Universidade Federal de Santa Catarina Centro Tecnolgico

Departamento de Engenharia Qumica e Engenharia de Alimentos Programa de Ps-Graduao em Engenharia Qumica

Uso Racional de Ferramentas de Engenharia Metablica:

Produo Bacteriana de Hidrognio e de Violacena

ERLON MENDES

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Engenharia Qumica da

Universidade Federal de Santa Catarina como requisito parcial para obteno do grau de

Mestre em Engenharia Qumica

Orientador: Prof. Dr. Luismar Marques Porto (EQA/UFSC)

Florianpolis, SC 2006

Erlon Mendes

Uso Racional de Ferramentas de Engenharia Metablica: Produo Bacteriana de Hidrognio e de Violacena

Esta dissertao foi julgada e aprovada para obteno do grau de Mestre em

Engenharia Qumica no Programa de Ps-Graduao em Engenharia Qumica da Universidade Federal de Santa Catarina

rea de Concentrao

Processos Qumicos e Biotecnolgicos

________________________________________ Prof. Dr. Luismar Marques Porto

Orientador

________________________________________ Prof. Dr. Agenor Furigo Junior

Coordenador do Programa de Ps-Graduao em Engenharia Qumica

Banca Examinadora:

______________________________ Prof. Dr. Luismar Marques Porto

Orientador

______________________________ Prof. Dr. Agenor Furigo Junior

Membro Interno

______________________________ Profa Dra Cntia Soares

Membro Externo

Florianpolis, SC, Maro de 2006

2

Mendes, Erlon Uso Racional de Ferramentas de Engenharia Metablica: Produo Bacteriana de Hidrognio e de Violacena. Dissertao (Mestrado) Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Ps-Graduao em Engenharia Qumica. 1. Ferramentas de Engenharia Metablica 2. Hidrognio 3. Violacena 4. MFA 5. MCA

3

Este trabalho parte integrante das pesquisas realizadas pelo Grupo de Engenharia Genmica e foi desenvolvido no Laboratrio de Tecnologias Integradas (InteLAB) do Departamento de Engenharia Qumica e Engenharia de Alimentos, Universidade Federal de Santa Catarina.

4

Dedico este trabalho aos meus pais, Ausemir e Acionir, ao meu irmo Elton e minha

namorada Zenair por todo o apoio, compreenso e amor dedicados neste momento

to importante da minha vida.

Muito Obrigado!

5

AGRADECIMENTOS

Agradeo ao Professor Luismar Marques Porto pela oportunidade de

estudar uma rea super interessante e absolutamente nova para mim, pelos

conhecimentos prestados, pela orientao, apoio e amizade.

Agradecimento especial aos colegas Gisele Serpa, Daniela Muccillo,

Julia Vasconcellos Castro e Itamar Leite de Oliveira por todo o apoio,

companheirismo, e grandes idias que me ajudaram muito na realizao deste

trabalho.

A todos os colegas do InteLAB, por contriburem de alguma forma para

a realizao deste trabalho.

Coordenadoria de Ps-Graduao em Engenharia Qumica.

Agradecimento muito especial aos meus pais Ausemir e Acionir, meu

irmo Elton e minha namorada Zenair por toda a compreenso, apoio, amor e

carinho dedicados durante toda a minha vida, e que me fizeram chegar at

aqui.

6

SUMRIO

NDICE DAS FIGURAS________________________________________________ 9 NDICE DAS TABELAS ______________________________________________ 12 NOMENCLATURA___________________________________________________ 13 LISTA DE ABREVIATURAS___________________________________________ 14 RESUMO ___________________________________________________________ 17 ABSTRACT _________________________________________________________ 18 CAPTULO I ________________________________________________________ 19

Introduo, Motivao e Justificativa ________________________________________ 19 CAPTULO II _______________________________________________________ 22

Reviso Bibliogrfica______________________________________________________ 22 2.1. A anlise e o controle de fluxos metablicos___________________________________22 2.1.1. A anlise de fluxo metablico ______________________________________________22 2.1.1.1. A teoria _____________________________________________________________23 2.1.2. A anlise de controle metablico____________________________________________25 2.2. A abordagem tradicional, pela maximizao da biomassa ________________________27 2.3. A minimizao da energia livre como alternativa biolgica _______________________29 2.4. A produo biolgica de hidrognio _________________________________________30 2.5. A produo de violacena _________________________________________________36

CAPTULO III ______________________________________________________ 39 Materiais e Mtodos_______________________________________________________ 39

3.1. Toolbox de Engenharia Metablica para o MATLAB, ME Toolbox _______________39 3.1.1. Mtodos Computacionais _________________________________________________42 3.1.1.1. Estimativa dos fluxos no medidos________________________________________42 3.1.1.2. Reconciliao estatstica das medidas______________________________________42 3.1.1.3. Anlise de sensibilidade ________________________________________________43 3.1.1.4. Criando a matriz estequiomtrica G ______________________________________44 3.1.2. Utilizando o ME Toolbox para anlise de fluxo metablico (MFA) _________________45 3.1.3. Utilizando o ME Toolbox para MFA com mtodos de istopos marcados (MFAIL)____46 3.1.4. Utilizando o ME Toolbox para MFA de sistemas subdeterminados utilizando programao linear (MFAOP)________________________________________________________________49 3.1.5. Utilizando o ME Toolbox para MCA de vias metablicas lineares (MCA) ___________51 3.1.6. Utilizando o ME Toolbox para MCA de pontos de bifurcao (MCAB) _____________53 3.2. Estudo de caso I: anlise de fluxo metablico para a produo de hidrognio por Clostridium butyricum ___________________________________________________________54 3.3. Estudo de caso II: anlise de fluxo metablico para a produo de violacena por Chromobacterium violaceum______________________________________________________60 3.4. Estudo de caso III: anlise de fluxo metablico para um modelo simplificado do metabolismo central de uma clula animal ___________________________________________65

CAPTULO IV_______________________________________________________ 69 Resultados e Discusso ____________________________________________________ 69

4.1. Estudo de caso I: anlise de fluxo metablico para a produo de hidrognio por Clostridium butyricum ___________________________________________________________69 4.1.1. Classificao do sistema __________________________________________________69 4.1.2. Estimativa dos fluxos no medidos da rede metablica no regime estacionrio ________69 4.1.3. Melhoramento estatstico das medidas _______________________________________71 4.1.4. Anlise de sensibilidade __________________________________________________74

7

4.1.5. Validao da hiptese de minimizao do gasto energtico. Anlise de fluxo metablico para produo de hidrognio usando a funo MFAOP _________________________________78 4.2. Estudo de caso II: anlise de fluxo metablico para a produo de violacena por Chromobacterium violaceum______________________________________________________80 4.3. Estudo de caso III: anlise de fluxo metablico para um modelo simplificado do metabolismo central de uma clula animal ___________________________________________84 4.4. Exemplos hipotticos do uso das funes MCA e MCAB ________________________87

CAPTULO V _______________________________________________________ 94 Concluses e Sugestes ____________________________________________________ 94

5.1. Concluses_____________________________________________________________94 5.2. Sugestes para trabalhos futuros ____________________________________________95

CAPTULO VI_______________________________________________________ 97 Referncias Bibliogrficas__________________________________________________ 97

CAPTULO VII _____________________________________________________ 100 Apndice _______________________________________________________________ 100

7.1. Funo MFA do ME Toolbox _____________________________________________100 7.2. Funo MFAIL do ME Toolbox ___________________________________________103 7.3. Funo AMM do ME Toolbox ____________________________________________107 7.4. Funo MFAOP do ME Toolbox __________________________________________108 7.5. Funo MCA do ME Toolbox_____________________________________________110 7.6. Funo KINETICS do ME Toolbox ________________________________________112 7.7. Funo ELASTICITY do ME Toolbox______________________________________114 7.8. Funo MCAB do ME Toolbox ___________________________________________115 7.9. Funo KINETICSB do ME Toolbox _______________________________________118 7.10. Funo ELASTICITYB do ME Toolbox ____________________________________119

8

NDICE DAS FIGURAS

Figura 1 Ilustrao da programao linear. A soluo tima est contida na linha AB no quadrante no negativo do espao soluo. A funo objetivo consiste numa famlia de linhas (das quais trs so mostradas). A linha que maximiza a funo objetivo intercepta a linha AB em (x,y) = (0,4), que representa a soluo para este problema de otimizao. ________________________________________________________________ 28 Figura 2 Modelo esquemtico de produo de hidrognio via biofotlise direta. Fd representa a enzima ferrodoxina, e H2ase a enzima hidrogenase. _________________ 31 Figura 3 Modelo esquemtico de produo de hidrognio via biofotlise indireta. _ 32 Figura 4 Modelo esquemtico de produo de hidrognio via foto-fermentao. N2ase representa a enzima nitrogenase. _____________________________________________ 33 Figura 5 Modelo esquemtico de produo de hidrognio via fermentao escura._ 34 Figura 6 Biossntese de violacena, conforme proposta por August et al. (2000). Vio A, Vio B, Vio C e Vio D so genes que formam o operon de produo da violacena. Os metablitos so: a) Triptofano, b) 5-Hidroxitriptofano, c) cido indol pirvido, d) cido D-2-amino-2-(3-indol) propinico, e) Pr-desoxiviolacena, f) Oxindol violacena, g) Violacena, h) Oxi-violacena, i) Desoxiviolacena. ____________________________ 37 Figura 7 Via metablica linear generalizada. __________________________________ 51 Figura 8 Exemplo de um ponto de bifurcao em uma via metablica. ___________ 53 Figura 9 Esquema mostrando o modelo para o metabolismo do hidrognio. O modelo metablico apresenta dois substratos, glicose e glicerol, formando gliceraldedo-3-fosfato e gerando etanol, butirato e acetato. A partir do glicerol ainda formado o 1,3-propanodiol. O hidrognio formado pelo sistema lateral onde a ferrodoxina (Fd) oxidada formando H2, sendo novamente reduzida pelo piruvato fechando o ciclo. __ 55 Figura 10 Esquema de vias metablicas mostrando o modelo para a biossntese de violacena por Chromobacterium violaceum. O esquema est simplificado, no mostrando todas as etapas intermedirias que geraram as 95 reaes usadas na matriz estequiomtrica. O modelo utiliza dois substratos, glicose e glicerol. Foram consideradas as reaes de formao de biomassa, aminocidos, nucleotdeos, a via das pentoses e a via de produo da violacena. ____________________________________ 61 Figura 11 Esquema mostrando o modelo simplificado para o metabolismo central de uma clula animal. _________________________________________________________ 65 Figura 12 Fluxos obtidos por balano de massa simples para a rede de reaes em estudo e alimentao com glicose. Grfico de sada do ME Toolbox. _______________ 70

