resultados obtidos para a espécie M. rigida no modelo de trânsito
intestinal induzido por óleo de rícino em ratos, demonstraram que a atropina (2
mg/kg), o EEOH (500 mg/kg) e F. AcOEt (250 mg/kg) inibiram
significantemente a distância percorrida pelo carvão ativado, em 43, 43 e 42 %
respectivamente, quando comparado ao controle negativo (Tabela 10).
Estes resultados, quando comparados aos resultados do experimento de
trânsito intestianal normal, expressos nas tabelas 13 e 14, mostram que tanto o
EEOH quanto a F. AcOEt são efetivos em inibir o trânsito intestinal, sem
diferenças entre os estados normal e induzido por óleo de rícino.
Tabela 10- Efeito da administração oral do EEOH e F. AcOEt de M. rigida ou
atropina no trânsito intestinal induzido por óleo de rícino em ratos.
Tratamento Dose
(mg/kg)
% de distância
percorrida pelo carvão
(Média ± d.p)
Inibição
(%)
Solução salina 0,9 % - 89 ± 4,6 -
Atropina 2 51 ± 3,2** 43
Extrato 500 50 ± 5,1** 43
F. AcOEt 250 52 ± 3,5** 42
ANOVA F(3,20) = 97, (P<0,05), seguido do teste de Dunnett, comparado ao controle negativo, **P<0,01
4.5 Avaliação da atividade antiespasmódica de Maytenus rigida
4.5.1 Efeito do EEOH ou da F. AcOEt sobre as contrações tônicas
induzidas por KCl ou por carbacol em íleo isolado de cobaia
O EEOH (0,1 – 500 µg/mL) relaxou de maneira dependente de
concentração e significante o íleo de cobaia (Figura 10 ) pré-contraído com
68
40 mM de KCl (CE50 = 39,4 ± 12,6 µg/mL) ou com 10–6 M de carbacol
(CE50 = 11,6 ± 2,5 µg/mL). Os valores de CE50 não apresentaram diferença
significante entre si e o Emax (100 %) do EEOH foi atingido na concentração de
81 µg/mL e de 500 µg/mL quando a contração era induzida por carbacol e KCl,
respectivamente (Gráfico 6). A responsividade do íleo aos agentes contráteis
testados foi restaurada entre 45 e 60 min após a retirada do EEOH da cuba.
De maneira semelhante, a F. AcOEt (0,1 – 500 µg/mL) também relaxou
de maneira dependente de concentração e significante o íleo de cobaia
(Figura 11) pré-contraído com 40 mM de KCl (CE50 = 22,0 ± 5,3 µg/mL) ou com
10-6 M de carbacol (CE50 = 16,6 ± 4,4 µg/mL). Não houve diferença significante
entre os valores de CE50 como pode ser observado no Gráfico 7. A
responsividade do íleo aos agentes testados foi restaurada cerca de 40min
após a retirada da F. AcOEt da cuba.
Quando se comparou os valores de CE50 do extrato EEOH e de sua F.
AcOEt frente ao mesmo agente contrátil testado, verificou-se que não houve
diferença significante entre si.
69
A
B
Figura 10 – Registros originais do efeito relaxante do EEOH de M. rigida sobre
as contrações tônicas induzidas por 40 mM de KCl (A) e 10-6 M de carbacol (B)
em íleo isolado de cobaia. As setas representam as concentrações cumulativas
(0,1, 0,3, 1, 3, 9, 27, 81 243 e 500 µg/mL, respectivamente) do EEOH.
70
Gráfico 6 – Efeito do EEOH de M. rigida sobre as contrações tônicas induzidas
por 40 mM KCl (■) ou 10 - 6 M de carbacol (□) em íleo isolado de cobaia
(n = 5). Os símbolos e as barras verticais representam a média e o e.p.m.,
respectivamente.
-1 0 1 2 3
0
25
50
75
100
KCl
CE50 = 39,4 ± 12,6 µg/mL
CCh
CE50 = 11,6 ± 2,5 µg/mL
log [EEtOH] µg/mL
Rel
axam
ento
(%
)
71
A
Figura 11 – Registros originais do efeito relaxante da F. AcOEt de M. rigida
sobre as contrações tônicas induzidas por 40 mM de KCl (A) e 10-6 M de
carbacol (B) em íleo isolado de cobaia. As setas representam as concentrações
cumulativas (0,1, 0,3, 1, 3, 9, 27, 81 243 e 500 µg/mL, respectivamente) da F.
AcOEt.
72
Gráfico 7 – Efeito da F. AcOEt de M. rigida sobre as contrações tônicas
induzidas por 40 mM KCl (▲) ou 10 - 6 M de carbacol (∆) em íleo isolado de
cobaia (n = 5). Os símbolos e as barras verticais representam a média e o
e.p.m., respectivamente.
-1 0 1 2 3
0
25
50
75
100
KClCE50 = 22,0 ± 5,3 µg/mL
CChCE50 = 16,6 ± 4,4 µg/mL
log [Fase AcOEt] µg/mL
Rel
axam
ento
(%
)
73
5 DISCUSSÃO
No presente trabalho avaliou-se a atividade antiulcerogênica,
antidiarréica e antiespasmódica do extrato etanólico bruto (EEOH) e de sua
fase Acetato de Etila (AcOEt) obtidos da entrecasca do caule de Maytenus
rigida Mart. utilizando-se para isso abordagens in vivo e in vitro em modelos
animais. Os resultados mais relevantes deste estudo é a demonstração pela
primeira vez de que M. rigida apresenta atividade antiulcerogênica frente aos
modelos que mimetizam a úlcera no homem e que esta atividade
gastroprotetora está relacionada ao aumento da liberação de muco, a
participação de óxido nítrico e de grupamentos sulfidrila, além da ação
antidiarréica, antimotilidade e antiespasmódica.
A úlcera péptica é uma doença que resulta do desequilíbrio entre os
fatores agressivos (primariamente ácido gástrico e pepsina) e os fatores de
defesa da mucosa (PGs, fluxo sanguíneo mucosal e substâncias antioxidantes)
(KONTUREK, 2005). Atinge cerca de 5 % da população mundial, sendo mais
freqüente nos países orientais. Nos países em desenvolvimento, cerca de 10 a
15 % dos homens e de 4 a 15 % das mulheres são acometidos desta doença.
No Brasil não há números oficiais, mas estima-se que 10 % da população tem,
tiveram ou terão úlcera péptica (BANDYOPADHYAY et al., 2001; PRADOS;
MIQUEL, 2004; YUAN; PADOL; HUNT, 2006).
