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Validação de metodologias para análises físico-químicas

Validação de metodologias para análises físico-químicas

ROBERTO GONÇALVES JUNQUEIRAROBERTO GONÇALVES JUNQUEIRAProfessor Associado -

UFMGProfessor Associado -

UFMG

São PauloJunho 2010São PauloJunho 2010

IX Simpósio Internacional ABRAPA de Inocuidade de Alimentos

IX Simpósio Internacional ABRAPA de Inocuidade de Alimentos

Todo laboratório deve tomar medidas para assegurar que é

capaz de fornecer dados analíticos

confiáveis.

Todo laboratório deve tomar medidas para assegurar que é

capaz de fornecer dados analíticos

confiáveis.

Essas medidas incluem:Essas medidas incluem:(THOMPSON et

al., 2002)

(ISO/IEC 17025, 2005)

Confiabilidade analítica

• utilizar métodos analíticos validados;•

comprovar a rastreabilidade;

•

estimar a incerteza;•

adotar controle de qualidade interno;

•

participar de ensaios de proficiência;•

ser acreditado por acreditador reconhecido.

• utilizar métodos analíticos validados;• comprovar a rastreabilidade;• estimar a incerteza;• adotar controle de qualidade interno;• participar de ensaios de proficiência;• ser acreditado por acreditador reconhecido.

é

a confirmação, por exame e evidência objetiva, de que os requisitos para um determinado uso pretendido são atendidos.

é

a confirmação, por exame e evidência objetiva, de que os requisitos para um determinado uso pretendido são atendidos.

Validação

….adequação ao uso….adequação ao uso

(ISO/IEC 17025, 2005)

Processo de estabelecer Processo de estabelecer

as características de desempenho

as características de desempenho

e limitações do método

e limitações do método

os fatores que as afetam e em que extensão

os fatores que as afetam e em que extensão

e identificare identificar

Validação

VerificaçãoVerificaVerificaççãoão

Métodos normalizadosMMéétodos normalizadostodos normalizados

ValidaçãoValidaValidaççãoão

Métodos normalizados modificados ou desenvolvidos no laboratório

MMéétodos normalizados modificados todos normalizados modificados ou desenvolvidos no laboratou desenvolvidos no laboratóóriorio

Quando validar?

(EURACHEM, 1998)

Verificação

o laboratório deve verificar se o

desempenho documentado do método normalizado pode ser alcançado.

o laboratório deve verificar se o

desempenho documentado do método normalizado pode ser alcançado.

São usadas as mesmas ferramentas da validação

São usadas as mesmas ferramentas da validação

• tendência• precisão• tendência• precisão

p. ex.

avalia-se

Características da faixa


Características de desempenho do método

Características da acurácia


SeletividadeSeletividadeRobustez Robustez

Características da calibração


Calibração

na avaliana avaliaçção dos outros ão dos outros parâmetros de validaparâmetros de validaçção.ão.

É

determinante

(SOUZA & JUNQUEIRA, 2005)


Sensibilidade Sensibilidade Sensibilidade


InclinaçãoInclinaInclinaççãoão

Efeito de Matriz Efeito de Matriz Efeito de Matriz InterceptoInterceptoIntercepto


CaracterCaracteríísticassticas da calibrada calibraççãoão

LinearidadeLinearidadeLinearidade

2

21nt r

r−

=−

com (n-2) graus de liberdade

Para H0

: ρ

= 0

HA

: ρ

≠

0testa-se a estatística t

definida por:

Graus de liberdade(n -

2)Nível de confiança

95% (α

= 0,05) 99% (α

= 0,01)2 0,950 0.9903 0,878 0,9594 0,811 0,9175 0,754 0,8756 0,707 0,8347 0,666 0,7988 0,632 0,7659 0,602 0,73510 0,576 0,70812 0,532 0,66114 0,497 0,62315 0,482 0,60620 0,423 0,53730 0,349 0,44940 0,304 0,39360 0,250 0,325

A significância do coeficiente de correlação r

é

dependente

do número de observações da regressão.

(BURKE, 2001a)

Valores críticos de r para diferentes graus de liberdade

Coeficiente de correlação rCoeficiente de correlação r

(RCS/AMC Technical

Brief, 2000)

Coeficientes de correlação r

e de determinação R2Coeficientes de correlação r

e de determinação R2

Apesar do amplo uso, o coeficiente de correlação r

não é

adequado como teste

de linearidade e deve ser evitado.

O coeficiente de determinação R2

não mede a adequação do ajuste ao modelo, uma vez que pode ser inflado pela adição de termos ao mesmo.

Se os pontos de uma calibração estiverem bem ajustados à

curva,

certamente o valor experimental de R2

será

próximo de 1.

Mas um R2

≈

1 não é

necessariamente o resultado de uma relação linear.

(THOMPSON et

al., 2002)

(MULHOLLAND & HIBBERT , 1997)

(BURKE, 2001a)

•• Estimativa dos parâmetros Estimativa dos parâmetros •• DistribuiDistribuiçção dos resão dos resííduos e duos e 2

ress

•

O nível zero geralmente é utilizado para ajustar o zero do

instrumento de medição.

–

Pontos próximos dos extremos da faixa de trabalho são sujeitos a maiores oscilações que os pontos centrais.

(MONTGOMERY & RUNGER, 1994; DRAPER & SMITH, 1998)

–

Desvio de linearidade é

comum no extremo inferior de uma equação de calibração estimada.

(RCS/AMC Technical

Brief, 2001)

Linearidade: uso do nível zero

afetaafeta•

A inclusão do zero na análise

de regressão não é

recomendada

Linearidade: delineamento experimental

Determinar a faixa de interesse

sendo a concentração esperada próxima ao centro da faixa

Preparar as soluções do(s) analito(s)

• em solvente

ou •

em extratos de amostras

(se houver efeito de matriz)Utilizar 6 níveis de

concentração•

igualmente espaçados, com pelo menos 3 replicatas

(verdadeiras e independentes)

•

mais o nível zero (usado para ajuste do instrumento)

Ler em ordem aleatória


Variável independente xi

Var

iáve

l dep

ende

nte

y i

Regressão linear simples: o método dos mínimos quadrados ordinários

ˆ ii a xy b= +

e1e3

e6

e8e10

2 2

1 1( ) mínˆ imoi

n n

i ii i

ye y= =

= − =∑ ∑

y8

y6

O Modelo da Regressão Linear SimplesO Modelo da Regressão Linear Simples

YY

XX

Valor observado de Y

quando X

= X1


quando X

= X1


quando X

= X2


quando X

= X2

População dos valores de Y

quando X

= X1


quando X

= X1

Média dos valores de Y

quando X

= X1


quando X

= X1


quando X

= X2


quando X

= X2


quando X

= X2


quando X

= X2μY|X

= βo + β1 XμY|X

= βo + β1 X

(Linha das médias)(Linha das médias)

Linha reta definida porLinha reta definida por

X1

X1 X2

X2

2(0, )i Nε σ→ 2(0, )i Nε σ→

2( )iVar Y σ= 2( )iVar Y σ=

1( )i i o iY Xε β β= − + 1( )i i o iY Xε β β= − +

1 2( , ) 0Cov ε ε =1 2( , ) 0Cov ε ε =

LLL

III

EEE

NNN

1i o i iY Xβ β ε= + +1i o i iY Xβ β ε= + +

Normalidade dos resíduos Normalidade Normalidade dos resdos resííduos duos

O modelo de regressão linear

Pontos influentes

Pontos Pontos influentes influentes

Ajuste ao modelo

Ajuste ao Ajuste ao modelo modelo

Variâncias homogêneas

Variâncias Variâncias homogêneashomogêneas

Independência dos resíduos

Independência Independência dos resdos resííduosduos

Regressão Linear

Regressão Regressão Linear Linear

LinearityLinearityLinearity

Independency of residuesIndependency of residuesIndependency of residues

Equality of varianceEquality of varianceEquality of variance

NormalityNormalityNormality

L I N EL I N EL I N E

Pontos influentes na regressão linearA regressão linear tem o inconveniente de ser muito sensível à

presença de pontos outliers e leverages.

x

ei

Outlier

x

ei

Leverages

Outliers (dispersos): pontos que provavelmente pertencem a outra população e afetam a estimativa de s2

res

.

Leverages (alavancas): pontos que têm grande influência na estimativa dos parâmetros da equação da regressão.