9

Figura 13 Fluxos obtidos por balano de massa simples para a rede de reaes em estudo e alimentao com glicerol. Grfico de sada do ME Toolbox. ______________ 71 Figura 14 Novos fluxos obtidos por balano de massa e melhoramento estatstico para a rede de reaes em estudo e alimentao com glicose. Grfico de sada do ME Toolbox. __________________________________________________________________ 73 Figura 15 Novos fluxos obtidos por balano de massa e melhoramento estatstico para a rede de reaes em estudo e alimentao com glicerol. Grfico de sada do ME Toolbox. __________________________________________________________________ 74 Figura 16 Sensibilidade acumulada para todos os fluxos medidos. Grfico de sada do ME Toolbox. _______________________________________________________________ 76 Figura 17 Sensibilidade do fluxo de H2 a variaes nos fluxos medidos. Grfico de sada do ME Toolbox. _______________________________________________________ 77 Figura 18 Comparao entre os fluxos obtidos pela funo MFA (a) e os estimados pela funo MFAOP (b). Grficos de sada do ME Toolbox. ______________________ 78 Figura 19 Comparao entre as sensibilidades acumuladas (a e b), e do H2 (c e d), obtidas pela funo MFA (a e c) e as obtidas pela funo MFAOP (b e d). Grficos de sada do ME Toolbox. _______________________________________________________ 79 Figura 20 Fluxos da Chromobacterium violaceum obtidos por otimizao linear usando a minimizao do gasto energtico como funo objetivo. Os fluxos esto classificados de acordo com a Tabela (12). Grfico de sada do ME Toolbox. ________ 81 Figura 21 Sensibilidade acumulada para todos os fluxos extracelulares. Grfico de sada do ME Toolbox. _______________________________________________________ 82 Figura 22 Sensibilidade do fluxo de violacena a variaes nos fluxos extracelulares. Grfico de sada do ME Toolbox. _____________________________________________ 83 Figura 23 Taxas dos fluxos medidos e no medidos. Grfico de sada do ME Toolbox.__________________________________________________________________________ 84

Figura 24 Fraes de distribuio dos carbonos marcados como resposta a molculas de piruvato marcadas no terceiro carbono. a) piruvato, b) isocitrato, c) -cetoglutarato, d) succinato, e) malato e f) oxaloacetato. Grficos de sada do ME Toolbox._________ 85 Figura 25 Fraes de distribuio dos carbonos marcados como resposta a molculas de -cetoglutarato marcadas no terceiro carbono. a) piruvato; b) isocitrato; c) -cetoglutarato; d) succinato; e) malato e f) oxaloacetato. Grficos de sada do ME Toolbox. __________________________________________________________________ 86 Figura 26 Modelagem de uma via metablica linear de quatro enzimas com inibio do metablito 3 sobre a enzima 2. O grfico mostra as concentraes de cada metablito (X1, X2 e X3), o fluxo metablico no estado estacionrio (J) e os coeficientes

10

de controle de fluxo para cada enzima da via metablica (C1, C2, C3 e C4). Grficos de sada do ME Toolbox. _______________________________________________________ 88 Figura 27 Modelagem de uma via metablica linear de quatro enzimas sem inibio. O grfico mostra as concentraes de cada metablito (X1, X2 e X3), o fluxo metablico no estado estacionrio (J) e os coeficientes de controle de fluxo para cada enzima da via metablica (C1, C2, C3 e C4). Grficos de sada do ME Toolbox. __________________ 89 Figura 28 Esquema de uma via bifurcada composta por quatro reaes, uma de consumo do substrato e trs de produo de produtos. __________________________ 90 Figura 29 Modelagem de uma via metablica bifurcada de quatro enzimas, uma reao de produo e trs de consumo do metablito. O grfico mostra a concentrao do metablito (X), cada um dos fluxos metablicos no estado estacionrio (J1, J2, J3 e J4) e os coeficientes de controle de fluxo para cada enzima da via metablica (C1, C2, C3 e C4). Grficos de sada do ME Toolbox. ____________________________________ 91 Figura 30 Esquema de uma via bifurcada composta por quatro reaes, duas de consumo de substratos e duas de produo de produtos. ________________________ 92 Figura 31 Modelagem de uma via metablica bifurcada de quatro enzimas, duas reaes de produo e duas de consumo do metablito. O grfico mostra a concentrao do metablito (X), cada um dos fluxos metablicos no estado estacionrio (J1, J2, J3 e J4) e os coeficientes de controle de fluxo para cada enzima da via metablica (C1, C2, C3 e C4). Grficos de sada do ME Toolbox. ____________________________ 93

11

NDICE DAS TABELAS

Tabela 1 Descrio do ME Toolbox.__________________________________________ 40 Tabela 2 Utilizao das funes do ME Toolbox. ______________________________ 41 Tabela 3 Parmetros da funo MFA. ________________________________________ 46 Tabela 4 Parmetros da funo MFAIL. ______________________________________ 47 Tabela 5 Parmetros da funo MFAOP. _____________________________________ 49 Tabela 6 Parmetros da funo MCA.________________________________________ 52 Tabela 7 Parmetros da funo MCAB. ______________________________________ 54 Tabela 8 Modelo de reaes metablicas para produo de hidrognio por Clostridium butyricum. _____________________________________________________ 56 Tabela 9 Matriz estequiomtrica (G) para a via metablica proposta. _____________ 57 Tabela 10 Fluxos medidos para as condies de alimentao com glicose e glicerol (Sait-Amans et al., 2000). ____________________________________________________ 58 Tabela 11 Energia livre de oxidao por NAD+ a 25C (Metzler, 1977).____________ 60 Tabela 12 Modelo de reaes metablicas para produo de violacena em Chromobacterium violaceum.________________________________________________ 62 Tabela 13 Energia livre de oxidao por NAD+ a 25C (Metzler, 1977).____________ 64 Tabela 14 Modelo de reaes metablicas para o metabolismo central simplificado. 66 Tabela 15 Fluxos medidos para as condies de alimentao com glicose e glicerol (Sait-Amans et al., 2000) e as novas estimativas obtidas pelo melhoramento estatstico.__________________________________________________________________________ 72

Tabela 16 Sensibilidade dos fluxos calculados em relao a variaes nos fluxos medidos. __________________________________________________________________ 75

12

NOMENCLATURA

C nmero condicional. JiC coeficiente de controle de fluxo da enzima i sobre o fluxo J.

resduo das medidas [ ]( )seca clula11 ghmmol . iE variao na atividade da enzima i. iX j

coeficiente de elasticidade da i-sima taxa de reao, vi, em relao concentrao do metablito j, Xj. G matriz estequiomtrica. Gc matriz estequiomtrica dos fluxos calculados. Gm matriz estequiomtrica dos fluxos medidos. h funo teste. J fluxo da via no estado estacionrio [ ]( )seca clula11 ghmmol . rmet taxas de sntese dos intermedirios nas reaes da via metablica [ ]( )seca clula11 ghmmol . velocidade especfica de crescimento ( )1h . v vetor dos fluxos de cada reao [ ]( )seca clula11 ghmmol . vc vetor dos fluxos calculados [ ]( )seca clula11 ghmmol .

newc,v novo vetor dos fluxos calculados, obtido aps a reconciliao estatstica das medidas [ ]( )seca clula11 ghmmol . vi taxa da reao i [ ]( )seca clula11 ghmmol . vm vetor dos fluxos medidos [ ]( )seca clula11 ghmmol .

newm,v novo vetor dos fluxos medidos, obtido aps a reconciliao estatstica das medidas [ ]( )seca clula11 ghmmol . Xj concentrao do metablito j [ ]( )seca clula1 gmmol . Xmet vetor das concentraes dos metablitos [ ]( )seca clula1 gmmol .

13

LISTA DE ABREVIATURAS

3DDAH7P 3-Desoxi-D-arabinoheptulosonato-7-fosfato 3HBCOA 3-Hidroxibutiril-CoA 3HPRAL 3-Hidroxi-propionaldedo 3PDGL 3-P-D-glicerato 3PSME o-(1-Carboxivinil)-3-D-shiquimato 5HTRP 5-Hidroxitriptofano 5MTA 5-Metiltioadenosina AACOA Acetoacetil-CoA AC Acetato ACCOA Acetil-CoA ACP Acetil-fosfato ACTAL Acetaldedo ADP Adenosina difosfato AICAR 5-Fosforibosil-5-amino-4-imidazol carboxamida AIPRO cido D-2-amino-2-(3-indol) propinico AKG -Cetoglutarato ALA Alanina AMP Adenosina monofosfato AN Antranilate ARG Arginina ASER o-Acetilserina ASN Asparagina ASP Aspartato ASPSA Aspartato -semialdedo ATP Adenosine trifosfato BUCOA Butiril-CoA BUTP Butiril-fosfato CAP Carbamoil fosfato CHOR Corismato CIT Citrulina COA Coenzima A-SH CRCOA Crotonil-CoA CYS Cistena D23PIC 2,3-Dihidrodipicolinato D26PIM l,l-2,6-Diaminopimelato D6PGC D-6-Fosfoglucano--lactona DHAC Dihidroxiacetona DHAP Dihidroxiacetona-fosfato DIMGP D-Eritromidazoleglicerol-fosfato DQT 3-Dehidroquinato DSAM SAM Descarboxilado E4P Eritrose-4-fosfato F1,6P Frutose-1,6-bifosfato

14

F6P Frutose-6-fosfato FAD Flavina adenina dinucleotdeo oxidada FADH2 Flavina adenina dinucleotdeo reduzida FCC Coeficiente de controle de fluxo Fd(ox) Ferrodoxina em seu estado oxidado Fd(red) Ferrodoxina em seu estado reduzido FUM Fumarato G1P Glicose-1-fosfato G3P Gliceraldedo-3-fosfato G6P Glicose-6-fosfato GDP Guanosina difosfato GL Glicerol GL3P Glicerol-3-fosfato GLC Glicose GLN Glutamina GLU Glutamato GLUP Glutamil fosfato GLX Glioxilato GLY Glicina GTP Guanosina trifosfato H2ase Hidrogenase HCYS Homocistena HIS Histidina HISOLP 1-Histidinol-fosfato HPHPYR p-Hidroxi fenilpiruvato HSER Homocerina ICIT Isocitrato ILE Isoleucina IMACP Imidazol acetil-fosfato IPYR cido indol pirvido LYS L-Lysine MAL Malato MCA Anlise de controle metablico (do ingls metabolic control analysis) MET Metionina METTHF 5,10-Metileno tetrahidrofolato MFA Anlise de fluxo metablico (do ingls metabolic flux analysis) MTHF 5,10-Metil tetrahidrofolato N2ase Nitrogenase NAD Nicotinamida adenina dinucleotdeo oxidada NADH Nicotinamida adenina dinucleotdeo reduzida NADP Nicotinamida adenina dinucleotdeo fosfato oxidada NADPH Nicotinamida adenina dinucleotdeo fosfato reduzida NAGLU N-Acetil glutamato NPRAN N-5-Fosforibosil-antranilato OA Oxaloacetato OBUT Oxobutirato