A abordagem terapêutica da úlcera péptica envolve o uso de agentes
que possam restaurar o equilíbrio existente na mucosa gástrica. Assim, a
terapia da úlcera péptica se baseia na supressão da secreção ácida gástrica
com os agentes anti-secretórios (antiácidos, antagonistas do receptor H2 da
histamina e inibidores da bomba de prótons) ou no aumento da produção e/ou
liberação de fatores protetores com os agentes citoprotetores (sucralfato,
misoprostol e quelato de bismuto) ou ainda na erradicação da H. pylori com
antibióticos (UMAMAHESWARI et al., 2006; CHOI et al., 2007). Atualmente, os
métodos endoscópicos controlam em 83 a 93 % dos sangramentos das úlceras
hemorrágicas. Porém, ocorre falha na hemostasia endoscópica, caracterizada
pela recidiva hemorrágica, devendo-se indicar tratamento operatório
(PARREIRA et al., 2002).
74
Apesar dessas intervenções terapêuticas e cirúrgicas serem
consideradas rápidas e eficazes no tratamento da úlcera péptica, há problemas
na utilização destes tratamentos que precisam ser contornadas a exemplo dos
antagonistas H2 que induzem rápida tolerância durante o tratamento e pode
ocorrer efeito rebote após a retirada da droga (CHOI, et al., 2007). Assim, não
existe no mercado fármaco antiulcerogênicos que apresentem 100 % de
eficácia, que impeçam recidivas das lesões ulcerativas e apresentem ausência
de efeitos colaterais. Com isso, se faz necessário a pesquisa de novas
alternativas terapêuticas para o tratamento da úlcera gástrica, principalmente a
partir de produtos naturais.
Entre os vários gêneros que vem despertando grande interesse na
comunidade científica, está o gênero Maytenus, com várias espécies
empregadas na medicina popular para tratar distúrbios gastrintestinais
(CARRICONDE, 2004). A M. ilicifolia é a principal espécie da família
Celastraceae usada para o tratamento da úlcera gástrica. Porém, devido ao
uso indiscriminado no Brasil esta planta está entrando para a lista das espécies
em extinção (NIERO et al., 2001). Faz-se necessário então, se buscar
comprovação de outras espécies que são utilizadas como antiulcerogênicas
que possam servir de alternativa à utilização de M. ilicifolia.
Considerando que não há relato de estudos farmacológicos em relação
a ação antiulcerogênica desta espécie e que a mesma apresenta compostos
potencialmente ativos, a espécie vegetal M. rigida foi selecionada pelo critério
etnofarmacológico e quimiotaxonômico (presença de flavonóides) para a
investigação farmacológica quanto à sua atividade antiulcerogênica nos
modelos de indução aguda de úlcera gástrica, que mais se assemelham às
úlceras gástricas que acometem o homem, buscando a comprovação científica
de sua utilização como antiulcerogênica já consagrada pela população.
Segundo Almeida et al., (2005) esta espécie é rica em triterpenos,
quinonas e flavonóides. Os triterpenos são produzidos pelas plantas para atrair
polinizadores, inibir a germinação e impedir a perda de água. Apresentam
atividades antiespasmódica, cardiovascular, anestésica local, anti-séptica,
antiinflamatória e antitumoral (SIMÕES; SPITZER, 2002). As quinonas
apresentam atividade laxante, antibacterina, antifúngica e antiespasmódica
(BRUNETON, 1991). Os flavonóides são compostos polifenólicos sintetizados a
75
partir do aminoácido fenilalanina, conferem as colorações naturais das plantas
e possuem diversos efeitos bioativos considerados importantes para a saúde
humana (DI CARLO et al., 1999). Apresentam atividades: antineoplásica,
antimutagênica, hepatoprotetora, antiinflamatória, analgésica, antidiabética,
anti-histamínica, antidiarréica, antiespasmódica e gastroprotetora (DI CARLO et
al., 1999; CARVALHO et al., 2002; ZUANAZZI; MONTANHA, 2000).
O efeito gastroprotetor de alguns flavonóides pode ser mediado pela
secreção de muco e bicarbonato, aumento das PGs endógena, inibição das
bombas H+/K+ATPases das células parietais impedindo a secreção ácida,
“varredura” de radicais livres e inibição de mediadores inflamatórios como
leucotrienos e óxido nítrico (DI CARLO et al., 1999; PARK et al., 2004;
ZAYACHKIVSKA et al., 2005).
Os flavonóides isolados da F. AcOEt obtida de M. rigida, a epicatequina
e 4-metilepigalocatequina (ESTEVAM, 2006), apresentam atividade
antioxidante (DAVID et al., 2002) e antiagregante plaquetária (NEIVA et al.,
2003).
Como parte do estudo farmacológico, o EEOH obtido de M. rigida foi
inicialmente avaliado quanto à toxicidade em camundongos de ambos os
sexos, onde foram observados parâmetros comportamentais e o número de
morte dos animais tratados com o extrato, com a finalidade de determinar a
dose letal 50 % (DL50).
A ausência de alterações significativas nos parâmetros analisados e por
não ter havido morte dos animais, demonstra baixa toxicidade desta espécie
vegetal nas condições e doses avaliadas o que impossibilitou a determinação
da DL50.
Segundo Souza Brito (1994) geralmente os extratos brutos vegetais e
seus derivados são testados até a dose de 1000 mg/kg em triagens
farmacológicas. Assim, neste estudo essa dose máxima foi estabelecida
conforme a presença da atividade antiulcerogênica, sendo selecionadas as
doses de 250, 500 e 750 mg/kg do EEOH.
Assim, passou-se a investigar a atividade antiulcerogênica do extrato
etanólico e da fase acetato de etila obtidos da entrecasca do caule de M. rigida.
Esta fase foi escolhida por ser rica em compostos fenólicos como flavonóides
(STEVAM, 2006).
76
O modelo de úlcera induzido por etanol tem sido amplamente utilizado
na triagem de atividade gastroprotetora. As lesões hemorrágicas gástricas
produzidas pelo etanol ocorrem por mecanismos variados, como o efeito tóxico
direto reduzindo a produção de muco e secreção de bicarbonato
(MARHUENDA; MARTIN; LASTRA, 1993), ativação da via da 5-lipoxigenase,
além de diminuir o fluxo sanguíneo, promover superprodução de radicais livres
que levam a peroxidação lipídica (desestabilização da membrana). Estes dois
últimos fatores causam danos na membrana celular, esfoliação, erosão epitelial
e morte celular (BIRDANE et al., 2007).
O etanol absoluto causa necrose das células superficiais da mucosa por
precipitar seus constituintes citoplasmáticos e romper a membrana celular.
Promove perturbação dos mastócitos que liberam mediadores vasoativos como
o leucotrieno C4 (LTC4) e histamina. Estes mediadores por sua vez causam
venoconstrição ao mesmo tempo em que a histamina provoca dilatação
arterial. Estes dois eventos causam hiperemia, que em conjunto com o
aumento da permeabilidade produzida por histamina e LTC4, provocam edema
mucosal. Quando o venoespasmo é muito violento, rompe as veias mucosais e
ocorre então a hemorragia (OATES; HAKKINEN, 1988).