ˆi i ii iy a xe yy b= − −= − ˆi i ii iy a xe yy b= − −= −

(STATSOFT, 2004)

Efeito de outliers

e leverages

Efeito de outliers

(STATSOFT, 2004)

r = 0,41

n = 17

r = 0,26

n = 18

r = 0,54

n = 16

r = 0,68

n = 15

r = 0,94

n = 14

Segundo HORWITZ (1995), é

aceitável retirar até

2/9

(22,2%) dos dados.

Inspeção do gráfico de resíduos ei

= yi

- yi

ei

HeteroscedasticidadeHeteroscedasticidade Desvio de linearidadeDesvio de linearidade

LeverageLeverageOutlierOutlier

(MONTGOMERY & RUNGER, 1994; DRAPER & SMITH, 1998)

DistribuiDistribuiçção satisfatão satisfatóóriaria

ei

Variável independente X


eiei




ei


ei


ei

^

•

Testes para detecção de outliers:-

Distância de Cook

-

Resíduo padronizado-

Resíduo “Studentizado”

-

Resíduo padronizado “Jacknife” ResResííduos maioresduos maiores

a estimativa dea estimativa de

inflam inflam

ResResííduosduos““studentizadostudentizado””

2ress

subestimamsubestimam

Estima o erro padrão de Estima o erro padrão de eeiiexcluindo o ponto suspeitoexcluindo o ponto suspeito

a deteca detecçção de ão de outliersoutliers

Diagnóstico de pontos outliers

dificultamdificultam

-800

-400

0

400

800

0 20 40 60 80 100 120

Gráfico de resíduosGráfico de resíduos

ˆi i i i ie Y Y Y a bX= − = − −ˆi i i i ie Y Y Y a bX= − = − −

: Resíduos 2 2i1

ˆ( ) ( 2)nres ii

s Y Y n=

= − −∑ - - - - : ±

t(1-α/2)(n-2)GL

sres


: Outliers

Concentração do analito (ng/mL)

e i

-800

-400

0

400

800

0 20 40 60 80 100 120

Gráfico de resíduosGráfico de resíduos


: Resíduos: Resíduos 2 2i1

ˆ( ) ( 2)nres ii

s Y Y n=

= − −∑2 2i1

ˆ( ) ( 2)nres ii

s Y Y n=

= − −∑ - - - - : ±

t(1-α/2)(n-2)GL

sres

- - - - : ±

t(1-α/2)(n-2)GL

sres: Outliers: Outliers

Concentração do analito (ng/mL)

e i


-60

-30

0

30

60

0 25 50 75 100 125 150-125

-75

-25

25

75

125

0 25 50 75 100 125 150

-125

-75

-25

25

75

125

0 25 50 75 100 125 150-60

-30

0

30

60

0 25 50 75 100 125 150

-125

-75

-25

25

75

125

0 25 50 75 100 125 150

Gráficos de resíduos: avermectinas em leiteGráficos de resíduos: avermectinas em leite

-60

-30

0

30

60

0 25 50 75 100 125 150-60

-30

0

30

60

0 25 50 75 100 125 150

-60

-30

0

30

60

0 25 50 75 100 125 150

-60

-30

0

30

60

0 25 50 75 100 125 150-125

-75

-25

25

75

125

0 25 50 75 100 125 150-60

-30

0

30

60

0 25 50 75 100 125 150

-60

-30

0

30

60

0 25 50 75 100 125 150

Dia 1 Dia 2 Dia 3

ABA (ng/mL) ABA (ng/mL) ABA (ng/mL)

DOR (ng/mL) DOR (ng/mL) DOR (ng/mL)

EPR (ng/mL) EPR (ng/mL) EPR (ng/mL)

IVE (ng/mL) IVE (ng/mL) IVE (ng/mL)

e i e i e i

e i e i e i

e i e i e i

e i e i e i



Pontos influentes


Ajuste ao modelo






Regressão Linear


Teste de normalidade: cálculo de R Teste de normalidade: cálculo de R

R = CORREL(C62:C76;D62:D76)R = CORREL(C62:C76;D62:D76)R = CORREL(C62:C76;D62:D76)

3 18 4ip i n⎛ ⎞ ⎛ ⎞= − +⎜ ⎟ ⎜ ⎟

⎝ ⎠ ⎝ ⎠

3 18 4ip i n⎛ ⎞ ⎛ ⎞= − +⎜ ⎟ ⎜ ⎟

⎝ ⎠ ⎝ ⎠

Quantil

NormalQuantil

Normal

( )1i ib p−= Φ ( )1i ib p−= Φ

b1

=

INV.NORMP(B62)b1

=

INV.NORMP(B62)

i

= 1, 2, ..., ni

= 1, 2, ..., npi

≈

P(-∞ ≤ z ≤

bi

)pi

≈

P(-∞ ≤ z ≤

bi

)


ei

em ordem crescenteei

em ordem crescente

n = 15; Rn = 15; R0,100,10

= 0,9506; = 0,9506; R = 0,9860R = 0,9860; ; p > 0,10p > 0,10

Os resOs resííduos seguem a distribuiduos seguem a distribuiçção Normalão Normal

b1

= -

1,7394

Curva Normal Reduzidap1

= 0,0410

0 z

A B C D61 i pi bi ei62 1 0,0410 -1,7394 -225,9663 2 0,1066 -1,2450 -187,0964 3 0,1721 -0,9458 -122,9665 4 0,2377 -0,7137 -76,3966 5 0,3033 -0,5150 -74,8267 6 0,3689 -0,3349 -68,6568 7 0,4344 -0,1651 -24,6569 8 0,5000 0,0000 -0,0970 9 0,5656 0,1651 2,6171 10 0,6311 0,3349 93,9172 11 0,6967 0,5150 102,4873 12 0,7623 0,7137 103,3574 13 0,8279 0,9458 122,1875 14 0,8934 1,2450 140,6176 15 0,9590 1,7394 215,48

XYXY

XX YY

SrS S

=⋅ (SOUZA & JUNQUEIRA, 2005)

-2,0

-1,0

0,0

1,0

2,0

-300 -200 -100 0 100 200 300

Valor de ei observado

Val

or N

orm

al e

sper

ado

-2,0

-1,0

0,0

1,0

2,0

-300 -200 -100 0 100 200 300

Valor de ei observado

Val

or N

orm

al e

sper

ado

Gráfico de Probabilidade Normal (Gráfico Q-Q)Gráfico de Probabilidade Normal (Gráfico Q-Q)

R = 0,9860R = 0,9860

Desvio da Normal não-significativoDesvio da Normal não-significativo

Rc (α: 0,10) = 0,9506; Rc (α: 0,05) = 0,9383; Rc (α: 0,01) = 0,9109Rc (α: 0,10) = 0,9506; Rc (α: 0,05) = 0,9383; Rc (α: 0,01) = 0,9109

p > 0,10p > 0,10

, bi

, bi

-2,0

-1,0

0,0

1,0

2,0

-20 -10 0 10 20

-2,0

-1,0

0,0

1,0

2,0

-30 -20 -10 0 10 20 30

-2,0

-1,0

0,0

1,0

2,0

-30 -20 -10 0 10 20 30-2,0

-1,0

0,0

1,0

2,0

-20 -10 0 10 20

Teste de Normalidade: avermectinas em leiteTeste de Normalidade: avermectinas em leite