15

OIVAL Oxoisovalerato OIVIO Oxiviolacena ORN Ornitina PEMFC Clulas de combustvel de membrana trocadora de prtons (do ingls proton exchange membrane fuel cells). PEP Fosfoenolpiruvato PFL Piruvato formato liase PFOR Piruvato ferrodoxina (flavodoxina) oxiredutase PHE Fenilalanina PHEN Prefenato PHPYR Fenilpiruvato PI Fosfato inorgnico PIP26DX -Piperidina-2,6-dicarboxilato PPI Pirofosfato PRBATP Fosforibosil-ATP PRO Prolina PRPP Fosforibosil pirofosfato PTRSC Putrecina PVIO Prodesoxiviolacena PYR Piruvato R5P Ribose-5-fosfato RL5P D-Ribulose-5-fosfato S7P D-Sedoheptulose-7-fosfato SER Serina SME Shiquimato SME5P Shiquimato-5-fosfato SPRMD Spermidina SUCC Succinato SUCCOA Succinil-CoA T3P1 Gliceraldedo-3-fosfato T3P2 Dihidroxiacetona-fosfato THF Tetrahidrofolato THR Treonina TRP Triptofano TYR Tirosina VAL Valina VIO Violacena X5P Xilulose-5-fosfato

16

RESUMO

MENDES, Erlon. Uso Racional de Ferramentas de Engenharia Metablica: Produo Bacteriana de Hidrognio e de Violacena. 2006. 117p. Dissertao (Mestrado em Engenharia Qumica) Programa de Ps-Graduao em Engenharia Qumica, UFSC, Florianpolis, SC. A quantificao da magnitude de cada um dos fluxos celulares sempre foi um importante objetivo na engenharia metablica, principalmente com relao produo de metablitos de interesse comercial ou cientfico. Uma ferramenta poderosa para determinao das taxas dos fluxos em vias metablicas a anlise de fluxo metablico (MFA), onde taxas de fluxos intracelulares so calculadas usando modelos estequiomtricos de uma gama de reaes intracelulares e aplicao de balanos de massa. No entanto, MFA por si s no fornece qualquer medida quantitativa do controle de fluxo, que importante para manter as taxas de sntese e converso diante de uma grande gama de condies externas. Alm disso, o entendimento dos controles de fluxo importante para modificao racional dos fluxos metablicos, que um dos objetivos centrais da engenharia metablica. Tal informao fornecida pela anlise de controle metablico (MCA). O MATLAB apresenta uma famlia de funes que servem a aplicaes especficas, chamadas toolboxes. Toolboxes so colees de funes do MATLAB (arquivos .M) que estendem o ambiente do MATLAB para resolver classes particulares de problemas. O presente trabalho tem como objetivo principal a apresentao de um toolbox para o MATLAB que integra a maioria das ferramentas e clculos em anlise de fluxo metablico (MFA) e anlise de controle metablico (MCA), o ME Toolbox. A verso atual do ME Toolbox permite a obteno de fluxos intracelulares, melhoria dos fluxos por reconciliao estatstica, anlise de sensibilidade, anlise de fluxo metablico usando mtodos de marcadores isotpicos, e anlise de controle metablico para redes lineares e bifurcadas, abrangendo assim uma grande gama de possibilidades em engenharia metablica. O ME Toolbox foi aplicado para produo de hidrognio por Clostridium butyricum, um potencial substituto para combustveis base de carbono, e para produo de violacena por Chromobacterium violaceum, pigmento de cor violeta que apresenta atividade antimicrobiana, antiviral, e antitumoral. Palavras Chave: Ferramentas de Engenharia Metablica, Hidrognio, Violacena, MFA e MCA.

17

ABSTRACT MENDES, Erlon. Rational Use of Metabolic Engineering Tools: Hydrogen and Violacein Bacterial Production. 2006. 117p. Dissertation (Masters Degree in Chemical Engineering) Post-Graduation Program in Chemical Engineering, UFSC, Florianpolis, SC. Quantification of the magnitude of each cellular flux was always an important objective in metabolic engineering, mostly concerned with commercial and scientific metabolite production. A powerful tool for flux rate determinations in metabolic pathways is the metabolic flux analysis (MFA). Using MFA one may calculate intracellular flux rates, starting from a stoichiometric model for the various intracellular reactions and mass balance. However, MFA by itself does not supply any quantitative information on the control of fluxes, an important goal for keeping the rates of synthesis and conversion over a great range of external conditions. Besides, the understanding of the flux controls is important for the rational modification of metabolic fluxes, which is one of the main objectives of metabolic engineering. Such information is supplied by the metabolic control analysis (MCA). A family of MATLAB add-on application-specific solutions for solving metabolic engineering problems was used in this study. MATLAB toolboxes are comprehensive collections of MATLAB M-files that extend the MATLAB environment. The present work has as main objective the presentation of a toolbox for MATLAB that integrates most of the tools and calculations in metabolic flux analysis (MFA) and metabolic control analysis (MCA), the ME Toolbox. The current version of the ME Toolbox allows calculation of intracellular fluxes, improvement of fluxes by statistical reconciliation, and to perform sensitivity analysis, metabolic flux analysis using isotope labeling methods, and metabolic control analysis for linear and branched pathways. Those techniques embrace a great range of possibilities in metabolic engineering. The ME Toolbox was applied for hydrogen production by Clostridium butyricum, an interesting substitute for carbon based fuel, and for violacein production by Chromobacterium violaceum, a violet pigment that presents antimicrobial, antiviral and anticancer activities. Keywords: Metabolic Engineering Tools, Hydrogen, Violacein, MFA and MCA.

18

CAPTULO I

Introduo, Motivao e Justificativa

A manipulao de vias metablicas com o objetivo de favorecer

microrganismos com propriedades desejveis um desejo muito antigo

(Stephanopoulos et al., 1998). Existem vrios exemplos bem sucedidos dessas

estratgias na produo de aminocidos, antibiticos, solventes e vitaminas. O

desenvolvimento de tcnicas de biologia molecular para recombinao do DNA

introduziu uma nova dimenso para a manipulao de vias metablicas. A

engenharia gentica permitiu a modificao precisa de reaes enzimticas

especficas em vias metablicas e, portanto, a construo de conhecimentos

genticos bem definidos, que permitem o desenvolvimento de organismos

metabolicamente engenheirados.

A engenharia metablica define-se como

o melhoramento dirigido de formao de produtos ou propriedades

celulares atravs da modificao de reaes bioqumicas especficas ou a

introduo de novas com o uso da tecnologia de DNA recombinante

(Stephanopoulos et al., 1998).

A obteno do alvo da modificao ou introduo de uma reao

especfica uma caracterstica essencial da engenharia metablica. A

quantificao da magnitude de cada um dos fluxos intracelulares sempre foi

um importante objetivo na engenharia metablica, principalmente com relao

produo de metablitos de interesse comercial. Uma ferramenta poderosa

para determinao das taxas dos fluxos em vias metablicas a anlise de fluxo

metablico (MFA, do ingls metabolic flux analysis), onde taxas de fluxos

intracelulares so calculadas usando modelos estequiomtricos de uma gama

de reaes intracelulares e a aplicao de balanos de massa.

No entanto, MFA por si s no fornece qualquer medida quantitativa

do controle de fluxo, que importante para manter as taxas de sntese e

converso diante de uma grande gama de condies externas. Alm disso, o

19

entendimento dos controles de fluxo importante para a modificao racional

dos fluxos metablicos, que um dos objetivos centrais da engenharia

metablica. Tal informao fornecida pela anlise de controle metablico

(MCA, do ingls, metabolic control analysis), que auxilia na descoberta da

resposta do fluxo metablico a uma pequena variao na atividade de uma

enzima.

Neste trabalho, esses conceitos foram testados em dois estudos de caso:

a produo de hidrognio por Clostridium butyricum, e a produo de violacena

por Chromobacterium violaceum.

A maior parte da necessidade global de energia dependente de

combustveis fsseis que, alm de serem fontes no renovveis e cada vez mais

escassas, ainda causam srias variaes climticas devido emisso dos gases

poluentes gerados como resultado de suas combustes. Com o objetivo de

remediar a escassez de combustveis fsseis e seus graves problemas

ambientais, o hidrognio tem sido sugerido como carreador de energia do

futuro. O hidrognio considerado o combustvel do futuro devido a sua alta

eficincia na converso, reciclabilidade e natureza no poluente. A produo

biolgica de hidrognio apresenta menor impacto ambiental e menor

necessidade energtica se comparada com os processos termoqumicos e

eletroqumicos (Debabrata e Nejat, 2001).

A produo biolgica de hidrognio por via bacteriana constitui-se,

pois, em um interessante modelo para o estudo de engenharia metablica,

sobretudo quando se considera a possibilidade de maximizar as principais

fontes energticas que, no futuro, podero ser substitudas.

Um outro modelo metablico interessante, e que vem sendo

amplamente estudado pelo Grupo de Engenharia Genmica, a produo de

violacena por Chromobacterium violaceum. O estudo para a sua produo em

larga escala pode se beneficiar do conhecimento dos fluxos intracelulares que

fazem parte da sua via de biossntese, e a sensibilidade do fluxo em estudo a

20

variaes nos fluxos extracelulares pode indicar as rotas mais eficientes de

mutao gentica para obteno de uma bactria superprodutora de violacena.

Para tornar a metodologia desenvolvida para estudos de engenharia

metablica um conjunto de ferramentas teis para a anlise da produo de

metablitos secundrios, foram estabelecidos os seguintes objetivos especficos:

Desenvolvimento da tcnica de minimizao de energia livre para a anlise de vias metablicas;

Anlise de fluxo metablico para a produo de hidrognio por Clostridium butyricum;

Anlise de fluxo metablico para a produo de violacena por Chromobacterium violaceum;

Integrao de tcnicas computacionais de engenharia metablica em um toolbox para o MATLAB.

Como parte deste trabalho, criou-se o ME Toolbox (Metabolic

Engineering Toolbox), que permite a realizao semi-automtica de anlises de

fluxo metablico, o estudo de controle de fluxos atravs de parmetros de

controle, e a distribuio de isotopmeros. Neste ltimo caso, o toolbox foi

testado para o metabolismo central de uma clula animal.

21

CAPTULO II

Reviso Bibliogrfica

2.1. A anlise e o controle de fluxos metablicos

2.1.1. A anlise de fluxo metablico

A quantificao da magnitude dos fluxos metablicos in vivo um

importante objetivo em fisiologia celular e engenharia metablica,

principalmente no que diz respeito produo de produtos teis

comercialmente e cientificamente. A anlise de fluxo metablico uma

metodologia eficiente para a obteno dos fluxos metablicos, onde as reaes

intracelulares so quantificadas a partir de fluxos extracelulares utilizando

modelos estequiomtricos e tcnicas de balano de massa.