A ingestão crônica ou aguda do etanol causa dano na mucosa gástrica,
que pode estar também associado com a geração de EROs, os quais
produzem um desequilíbrio entre o processo oxidante e antioxidante da célula,
com consequente peroxidação lipídica associada a depleção de componentes
dos sistemas antioxidantes enzimático como a superóxido desmutase (SOD),
glutationa peroxidase (GPx) e glutationa S-transferase (GST) e não enzimático
como a glutationa reduzida (GSH) (HIROKAWA et al., 1998; REPETTO;
LLESUY, 2002).
Após a absorção pelo estômago e a parte superior do intestino, o etanol
é rapidamente transportado para outros órgãos, inclusive para o trato digestivo.
O etanol é então oxidado a acetaldeído pela flora intestinal normal e pelo
fígado, resultando em elavadas concentrações deste metabólito que é volátil e
altamente tóxico. O acetaldeido forma complexo com a glutationa, diminuindo a
disponibilidade deste antioxidante, favorecendo a peroxidação lipídica
(SALASPURO, 2003).
77
Os resultados obtidos neste modelo agudo de indução mostraram que
tanto o EEOH como a F. AcOEt foram capazes de proteger a mucosa gástrica
contra as lesões induzidas por etanol em ratos assim como o extrato também
foi efetivo no modelo de HCl/etanol em camundongos, mostrando um possível
efeito antiulcerogênico da planta investigada.
Como o modelo de etanol é inespecífico, ou seja, essa proteção pode
estar relacionada a fatores anti-secretores ou citoprotetores da mucosa gástrica
(MORIMOTO et al., 1991), passou-se a investigar o modelo de úlcera induzido
por estresse (imobilização e frio), que aponta para um mecanismo anti-
secretório.
O estresse como fator etiológico pode ajudar a explicar a crescente
tendência ao desenvolvimento e complicações da úlcera gástrica. A incidência
de úlcera provocada por estresse tem aumentado pela urbanização da
sociedade, em períodos de grandes movimentos de massa realizados pela
população, em treinamentos militares, além do uso de anticoagulantes e de
altas doses de corticosteróides e prolongadas hospitalização em unidades de
terapia intensiva (BHATIA; TANDON, 2005; METZ, 2005).
Existem vários modelos animais de lesão gástrica induzida por estresse,
como: imobilização, baixas temperaturas, ruídos, nado forçado, radiação,
cirurgias abdominais e cranianas, exposição ao éter e choque (TACHÉ et al.,
2001), mas o modelo mais amplamente utilizado é o que utiliza como agente
agressor a imobilização dos animais a baixas temperaturas (GLAVIN; SZABO,
1992).
O estresse por imobilização e frio é responsável por alterações no SNC,
causando aumento na secreção e motilidade gástrica dependente do nervo
vago e mediado pela liberação do homônio liberador de tirotropina (TRH). Este
hormônio em associação com a dimunuição da tempertaura corporal durante o
estresse, promove liberação do hormônio estimulante da tireóide (TSH)
(TAKEUCHI et al., 1999; TANAKA et al., 2007). Esta atividade vagal quando
exacerbada tem sido sugerida por Goa e Monk (1987) como fator primordial na
ulceração induzida por estresse, uma vez que pode ser parcial ou totalmente
prevenida por vagotomia.
O estresse estimula o sistema nervoso tanto simpático como o
parassimpático no estômago. Esta estimulação é responsável pelo aumento da
78
motilidade com conseqüente aumento da contração do músculo gastrintestinal,
levando a compressão muscular e isquemia mucosal. A estimulação simpática
causa diretamente vasoconstrição arteriolar, com redução significativa do fluxo
sanguíneo, promovendo hipóxia local e isquemia, que gera EROs, peroxidação
lipídica e depleção do conteúdo de glutationa (GUTH; PAULSEN; NAGATA,
1984; BANDYOPADHYAY et al., 2001).
O estresse também aumenta a secreção de ácido e reduz a produção de
muco mediado pela liberação de histamina, aumenta a liberação de radicais
livres, acúmulo de peróxido de hidrogênio que inativa a síntese de PGs e
também favorece a geração de outras EROs (HIRUMA-LIMA et al., 2006).
Estes eventos em combinação exercem papel fundamental na ulceração
gástrica induzida por estresse.
O EEOH e a F. AcOEt de M. rigida foram capazes de inibir o
desenvolvimento das úlceras induzidas por imobilização e frio a exemplo do
lansoprazol. Como no modelo de estresse há um aumento na secreção de
ácido, inibição da secreção de muco e bicarbonato (pela estimulação da via
histaminérgica e pela inibição da ação das PGs), além do aumento na
produção de radicais livres, é possível sugerir que o EEOH e a fase
apresentem atividade antiulcerogênica por mecanismos anti-secretório,
citoprotetor e/ou antioxidante.
Com base nos resultados obtidos, passamos a investigar um modelo
mais específico relacionado com a citoproteção que é o modelo de
antiinflamatório não esteroidal, utilizando para isto EEOH (250, 500 e 750
mg/kg) e F. AcOEt (125, 250 e 500 mg/kg) obtidos de M. rigida em
camundongos.
Os AINEs causam danos na mucosa gástrica tanto no homem como em
animais experimentais, sendo que no homem está associado à administração
crônica destas drogas que provocam efeitos adversos como úlcera gástrica e
duodenal, podendo levar a hemorragia ou perfuração (WALLACE, 2001).
O mecanismo patogênico dessas lesões envolve inúmeros fatores,
sendo freqüentemente atribuído a inibição da biossíntese das PGs
gastroprotetoras, o que acarreta uma superprodução de leucotrienos e outros
produtos da via da 5-lipoxigenase, além de ativação/infiltração de neutrófilos,
distúrbios microcirculatórios, hipermotilidade gastrintestinal e aumento da
79
secreção de ácido luminal, além da ação local destas drogas (SUZUKI et al.,
2000; SCHUBERT, 2006). Os neutrófilos são recrutados para o local da
inflamação por quimiotaxia e participam da amplificação da resposta
inflamatória, promovendo a extensão do dano causado por AINEs e não
participa do início da lesão. A hipermotilidade gástrica é o mais importante
evento no início das lesões produzidas por estes agentes (SUZUKI et al.,
2000).
Os AINEs ao inibirem a síntese das PGs, muda o esvaziamento gástrico
pós-prandial e inibe as contrações migratórias interdigestivas (CMIs) no jejum
que culminam com a retenção de fatores que promovem a injúria gástrica
(NARITA et al, 2006).
Quando em contato direto com a mucosa, os AINEs se dissociam
formando altas concentrações de íons ácidos orgânicos fracos, que quebram o
gradiente de íons hidrogênio entre o lume gástrico e o tecido da mucosa. A
interação entre o lume gástrico e o tecido da mucosa é essencial tanto para
continuidade epitelial, como para manutenção da sua integridade. Os AINEs
causam desestruturação da barreira protetora de muco-bicarbonato e da
membrana das células epiteliais provocando retrodifusão de ácido,
desequilíbrio iônico, formação de radicais livres e morte celular. Esta ação local
sugere que danos na barreira superficial são resultados do contato dos AINEs
com o tecido da mucosa além do reflexo de uma resposta bioquímica e
farmacológica, como a inibição da COX (WALLACE; BELL, 1996;
LICHTENBERGER, 2001).