-2,0

-1,0

0,0

1,0

2,0

-60 -40 -20 0 20 40

-2,0

-1,0

0,0

1,0

2,0

-20 -10 0 10 20-2,0

-1,0

0,0

1,0

2,0

-20 -10 0 10 20

-2,0

-1,0

0,0

1,0

2,0

-20 -10 0 10 20

-2,0

-1,0

0,0

1,0

2,0

-10 -5 0 5 10

-2,0

-1,0

0,0

1,0

2,0

-20 -10 0 10 20

-2,0

-1,0

0,0

1,0

2,0

-30 -20 -10 0 10 20 30-2,0

-1,0

0,0

1,0

2,0

-20 -10 0 10 20

Dia 1 Dia 2 Dia 3

Valor ei

observado

Valor ei

observado

Valor ei

observado

Valor ei

observado

Valor ei

observado

Valor ei

observado

Valor ei

observado

Valor ei

observado

Valor ei

observado

Valor ei

observado

Valor ei

observado

Valor ei

observado

Val

or N

orm

al e

sper

ado

Val

or N

orm

al e

sper

ado

Val

or N

orm

al e

sper

ado

Val

or N

orm

al e

sper

ado

Val

or N

orm

al e

sper

ado

Val

or N

orm

al e

sper

ado

Val

or N

orm

al e

sper

ado

Val

or N

orm

al e

sper

ado

Val

or N

orm

al e

sper

ado

Val

or N

orm

al e

sper

ado

Val

or N

orm

al e

sper

ado

Val

or N

orm

al e

sper

ado

ABA ABA ABA

DOR DOR DOR

EPR EPR EPR

IVE IVE IVE

R = 0,9754

p > 0,10

R = 0,9849

p > 0,10

R = 0,9740

p > 0,10

R = 0,9898

p > 0,10

R = 0,9899

p > 0,10

R = 0,9921

p > 0,10

R = 0,9846

p > 0,10

R = 0,9909

p > 0,10

R = 0,9836

p > 0,10

R = 0,9763

p > 0,10

R = 0,9889

p > 0,10

R = 0,9710

p > 0,10



Pontos influentes


Ajuste ao modelo






Regressão Linear


Homogeneidade de variância

• Muitos métodos de ensaio produzem dados heteroscedásticos.

• Em caso de heteroscedasticidade, a regressão linear simples não é

recomendada.

Regressão Regressão ponderada ponderada

ei


HomoscedasticidadeHomoscedasticidade HeteroscedasticidadeHeteroscedasticidade HeteroscedasticidadeHeteroscedasticidade


ei


ei

(DANZER & KURRIE, 1998)

-400

-200

0

200

400

0 20 40 60 80 100 120

Concentração (ng/mL)

e i

-400

-200

0

200

400

0 20 40 60 80 100 120

Concentração (ng/mL)

e i

Teste de Levene/Brown/ForsytheTeste de Levene/Brown/Forsythe

1 2

2

1 2

( )

1 1L

p

d dt

sn n

−=

⎛ ⎞+⎜ ⎟

⎝ ⎠

1 2

2

1 2

( )

1 1L

p

d dt

sn n

−=

⎛ ⎞+⎜ ⎟

⎝ ⎠

Grupo 1Grupo 1

Grupo 2Grupo 2


0

40

80

120

160

1

jn

j j ij ji

d e e n=

= −∑1

jn

j j ij ji

d e e n=

= −∑ ( ) ( )2 222

1 1 11

jn

p ij j jj i j

s d d n= = =

= − −∑∑ ∑( ) ( )2 222

1 1 11

jn

p ij j jj i j

s d d n= = =

= − −∑∑ ∑( )1 2 0,9751 2

1 1pd d t s

n n− ± +( )1 2 0,975

1 2

1 1pd d t s

n n− ± +

1 2 29,15 79, 41d d− = ±1 2 29,15 79, 41d d− = ± 0,787 0,05Lt p= >0,787 0,05Lt p= >

25-75 ng/mL 100-150 ng/mL

Concentração do analito

Des

vio

méd

io

Teste de Levene/Brown/ForsytheTeste de Levene/Brown/Forsythe

0

4

8

12

16

20

0

4

8

12

16

0

4

8

12

16

20

24

Homogeneidade de variâncias: avermectinasHomogeneidade de variâncias: avermectinas

0

2

4

6

8

10

12

0

2

4

6

8

10

0

4

8

12

16

0

1

2

3

4

5

6

0

2

4

6

8

10

12

Dia 1 Dia 2 Dia 3

25-75 ng/mL 100-150 ng/mL 25-75 ng/mL 100-150 ng/mL 25-75 ng/mL 100-150 ng/mL

Des

vio

méd

ioD

esvi

o m

édio

Des

vio

méd

ioD

esvi

o m

édio

Des

vio

méd

ioD

esvi

o m

édio

Des

vio

méd

ioD

esvi

o m

édio

Des

vio

méd

ioD

esvi

o m

édio

Des

vio

méd

ioD

esvi

o m

édio

1 2| | 1,78 5,53d d− = ± 1 2| | 10,6 11,5d d− = ± 1 2| | 9,18 9,85d d− = ±

1 2| | 3,14 5,85d d− = ± 1 2| | 2,12 6,30d d− = ± 1 2| | 4,55 5,98d d− = ±

0

2

4

6

8

10

12

0

4

8

12

16

1 2| | 0,97 6, 26d d− = ± 1 2| | 7, 28 10,0d d− = ± 1 2| | 2,11 8,61d d− = ±

1 2| | 0,00 2,71d d− = ± 1 2| | 2, 21 7,65d d− = ± 1 2| | 4,18 5,63d d− = ±

0

4

8

12

16

0,690 0,50Lt p= >

0

5

10

15

20

25

30

35

1,959 0,50Lt p= > 1,975 0,50Lt p= >

1,139 0,50Lt p= > 0,733 0,50Lt p= > 1,622 0,50Lt p= >

0,329 0,50Lt p= > 1,579 0,50Lt p= > 0,520 0,50Lt p= >

0,000 0,50Lt p= > 0,625 0,50Lt p= > 1,592 0,50Lt p= >

ABA

DOR

EPR

IVE

ABA

DOR

EPR

IVE

ABA

DOR

EPR

IVE



Pontos influentes


Ajuste ao modelo






Regressão Linear


Independência

• Em caso de autocorrelação, a regressão linear simples não é

recomendada.

• Teste de Durbin-Watson

Regressão Regressão generalizadageneralizada

IndependênciaIndependência AutocorrelaAutocorrelaçção ão negativanegativa

AutocorrelaAutocorrelaççãoãopositivapositiva

ei

ei-1

ei

ei-1 ei-1

ei

A B C D114 i ei ei-1 ei – ei-1115 1 -68,65116 2 -24,65 -68,65 44,00117 3 103,35 -24,65 128,00118 4 -187,09 103,35 -290,43119 5 -0,09 -187,09 187,00120 6 93,91 -0,09 94,00121 7 102,48 93,91 8,57122 8 215,48 102,48 113,00123 9 -225,96 215,48 -441,43124 10 -122,96 -225,96 103,00125 11 -76,39 -122,96 46,57126 12 2,61 -76,39 79,00127 13 140,61 2,61 138,00128 14 -74,82 140,61 -215,43129 15 122,18 -74,82 197,00

Teste de independência de Durbin-WatsonTeste de independência de Durbin-Watson

21

2

2

1

( )n

i ii

n

ii

e ed

e

−=

=

−=∑

∑

21

2

2

1

( )n

i ii

n

ii

e ed

e

−=

=

−=∑

∑

SOMAQUAD(D116:D129)

SOMAQUAD(B115:B129)d

=

Se d ≈

2: não há

autocorrelação,i.e., os resíduos são independentesSe d ≈

2: não há

autocorrelação,

i.e., os resíduos são independentes

d varia de 0 → 2 ← 4d varia de 0 → 2 ← 4

n = 15 d = 2,084 p > 0,10n = 15 d = 2,084 p > 0,10

Os resOs resííduos são independentesduos são independentes(SOUZA & JUNQUEIRA, 2005)

Gráfico de Durbin-WatsonGráfico de Durbin-Watson

d = 2,084d = 2,084

-

300-

300

300300

-

300-

300

300300

p > 0,10p > 0,10

ei

ei

ei-1

ei-1

Os resOs resííduos são independentesduos são independentes1,36 = d1,36 = dUU

< < d = 2,084d = 2,084

< 4< 4--ddUU

= 2,64= 2,64

-30

30

-30 30

-20

20

-20 20

Independência dos resíduos : avermectinasIndependência dos resíduos : avermectinas

-20

20

-20 20

-20

20

-20 20

-40

40

-40 40

-30

30

-30 30

-20

20

-20 20

-20

20

-20 20

-20

20

-20 20

-10

10

-10 10

-25

25

-25 25

-20

20

-20 20

Dia 1 Dia 2 Dia 3ABA

DOR

EPR

IVE

ABA

DOR

EPR

IVE

ABA

DOR

EPR

IVE

ei

ei-1

ei

ei-1

ei

ei-1

ei

ei-1

ei

ei-1

ei

ei-1

ei

ei-1

ei

ei-1

ei

ei-1

d = 2,139

p > 0,10d = 1,803

p > 0,10d = 1,525

p > 0,10

d = 2,342

p > 0,10d = 2,497

p > 0,10d = 1,980

p > 0,10

d = 1,950

p > 0,10

d = 1,455

p > 0,10

d = 2,702

p > 0, 05d = 1,272

p > 0, 05

d = 1,719

p > 0,10d = 2,114

p > 0,10

ei-1 ei-1 ei-1

ei ei ei



Pontos influentes


Ajuste ao modelo




Regressão Linear

Regressão Regressão LinearLinear




ei

Ajuste ao modelo• Muitos métodos de ensaio produzem dados em que o modelo linear não é

aplicável, sendo melhor ajustados a

modelos polinomiais ou outros modelos.