A anlise de fluxo metablico no s permite a quantificao de fluxos

intracelulares, como tambm indica as rotas mais eficientes para o melhor

aproveitamento do substrato na produo de um metablito de interesse, como,

por exemplo, a obteno de mutantes super-produtores do metablito desejado.

A anlise de fluxo metablico ainda fornece vrias informaes

adicionais (Stephanopoulos et al., 1998):

Identificao dos controles dos pontos de bifurcao possvel, atravs da separao de fluxos em diferentes condies e com diferentes mutantes,

saber a flexibilidade ou a rigidez de pontos de bifurcao.

Identificao de vias metablicas alternativas A formulao da estequiometria das reaes, que a base do MFA, requer conhecimento

detalhado da rota bioqumica atual, pela qual os substratos so

convertidos em produtos. Isso, no entanto, pode no ser claro para

muitos microorganismos e muitas vias metablicas alternativas podem

ser identificadas.

22

Clculo de fluxos extracelulares no medidos Em alguns casos, o nmero de fluxos extracelulares que podem ser medidos menor do que o

necessrio para o clculo de fluxos intracelulares desconhecidos. Nesses

casos, possvel obter tais fluxos usando programao linear.

Clculo de rendimentos tericos mximos A separao dos fluxos pode ser ajustada de forma a maximizar a quantidade do produto formado e

ainda identificar os metablitos limitantes.

2.1.1.1. A teoria

A forma geral da equao do balano de massa para um estado varivel

dada pela seguinte equao diferencial (Stephanopoulos et al., 1998):

metmetmet XrX =

dtd . (1)

O primeiro termo do lado direito representa a rede de taxas de sntese

dos intermedirios nas reaes da via metablica. O segundo termo descreve a

diluio do conjunto de metablitos devido ao crescimento da biomassa. No

entanto, devido ao baixo nvel intracelular da maioria dos metablitos, tais

efeitos de diluio so considerados muito pequenos se comparados com os

fluxos que afetam os mesmos metablitos. Isso faz com que o segundo termo do

lado direito da Equao (1) seja usualmente considerado zero. Admitindo que

exista uma alta regenerao da maioria dos metablitos, suas concentraes

rapidamente se ajustam aos novos nveis, fazendo com que a hiptese de estado

pseudo-estacionrio seja aplicvel. Isso faz com que o primeiro termo da

Equao (1) seja igualado zero. As taxas de sntese de cada reao podem ser

decompostas como o produto da transposta da matriz estequiomtrica e o vetor

de todas as taxas de reao. Logo, chega-se ao seguinte balano simplificado:

vGr0 met'== , (2)

23

onde G representa a matriz dos coeficientes estequiomtricos, chamada matriz

estequiomtrica, e v representa o vetor dos fluxos de cada reao. A linha na

Equao (2) representa a transposta da matriz estequiomtrica G. A Equao (2)

a base para anlise de fluxo metablico e representa K balanos algbricos

lineares para K metablitos com J fluxos desconhecidos. Como o nmero de

reaes (J) sempre maior que o nmero de metablitos da via (K), existe

sempre um certo grau de liberdade no conjunto de equaes algbricas dado

por . Portanto, para soluo do sistema, alguns elementos de v

devem ser medidos ou conhecidos para que o sistema seja determinado. Se

exatamente F fluxos so medidos, o sistema torna-se determinado e a soluo

nica. Caso o nmero de fluxos medidos seja superior a F, o sistema

superdeterminado, significando que existem equaes extras que podem ser

usadas para testar a consistncia dos balanos globais. No entanto, se o nmero

de fluxos medidos inferior a F, o sistema subdeterminado, e os fluxos

desconhecidos podem ser determinados apenas se restries adicionais forem

induzidas ou se um critrio de otimizao global for imposto aos balanos

metablicos. Em um sistema determinado, podemos obter os fluxos

desconhecidos particionando a Equao (2) da seguinte forma:

KJF =

ccmm vGvGvG0''' +== , (3)

onde os ndices m e c representam os fluxos medidos e os que se deseja calcular

respectivamente. Uma vez que F exatamente igual ao nmero de fluxos medidos (sistema determinado), uma matriz quadrada (dimenses K K) e, portanto, inversvel. Os elementos de podem ento ser obtidos pela

Equao (4):

cG

cv

( ) mmcc vGGv '' 1= . (4) Para os sistemas superdeterminados, no inversvel e a soluo

para a Equao (4) pode ser obtida pelo uso da pseudo-inversa de Moore-

Penrose.

cG

( ) ( ) cccc GGGG 1= '#' . (5)

24

Desta forma, a Equao (4) passa a ser:

( ) mmcc vGGv '#'= . (6) Observe que, se uma matriz quadrada, sua pseudo-inversa ser a

prpria inversa.

cG

A Equao (6) muito til quando o nvel de rudo nas medidas

pequeno. Baixo nvel de rudo representa que os resduos das medidas so

distribudos uniformemente entre os fluxos. No entanto, se um rudo

significante apresenta-se apenas em alguns fluxos medidos, a soluo pode no

satisfazer a conservao dos fluxos e, portanto, ao balano de massa em alguns

ns. Uma forma tradicional de resolver o problema fazer uma reconciliao

estatstica das medidas. A reconciliao estatstica das medidas usa ferramentas

de estatstica para que os valores experimentais se adaptem melhor aos

balanos de massa propostos, isto , os dados experimentais so melhorados.

Maiores detalhes sobre a reconciliao estatstica sero apresentados em

materiais e mtodos.

2.1.2. A anlise de controle metablico

A anlise de fluxo metablico (MFA) pode ser utilizada para o estudo

das interaes entre diferentes vias metablicas e quantificao da distribuio

dos fluxos ao redor dos pontos de bifurcao. No entanto, a anlise de fluxo

metablico por si s no fornece qualquer medida quantitativa do controle de

fluxo, que o responsvel por manter as taxas de sntese e converso de

metablitos balanceada, diante de uma grande variedade de condies

externas, sem aumento ou queda significativa nas concentraes intracelulares

dos metablitos. Com o conhecimento do controle de fluxo possvel saber, a

partir de modelos cinticos em pontos isolados da via, o que aconteceria com o

fluxo metablico se alterssemos o nvel de expresso de uma determinada

25

enzima. Tal informao permite uma modificao racional dos fluxos

metablicos, que o principal objetivo da engenharia metablica.

Os aspectos fundamentais da rede so obtidos atravs da sensibilidade

das variveis do sistema, que so os fluxos ou nveis de metablitos, a variaes

nos parmetros do sistema, que so as atividades enzimticas ou nveis de

substrato e produto. Estas sensibilidades so tambm chamadas de coeficientes

de controle.

Sendo J o fluxo no estado estacionrio e Ei a atividade da enzima i, o coeficiente de controle de fluxo (FCC), , definido como a taxa da variao

relativa no fluxo (dJ/J) sobre a variao relativa na atividade da enzima i (dE

JiC

i/Ei)

(Stephanopoulos et al., 1998).

ii

i

ii

Ji Elnd

JlnddEdJ

JE

EdEJdJC === (7)

Pela definio dos FCCs, a enzima com o maior coeficiente de controle

de fluxo exerce maior influncia sobre o controle de fluxo em um determinado

regime estacionrio.

Como os FCCs so definidos em termos de fluxos relativos e atividades

relativas, eles so adimensionais e suas magnitudes so independentes das

unidades utilizadas nos fluxos e nas atividades enzimticas. Uma conseqncia

importante da normalizao dos FCCs que, relativo a cada fluxo, a soma de

todos os FCCs deve ser um. Isso conhecido como o teorema da soma dos

controles de fluxo:

11

==

L

i

Ji

KC . { }Lk ,...,2,1 (8)

Outro conceito importante em MCA o coeficiente de elasticidade.

Diferentemente dos coeficientes de controle, que so propriedades sistmicas de

todo o sistema metablico, elasticidades so propriedades locais de enzimas

individuais na rede metablica. A elasticidade da i-sima taxa de reao, vi, em

relao concentrao do metablito j, Xj, definida como a taxa da variao

26

relativa na taxa de reao com relao a uma variao infinitesimal na

concentrao do metablito, assumindo que todas as outras variveis do

sistema no variam de seus valores do regime estacionrio, isto :

j

i

j

i

i

j

jj

iiiX Xln

vlnXv

vX

XXvv

j =

== . (9)

Se a reduo na atividade de uma enzima tem um efeito pequeno no

fluxo geral, significa que o coeficiente de controle da enzima perturbada

pequeno. De forma similar, a perturbao de uma enzima com pequena

elasticidade relacionada a seu metablito intermedirio pode causar uma

variao significativa no fluxo. Esta relao entre coeficientes de controle de

fluxo e elasticidades expressa segundo o teorema da conectividade dos controles

de fluxo, expresso por:

01

==

L

i

iX

Ji j

KC { }Li ,...,2,1 , { }Kj ,...,2,1 . (10)

Este teorema diz como a cintica de uma enzima afeta localmente o

fluxo global. Em geral, pode-se concluir que enzimas com grandes FCCs

possuem pequenos coeficientes de elasticidade, e vice-versa. Portanto,

improvvel que enzimas que respondem rapidamente variaes nos nveis

dos metablitos, isto , possuem grande elasticidade, exeram maior controle

no fluxo global do que enzimas que respondem lentamente a variaes nos

nveis de metablitos.

2.2. A abordagem tradicional, pela maximizao da biomassa

Quando o nmero de fluxos medidos inferior ao grau de liberdade do

sistema, existe um nmero infinito de solues para os fluxos metablicos

(sistema subdeterminado). Nesses casos, a programao linear pode ser usada

para determinar a distribuio dos fluxos. Para tanto, torna-se necessrio o uso

de uma funo que fora a soluo do sistema para satisfazer determinado

objetivo, a chamada funo objetivo.

27

Uma descrio bsica da programao linear apresentada por

Stephanopoulos et al. (1998).

Considerando o sistema de duas variveis, x e y, relacionadas atravs

da seguinte equao:

42 =+ yx (11)

Uma restrio comum a todos os problemas de programao linear

que todas as variveis devem ser no-negativas. Essa limitao restringe o

espao de solues ao primeiro quadrante, mesmo assim existem infinitas

solues para o sistema. No entanto, se uma funo objetivo for aplicada ao

sistema, por exemplo, maximizar yx + 32 , o sistema passa a ter uma nica soluo, e 0=x 4=y , conforme ilustrado na Figura (1).

Fonte: Stephanopoulos et al., 1998. Figura 1 Ilustrao da programao linear. A soluo tima est contida na linha AB no quadrante no negativo do espao soluo. A funo objetivo consiste numa famlia de linhas (das quais trs so mostradas). A linha que maximiza a funo objetivo intercepta a linha AB em (x,y) = (0,4), que representa a soluo para este problema de otimizao.