Os AINEs alteram as propriedades hidrofóbicas da superfície da mucosa
gastrintestinal, tornando-a mais susceptível a injúria, mesmo quando
administrados por via parenteral, sugerindo que o dano local pode não ser o
principal mecanismo da toxicidade gastroduodenal produzida por esta classe
de droga. Esta alteração na hidrofobicidade pode persistir por até 24 horas
devido a circulação enterohepática sofrida pelos AINEs (LUGEA et al., 1997).
Muitos AINEs como o piroxicam são ácidos fracos que se concentram no
interior da células gástricas cujo pH é baixo. Estudos in vitro e in vivo têm
mostrado que os AINEs ou aumentam a secreção basal de ácido ou
80
potencializam a secreção estimulada por vários agentes como a histamina
(SCHUBERT, 2006).
Neste modelo o EEOH e a F. AcOEt obtidos de M. rigida, também
mostraram efeito gastroprotetor ao inibir a formação das úlceras induzidas por
piroxicam. Mesmo não sendo este um modelo de indução muito específico,
uma vez que envolve além do mecanismo citoprotetor clássico inibidor da
síntese de prostaglandina, envolve mecanismos anti-secretórios e
antioxidadantes, é possível sugerir um efeito citoprotetor do extrato e da fase.
Com base nestes dados, pode-se concluir parcialmente que o EEOH e
fase AcEOt obtido de M. rigida, inibiram as ulcerações gástricas produzidas
pelos agentes lesivos utilizados nos modelos agudos de úlcera e que pode
estar relacionado tanto a inibição da secreção ácida gástrica, aumento dos
mecanismos de proteção da mucosa, bem como pela ação antioxidante.
Estes resultados são semelhantes aos obtidos com outras espécies de
Maytenus, a exemplo de M. ilicifolia (SOUZA-FORMIGONI et al, 1991; JORGE
et al, 2004; BAGGIO et al., 2007), M. truncata (SILVA et al., 2005), M.
aquifolium (SOUZA-FORMIGONI et al, 1991; BERSANI-AMADO et al., 2000;
GONZALEZ et al., 2001), M. robusta (ANDRADE et al., 2007).
Analisando a proteção promovida tanto pelo EEOH quanto pela fase
AcEOt obtidos de M. rigida nos modelos de indução aguda de úlcera gástrica
que avaliam a existência de possível atividade antiulcerogênica e utilizando o
teste estatístico de Tukey que faz a comparação de todos os grupos entre si,
foi observado que os grupos tratados com as doses de 500 e 750 mg/kg de
EEOH não apresentaram diferenças significativas entre si; o mesmo foi
observado com as doses de 250 e 500 mg/kg da F. AcOEt, o que permitiu
definir a dose de 500 mg/kg para o EEOH e de 250 mg/kg para a F. AcOEt
como as melhores doses, que passaram a ser utilizadas na determinação do
mecanismo de ação.
O ácido gástrico é um importante fator para a gênese da ulceração em
ratos com ligadura do piloro (SHAY et al.,1945). Segundo Baggio et al., (2003)
a ligadura do piloro promove hipersecreção gástrica devido ao reflexo vago-
vagal promovido pelo estímulo dos mecanorreceptores presentes na mucosa
antral e a distensão gástrica produzida pelo acúmulo de secreção parece
influenciar ainda mais a secreção ácida, possivelmente pelo aumento na
81
liberação de hormônios gastrintestinais. Neste modelo as úlceras ocorrem
também devido a autodigestão da mucosa gástrica e rompimento da barreira
de muco gástrico (SAIRAM et al., 2002). É um modelo que mostra possíveis
alterações nos parâmetros bioquímicos do conteúdo gástrico (TOMA et al.,
2004) como pH, acidez total e volume gástrico, podendo ser considerada como
atividade anti-secretória as substâncias que afetam a acidez gástrica.
No entanto, a administração do EEOH e F. AcOEt por via intraduodenal
não produziu alterações significativas em nenhum dos parâmetros avaliados,
diferente da cimetidina, o que sugeri portanto, que ambos EEOH e F. AcOEt
não apresentaram atividade sistêmica quando administrados pela via
selecionada. Porém, a atividade anti-secretória de M. rigida não pode ser
totalmente descartada, uma vez que esta amostra vegetal não foi avaliada
nesse modelo por via oral e não foram determinados os níveis dos hormônios
gastrina e somatostatina que são fortes indicadores de atividade anti-
secretória.
No modelo de ligadura do piloro, os resultados diferem daqueles
apresentados pela fração rica em flavonóides de M. robusta, que apresentou
redução do volume gástrico e da acidez total e aumento do pH gástrico
(ANDRADE et al., 2007).
Na seqüência, avaliamos o potencial de cura da espécie em estudo, ou
seja, a capacidade de acelerar o processo de cicatrização da úlcera induzida
por ácido acético 30 %. Este modelo em ratos introduzido por Takagi, Okabe;
Saziki (1969) se assemelha à úlcera crônica humana em termos de
características patológicas e mecanismo de cicatrização, responde bem a
várias drogas antiulcerogênicas como inibidores de bomba, sucralfato e fatores
de crescimento, além de ocorrer recidiva espontânea como em pacientes com
úlcera péptica (OKABE, AMAGASE, 2005).
O ácido acético promove a formação de úlcera de natureza perfurativa
devido a liberação de histamina, que aumenta a permeabilidade capilar e a
retrodifusão de ácido gástrico (TAKAGI, OKABE; SAZIKI, 1969;
UMAMAHESWARI et al., 2006).
Histologicamente a úlcera é formada por duas estruturas principais, a
margem da úlcera formada pela mucosa não necrótica, em que as glândulas
tornam-se dilatadas e suas células sofrem diferenciação, expressam receptores
82
para o fator de crescimento epidermal e proliferam ativamente e a base da
úlcera formada por tecido de granulação que se desenvolve após 48 - 72 horas
após a ulceração. O tecido de granulação é formado de células do tecido
conectivo (macrófagos, fibroblastos e células endoteliais) (TARNAWSKI, 2005).