• Não é

possível testar a linearidade; o que se pode fazer é

demonstrar se o desvio de linearidade

não é

significativo, por exemplo, por ANOVA.

ei



ei

Necessita deNecessita dereplicatas em cada nreplicatas em cada níível vel

Modelo linearModelo linear Modelo não linearModelo não linear Modelo não linearModelo não linear

QM Desvio ou Resíduo

(n-2 GL)

QM Desvio ou Resíduo

(n-2 GL)

QM da Regressão

(1 GL)

QM da Regressão

(1 GL)

SQ devida à Regressão

(2-1 GL)

SQ devida à Regressão

(2-1 GL)

SQ em torno da Regressão

(n-2 GL)

SQ em torno da Regressão

(n-2 GL)

Análise de variância da regressãoAnálise de variância da regressão

fornecefornece

fornecefornece

(ANOVA)(ANOVA)Estima

(variabilidade explicada pela

regressão)

Estima

(variabilidade explicada pela

regressão)

2Regσ 2Regσ

Estima

(variabilidade não explicada

pela regressão)

Estima

(variabilidade não explicada

pela regressão)

2resσ 2resσ

SQ Total(n-1 GL)

SQ Total(n-1 GL)

Testa a significância da Regressão

Testa a significância da Regressão

COMPARAÇÃOCOMPARAÇÃO

(DRAPER & SMITH, 1998)

SQ Resíduo

(n-2 GL)

SQ Resíduo

(n-2 GL)

QM Erro Puro

(n-u GL)

QM Erro Puro

(n-u GL)

QM Falta de Ajuste

(u-2 GL)

QM Falta de Ajuste

(u-2 GL)

SQ Falta de Ajuste

(u-2 GL)(diferença)

SQ Falta de Ajuste

(u-2 GL)(diferença)

SQ Erro Puro

(n-u GL)(replicatas)

SQ Erro Puro

(n-u GL)(replicatas)

Teste de desvio de linearidadeTeste de desvio de linearidade Estima

σ 2

(modelo correto)

Estima σ 2+tendência

(modelo incorreto)

Estima

σ 2

(modelo correto)

Estima σ 2+tendência(modelo incorreto)

Estima σ 2Estima σ 2

fornecefornece

fornecefornece

(“Falta de Ajuste”)(“Falta de Ajuste”)

COMPARAÇÃOCOMPARAÇÃOTesta o Desvio de Linearidade

Testa o Desvio de Linearidade


Quadro ANOVA para a regressãoQuadro ANOVA para a regressão

FFV GL SQ QM

Entre níveis 2k k

k 1( )

u

n Y Y=

−∑u - 1

Total 2

1( )

n

ii

Y Y=

−∑n - 1

Resíduo

Regressão

2i

1

ˆ( )n

ii

Y Y=

−∑

QMReg

/QMres2 2

1( )

n

ii

b X X=

−∑ SQReg

/GLReg

SQres

/GLres

1

n - 2(res)

(Reg)

FV: Fonte de variação

GL: Graus de liberdade

SQ: Soma de Quadrados

QM: Quadrados Médios

Falta de Ajuste 2k k k

k=1

ˆ( )u

n Y Y−∑ QMFAj

/QMErPu - 2(FAj)

SQFAj

/GLFAj

Erro Puro 2kj k

k 1 j 1( )

knu

Y Y= =

−∑∑n -

u(ErP)

SQErP

/GLErP

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(6) – (1)

(6) – (4)

(4) – (1) ou (2) – (5)

FF

ϕϕαα

1-α1-α

Linearidade: inseticida organofosforadoGráfico de resíduos

-600

-400

-200

0

200

400

600

0 20 40 60 80 100 120

Dimetoato, ng mL-1

e i

0

50

100

150

200

250

300

12-44 ng/mL 60-92 ng/mL

Des

vio

méd

io

Gráfico Q-Q

-2

-1

0

1

2

-400 -300 -200 -100 0 100 200 300

Valor de ei Observado

Valo

r Nor

mal

esp

erad

o

Gráfico de Durbin-Watson Gráfico para Teste de Levene

-400

400

-400 400ei

ei-1

R = 0,9657p > 0,10

d = 1,9275p > 0,10 tL = 0,9970

p > 0,05

+t0,975

sres

-t0,975

sres

(AMARAL, 2007)

Linearidade: inseticida organofosforadoANOVA da Regressão -

Dimetoato

Fonte de Variação F Significância

Regressão 4614,39 P < 0,001

Desvio de Linearidade 0,1433 P > 0,05

Gráfico Final da Linearidade

y = 101,5198x + 27,9366R2 = 0,9970

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

0 20 40 60 80 100

Dimetoato, ng mL-1

Res

post

a

(AMARAL, 2007)




Efeito de Matriz Efeito de Matriz Efeito de Matriz InterseçãoInterseInterseççãoão




Efeito de matrizEfeito de matriz

os parâmetros da curva os parâmetros da curva de calibrade calibraççãoão

O efeito de matrizO efeito de matriz

outros parâmetros outros parâmetros da validada validaççãoão

afeta afeta significativamentesignificativamente

influindo nainfluindo naavaliaavaliaçção deão de

Efeito de matriz: delineamento experimentalCurva do analito

no solvente

Diagnosticar outliers; testar normalidade, homoscedasticidade, independência e

ajuste ao modelo linear

Curva do analitona matriz

Comparar as inclinações e interseções pelo teste de t

ou t’

Testar a homogeneidade das variâncias (Teste de Fmáx

de Hartley)

• seis níveis igualmente espaçados •

duas ou três replicatas por nível, dependendo da capacidade analítica

Para cada curva estimar inclinação, interseção e 2

ress

Efeito de matriz: dimetoato

Matriz: BananaMatriz: Alface

t |am

-

as

| = 1,802; 27 G.L.; p

= 0,083

t |bm

-

bs

| = 1,010; 27 G.L.; p

= 0,321

t |am

-

as

| = 1,098; 24 G.L.; p

= 0,284

t |bm

-

bs

| =

7,705; 24 G.L.;

p

< 0,001

(AMARAL, 2007)

y = 66,787x - 314,84R2 = 0,9754 (solvente)

y = 71,678x + 180,5R2 = 0,9607 (matriz)

0

2000

4000

6000

8000

0 20 40 60 80 100

Dimetoato, ng mL-1

Res

post

a

y = 83,639x - 41,983R2 = 0,9873 (solvente)

y = 119,55x - 323,35R2 = 0,9882 (matriz)

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

0 20 40 60 80 100

Dimetoato, ng mL-1

Res

post

a




Efeito de Matriz Efeito de Matriz Efeito de Matriz InterseçãoInterseInterseççãoão




Sensibilidade

é a variação no

sinal de medida por unidade de variação da concentração.

Sensibilidade = dy/dx

Sensibilidade

0

200

400

600

800

1000

1200

0 10 20 30

Concentração

Sina

l dy

dx

Avaliação da sensibilidade

Tem pouca utilidade na validação, pois depende de ajustes instrumentais.

Mas é

útil em procedimentos de garantia de qualidade.

Pode ser obtida a partir da curva de calibração.