A 4

3

2

Varma (1993) usaram MFA por programao linear para interpretar o

catabolismo da glicose por Escherichia coli sob vrios nveis de oxigenao.

Neste trabalho foi possvel prever as mudanas no metabolismo celular quando

o consumo de oxignio vai ficando debilitado. A seqncia de produtos que

obtida na passagem de um sistema aerbico para anaerbico (acetato, formato e

2x+3y=3

2x+y=4 2x+3y=12

1

2x+3y=6 B 0

0 1 2 3 4 5 6

28

etanol), foi reproduzida com programao linear usando a maximizao da taxa

de formao de biomassa como funo objetivo.

Ozkan (2005) fizeram mutantes de Escherichia coli para superproduo

da protena de ligao glicose isomerase-maltose (Gl-malE). O estudo do

metabolismo da bactria mutante foi feito usando MFA por programao linear

em um sistema de 411 reaes, tambm usando a taxa de formao de

biomassa.

Bell e Palsson (2005) introduziram a teoria da anlise do plano fase, cuja

principal diferena da anlise de fluxo metablico convencional a definio de

um campo de comportamentos fenotpicos timos quando duas condies

variam. Suas aplicaes incluem a comparao do crescimento de uma

linhagem em diferentes substratos, anlise das conseqncias de delees no

gene, e experimentos de design.

2.3. A minimizao da energia livre como alternativa biolgica

A minimizao do gasto energtico outra estratgia utilizada para a

anlise de fluxo metablico por otimizao linear. Cortassa et al. (2002) sugerem

dois tipos de funo objetivo: (i) a maximizao do crescimento de biomassa,

metodologia amplamente utilizada quando o modelo metablico complexo

demais para a obteno dos dados experimentais necessrios a um sistema

determinado, e (ii) a minimizao do gasto energtico, que pode ser obtida pela

minimizao das taxas das reaes em que ocorre produo de ATP. A funo

objetivo utilizada para os sistemas subdeterminados do presente trabalho

tambm se baseia na minimizao do gasto energtico, mas de uma forma mais

complexa, utilizando um balano energtico entre produtos e substratos da via

metablica.

29

2.4. A produo biolgica de hidrognio

A utilizao de combustveis fsseis vem sendo apontada como fator de

agravo que est causando aquecimento global, degradao do meio ambiente e

problemas de sade. Alm disso, os recursos de combustveis fsseis so

limitados, no renovveis e o uso indiscriminado eventualmente levar ao fim

dos mesmos nas prximas dcadas.

Devido a sua alta converso, reciclabilidade e natureza no poluente, o

hidrognio considerado o combustvel do futuro (Debabrata e Nejat, 2001).

O hidrognio pode ser produzido por inmeros processos, incluindo a

eletrlise da gua, a reforma termocataltica de compostos orgnicos ricos em

hidrognio, e processos biolgicos. Atualmente o hidrognio produzido quase

que exclusivamente por eletrlise da gua ou por reforma a vapor do metano. A

produo biolgica de hidrognio usando microrganismos uma rea nova do

desenvolvimento tecnolgico que oferece potencial de produo de hidrognio

a partir de uma grande variedade de recursos renovveis (Levin et al., 2004).

A produo biolgica de hidrognio possui vrias abordagens. Dentre

elas, destacam-se: biofotlise direta, biofotlise indireta, foto-fermentao e

fermentao escura (Hallenbeck e Benemann, 2002; Levin et al., 2004).

A biofotlise direta um processo em que microalgas verdes capturam

luz e a energia recuperada usada para juntar duas molculas de gua para a

gerao de um redutor de baixo potencial, que pode ser usado para reduzir

uma enzima hidrogenase que produz hidrognio (Figura 2), seguindo a

seguinte reao geral:

2 H2O 2 H2 + O2 .

energia luminosa

hidrogenase

(12)

As microalgas verdes utilizam energia luminosa para gerar eltrons que

so transferidos para uma molcula de ferrodoxina, tomando a sua forma

30

reduzida. A enzima hidrogenase combina os prtons (H+) do meio com eltrons

doados pela ferrodoxina reduzida, para formar e liberar H2.

Fonte: Hallenbeck e Benemann, 2002. Figura 2 Modelo esquemtico de produo de hidrognio via biofotlise direta. Fd representa a enzima ferrodoxina, e H2ase a enzima hidrogenase.

Infelizmente, como a etapa escura a etapa limitante, a eficincia na

converso da luz solar de apenas 10%, apresentando maior eficincia em

menor fluxo solar. Alm disso, a atividade enzimtica da hidrogenase, principal

enzima para a produo de hidrognio, extremamente sensvel ao oxignio,

sendo necessrias condies especiais para o sistema, cujas baixas presses

parciais seriam impossveis de se manter em qualquer processo prtico de

biofotlise direta (Hallenbeck e Benemann, 2002).

O uso de mutagnese clssica tem proporcionado um sucesso limitado

na obteno de mutantes com tolerncia ao oxignio (Hallenbeck e Benemann,

2002), mas estes apresentam apenas aumento na atividade respiratria e,

portanto, provendo um melhoramento aparente na resistncia ao oxignio.

Mesmo se o problema da inibio pelo oxignio fosse superado, a biofotlise

Fotossntese I, II

2 H2O O2

2e- Fd

H2ase

H2

2 H+

31

direta requer grandes fotobiorreatores e separao do H2 e O2, que tornaria o

processo impraticvel.

A biofotlise indireta tenta resolver o problema da sensibilidade ao

oxignio separando a evoluo do oxignio e do hidrognio em dois estgios,

atravs da fixao de CO2 (Figura 3).

Fonte: Hallenbeck e Benemann, 2002.Figura 3 Modelo esquemtico de produo de hidrognio via biofotlise indireta.

Estgio 1 (+O2) Estgio 2 (-O2)

Material Celular

Uma elaborao deste conceito envolve quatro passos distintos

(Hallenbeck e Benemann, 2002):

1. Produo de alta concentrao de biomassa e armazenamento de

carboidratos em tanques a 10% de eficincia solar;

2. Concentrao da biomassa dos tanques em um tanque de

decantao;

3. Fermentao escura anaerbica para produzir 4 mol de H2/mol

de glicose armazenada nas clulas das algas, mais 2 mols de

acetato;

Fotossntese I, II

2 H2O O2

2e- Fd

Material Celular

CO2

Fermentao 2e- Fd

H2ase

H2

2 H+

32

4. Um fotobiorreator no qual as clulas das algas converteriam os

dois moles de acetato para 8 moles de H2.

Infelizmente os processos de biofotlise indireta ainda esto em estgio

conceitual. Seus aspectos econmicos ainda precisam ser demonstrados mesmo

em nvel experimental.

Nas foto-fermentaes, bactrias prpuras produzem hidrognio

molecular catalisado pela nitrogenase sob condies de deficincia em

nitrognio, usando energia luminosa e cidos orgnicos reduzidos (Figura 4).

Fonte: Hallenbeck e Benemann, 2002. Figura 4 Modelo esquemtico de produo de hidrognio via foto-fermentao. N2ase representa a enzima nitrogenase.

Assim como nos demais processos fotossintetizantes, as foto-

fermentaes apresentam eficincias cada vez mais baixas sob alta

luminosidade. As taxas e eficincias na produo de hidrognio nesse e em

todos os outros sistemas envolvendo diretamente a fotossntese para produo

de H2 esto longe de qualquer viabilidade econmica plausvel.

Fotossntese Bacteriana

2e- Fd

4 ATPN2ase

H2

2 H+

cidos orgnicos contendo dejetos

33

A fermentao escura o processo onde bactrias anaerbicas produzem

hidrognio principalmente pelo metabolismo anaerbico do piruvato, formado

durante o catabolismo de vrios substratos (Figura 5).

Bactrias conhecidas produtoras de hidrognio so das espcies

Enterobacter, Bacillus e Clostridium.

Fonte: Hallenbeck e Benemann, 2002. Figura 5 Modelo esquemtico de produo de hidrognio via fermentao escura.

A quebra do piruvato catalisada por um dos dois sistemas

enzimticos:

1) Piruvato formato liase (PFL):

Piruvato + CoA Acetil-CoA + FormatoPFL

(13)

2) Piruvato ferrodoxina (flavodoxina) oxidoredutase (PFOR):

Piruvato + CoA + 2 Fd(ox) Acetil-CoA + CO2 + 2 Fd(red)PFOR

(14)

Biomassa

Produtos agrcolas

Rejeitos orgnicos

Pr-tratamento

H2 CO2

Separao gasosa

Fermentao (organismos

geneticamente modificados)

34

Nas duas reaes, o piruvato gerado pela gliclise usado, na ausncia

de oxignio, para produzir acetil-CoA, que pode gerar ATP, e ainda formato ou

ferrodoxina reduzida (Fd(red)), que pode gerar hidrognio.

Certas bactrias fotoheterotrficas da superfamlia Rhodospirillaceae

podem crescer na ausncia de luz usando CO como nica fonte de carbono para

gerar ATP com liberao de H2 e CO2. A oxidao de CO para CO2 com

liberao de H2 ocorre via reao de deslocamento gs-gua (CO-gua):

CO(g) + H2O(l) CO2(g) + H2(g) . (15)

Utilizando resultados de outros trabalhos de diversas produes

biolgicas de hidrognio, Levin et al. (2004) fizeram um estudo de viabilidade

na produo de biorreatores que pudessem suprir hidrognio suficiente para

uso em clulas de combustvel de membrana trocadora de prtons (proton

exchange membrane fuel cells - PEMFC). Trs capacidades diferentes 1,5; 2,5 e 5

kW foram tidas como suficientes para gerar eletricidade a fim de suprir a

demanda energtica de uma casa tpica norte americana sem aquecimento

interno, com aquecimento interno e armazenamento de energia, e com

aquecimento interno sem sistema de armazenamento, respectivamente. O

resultado das anlises mostrou que sistemas baseados em fotossntese no

possuem taxas de produo de hidrognio suficientes para carregar clulas de

combustvel, mesmo de 1 kW. No entanto, alguns sistemas de fermentao

escura e reao de deslocamento CO-gua de R. gelatinosus CBS apresentaram

resultados promissores.

Biorreatores de tamanhos razoveis seriam suficientes para carregar

clulas de energia de 5 kW usando um grupo de bactrias mesoflicas,

enriquecido para a espcie Clostridium. Um biorreator de aproximadamente 500

L forneceria hidrognio suficiente para carregar uma PEMFC de 2,5 kW,

enquanto 1.000 L forneceriam hidrognio suficiente para uma PEMFC de 5 kW.

A reao de deslocamento CO-gua de R. gelatinosus CBS intrigante

uma vez que oferece potencial para captura e reforma de CO para produo de

35

H2. Um reator de aproximadamente 624 L seria necessrio para fornecer

hidrognio suficiente para uma PEMFC de 2,5 kW e um reator de 1.250 L para

uma PEMFC de 5 kW (Levin et al., 2004).