A cicatrização da úlcera é um processo complexo que envolve migração
celular, proliferação, reepitelização, angiogênese e deposição da matrix. Todos
estes eventos são controlados por fatores de crescimento, fatores de
transcrição e citocinas e culminam com a formação de escaras (TARNAWSKI,
2005). Estes processos são acompanhados por aumento do fluxo sanguíneo
na área lesada, aumento nos níveis de gastrina plasmática e de citocinas pró-
inflamatórias como o fator de necrose tumoral alfa e interleucina-1 beta
(BRZOZOWSKI, 2003), que são regulados pelos fatores de crescimento, em
especial o fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF). A angiogênese
no tecido de granulação na base da úlcera e a replicação das células epiteliais
na margem da úlcera restabelecem a arquitetura glandular (WALLACE, 2005),
como também restauram a lâmina própria (MILANI; CALABRO, 2001; SHIN et
al., 2002; TSUJI et al., 2002). A medida que a úlcera vai sendo cicatrizada,
ocorre uma redução desses fatores (BRZOZOWSKI; KONTUREK;
KONTUREK, 2001).
O NO endógeno acelera a cicatrização da úlcera por manter o fluxo
sanguineo próximo à área lesada e aumentar a angiogênese. Quando gerado
pela iNOS o NO pode ter efeito benéfico na cicatrização da úlcera por induzir
apoptose das células inflamatórias (BRZOZOWSKI, 2003; OKABE, AMAGASE,
2005). No entanto, Guo et al., (2003) mostraram que a ativação da enzima
iNOS pode contribuir para a inflamação durante a formação da úlcera,
enquanto que as enzimas HO-1 (enzima que metaboliza grupos heme a
biliverdina, monóxido de carbono e ferro) e COX-2 quando ativadas podem
promover cicatrização com resolução da inflamação e remodelagem do tecido
ulcerado.
A secreção de muco e bicarbonato, que pode ser aumentado tanto por
PGs quanto por NO, também é importante no processo de cicatrização da
úlcera, uma vez que a camada formada por muco e bicarbonato protege as
células recém formadas da ação do ácido gástrico (TARNAWSKI et al, 1995;
LIMA et al, 2006).
83
O modelo de úlcera induzida por ácido acético em rato também serve de
suporte para monitorar a evolução do peso corporal em animais submetidos a
diferentes tratamentos, além de ser um indicador da possível presença de
toxicidade subaguda após 14 dias de tratamento em relação a parâmetro como
peso relativo de órgãos vitais (CALVO et al., 2007).
No experimento de úlcera induzida por ácido acético 30 %, a fase AcEOt
e cimetidina foram capazes de acelerar a cicatrização da úlcera gástrica
crônica em ratos. Resultados semelhantes também foram observados por
Baggio et al., (2007) para M. ilicifolia.
Os animais também não apresentaram diferenças significativas em
relação ao ganho de peso corporal, nem ao peso relativo dos órgãos vitais
como coração, fígado, baço e rins, em relação ao grupo controle. Esses dados
em conjunto com os obtidos na triagem comportamental, indicam a baixa
toxicidade da espécie M. rigida.
Na pespectiva de compreender os mecanismos envolvidos na ação
antiulcerogênica do EEOH e F. AcOEt obtidos da entrecasca do caule de M.
rigida passou-se a investigar modelos experimentais que envolva a
participação de muco, PGs, NO e grupos sulfidrila (SHs).
O muco gástrico é um importante fator protetor da mucosa gástrica e
consiste de glicoproteínas semelhantes às mucinas, que podem ser detectadas
pela quantidade de alciam blue ligado a elas (BOLTON; PALMER; COHEN,
1978). O muco pode ser encontrado aderido à mucosa gástrica (também
conhecido como muco insolúvel) ou muco livre (também conhecido como muco
solúvel).
A propriedade protetora da barreira de muco não depende somente da
estrutura de gel, mas também da quantidade ou da espessura da camada de
muco que recobre a superfície mucosal (PENISSI; PIEZZI, 1999).
Tanto PGE2 quanto NO são responsáveis pela produção e liberação de
muco das células epiteliais e células do colo das glândulas gástricas, e os
compostos sulfidrílicos são responsáveis por manterem a estabilidade do muco
ao formar pontes de dissulfeto com suas subunidades (AVILA et al., 1996;
CHANDRANATH, BASTAK; SINGH, 2002; KUSHIMA et al., 2005).
No experimento no qual o conteúdo de muco aderido à mucosa foi
usado como indicador da secreção de muco, os resultados mostram que o
84
tratamento dos animais com a fase AcEOt (250 mg/kg), aumentou
significativamente o conteúdo de muco gástrico, sugerindo que o efeito desta
fase é mediado pelo aumento da secreção de muco.
As PGs, principalmente a PGE2, exercem importante papel na proteção
da mucosa gástrica contra vários agentes necrotizantes. Ela fortalece a barreira
mucosal ao aumentar a produção de muco e secreção de bicarbonato,
melhorar a circulação, diminuir a difusão de ácido, aumentar os níveis de
fosfolipídeos na superfície epitelial (que aumenta a hidrofobicidade mucosal),
inibir a formação de radicais livres e liberação de enzimas pelos neutrófilos,
diminuir a motilidade, além de inibir apoptose (HOSHINO et al, 2003; LIMA et
al, 2006; CHOI et al., 2007).
A síntese da PGE2, a partir do ácido araquidônico, pela ação das
enzimas COX-1 e COX-2 é estimulada nas células da mucosa gástrica na
presença de substâncias biologicamente ativas como citocinas, NO e ACh
(OHNISHI et al., 2001; GUDIS; SAKAMOTO, 2005).
As PGs derivadas da COX-2 induzem a produção do fator de
crescimento do hepatócito (HGF), fator de crescimento do endotélio vascular
(VEGF) (envolvido na angiogênese) e fator de crescimento epidérmico (EGF)
(envolvido na proliferação celular) que estão envolvidos nos processos de
reparo da úlcera dependente (GUDIS, SAKAMOTO, 2005).
O efeito biológico das PGs, é mediado por receptores de membranas
específicos, denominados receptores EP1, EP2, EP3 e EP4, que são acoplados
a proteínas-G de membrana, porém com diferentes vias de transdução de sinal
intracelular (SUGIMOTO; NARUMIYA; ICHIKAWA, 2000). A ativação do
receptor EP1 resulta na liberação intracelular de IP3 e DAG ativando a via do
Ca2+, enquanto que ligantes de EP2 e EP4, ativam o sistema ciclase de adenilil-
AMPc e ligantes EP3 inibem esse sistema (PAWLIK et al., 2002).
A capacidade das PGs de impedir o aparecimento das lesões
produzidas por AINEs é funcionalmente relacionada a inibição da motilidade,
que atenua os distúrbios microcirculatórios devido a contração do estômago
(SUZUKI et al., 2000).
A ação preventiva das PGs derivadas da COX-2 no local da inflamação
contra a ação de agentes necrotizantes é conhecida como citoproteção
(GUDIS, SAKAMOTO, 2005; LIMA et al, 2006; CHOI et al., 2007) e a inibição
85
da biossíntese das PGs por indometacina e outros AINEs relacionados
suprime este efeito (GRETZER et al, 1998).