Avalia se um instrumento está

apresentando um padrão

consistente de resposta

(THOMPSON et

al., 20027)






SeletividadeSeletividade

RobustezRobustez




(NATA, 1997; EURACHEM, 1998)

A seletividade

o mo méétodo todo éé

capaz de capaz de quantificar o analito na quantificar o analito na

presenpresençça de interferentesa de interferentes

avalia o grau avalia o grau no qual no qual

Deve ser Deve ser avaliada avaliada

para todo interferente para todo interferente importante, possimportante, possíível de vel de

estar presenteestar presente

Idealmente Idealmente para qualquer para qualquer interferenteinterferente

Seletividade: separação de avermectinas

Solução padrão deAvermectinas (150 ng/mL)

Solução padrão deAvermectinas (150 ng/mL)

Amostra brancade leite bovino

Amostra brancade leite bovino

Amostra de leite adicionadade avermectinas (30 μg/mL)Amostra de leite adicionadade avermectinas (30 μg/mL)

ABAABA

DOR

DOR

EPR

EPR

IVE

IVE

ABAABA

DOR

DOR

EPR

EPR

IVE

IVE

Separação e quantificação das avermectinas Eprinomectina (EPR), Abamectina (ABA), Doramectina (DOR) e Ivermectina (IVE) por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção de fluorescência

Separação e quantificação das avermectinas Eprinomectina (EPR), Abamectina (ABA), Doramectina (DOR) e Ivermectina (IVE) por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção de fluorescência (SOUZA et

al., 2007b)

Seletividade: separação de agrotóxicos(1)

(2)

(3)

(4)(5) (6)

Cromatograma típico da separação de inseticidas organofosforados

na solução matriz de tomate

Analitos: 92,0 µg L-1

Resolução > 3,2

(1) etoprofós; (2) dimetoato; (3) pirimifós; (4) clorpirifós; (5) parationa

e (6) etiona.

(AMARAL, 2007)







RobustezRobustez






Limite de quantificação


Capacidade de detecção (CCβ)


Limite de decisão (CCα)


Limite de detecção


O limite de detecção pode ser expresso em termos de uma concentração xL

, derivado do menor sinal que pode ser avaliado com certeza razoável.

xL

= xb

+ k sb

xL

= xb

+ k sb

sendo xb

a média de amostras brancas, sb

o seu desvio padrão e k

um fator numérico escolhido de acordo com

o nível de confiança requerido, geralmente igual a 3.

(CURRIE: IUPAC, 1995)


3,00 = 2(1,50) = 2 z0,933 α = 6,7%3,28 = 2(1,64) = 2 z0,950 α = 5,0%

(MILLER &. MILLER, 1993)

(RCS/AMC Technical Brief, 2001)

Concentração

Resp

osta

0

Resultados

Funç

ão de

Calib

ração

0

•

Pode ser estimado pela média das leituras de amostras brancas (n ≥

20) mais 3 desvios padrão

(s0

), expresso em concentração do analito.

•

A estimativa da precisão (s0

) deve estar baseada em pelo menos seis determinações independentes, em uma matriz típica, sem o analito ou com baixo teor, sem censurar a ocorrência de zero

ou de resultados

negativos.

Limite de detecção: como determinar

xL

= x0

+ 3 s0

(AOAC, 1998)

(THOMPSON et

al., 2002)

DetecçãoDetecção QuantificaçãoQuantificação

Menor concentração detectada nas amostras,

distinguida de zero (sinal/ruído ≥

3), mas não

necessariamente quantificada.

Concentração abaixo da qual o método não pode operar com exatidão e

precisão aceitáveis, com base em critérios preestabelecidos

SOUZA et

al. 2005


LimitesLimites

Limites de Detecção e Quantificação


CaracterCaracteríísticassticas da faixada faixa



Limite de Limite de quantificaquantificaççãoão


Capacidade de Capacidade de detecdetecçção (CCão (CCββ))


Limite de Limite de decisão (CCdecisão (CCαα))


Limite de Limite de detecdetecççãoão

ConcentraçãoLR

(Adaptado de KENNEDY, 2004)

CCα

Média + 1,64 σLR

Média + 1,64 σLR

O significado dos valores de CCα

e CCβ

ϕPara α

= 0,05,

5% das amostras contendo o LR fornecerão um

sinal maior que o de CCα.

(falsos positivos)

Para α

= 0,05, 5% das amostras

contendo o LR fornecerão um


(falsos positivos)

ConcentraçãoLR


CCα


e CCβ50% dão respostamais baixa que CCα(falsos negativos)

50% dão respostamais baixa que CCα(falsos negativos)

Para amostras em CCα

Para amostras Para amostras em em CCCCαα

ϕ

ConcentraçãoLR


CCα


e CCβ

ϕ

CCβ

Para amostras em CCβ

Para amostras Para amostras em CCem CCββ



ConcentraçãoLR


CCα

Média + 1,64 σLR

Média + 1,64 σLR


e CCβ50% dão respostamais baixa que CCα(falsos negativos)


Para amostras em CCα

Para amostras Para amostras em em CCCCαα

ϕ

CCβ

Para amostras em CCβ

Para amostras Para amostras em CCem CCββ



Para α




(falsos positivos)

Para α




(falsos positivos)

0

10

20

30

40

50

0 50 100 150 200

Representação gráfica do cálculo de CCα

e CCβ

Curva + 1,64 σR

Curva -

1,64 σR

Curva média


Yc

= 29,9

LR =

100

μg/

kg

CCα

= 11

6 μg

/kg

CCβ

= 13

5 μg

/kgRes

post

a

Concentração, μg/kg

Substância com Limite de Restrição (LR) definido●

Médias de bateladas do estudo de precisão intermediária

Resp

osta

ConcentraçãoCCβCCβ

(ISO 11843, 1997)

Representação gráfica do cálculo de CCα

e CCβSubstância não-autorizada

Calcula-se o Intercepto + 2.33 sa

(α

= 0,01)

Calcula-se o Intercepto + 2.33 sa

(α

= 0,01)

Sinal de CCα

+ 1,64 sres

(α

= 0,05)

Sinal de CCα

+ 1,64 sres(α

= 0,05)

CCαCCα


Inte

rcep

to

(a)

Inte

rcep

to

(a)

(ISO 11843-2, 2000; Van Loco & Beernaert, 2003)

( )( )

2

( 2),1 211 LR

c LR res ni

x xy a bx s t

n x xα− −

−= + + + +

−∑

cy aCCb

α −=

( )( )

2

( 2),1 211c res n

i

CC xy a bCC s t

n x xβ

ββ − −

−= + − + +

−∑

Calcula-se a ordenada yc

no nível de restrição x

=

xLR

Estima-se CCαEstima-se iterativamente

CCβ

t(n-2)

: t

de student para α = 0,05

(substâncias com LR) ou α = 0,01 (se LR = 0) ;

Estima-se a, b

e sres

por regressão linear aplicada aos dados do estudo de

precisão intermediária

Características da faixaLimite de decisão (CCα)

e Capacidade de detecção (CCβ)

β = 0,05

e (n-2)

graus de liberdade

Cálculo de CCα

e CCβ

para substâncias com LRMétodo de nível único (COMMISSION DECISION 2002/657/CE)

•

Adiciona-se o analito à

matriz branca em níveis iguais ao LR em pelo menos 20 replicatas

•

Calcula-se o desvio-padrão (sLR )

•

Considera-se erro α

= 0,05

•


matriz branca em níveis iguais ao LR em pelo menos 20 replicatas

• Calcula-se o desvio-padrão (sLR )

• Considera-se erro α

= 0,05

LR + 1,64 sLR

= CCαLR + 1,64 sLR

= CCα

•


matriz branca em níveis iguais ao CCα

em

pelo menos 20 replicatas •

Calcula-se o desvio-padrão (sCCα

)

•

Considera-se erro β

= 0,05

•



em

pelo menos 20 replicatas

• Calcula-se o desvio-padrão (sCCα

)

• Considera-se erro β

= 0,05

CCα

+ 1,64 sCCα

= CCβCCα

+ 1,64 sCCα

= CCβ

Se sLR

≈

sCCα

≈

s CCβ ≈ CCa+1,64(CCa-LR)/1,64

CCβ(1)

≈

2CCa-LRs = (CCa-LR)/1,64

CCβ(1): primeira estimativa de CCβ

usada no método iterativo|Yc

(i)

– Yc(i-1)| ≤

1 x 10-10 : critério de convergência.