Biorreatores de 1.000 a 1.500 L na base de uma casa no so

impensveis visto que tanques de aquecimento de leo com aproximadamente

este tamanho so usados em algumas casas norte-americanas.

Cabe ressaltar que os volumes dos reatores foram baseados em taxas

obtidas por experimentos de laboratrio, sendo necessrias mais pesquisas para

determinar se o aumento da escala influenciaria na produo de H2.

2.5. A produo de violacena

Chromobacterium violaceum uma -proteobactria Gram-negativa, predominante em uma variedade de ecossistemas nas regies tropicais e

subtropicais. Esta bactria tem sido encontrada em maior abundncia nas guas

as margens do Rio Negro. A trs dcadas a C. violaceum tem sido fonte de

estudos no Brasil. Em geral, tais estudos tm sido focados num pigmento

violeta chamado violacena, que vem sendo usado como composto teraputico

para fins dermatolgicos. A violacena apresenta atividades antipatognicas,

bactericidas, antivirais e antitumorais (Vasconcelos et al. 2003).

O seqenciamento desta bactria pelo Consrcio Nacional Brasileiro do

Projeto Genoma revelou detalhes de sua complexidade que explicam sua

versatilidade e abriu fronteiras para o estudo do seu potencial biotecnolgico.

August et al. (2000) seqenciou e clonou o operon vioABCD, sendo

seus resultados posteriormente confirmados pelo seqenciamento completo da

C. violaceum. No mesmo trabalho sugerido um mecanismo de biossntese da

violacena, mostrado na Figura (6).

36

Adaptado de August et al., 2000. Figura 6 Biossntese de violacena, conforme proposta por August et al. (2000). Vio A, Vio B, Vio C e Vio D so genes que formam o operon de produo da violacena. Os metablitos so: a) Triptofano, b) 5-Hidroxitriptofano, c) cido indol pirvido, d) cido D-2-amino-2-(3-indol) propinico, e) Pr-desoxiviolacena, f) Oxindol violacena, g) Violacena, h) Oxi-violacena, i) Desoxiviolacena.

37

A via de biossntese mostrada na Figura (6) foi a pea chave para a

anlise de fluxo metablico para produo de violacena.

38

CAPTULO III

Materiais e Mtodos

3.1. Toolbox de Engenharia Metablica para o MATLAB, ME Toolbox

A anlise de fluxo metablico (MFA) e anlise de controle metablico

(MCA) so ferramentas bem estabelecidas e largamente utilizadas para

quantificao de fluxos celulares (Vallino e Stephanopoulos, 1993; Chatziiannou

et al., 2003; Nadeau et al., 2000; Shimizu et al., 2003; Shirai et al., 2005), no

estudo da sensibilidade dos fluxos em relao a pequenas perturbaes nas

medidas (Chatziiannou et al., 2003), no uso de marcadores isotpicos para

estudar o metabolismo (McCabe e Previs, 2004) e anlise dos coeficientes de

controle de fluxos em pontos de bifurcao chaves da via metablica (Shimizu

et al., 2003; Heijnen et al., 2004).

MFA e MCA so ferramentas muito importantes na engenharia

metablica, apresentam suas limitaes e vantagens quando analisadas

separadamente mas, se combinadas sabiamente, fornecem informaes do

funcionamento celular com um alto nvel de detalhamento.

Um dos objetivos deste trabalho a apresentao de um toolbox para o

MATLAB que integra a maioria das ferramentas e clculos em anlise de fluxo

metablico e anlise de controle metablico, o ME Toolbox (Tabela 1).

39

Tabela 1 Descrio do ME Toolbox.

Funo Descrio Parmetros de entrada Parmetros de sada Observaes

MFA

Executa a anlise de fluxo metablico para um sistema determinado ou superdeterminado.

G, vm, p, pcs.

vc, R, rk, vmnew, vcnew, h, e, answ, C, accum, spec.

MFAIL

Executa a anlise de fluxo metablico utilizando mtodos de carbono marcado.

G, vm, p

vc, R, rk, answ, xpyr, xicit, xakg, xsuc, xmal, xoaa.

Necessita da interativida-de do usurio para adaptar a funo a novos problemas.

AMM

Funo auxiliar do MFAIL. Constri as matrizes de mapeamento atmico.

m, n mn

MFAOP

Executa a anlise de fluxo metablico para um sistema subdeterminado.

f, SP, EF, G, pcs.

x, fval, exitflag, output, lambda, C.

MCA Executa a anlise de controle metablico para uma via linear.

o, lev.

xin, Ein, Cin, x, E, C, Xstore, Cstore, fcst, fcct.

Necessita das variveis globais: s, p, Em, kcat, Keq, km, answ, inhib, Ki.

KINETICS

Funo auxiliar do MCA. Constri as equaes cinticas automaticamente. Usada para a obteno das variveis do sistema (concentraes e o fluxo) no estado estacionrio.

x f

Necessita das variveis globais: s, p, Em, kcat, Keq, km, answ, inhib, Ki.

ELASTICITY

Funo auxiliar do MCA. Calcula os coeficientes de elasticidade automaticamente.

x e

Necessita das variveis globais: s, p, Em, kcat, Keq, km, answ, inhib, Ki.

MCAB

Executa a anlise de controle metablico para um ponto de bifurcao.

J, dep, lev.

xin, Ein, Cin, x, E, C, Jstore, Xstore, Cstore, XJstore.

Necessita das variveis globais: s, p, Em, kcat, Keq, km, k.

40

KINETICSB

Funo auxiliar do MCAB. Constri as equaes cinticas automaticamente.

x f

Necessita das variveis globais: s, p, Em, kcat, Keq, km, k.

ELASTICITYB

Funo auxiliar do MCAB. Calcula os coeficientes de elasticidade automaticamente.

x e

Necessita das variveis globais: s, p, Em, kcat, Keq, km.

Para explicar a utilizao do ME Toolbox, sero apresentados trs

estudos de casos: a MFA para a produo biolgica de hidrognio por

Clostridium butyricum, a MFAIL para um modelo metablico simplificado do

metabolismo central com o uso de marcadores isotpicos, e a MFAOP para

estimativas dos fluxos em Chromobacterium violaceum, sob a hiptese de

minimizao do gasto energtico. Alm dos estudos de casos, sero avaliados

exemplos hipotticos do uso das funes MCA e MCAB (Tabela 2).

Tabela 2 Utilizao das funes do ME Toolbox.

Funo Produo de hidrognio Produo de violacena

Metabolismo central

Exemplos hipotticos

MFA MFAIL AMM MFAOP MCA KINETICS ELASTICITY MCAB KINETICSB ELASTICITYB

A verso atual do ME Toolbox permite a obteno de todos os fluxos

intracelulares por balano de massa, melhoria dos dados experimentais por

reconciliao estatstica, anlise de sensibilidade, anlise de fluxo metablico

usando mtodos de marcadores isotpicos, anlise de fluxo metablico de

sistemas subdeterminados por programao linear, anlise de controle

metablico de vias no bifurcadas, e anlise de controle metablico de pontos

de bifurcao.

41

3.1.1. Mtodos Computacionais

Todos os mtodos computacionais mostrados a seguir foram

implementados usando o pacote de programao computacional MATLAB

(The Math Works Inc., MA, USA) e baseados nas equaes apresentadas por

Stephanopoulos et al. (1998).

3.1.1.1. Estimativa dos fluxos no medidos

Todos os fluxos no medidos experimentalmente so obtidos, em

primeira anlise, utilizando a Equao (6).

3.1.1.2. Reconciliao estatstica das medidas

Com o objetivo de obterem-se melhores estimativas para ambos, fluxos

medidos e no medidos, uma reconciliao estatstica das medidas

implementada, como descrita por Stephanopoulos et al. (1998). Como foi dito

anteriormente, a reconciliao estatstica usa ferramentas de estatstica para que

os dados experimentais sejam melhorados, adaptando-os melhor aos balanos

de massa e reduzindo os erros experimentais.

Para a obteno das relaes estequiomtricas de uma rede metablica

em formato matricial, devem-se identificar as reaes linearmente dependentes.

Para isso, primeiramente obtm-se a matriz de redundncia R , cujo rank

indica quais equaes do sistema so linearmente independentes.

( ) '''' mccm GGGGR #= (16) Conforme descrito na reviso bibliogrfica, a linha sobre as matrizes

representa suas transpostas, e so o resultado do particionamento da

matriz estequiomtrica onde os ndices, m e c, representam os fluxos

mG cG

G

42

medidos e os que se deseja calcular, respectivamente. ( ) #'cG representa a pseudo-inversa da matriz . 'cG

De posse do nmero de equaes linearmente independentes, obtm-se

a matriz de redundncia reduzida, : rR

RKRr = , (17)

onde K um vetor de dimenses (1 j), sendo j o nmero de colunas da matriz , com uns nas posies referentes s linhas linearmente dependentes, obtidas

aps a anlise do rank da matriz de redundncia, e zeros nas demais

posies. A partir da matriz de redundncia reduzida, o resduo obtido:

G

mr vR = . (18)

O resduo , ento, usado para o clculo da funo teste h, definida

como:

( ) 1' = 'rr RRh . (19) Assume-se que a funo teste h segue distribuio e indica se os

rudos das medidas esto ou no correlacionados entre si. Os graus de

liberdade da distribuio so iguais ao rank da matriz de redundncia R.

Novas estimativas para os fluxos medidos so, ento, obtidas:

2

2

( )( ) mr'rr'rnewm, vRRRRIv 1= . (20) E a partir dos novos fluxos medidos, melhorados estatisticamente,

novos fluxos calculados so estimados a partir da Equao (6).

3.1.1.3. Anlise de sensibilidade

A medida da sensibilidade de uma matriz tambm chamada de

nmero condicional, C, cuja magnitude fornece informaes importantes sobre

os requisitos de preciso nos fluxos medidos:

43

( )#= '' GGC . (21) Para uma matriz estequiomtrica ser considerada bem condicionada, o

nmero condicional deve estar entre 1 e 100. Como o nmero condicional no

fornece nenhuma informao sobre a sensibilidade dos clculos no que diz

respeito variaes nos fluxos medidos, tal informao obtida pelos

elementos da matriz soluo.

( ) 'm'cm

c GGvv #=

dd . (22)

A Equao (22) mostra a sensibilidade dos fluxos calculados a pequenas

perturbaes nas medidas (Stephanopoulos et al., 1998).

O ME Toolbox desenvolvido neste trabalho gera as sensibilidades

acumuladas em toda a rede metablica, mostrando quais fluxos medidos tm

maior importncia em toda a rede, e as sensibilidades com relao a um fluxo

calculado (no medido) de interesse, selecionado por um escalar pcs que indica

a posio do mesmo na matriz estequiomtrica . G

interessante observar que a anlise de sensibilidade no depende de

dados experimentais e est presente nas funes MFA e MFAOP.