Com base nessas informações passou-se a investigar a participação da
PGE2 na produção de muco promovido por M. rigida. Os resultados obtidos
demonstram que a F. AcOEt não promoveu aumento na produção de PGE2
quando comparada ao seu respectivo controle o que indica que o aumento do
muco produzido pela fase independe do aumento da síntese de PGs, o que
sugeri o envolvimento de outra via que não a das PGs.
Assim, passou-se a investigar o envolvimento do óxido nítrico no
aumento da produção de muco, uma vez que o NO em seu mecanismo
gastroprotetor também é capaz de aumentar a produção e liberação do muco.
O NO liberado das células endoteliais e células neuronais está envolvido
na manutenção da integridade da mucosa gástrica, pois mantém o fluxo
sanguíneo que é fundamental para a proteção da mucosa (MARTIN; JIMÉNEZ;
MOTILVA, 2001; GUO et al., 2003). Além disso, promove inibição da adesão e
migração de leucócitos, atua como seqüestrador de radicais livres, inibe a
secreção de ácido, promove secreção de muco, promove reparo tecidual e
inibe a agregação plaquetária (WALLACE; GRANGER, 1996; MARTIN;
JIMÉNEZ; MOLTIVA, 2001; GUO et al., 2003). O NO também está envolvido
na regulação do peristaltismo intestinal, do esvaziamento gástrico e na
atividade motora antral além de participar do processo de cicatrização da
úlcera gástrica (GUO et al., 2003).
A inibição da síntese do NO por L-NAME, promove diminuição do fluxo
sanguíneo mucosal, indicando que o NO diminui a lesão induzida por etanol
pela regulação da microcirculação (MATSUDA et al., 1999).
Assim para averiguar o envolvimento do óxido nítrico no mecanismo
protetor da mucosa do EEOH e F. AcOEt obtidos de M. rigida, foi realizado o
modelo agudo de úlcera induzida por etanol em ratos pré-tratados com N-nitro-
L-arginina-metil-ester (L-NAME) uma droga bloqueadora da síntese do NO, em
que foi observado que a proteção produzida pelo extrato e fase foi revertida
pela administração prévia de L-NAME. Portanto, pode-se sugerir que M. rigida
promove citoproteção depedente das ações do NO, possivelmente por
aumentar a produção de muco.
86
Na seqüência passou-se a investigar a participação dos grupos sulfidrila
na citoproteção produzida por M. rigida.
Os organismos aeróbios são protegidos da ação de ROS por meio de
sistemas antioxidantes como as enzimas superóxido desmutase, glutationa
peroxidase e catalase, e sistemas antioxidantes não enzimáticos a exemplo do
β-caroteno, a vitamina C e compostos sulfidrila como a glutationa (BIRDANE et
al., 2007).
Antioxidantes sintéticos são extensivamente utilizados como aditivos
alimentares e são consumidos em quantidades apreciáveis, porém problemas
de toxicidade têm sido cada vez mais constantes com a utilização destes
agentes, o que tem aumentado o interesse no desenvolvimento de
antioxidantes naturais (REPETTO; LLESUY, 2002).
A GSH é o tiol não protéico mais abundante nas células dos mamíferos,
sendo considerada como o mais importante composto sulfidrila intracelular,
estando envolvido em muitos processos funcionais, celulares e principalmente
quanto a sua participação em algumas reações de detoxicação (JORDÃO
JÚNIOR et al., 1998).
Os grupos sulfidrílicos são classificados em proteicos (composto de
peptídeos de baixo peso molecular como a glutationa na sua forma reduzida –
GSH) e não protéicos (composto das proteínas de alto peso molecular, como a
glutationa complexada a albumina) (FAURE; LAFOND, 1995; JORDÃO
JÚNIOR et al., 1998).
A glutationa funciona como seqüestrador nucleofílico e como co-fator na
redução do peróxido de hidrogênio mediado pela enzima glutationa-peroxidase
sendo, portanto, antioxidante endógeno. É oxidada a glutationa dissulfeto ao
doar elétrons para a glutationa peroxidase e/ou reagir diretamente com as
ROS, que podem subseqüentemente reduzir os níveis de GSH (BIRDANE et
al., 2007).
A GSH protege a mucosa gástrica do estresse oxidativo induzido por
etanol ao se ligar aos radicais livres que são formados após a injúria tecidual
por este agente nocivo. O etanol quebra as pontes de sulfetos que unem as
subunidades de muco tornando o muco solúvel em água, reduzindo assim seu
efeito protetor (KUSHIMA et al., 2005).
87
O possível envolvimento de compostos sulfidrila endógenos no efeito
gastroprotetor de M. rigida foi investigado no modelo de úlcera induzido por
etanol, em que os animais foram pré-tratados com NEM (bloqueador de
sulfidrila) antes da administração do agente lesivo. Tanto o EEOH quanto a F.
AcOEt tiveram seus efeitos protetores da mucosa gástrica reduzidos quando
comparados aos grupos que foram pré-tratados com solução salina 0,9 %,
indicando a participação de SHs endógenos no efeito gastroprotetor da espécie
em estudo. Este resultado difere do encontrado para a fração rica em
flavonóides de M. ilicifolia (BAGGIO et al., 2007).
Com base nos dados apresentados, podemos sugerir que M. rigida
promove citoproteção ao aumentar o conteúdo de muco gástrico e que este
aumento está relacionado a participação do NO e grupamentos sulfidrila,
porém, independente de prostaglandina. É possível que os flavonóides
presentes em M. rigida, especialmente na F. AcOEt sejam, pelo menos em
parte, responsáveis pela atividade citoprotetora desta espécie, uma vez que os
flavonóides possuem propriedades anti-oxidantes, além de reforçar o sistema
de defesa da mucosa gástrica através do estímulo da secreção muco (MARTIN
et al., 1994; ANIAGU et al., 2005).
Como não podemos descartar o possível efeito do extrato e fase sobre
outros mediadores que contribuem para a ulceração e ou proteção da mucosa
gástrica, novos experimentos para melhor caracterizar os mecanismos
envolvidos na gastroproteção de M. rigida deverão ser realizados.
Em geral drogas que apresentam atividade antiinflamatória também
apresentam a propriedade de inibir a diarréia induzida por óleo de rícino,
sugerindo o envolvimento das PGs (AWOUTERS et al., 1978) e/ou do NO
(MASCOLO et al., 1994) no seu mecanismo.
Nessa pespectiva e considerando que M. rigida apresenta indicação
popular no tratamento de distúrbios gastrintestinais (CARRICONDE, 2004) e
apresentou ação antiinflamatória no modelo edema de pata induzida por
carragenina (SANTOS et al, 2007), passou-se a investigar o possível efeito do
EEOH e F. AcOEt obtidos de M. rigida sobre o intestino pelos modelos de
diarréia induzida por óleo de rícino e do modelo de motilidade intestinal.