Cálculo de CCα

e CCβ

para substâncias banidasMétodo de nível único (COMMISSION DECISION 2002/657/CE)

•

Analisa-se amostras brancas para cada matriz em pelo menos 20 replicatas independentes;

•

Calcula-se o desvio-padrão (sLR )e CCα

pela relação sinal /ruído

•

Analisa-se amostras brancas para cada matriz em pelo menos 20 replicatas independentes;

• Calcula-se o desvio-padrão (sLR )e CCα

pela relação sinal /ruído

CCα

= Sinal / Ruído de 3:1CCα

= Sinal / Ruído de 3:1

•



em

pelo menos 20 replicatas •

Calcula-se o desvio-padrão (sCCα

)

•

Considera-se erro β

= 0,05

•



em

pelo menos 20 replicatas

• Calcula-se o desvio-padrão (sCCα

)

• Considera-se erro β

= 0,05

CCα

+ 1,64 sCCα

= CCβCCα

+ 1,64 sCCα

= CCβ

CCα

= XB

+ 3sB

CCα

= XB

+ 3sB

ou


Equivale ao conceito de LOD de CURRIE (1995)

Equivale ao conceito de LOD de CURRIE (1995)








RobustezRobustez



Limite de decisão (CCα) e capacidade de detecção (CCβ)

para avermectinas

em leite bovino

AvermectinaParâmetro (µg/L)*CCα CCβ

ABA 12,8 15,6DOR 12,9 15,9EPR 12,6 15,1IVE 13,7 17,4

*Considerando um Limite de Restrição (LR) de 10 μg/L para as avermectinas pesquisadas no leite.

Os parâmetros foram estimados utilizando os valores de recuperação do estudo de precisão intermediária, como variável resposta, para os níveis ≥

10 μg/L .

SOUZA et

al. 2007b

Limite de decisão (CCα) e capacidade de detecção (CCβ)

para organofosforados

em hortifrutícolas

AMARAL , 2007

Agrotóxicosalface banana tomate

CCα CCβ CCα CCβ CCα CCβ(цg kg-1)

clorpirifós 7,1 11,9 16,9 23,7 12,6 21,1dimetoato 9,3 15,5 11,3 19,5 1100 1100etiona 13,1 22,0 17,2 28,9 2100 2200etoprofós 6,8 11,5 10,7 17,9 10,4 17,5parationa 6,7 11,3 16,1 26,9 10,9 18,3pirimifós 5100 5300 5200 5500 11,7 19,7

Exatidão ou Veracidade





IncertezaIncerteza

Precisão intermediária


Precisão / repetitividade


RecuperaçãoRecuperaRecuperaççãoão

Melhorando a precisãoMelhorando a precisão

Mel

hora

ndo

a ex

atid

ãoM

elho

rand

o a

exat

idão

Melhora

ndo a ac

urácia

Melhora

ndo a ac

urácia

Diminuind

o a inc

erteza

Diminuind

o a inc

erteza

Exatidão e precisão: acurácia (accuracy)Exatidão e precisão: acurácia (accuracy)

(RCS/AMC Technical Brief, 2003)(RCS/AMC Technical Brief, 2003)






IncertezaIncerteza






•

É

a proximidade da concordância

entre um resultado de um teste e o valor de referência aceito

da propriedade que está

sendo medida.

•

A exatidão é

declarada quantitativamente em termos de “tendência”, com uma menor tendência indicando maior exatidão.

•

A tendência é

determinada comparando a resposta do método a de um material de referência

com o

valor conhecido declarado.

Exatidão ou veracidade (trueness)Exatidão ou veracidade (trueness)

(THOMPSON et

al., 2002)

•

O material teste é

analisado tanto em seu estado original como depois da adição de uma massa conhecida

do analito.

•

A diferença

entre os dois resultados, expressa como uma proporção da massa adicionada, fornecerá

a

recuperação.

0(%) 100an

an

X XRm−

= ×

em que R

é

a recuperação, expressa em %; Xan

é a concentração recuperada do analito; X0

a concentração original (para amostras brancas X0

= 0); man

a massa adicionada do analito.

Adição de padrão e recuperação

–

os mesmos efeitos não necessariamente se aplicam, na mesma extensão, ao analito nativo

– efeitos adicionais podem afetar o analito nativo

Falta de exatidão

•

A recuperação só

avalia a tendência devido a efeitos que operam no analito adicionado.

•

Boa recuperação não é

uma garantia de exatidão, mas baixa recuperação é

certamente uma indicação de falta

de exatidão.(THOMPSON et

al., 2002)

Critérios de aceitação -

exatidão

Fração de massa* Limites (%)c ≤

1,0 x 10–9 50 a 120

1,0 x 10–9

< c < 1,0 x 10–8 70 a 110c ≥

1,0 x 10–8 80 a 110

* adimensional: para 1 μg/kg

= 1 ppb tem-se c = 10-9

(EC 657, 2002 adaptado)

LInf

≤

Rm

≤

LSupRecuperação

Média (Rm

,%)para cada

nível estudado

Amostras brancas adicionadas de padrão






IncertezaIncerteza






Precisão

Normalmente é

especificada em termos de desvio padrão ou desvio padrão relativo.

•

A precisão avalia a dispersão de resultados

em condições definidas.

(THOMPSON et

al., 2002)

Sob condiSob condiçções deões de

ReprodutibilidadeReprodutibilidadeRepetitividadeRepetitividade

PrecisãoPrecisão

Reprodutibilidade parcial Reprodutibilidade parcial (Precisão intermedi(Precisão intermediáária)ria)

Precisão

Precisão intermediária: delineamentoPrecisão intermediária: delineamento

Analista 1Analista 1 (6 amostras)(6 amostras)

Analista 2Analista 2 (6 amostras)(6 amostras)

Dia 1Dia 1 (3 amostras)(3 amostras)

(SOUZA et

al., 2007a)(SOUZA et

al., 2007a)




12 amostras12 amostras adicionadas por nadicionadas por níívelvel

(pelo menos 5 n(pelo menos 5 nííveis veis mais amostra branca) mais amostra branca)

Critérios de aceitação -

precisão

Fração de massa* σRT

ou σRH

**c < 1,2 x 10–7 σRT

= 0,22c1,2 x 10–7

≤

c ≤

0,138 σRH

= 0,02c0,8495

c > 0,138 σRT

= 0,01c0,5

*para 1 ppm, c = 10-6; ** σR

de Thompson (σRT

) ou de Horwitz (σRH

)

(EC 657, 2002; Thompson, 2000; Horwitz, 1982)

sR

≤

(σRT

ou σRH

)ReprodutibilidadeParcial

Repetitividade sr

≤

1/2

a 2/3

(σRT

ou σRH

)

(Horwitz , 1982; Thompson, 2000)

(EC, 2002)

Critérios para aprovação de métodos de ensaio no Codex Alimentares

Aplicabilidade

•

O método tem que ser aplicável a um requisito especificado, um produto específico e a nível(eis) específico(s) (máximo/mínimo, ML). •

A faixa mínima aplicável do método depende do nível especificado (ML) a ser avaliado e pode ser expressa em função do desvio padrão de reprodutibilidade (sR

) ou dos limites LOD e LOQ. Faixa mínima aplicável

Para ML ≥

0,1 mg/kg; [ML -

3 sR

; ML + 3 sR

]Para ML <

0,1 mg/kg; [ML -

2 sR

; ML + 2 sR

]sR

(1)

= desvio padrão de reprodutibilidadeLimite de Detecção (LOD)

Para ML ≥

0,1 mg/kg; LOD ≤

ML ·

(1/10)Para

ML <

0,1 mg/kg; LOD ≤

ML ·

(1/5)Limite de Quantificação (LOQ)

Para ML ≥

0,1 mg/kg; LOQ ML ·

(1/5)Para

ML <

0,1 mg/kg; LOQ ≤

ML ·

(2/5)

PrecisãoPara ML ≥

0,1 mg/kg; valor de HorRat ≤

2(*); Para ML <

0,1 mg/kg, RSDTR

< 22%.RSDR

(2)

= desvio padrão relativo de reprodutibilidade

(*) HorRat

= sR

(observado)/sR

(calculado pela Equação de Horwitz/Thompson)

O sR(1)

e o RSDR(2)

devem ser calculados pelas equações de Horwitz/Thompson. Quando estas não forem aplicáveis (devido a um propósito analítico ou regulamentação) ou quando os métodos forem “convertidos”

em critérios, então se deve basear nos valores de sR(1)

e RSDR

(2)

obtidos de estudos colaborativos apropriado do método.

Continua...