De posse das equaes das atividades enzimticas das vias lineares ou

dos pontos de bifurcao de maior interesse, ainda possvel usar as funes

MCA e MCAB para fazer a anlise de controle metablico dessas regies chave

para a produo de um metablito de interesse.

3.1.1.4. Criando a matriz estequiomtrica G

A matriz estequiomtrica reconhecida pelo ME Toolbox uma matriz (i

j) onde i o nmero de reaes (fluxos) e j o nmero de metablitos, isto , cada linha representa uma reao da rede metablica e cada coluna representa

um dos metablitos presente nesta rede.

44

Primeiramente, deve-se identificar todos os metablitos presentes na

rede e coloc-los, sem repeties, na primeira linha de uma planilha eletrnica,

deixando a primeira coluna em branco para identificar as reaes. Identificar os

metablitos ordenadamente resulta em menor esforo computacional e,

conseqentemente, maior velocidade. Cria-se, na primeira coluna, um

indicador para cada reao.

Para finalizar a estrutura matricial, devem-se dividir os metablitos em

trs grupos: substratos, produtos e metablitos internos, movendo suas colunas

conforme necessrio.

Construda a estrutura matricial, parti-se para a representao da rede

metablica. Cada reao deve ser criada colocando-se os ndices

estequiomtricos abaixo de cada metablito e zeros nas demais posies. Os

ndices estequiomtricos devem ser positivos para os produtos e negativos

quando para os reagentes.

Das trs matrizes obtidas, apenas a matriz dos metablitos internos

utilizada, e dever ser exportada no formato de texto separado por espaos. O

contedo do texto precisar ser copiado e colado em um arquivo de entrada de

dados para o ME Toolbox.

3.1.2. Utilizando o ME Toolbox para anlise de fluxo metablico (MFA)

A funo MFA do ME Toolbox possui a seguinte forma cannica:

[vc,R,rk,vmnew,vcnew,h,e,answ,C,accum,spec] = MFA (G,vm,p,pcs). (23)

Os parmetros de entrada e sada, bem como suas descries, esto

mostrados na Tabela (3).

45

Tabela 3 Parmetros da funo MFA.

Parmetros de entrada Parmetro Descrio G Matriz estequiomtrica. vm Vetor contendo os fluxos extracelulares medidos.

p Vetor contendo as posies relativas aos fluxos do vetor vm na matriz estequiomtrica G. pcs Posio relativa ao fluxo de interesse para anlise de sensibilidade. Parmetros de sada Parmetro Descrio vc Vetor contendo os fluxos intracelulares calculados. R Matriz de redundncia. rk Rank da matriz de redundncia. vmnew Vetor contendo os fluxos extracelulares melhorados estatisticamente. vcnew Vetor contendo os fluxos intracelulares recalculados a partir de vmnew. h Valor da funo teste h. e Valor do resduo . answ Resposta se a soluo nica ou no. C Valor do nmero condicional.

accum Matriz contendo o somatrio do mdulo das sensibilidades para cada fluxo extracelular.

spec Matriz contendo a sensibilidade do fluxo indicado em pcs a variaes nos fluxos extracelulares.

3.1.3. Utilizando o ME Toolbox para MFA com mtodos de istopos

marcados (MFAIL)

Outra anlise muito importante que pode ser feita com o ME Toolbox

a anlise de fluxo metablico usando mtodos de istopos marcados, atravs da

funo MFAIL.

[vc,R,rk,answ,x] = MFAIL (G,vm,p). (24)

Os parmetros de entrada e sada, bem como suas descries, esto

mostrados na Tabela (4).

46

Tabela 4 Parmetros da funo MFAIL.

Parmetros de entrada Parmetro Descrio G Matriz estequiomtrica. vm Vetor contendo os fluxos extracelulares medidos.

p Vetor contendo as posies relativas aos fluxos do vetor vm na matriz estequiomtrica G. Parmetros de sada Parmetro Descrio vc Vetor contendo os fluxos intracelulares calculados. answ Resposta se a soluo nica ou no.

x Matriz contendo todas as fraes de carbonos marcados em cada um dos produtos.

Atravs do MFAIL possvel prever a frao de carbonos marcados

para cada produto, como resposta a substratos marcados em um dos carbonos.

Inicialmente, o MFAIL calcula os fluxos intracelulares usando a

Equao (6). Depois disso, utilizando as configuraes de carbonos conhecidos

para cada uma das reaes da via, so construdas as matrizes de mapeamento

atmico. As matrizes de mapeamento atmico so matrizes de dimenses (i j), onde i o nmero carbonos do produto e j o nmero de carbonos do reagente.

As posies onde o reagente passou um carbono para o produto recebem o

nmero 1. Veja, por exemplo, a seguinte reao:

PYR #ABC +

OA #abcd

ICIT #dcbaCB +

CO2#A . (25)

Para a construo da matriz de mapeamento atmico que relaciona piruvato

(PYR) com isocitrato (ICIT), deve-se primeiramente construir uma matriz nula

de dimenses (6 3), que so o nmero de carbonos do isocitrato e piruvato, respectivamente.

=>

000000000000000000

ICITPYR . (26)

47

A partir da configurao dos carbonos, presente abaixo dos metablitos, sabe-se

que o carbono B do piruvato o ltimo carbono do isocitrato, e que o carbono C

do piruvato o penltimo carbono do isocitrato. Dessa forma, chega-se matriz

de mapeamento atmico (Equao 27):

=>

010100000000000000

ICITPYR . (27)

A funo MFAIL usa a funo AMM para criar as matrizes de

mapeamento atmico de uma forma mais fcil. Para obter a matriz de

mapeamento atmico da Equao (27), bastaria executar a seguinte seqncia

de comandos:

pyr = ['A','B','C']; icit = ['d','c','b','a','C','B']; pyr_icit = AMM (pyr,icit) (28)

A funo AMM executa uma comparao membro a membro de dois

vetores de caracteres, criando a matriz de mapeamento atmico

automaticamente. Pode-se observar que os vetores pyr e icit contm exatamente

os caracteres que esto abaixo da reao (Equao 25).

Construdas as matrizes de mapeamento atmico, a funo MFAIL combina os vetores e em um nico vetor contendo todos os fluxos em

suas respectivas posies. Por fim, o MFAIL resolve um sistema linear contendo

todos os balanos dos estados de marcao da via metablica.

mv cv v

A funo MFAIL a nica funo do ME Toolbox que precisa ser

adaptada ao problema do usurio. A enorme variedade de casos em engenharia

metablica tornou impossvel a obteno de um padro de consenso para

construo automtica do sistema linear.

48

Maiores detalhes sobre o uso do MFAIL esto presentes no estudo de

caso do modelo metablico simplificado para o metabolismo central com o uso

de marcadores isotpicos.

3.1.4. Utilizando o ME Toolbox para MFA de sistemas subdeterminados

utilizando programao linear (MFAOP)

A funo MFAOP faz uma estimativa de todos os fluxos utilizando

apenas um fluxo experimental, segundo uma funo objetivo.

[x,fval,exitflag,output,lambda,C] = MFAOP (f,SP,EF,G,pcs). (29)

Os parmetros de entrada e sada, bem como suas descries, esto

mostrados na Tabela (5).

Tabela 5 Parmetros da funo MFAOP.

Parmetros de entrada Parmetro Descrio f Funo objetivo.

SP Matriz de posies dos substratos. A primeira coluna composta de um escalar que representa o substrato (1, 2, ...), e a segunda coluna representa a posio do respectivo substrato na matriz estequiomtrica.

EF Vetor contendo o fluxo experimental. O primeiro termo do vetor representa a posio do fluxo experimental, e o segundo termo representa o seu valor (a taxa do fluxo).

G Matriz estequiomtrica. pcs Posio relativa ao fluxo de interesse para anlise de sensibilidade. Parmetros de sada Parmetro Descrio x Vetor contendo os fluxos intracelulares calculados. fval Valor da funo objetivo em x.

exitflag

Descrio das condies de sada. > 0 quando a programao linear convergiu para uma soluo em x, 0 quando a programao linear alcanou o nmero mximo de interaes sem convergir, e < 0 quando o sistema linear no tiver soluo.

output Indica o nmero de interaes. lambda Retorna o conjunto de multiplicadores de Lagrange. C Valor do nmero condicional.

O MFAOP encontra a soluo para o sistema linear da Equao (2) e

executa uma anlise de sensibilidade segundo as Equaes (21 e 22).

49

Para a determinao da funo objetivo, parte-se do pressuposto que o

objetivo de uma clula, em determinadas condies, minimizar o gasto

energtico para o seu metabolismo. Esta proposta est baseada na crena de que

a minimizao da energia utilizada por um microrganismo pelo menos to

importante, do ponto vista evolutivo, quanto a otimizao da produo celular

(biomassa). Nem sempre a maximizao da biomassa prioritria para o

microrganismo. Por exemplo, a C. violaceum, quando cultivada em glicerol no

lugar de glicose, diminui sua multiplicao celular e produz mais violacena

(provavelmente associada a mecanismos de defesa); por outro lado, quando h

deficincia de nitrognio, a produo de biopolmeros (no caso da C. violaceum,

poli-hidroxialcanoatos) maximizada, claramente como mecanismo de

acmulo de energia de reserva.

Dessa forma, props-se a construo da seguinte funo objetivo f:

=produtos

oxreagentes

ox GnGnf''min . (30)

Diferentemente de qualquer teoria proposta at ento, a funo objetivo

mostrada na Equao (30) prope um balano energtico, tipo black box, a ser

minimizado. Na Equao (30), n representa o nmero de moles, obtidos atravs dos fluxos das reaes de consumo de substrato e formao de produtos, e

a variao da energia livre de Gibbs a pH 7 para oxidao por NAD

'oxG

+. Como se

trata de um balano black box, apenas os substratos e os produtos finais da via

metablica foram postos na funo objetivo.

Maiores detalhes sobre o uso do MFAOP esto presentes nos estudos

de casos da anlise de fluxo metablico para produo de hidrognio por

Clostridium butyricum e tambm na anlise de fluxo metablico para produo

de violacena por Chromobacterium violaceum.

50

3.1.5. Utilizando o ME Toolbox para MCA de vias metablicas lineares

(MCA)

A funo MCA do toolbox foi projetada para fazer a anlise de controle

metablico para vias lineares com a seguinte linha de comando:

[xin,Ein,Cin,x,E,C,Xstore,Cstore,fcst,fcct] = MCA (o,lev). (31)

Uma via metablica linear uma via composta por um nmero

qualquer de metablitos mas que no possui pontos de bifurcao (Figura 7).

pXXsnn E

n

EEE 121...1

+ Figura 7 Via metablica linear generalizada.

Para uma via metablica linear, os teoremas descritos nas Equaes (8)

e (10) podem ser resumidos em forma de matriz:

LXXX

LXXX

KKK

.........

...1...11

21

21111

11

11

11

.........

...

...