A diarréia resulta de anormalidades funcionais do tubo digestivo, que
produzam redução da absorção ou aumento da secreção de água e eletrólitos
88
(OLIVEIRA, 2003). É tida como a passagem do conteúdo intestinal não
formado a uma taxa diária correspondente ao dobro de uma pessoa normal.
Para restaurar este processo, muitos pacientes necessitam de terapia
antidiarréica, que objetiva aumentar a resistência ao fluxo e aumentar a
absorção mucosal e diminuir a secreção (AKINDELE; ADEYEMI, 2006).
O óleo de rícino, extraído das sementes de Ricinus communis quando
ingerido é hidrolisado pelas lípases pancreáticas a glicerol e ácido ricinoléico,
sendo este último o responsável pela atividade diarréica do óleo (AKINDELE;
ADEYEMI, 2006).
Vários mecanismos têm sido propostos para a diarréia induzida por óleo
de rícino, nos quais podemos citar a inibição da atividade da enzima Na+, K+-
ATPase intestinal, o que reduz a absorção de fluidos normais; ativação da
adenilato ciclase com conseqüente aumento de AMPc mucosal o qual medeia
o acúmulo de secreção no intestino delgado e cólon e afeta a contratilidade do
músculo liso intestinal; estimulação da síntese de PGs que por sua vez inibe
reabsorção de NaCl e água; além da estimulação da secreção do fator de
ativação plaquetário (ROUF et al., 2007; AFROZ et al., 2006). Mascolo et al.
(1994) descreveram o envolvimento também do NO ao observarem que
inibidores da sintase do NO impedem a diarréia induzida por óleo de rícino em
ratos. Uchida et al. (2000) citam que o NO está implicado na ativação
colinérgica da secreção de água.
Para determinarmos o efeito antidiarréico do EEOH e F. AcOEt de M.
rigida, foi utilizado o teste com óleo de rícino, que é amplamente empregada
para o “screen” de drogas com esta propriedade. Uma das vantagens deste
modelo é a grande reprodutibilidade de evacuação de fezes não formadas duas
horas após a administração laxante (BORRELLI, et al., 2006).
O EEOH e F. AcOEt foram capazes de inibir a diarréia neste modelo,
podendo esta inibição ser pelo aumento da absorção de água e eletrólitos no
TGI, uma vez que diminuiu o números de bolos fecais líquidos.
Drogas que inibem o trânsito intestinal em estados fisiopatológicos
podem ser eficazes no alívio da diarréia (BORRELLI, 2006). Suzuki et al (2000)
sugerem que a hipermotilidade gástrica tem estreita relação com a formação da
úlcera induzida por AINES como a indometacina. Com a hipermotilidade
gástrica, ocorre um aumento da motilidade intestinal. Segundo Anthony et al.
89
(1993), contrações anormais da parede intestinal promovem ruptura da camada
de muco sobre o epitélio gastrintestinal, levando a um aumento da
susceptibilidade da mucosa a ação de patógenos e substâncias irritantes.
A hipermotilidade intestinal pode ser devida à deficiência de PG
periféricas, enquanto que a hipermotilidade gástrica pode ser devido à
deficiência de PG tanto periférica quanto centrais (YOKOTA et al., 2005).
O NO também está envolvido na regulação da motilidade gastrintestinal,
uma vez que é capaz de diminuir o trânsito intestinal (YU; LIAO; CHEN, 2000).
O NO é um NT inibitório do músculo liso intestinal de humanos, agindo
via mecanismo mediado pelo ciclase de guanilil/GMPc e mecanismo
independente de GMPc (TODA; HERMAN, 2005) e está envolvido na
regulação da motilidade gastrintestinal, uma vez que é capaz de diminuir o
trânsito intestinal (YU; LIAO; CHEN, 2000). Tem sido demonstrado que a
inibição da biossíntese do NO desencadeia o aparecimento de uma rápida
propagação das contrações migratórias pós-prandial, indicando que o NO está
envolvido na modulação da motilidade intestinal no jejum e no pós-prandial
(TODA; HERMAN, 2005).
Em sua revisão sobre o estresse e o trato gastrintestinal, Bhatia e
Tandon (2005) descrevem que o estresse aumenta a permeabilidade colônica
e o número de mastócitos mucosal. Os produtos da degradação dos mastócitos
promovem influxo de células polimorfonucleares e aumentam a secreção e a
motilidade intestinal levando a dor e a diarréia.
É também conhecido que a velocidade do curso intestinal é um dos
fatores que afetam a intensidade da absorção luminal. Assim, provavelmente
as substâncias que diminuem a motilidade gastrintestinal, regulam a
biodisponibilidade de drogas administradas por via oral, como os agentes
antiúlcera, assim favorecendo o processo de cicatrização da úlcera (KUSHIMA
et al., 2005).
O modelo de transito intestinal consiste na administração de um
marcador (solução de carvão ativado 5 % em goma arábica 5 %) e na
avaliação do trajeto do mesmo no intestino delgado durante um período de
tempo (STICKNEY; NORTHUP, 1959). O EEOH e a F. AcOEt obtidos de M.
rigida demonstraram efeito inibitório sobre a propulsão intestinal tanto normal
90
quanto induzida por óleo de rícino, porém sem significância estastística entre
os dois modelos.
Uma propriedade antiespasmódica pode ser deduzida do fato que a
referida espécie causou uma diminuição no movimento propulsivo do carvão
ativado no intestino delgado, sugerindo que no efeito inibitório sobre a
motilidade intestinal pode estar envolvido um mediador local como o NO, pois
estudos demonstram que inibidores da NOS aumentam a freqüência de
contrações e aumentam o esvaziamento gastrintestinal (TACK et al., 2002).
Isto pode contribuir ao menos em parte para a atividade antidiarréica por
permitir um maior tempo para absorção de água e eletrólitos pelo TGI, e por
dificultar o esvaziamento gástrico, o que é importante também para impedir o
aparecimento da úlcera gástrica, sendo um indicativo de que há envolvimento
do tônus muscular na atividade antiúlcera do EEOH e da F. AcOEt obtidos da
M. rigida.
O modelo do músculo liso intestinal de cobaia é um meio importante
para se investigar mecanismos de ação de substâncias que possam ser
utilizadas em processos fisiopatológicos, como, diarréias e cólicas intestinais. A
diarréia é um problema médico frequente (FARTHING, 2000) e ainda é uma
das principais ameaças à saúde em populações pobres de países tropicais e
subtropicais. A Organização Mundial da Saúde (OMS) calcula que 3-5 bilhões
de casos ocorrem anualmente (1 bilhão de crianças menores de 5 anos) e
cerca de 5 milhões de mortes ocorrem devido a diarréia anualmente (2,5
milhões de crianças menores de 5 anos) (HEINRICH et al., 2005; ESTRADA-
SOTO et al., 2007).