Recuperação (R):

Concentração Relação Unidade Recuperação (%) 100 1 100% (100 g/100g) 98 –

102≥

10 10-1 ≥

10% (10 g/100g) 98 –

102≥

1 10-2 ≥

1% (1 g/100g) 97 –

103≥

0,1 10-3 ≥

0,1% (1 mg/g) 95 –

1050,01 10-4 100 mg/kg 90 –

1070,001 10-5 10 mg/kg 80 –

1100,0001 10-6 1 mg/kg 80 –

1100,00001 10-7 100 μg/kg 80 –

1100,000001 10-8 10 μg/kg 60 –

1150,0000001 10-9 1 μg/kg 40 –

120Outras diretrizes estão disponíveis para faixas de recuperação esperadas em áreas específicas de análise. Em casos nos quais foram observadas que as recuperações variam em função da matriz, outras exigências específicas devem ser aplicadas.

Exatidão (Trueness):

Preferivelmente para a avaliação da exatidão deve ser usado um material de referência certificado.

... Continuação

Critérios para aprovação de métodos de ensaio no Codex Alimentares

Recuperação e precisão: organofosforados

Agrotóxicos

Nível nominal de adição

8 цg kg-1 35 цg kg-1 62 цg kg-1

MR(1) DPRr DPRR MR(2) DPRr DPRR MR(2) DPRr DPRR

clorpirifós 92,1 9,4 10,1 91,4 9,7 9,8 92,9 6,2 6,4

dimetoato 104,0 6,5 9,5 95,7 13,0 13,0 97,6 6,3 7,3

etiona 104,2 12,8 12,8 96,1 14,3 14,3 92,4 11,2 13,1

etoprofós 86,7 10,4 17,6 94,2 7,2 7,5 92,9 6,6 7,8

parationa 92,7 11,5 15,4 94,0 8,9 9,3 96,3 5,8 6,0

pirimifós 92,5 10,2 12,0 95,2 8,5 8,7 94,3 5,3 5,7

Matriz : alface

* LOD = 5 μg kg-1, MR

= média de recuperação, DPRr

= desvio padrão relativo de repetitividade, DPRR = desvio padrão relativo de reprodutibilidade parcial. (Critérios de aceitação: 70 ≤

MR(1)

≤

110% ou 80 ≤

MR(2)

≤

110%; DPRr

≤

14,7%;

DPRR

≤

22,0%). AMARAL , 2007


Agrotóxicos

Nível nominal de adição*

8 цg kg-1 35 цg kg-1 62 цg kg-1


clorpirifós 95,5 10,0 10,7 91,9 11,8 11,8 87,9 7,4 13,1

dimetoato 91,4 12,9 20,6 90,1 14,1 14,5 90,4 5,2 10,9

etiona 94,8 8,7 9,3 97,9 9,7 11,8 94,9 5,5 21,4

etoprofós 94,7 9,3 13,5 90,4 8,4 14,4 89,8 4,7 10,1

parationa 92,1 13,3 17,8 89,1 12,4 12,4 90,1 8,6 19,4

pirimifós 88,9 9,0 13,1 90,8 11,5 11,5 88,5 7,8 14,0

Matriz : banana




MR(1)

≤

110% ou 80 ≤

MR(2)

≤

110%; DPRr

≤

14,7%;

DPRR

≤

22,0%). AMARAL , 2007


Agrotóxicos

Nível nominal de adição

8 цg kg-1 35 цg kg-1 62 цg kg-1


clorpirifós 85,1 12,8 19,3 89,5 11,4 14,7 86,5 12,9 12,9

dimetoato 93,3 13,3 17,2 94,0 10,1 11,8 84,9 12,4 14,7

etiona 81,0 9,9 20,7 88,4 10,8 16,5 84,5 10,2 10,3

etoprofós 88,1 6,3 16,9 88,0 13,1 13,8 89,0 10,4 10,4

parationa 87,5 8,2 17,7 92,5 11,5 13,1 86,4 10,3 10,3

pirimifós 83,4 8,8 17,4 92,7 12,9 16,2 87,5 11,0 11,0

Matriz : tomate




MR(1)

≤

110% ou 80 ≤

MR(2)

≤

110%; DPRr

≤

14,7%;

DPRR

≤

22,0%). AMARAL , 2007

Normalidade Normalidade

Premissas para Análise de Variância

Análise de Variância


Homogeneidade de variâncias


Pontos dispersos (outliers)


IndependênciaIndependência

Diagnosticar outliers pelo teste de Grubbs

(α

= 0,05). Remover os outliers detectados até

que não sejam

mais detectados ou até

um máximo de 22,2% dos dados originais.

Teste de Grubbs

para outliers

(BURKE, 2001b)

ouou ouou

Para cada ciclo, será

considerado outlier o resultado que fornecer G1

, G2

ou G3

superior ao valor crítico.

22

3 2

( 3)1( 1)

nn sGn s

−⎛ ⎞−= −⎜ ⎟−⎝ ⎠

22

3 2

( 3)1( 1)

nn sGn s

−⎛ ⎞−= −⎜ ⎟−⎝ ⎠

12

nX XGs−

= 12

nX XGs−

=1iX X

Gs−

=1iX X

Gs−

=

Parar *Parar *

ResResííduos duos

Teste de premissas -

Normalidade

Teste normalidadeTeste normalidade(Ryan(Ryan--Joiner)Joiner)

DistribuiDistribuiççãoãonormalnormal

((αα

= 0,05)= 0,05)

NãoNão

SimSim

TransformaTransformaççãoãodos dados dos dados

(raiz, (raiz, loglog, inverso), inverso)

Teste normalidadeTeste normalidade(Ryan(Ryan--Joiner)Joiner)

DistribuiDistribuiççãoãonormalnormal

((αα

= 0,05)= 0,05)

NãoNão

SimSim

••Impedimento para uso das distribuiImpedimento para uso das distribuiçções ões de t e F nos testes de hipde t e F nos testes de hipóóteses.teses.

ContinuarContinuar

(SOUZA & JUNQUEIRA, 2005)(SOUZA & JUNQUEIRA, 2005)

ANOVAANOVA

Teste homoscedasticidadeTeste homoscedasticidade((LeveneLevene--BrownBrown--ForsytheForsythe))

Parar*Parar*

VariânciasVariânciashomogêneashomogêneas

((αα

= 0,05)= 0,05)

SimSimNãoNão

Teste de premissas -

Homoscedasticidade

*ANOVA ponderada.*ANOVA ponderada.

ANOVAANOVA

(SOUZA & JUNQUEIRA, 2005)(SOUZA & JUNQUEIRA, 2005)

Normalidade Normalidade

Premissas para Análise de Variância







IndependênciaIndependência

QMr(N –

u) GL

QMbat

(u –

1) GL

SQ Tratamento ou Batelada(u –

1) GL

SQ Resíduo ou Repetitividade

(N –

u) GL

Análise de variânciaAnálise de variância(ANOVA)(ANOVA)

Estima

(variabilidade de batelada)

Estima

(variabilidade de repetitividade)

2batσ

SQ Total

(N –

1) GL

ForneceFornece

ForneceFornece

2rσ


Quadro ANOVA

Variância ExpressãoRepetitividade s2

r s2r

Entre bateladas s2entre

bat (s2bat - s2

r

)/nméd

Reprodutibilidade parcial s2R s2

r

+ s2entre

bat

Expressões da precisão

FV: Fonte de variação; GL: Graus de liberdade; SQ: Soma de Quadrados; QM: Quadrados Médios; u: no

de bateladas; n: no

de replicatas, n = n1 + n2

+ ....+ nu

.

Baseado em KUTTATHARMMAKUL et al., 1999; MAROTO et al., 1999

FV GL SQ QM FBatelada u -

1 SQbat s2

bat s2bat

/s2r

Repetitividade n -

u SQr s2r

Total n -

1

Recuperação, precisão e limites: avermectinas

Avermectina Parâmetro (%)Concentração adicionada (µg/L)

5 10 15 20 30ABA Rm 101,8 98,9 98,1 101,4 99,9

sr 13,9 6,7 9,5 5,8 4,1sR 14,3 9,6 11,5 8,6 8,0

DOR Rm 86,2 91,9 90,1 98 96,6sr 21,3 7,9 11,2 4,7 3,6sR 21,4 12,0 11,7 9,1 8,7

EPR Rm 81,2 92,7 90,6 94,0 96,9sr 20,2 8,7 6,7 8,0 5,0sR 20,2 9,0 7,4 8,8 8,0

IVE Rm 84,0 94,8 87,2 94,6 92,1sr 16,7 10,7 9,0 6,9 4,4sR 19,5 14,7 13,9 10,2 11,0

Rm

= média de recuperação; sr

= desvio padrão relativo de repetitividade; sR

= desvio padrão relativo de reprodutibilidade parcial. Critérios de aceitação para Rm

: 70 a 110% (para amostras adicionadas de 5 μg/L), 80 a 110% (para amostras adicionadas ≥10 μg/L). Critério de aceitação para sr

: ≤

14,7%.