Alguns agentes antidiarréicos são conhecidos por apresentar efeito
antiespasmódico (HAJHASHEMI et al., 2000), como por exemplo, difenoxilato
(Lomotil) e loperamida (Imosec), entretanto podem causar depressão do
Sistema Nervoso Central (RYU et al., 2004). Sem contar com os
antiespasmódicos ou espasmolíticos clássicos como o extrato fluido de
beladona (Elixir Paregórico), tintura de ópio, atropina, escopolamina
(Buscopan), papaverina, diciclomina (Bentyl), dentre outros que também
apresentam efeitos centrais (BROWN; TAYLOR, 2006; KOROLKOVAS, 2007).
91
Com objetivo de investigar se o EEOH e a sua F. AcOEt estariam
exercendo efeito antiespasmódico, avaliou-se seus efeitos sobre o íleo de
cobaia pré-contraido com KCl ou com carbacol. A evidência de que tanto o
extrato como a F. AcOEt induziram relaxamento do íleo pré-contraído
comprovam esta hipótese. O fato de não haver diferença significante entre a
potência relaxante do EEOH e da F. AcOEt frente aos agentes contráteis
testados sugere que esses podem estar agindo por um mecanismo de ação
comum à via de sinalização dos agentes contráteis testados, e não em nível de
receptor na membrana plasmática.
Uma vez que o íleo é um órgão totalmente dependente de variação do
potencial de membrana (NOUAILHETAS et al., 1985) e como o componente
tônico da contração induzida por agonistas de acoplamento misto (fármaco e
eletromecânico) como carbacol (UNNO; KOMORI; OHASHI, 1995; BOLTON et
al., 1981) ou por um agente despolarizante (KCl) (acoplamento eletromecânico)
é mantido quase que exclusivamente por influxo de Ca2+ através dos canais de
Ca2+ dependentes de voltagem (CaV) (BOLTON, 1979; REMBOLD, 1996;
BOLTON; 2006), sugere-se que o EEOH e a F. AcOEt podem estar agindo por
bloqueio do influxo de Ca2+ através dos CaV.
Os resultados apresentados nesse trabalho ora desenvolvido indicam
uma ação citoprotetora do EEOH e da F. AcOEt obtidos de M. rigida
dependente da liberação de muco sem participação efetiva das PGs, porém
dependente da via do NO, além da participação de grupamentos sulfidrílicos
não-protéicos, e também atividade antidiarréica e antimotilidade que podem
ajudar na ação antiulcerogênica. Provavelmente essas atividades, estão
relacionadas, ao menos em parte, à presença dos flavonóides presentes no
EEOH e na F. AcOEt.
Neste contexto, os resultados obtidos neste estudo nos fornecem base
farmacológica para utilização de M. rigida, validando seu uso popular e
indicando seu potencial terapêutico como antiulcerogênico, antidiarréico e
antiespasmódico.
92
6 CONCLUSÕES
� O extrato etanólico (EEOH) obtido da entrecasca do caule de
Maytenus rigida Mart. (Celastracea) apresentou baixa toxicidade (in
vivo) nas condições avaliadas por não alterar o comportamento e não
causar morte nos animais;
� O extrato EEOH e a fase acetato de etila (AcOEt) obtidos da M.
rigida, nas doses utilizadas apresentaram atividade antiulcerogênica
frente aos agentes indutores: etanol, antiinflamatório não-esteroidal
(piroxicam) e estresse (imobilização e frio);
� A atividade antiulcerogênica está relacionada com aumento na
produção de muco gástrico, com participação de NO e grupamentos
sulfidrila;
� O EEOH e a F. AcOEt não alteraram os parâmetros bioquímicos do
suco gástrico: volume gástrico, pH e concentração de H+, sugerindo
a não absorção sistêmica;
� A F. AcOEt induziu o processo de cicatrização da úlcera gástrica por
ácido acético após tratamento crônico;
� O EEOH e a F. AcOEt apresentaram atividade antidiarréica em
camundongos;
� O EEOH e a F. AcOEt inibiram a motilidade intestinal normal e
induzido por óleo de rícino em rato;
� O EEOH e a F. AcOEt apresentaram efeito antiespasmódico em íleo
isolado de cobaia.
93
7 PERSPECTIVAS
De acordo com os resultados obtidos da investigação da atividade
antiulcerogênica e antidiarréica do EEOH e da F. AcOEt obtidos da entrecasca
do caule de Maytenus rigida Mart., propõem-se as seguintes perspectivas para
complementar esse estudo:
� Determinar os níveis séricos de somatostatina e gastrina;
� Determinar os parâmetros bioquímicos do suco gástrico quando avaliada
a via oral de administração;
� Avaliar os fatores envolvidos no processo de cicatrização de lesões
ulcerativas no modelo crônico de úlcera gástrica;
� Avaliar os mecanismos de ação antioxidante de M. rigida;
� Determinar o envolvimento da bomba H+, K+ no mecanismo de ação de
M. rigida;
� Avaliar as via envolvidas na alteração na motilidade gastrointestinal
promovida pelo extrato e pela F. AcOEt;
� Avaliar a participação de canais iônicos no efeito antiespasmódico de M.
rigida.
� Identificar os princípios ativos presentes nas frações ativas.
94
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APÊNDICES
Apêndice 1
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Apêndice 2
Carta de submissão do artigo "Evaluation of the antiulcerogenic activity obtained from the extract ethanolic of Maytenus rigida Mart. in rodents" Dear Dr.Batista, Your submission entitled "Evaluation of the antiulcerogenic activity obtained from the extract ethanolic of Maytenus rigida Mart. in rodents" has been received by journal Journal of Ethnopharmacology You will be able to check on the progress of your paper by logging on to Elsevier Editorial as an author. The URL is http://ees.elsevier.com/jep/. Your manuscript will be given a reference number once an Editor has been assigned. Thank you for submitting your work to this journal. Kind regards, Journal of Ethnopharmacology
118
ANEXOS
Anexo 1- Protocolo experimental para triagem comportamental Planta selecionada Doses Data Via de administração Animais Responsável técnico Grupos
Quantificação dos efeitos (0) sem efeito, (-) efeito diminuído, (+) efeito presente,
(++) efeito intenso
Atividade farmacológica
Até 30’ 1 h 2 h 3 h 4 h 1 – SNC A- Estimulantes Hiperatividade Irritabilidade Agressividade Tremores Convulsões Piloereção Movimento intenso das vibrissas Outros B- Depressora Hipnose Ptose Sedação Anestesia Reflexo do endireitamento Catatonia Analgesia Resposta ao toque diminuído Perda do reflexo corneal Perda do reflexo auricular C- Outros comportamentos Ambulação Groming Rearing Escalar Vocalizar Sacudir a cabeça Contorções abdominais Abdução das patas do trem posterior Estereotipia 2 – SN AUTÔNOMO Diarréia Constipação Defecação aumentada Respiração forçada Lacrimejamento Micção Salivação Cianose Tono muscular Força para agarrar 3 – MORTE
Fonte: ALMEIDA et al., 1999.
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Anexo 2- Certidão de aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa Animal do
LTF/UFPB
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