Critério de aceitação para sR

: ≤

22%. Limite de detecção: 5 μg/L. Limite de quantificação: 10 μg/L.SOUZA et

al. 2007b

Recuperação: avermectinas

em leite

40

70

100

130

0 5 10 15 20 25 3040

70

100

130

0 5 10 15 20 25 30

40

70

100

130

0 5 10 15 20 25 3040

70

100

130

0 5 10 15 20 25 30

ABA (ng/mL) DOR (ng/mL)

EPR (ng/mL) IVE (ng/mL)SOUZA et

al. 2007b







RobustezRobustez



RobustezRobustezÉ

o grau de propensão de um método para sofrer

alterações devidas a variações nas condições analíticas.

Mede a confiabilidade do método em relação a parâmetros de interferência.

A avaliação da robustez deve ser considerada durante a fase de desenvolvimento

do método.

Se constatada suscetibilidade, precauções devem ser incluídas no procedimento.

Robustez

FatorCombinação de Fatores no

A B C D E F G Hi + + + + - - - -ii + + - - + + - -iii + - + - + - + -iv + + - - - - + +v + - + - - + - +vi + - - + + - - +vii + - - + - + - -

Robs s t u v w x y z

(EC 657, 2002)

O esquema fatorial de O esquema fatorial de YoudenYouden

RobustezRobustezExemplos de variações nas soluções

a) estabilidade das soluções analíticas;b) tempo de extração;

Variações típicas em cromatografia líquidaa) influência da variação de pH da fase móvel;b) influência da variação da composição da fase móvel;c) diferentes colunas (diferentes lotes e/ou fabricantes);d) temperatura;e) velocidade de fluxo;

Variações típicas em cromatografia gasosaa) diferentes colunas (diferentes lotes e/ou fabricantes);b) temperatura;c) velocidade de fluxo.

Estabilidade

Condição -20 °C +4 °C +20 °C

Escuro 10 10 10

Luz 10

Número de alíquotas para a determinação da estabilidade de um analito em solução

(EC 657, 2002)

Em análises de rotina, em que várias amostras e padrões são medidos a cada dia, é

essencial avaliar a

estabilidade das soluções, analitos e constituintes da matriz

durante o armazenamento.

•

Além dos parâmetros de desempenho do método analítico, a documentação

da validação

AplicabilidadeAplicabilidade

deverdeveráá

conter conter informainformaçções sobreões sobre

•• identidade do analito (p. ex. As total)identidade do analito (p. ex. As total)•• faixa de concentrafaixa de concentraçção validada (p. ex. 15 a 240 ão validada (p. ex. 15 a 240 μg/kg)g/kg)•• matrizes cobertas (p. ex. fmatrizes cobertas (p. ex. fíígado bovino)gado bovino)•• descridescriçção deão de

-- equipamentosequipamentos-- reagentesreagentes-- procedimento analprocedimento analííticotico-- procedimentos de calibraprocedimentos de calibraççãoão-- precauprecauçções de seguranões de seguranççaa-- aplicaaplicaçção pretendida, etc.ão pretendida, etc.

(SOUZA et

al., 2007a)

(THOMPSON et

al., 2002)

Validação de Métodos

comparação com outros métodos

comparaçõesinterlaboratoriais

comprovação da rastreabilidade

cálculo da incerteza

controle de qualidade

interno

Qualidade Analítica

Muito Obrigado

Muito Obrigado

ReferênciasReferências•

AMARAL, E. H. Resíduos de agrotóxicos organofosforados: validação

de método de cromatografia a gás e quantificação em produtos agrícolas. 2007. 135 p. UFMG: Mestrado em Ciência de Alimentos.

•

AMARAL, E. H. Resíduos de agrotóxicos organofosforados: validação de método de cromatografia a gás e quantificação em produtos agrícolas. 2007. 135 p. UFMG: Mestrado em Ciência de Alimentos.

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BURKE, S. Missing Values, Outliers, Robust Statistics & Non- parametric Methods. LC GC Europe, January: 19-24, 2001b.

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BURKE, S. Regression and calibration. LC GC Europe, January: p. 13- 18, 2001a.

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DRAPER, N.R.; SMITH, H. Applied regression analysis. New York: Wiley. 1998. 706 p.

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Part 2: Methodology in the linear calibration case.

Geneva: ISO, 2000.

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Geneva: ISO, 2000.

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MAROTO, A.; RIU, J.; BOQUÉ, R.; RIUS, F.X. Estimating uncertainties of analytical results using information from the validation process. Anal. Chim. Acta, v. 391, p. 173-185, 1999.

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MONTGOMERY, D.C.; RUNGER, G.C. Applied statistics and probability for engineers. New York: John Wiley & Sons, 1994. p. 471-624.

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MULHOLLAND, M.; HIBBERT, D.B. Linearity and the limitations of least squares calibration. J. Chromatogr. A, v. 762, p. 73-82, 1997.

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MILLER, J.C.; MILLER, J.N. Statistics for analytical chemistry. 3 ed. New York: Ellis Horwood. 1993. 233 p.

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KUTTATHARMMAKUL, S.; MASSART, D.L.; SMEYERS-VERBEKE, J. Comparison of alternative measurement methods. Anal. Chim. Acta, v. 391, p. 203-225, 1999.

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RSC

Royal Society of Chemistry Analytical Methods Committee Technical Brief: What should be done with results below the detection limit? Mentioning the unmentionable. RSC, 2001. 2 p.

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G.W.; COCHRAN

W.G. Statistical methos. 8 ed. Ames: Iowa State University, 1989. 503 p.

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SOUZA, S.V.C.

Procedimentos para validação de métodos de ensaio: delineamento, aplicações em análises de resíduos em alimentos e avaliação da eficiência. 2007. 297 p. Tese UFMG: Doutorado em Ciência de Alimentos.

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SOUZA, S.V.C.; JUNQUEIRA, R.G. A procedure to assess linearity by ordinary least squares method. Analytica Chimica Acta, v. 552, p. 25-

35, 2005.

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RSC

Royal Society of Chemistry. Analytical Methods Committee Technical Brief: Is my calibration linear? RSC, 2000. 2 p.

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STATSOFT

Electronic textbook. Tulsa: StatSoft, Inc. 1989. [http://www. statsoft.com/textbook/] acesso em 15/06/2010

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SOUZA, S.V.C.; PINTO, C.T.; JUNQUEIRA, R.G. In-house method validation: Application in arsenic analysis. Journal of Food Composition and Analysis, v. 20, p. 241-247, 2007a.

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S.V.C.; LIMA, J.A.; TEODORO, J.C.; JUNQUEIRA, R.G. Validação intralaboratorial

de método quantitativo para determinação

múltipla de resíduos de avermectinas

em leite bovino por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção de fluorescência. Ciência e Tecnologia de Alimentos, v. 27, p. 823-836, 2007b.

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SOUZA,

S.V.C.; JUNQUEIRA, R.G.; GINN, R. Analysis of semicarbazide

in baby food by liquid chromatography tandem mass

spectrometry (LC-MS-MS) –

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ReferênciasReferências•

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and sub-ppb concentrations in relation to fitness for purpose criteria in proficiency testing. Analyst, v. 125, p. 385-386, 2000.

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VAN LOCO, J.; BEERNAERT, H. In: Proceedings of European Food Chemistry, 12, 2003, Brugges, Belgium. Proceedings. Brugges: European Food Chemistry, 2003. p. 91-94.

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THOMPSON, M.; ELLISON, S.L.R.; WOOD, R. Harmonized guidelines for singlelaboratory validation of methods of analysis. Pure Appl.

Chem., v. 74, p. 835-855, 2002.

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validação de metodologias para análises físico …abrapaalimentos.com.br/documentos/simposio...

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