222

111

L

L

L

XL

XL

JL

XXJ

XXJ

CCC

CCCCCC

= .

1...00......0...100...01

(32)

Por convenincia, as equaes cinticas partem de uma expresso

padro, sendo necessrio apenas fornecer seus coeficientes, incluindo inibies

se houver. A expresso adotada do tipo:

( ) ( )( ) ( )

( )( )

( ) ( )( )( )

( )i

inhib

ieq

iimi

ieq

iiicat

ii

KX

KX

kX

KX

XkEnv

+

++

=

1

1

1

1

. (33)

Com essa forma fixa foi possvel manter o programa com o clculo

automtico das elasticidades, sem que o usurio precise fornecer as derivadas

das equaes cinticas segundo a Equao (9).

Os parmetros de entrada e sada, bem como suas descries, esto

mostrados na Tabela (6).

51

Tabela 6 Parmetros da funo MCA.

Parmetros de entrada Parmetro Descrio o Escalar que indica qual enzima ser superexpressa. lev Escalar que indica o nvel de superexpresso da enzima. Parmetros globais Parmetro Descrio s Nvel de substrato. p Nvel de produto. En Vetor contendo todas as constantes cinticas En. kcat Vetor contendo todas as constantes cinticas kcat. Keq Vetor contendo todas as constantes cinticas Keq.

answ Parmetro que recebe os valores 'y' ou 'n', ativando ou desativando os clculos de inibio.

inhib Matriz de dimenses (i 2) onde i o nmero de inibies. A primeira coluna representa o metablito que exerce inibio, e a segunda coluna representa a enzima inibida.

Ki Vetor de dimenso i contendo as constantes de inibio Ki. Parmetros de sada Parmetro Descrio

xin Vetor contendo as concentraes de cada metablito antes de qualquer superexpresso da enzima. O ltimo termo do vetor representa o fluxo no estado estacionrio J, tambm antes de qualquer superexpresso.

Ein Matriz contendo as elasticidades antes da superexpresso. Cin Matriz contendo os coeficientes de controle antes da superexpresso.

x Vetor contendo as concentraes de cada metablito aps a superexpresso da enzima. O ltimo termo do vetor representa o fluxo no estado estacionrio J.

E Matriz contendo as elasticidades aps a superexpresso. C Matriz contendo os coeficientes de controle aps a superexpresso.

Xstore uma matriz que armazena todos os valores de x durante o aumento da expresso.

Cstore uma matriz que armazena todos os valores de C durante o aumento da expresso. fcst Confirmao do teorema da soma dos controles de fluxo. fcct Confirmao do teorema da conectividade dos controles de fluxo.

Alm das matrizes dos FCCs e das elasticidades, o programa ainda

fornece grficos de evoluo dos nveis de cada matablito, do fluxo no estado

estacionrio J e dos FCCs da via metablica.

52

3.1.6. Utilizando o ME Toolbox para MCA de pontos de bifurcao (MCAB)

A funo MCAB do toolbox faz a anlise de controle metablico de vias

bifurcadas como a exemplificada na Figura (8).

Figura 8 Exemplo de um ponto de bifurcao em uma via metablica.

A linha de comando para o uso da funo MCAB a seguinte:

[xin,Ein,Cin,x,E,C,Jstore,Xstore,Cstore,XJstore] = MCAB (J,dep,lev). (34)

A funo MCAB pode ser usada facilmente em pontos de bifurcao

com qualquer nmero de reaes de entrada e de sada.

Como os pontos de bifurcao so relacionados produo e consumo

de um nico metablito, no foi inserido nenhum efeito de inibio deste

metablito sobre qualquer enzima que catalise tais reaes. Dessa forma, o

modelo cintico utilizado foi a Equao (35), para as reaes de produo, e a

Equao (36), para as reaes de consumo, conforme dado abaixo:

( ) ( )( ) ( )

( )

( ) ( )( )( )ieqi

imi

ieqiicat

ii

KX

ks

KXsk

Env++

= , (35)

( ) ( )( )

( )

( ) ( )ieqi

im

ieq

iicat

ii

Kp

kX

Kp

XkEnv

)(

)(

++

= . (36)

Os parmetros de entrada e sada, bem como suas descries, esto

mostrados na Tabela (7).

53

Tabela 7 Parmetros da funo MCAB.

Parmetros de entrada Parmetro Descrio J Vetor contendo as taxas de cada um dos fluxos do ponto de bifurcao. dep Escalar que indica o fluxo dependente. o fluxo que ser superexpresso. lev Escalar que indica o nvel de superexpresso da enzima. Parmetros globais Parmetro Descrio s Nvel de substrato. p Nvel de produto. En Vetor contendo todas as constantes cinticas En. kcat Vetor contendo todas as constantes cinticas kcat. Keq Vetor contendo todas as constantes cinticas Keq. Parmetros de sada Parmetro Descrio

xin Vetor contendo a concentrao do metablito e a taxa do fluxo dependente dep no estado estacionrio, antes de qualquer superexpresso. Ein Matriz contendo as elasticidades antes da superexpresso. Cin Matriz contendo os coeficientes de controle antes da superexpresso.

x Vetor contendo a concentrao do metablito e a taxa do fluxo dependente dep no estado estacionrio, aps a superexpresso. E Matriz contendo as elasticidades aps a superexpresso. C Matriz contendo os coeficientes de controle aps a superexpresso.

Jstore uma matriz que armazena todas as taxas dos fluxos durante o aumento da expresso.

Xstore uma matriz que armazena todos os valores de x durante o aumento da expresso.

Cstore uma matriz que armazena todos os valores de C durante o aumento da expresso.

XJstore uma matriz que combina Xstore com Jstore. Usada para facilitar a obteno de grficos.

O MCAB gera ainda uma figura com os fluxos do ponto de bifurcao,

o nvel do metablito e os FCCs.

3.2. Estudo de caso I: anlise de fluxo metablico para a produo de

hidrognio por Clostridium butyricum

O diagrama de fluxos mostrado na Figura (9) mostra um esquema das

reaes pertinentes biossntese de hidrognio por Clostridium butyricum em

condies anaerbicas (Saint-Amans et al., 2001).

54

Adaptado de Saint-Amans et al., 2001. Figura 9 Esquema mostrando o modelo para o metabolismo do hidrognio. O modelo metablico apresenta dois substratos, glicose e glicerol, formando gliceraldedo-3-fosfato e gerando etanol, butirato e acetato. A partir do glicerol ainda formado o 1,3-propanodiol. O hidrognio formado pelo sistema lateral onde a ferrodoxina (Fd) oxidada formando H2, sendo novamente reduzida pelo piruvato fechando o ciclo.

Todas as reaes no modelo estequiomtrico so consideradas

reversveis. As setas na Figura (9) representam as direes que so geralmente

aceitas. As taxas apresentadas no modelo foram representadas como: taxa de

consumo de glicose (vCluc), taxa de produo de piruvato (vPyr), taxa de

produo de CO2 (vCO2), taxa de produo de acetoaceil-CoA (vAACoA), taxa

de produo de 3-hidroxibutiril-CoA (vHbCoA), taxa de produo de crotonil-

55

CoA (vCrCoA), taxa de produo de butiril-CoA (vBuCoA), taxa de produo

de butiril-fosfato (vButP), taxa de produo de butirato (vBut), taxa de

produo de acetaldedo (vActal), taxa de produo de etanol (vEtOH), taxa de

produo de acetil-fosfato (vAcP), taxa de produo de acetato (vAct), taxa de

consumo de glicerol para produo de dihidroxiacetona (vGlyc1), taxa de

produo de dihidroxiacetona-fosfato (vDHAP), taxa de produo de

gliceraldedo-3-fosfato pela via do glicerol (vG3P), taxa de consumo de glicerol

para produo de 3-Hidroxipropionaldedo (vGlyc2), taxa de produo de 1,3-

propanodiol (v1,3Prd), taxa de produo de lactato (vLac), e taxa de produo

de H2 (vH2). A partir da via metablica sugerida (Figura 9), tem-se o conjunto

de 20 reaes listadas na Tabela (8).

Tabela 8 Modelo de reaes metablicas para produo de hidrognio por

Clostridium butyricum.

# Fluxo Reao r1 vGluc Glicose + 2ATP 2ADP + 2Gliceraldedo-3-fosfato

r2 vPyr Gliceraldedo-3-fosfato + 2ADP + NAD+ Piruvato +

2ATP + NADH + H+

r3 vCO2 Piruvato + HSCoA + NAD+ Acetil-CoA + NADH + H+ +

CO2r4 vAACoA Acetil-CoA Acetoacetil-CoA + HSCoA

r5 vHbCoA Acetoacetil-CoA + NADH + H+ 3-Hidroxibutiril-CoA +

NAD+r6 vCrCoA 3-Hidroxibutiril-CoA Crotonil-CoA + H2O r7 vBuCoA Crotonil-CoA + NADH + H+ Butiril-CoA + NAD+r8 vButP Butiril-CoA + ATP Butiril-fosfato + HSCoA + ADP r9 vBut Butiril-fosfato + ADP Butirato + ATP

r10 vActal Acetil-CoA + NADH + H+ Acetaldedo + HSCoA +

NAD+r11 vEtOH Acetaldedo + NADH + H+ Etanol + NAD+r12 vAcP Acetil-CoA + ATP Acetil-fosfato + HSCoA + ADP r13 vAct Acetil-fosfato + ADP Acetato + ATP r14 vGlyc1 Glicerol + NAD+ Dihidroxiacetona + NADH + H+

r15 vDHAP Dihidroxiacetona + ATP Dihidroxiacetona-fosfato + ADP r16 vG3P Dihidroxiacetona-fosfato Gliceraldedo-3-fosfato r17 vGlyc2 Glicerol 3-Hidroxi-propionaldedo

r18 v1,3Prd 3-Hidroxi-propionaldedo + NADH + H+ 1,3-

Propanodiol + NAD+

56

r19 vLac Piruvato + NADH + H+ Lactato + NAD+r20 vH2 NADH + H+ NAD+ + H2

A representao estequiomtrica das reaes dada na Tabela (9) pela

matriz G de dimenses (m n) onde m so as 20 reaes e n so os 19

metablitos envolvidos nas reaes.

Tabela 9 Matriz estequiomtrica (G) para a via metablica proposta.

Glic

eral

ded

o-3-

fosfa

to

Piru

vato

HSC

oA

Ace

til-C

oA

Ace

toac

etil-

CoA

3-H

idro

xibu

tiril-

CoA

Crot

onil-

CoA

Butir

il-Co

A

Butir

il-fo

sfato

Ace

tald

edo

Ace

til-fo

sfato

Dih

idro

xiac

eton

a

Dih

idro

xiac

eton

a-fo

sfato

3-H

idro

xi-p

ropi

onal

ded

o

ATP

AD

P

NA

D+

NA

DH

H+

2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -2 2 0 0 0 r1 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 -2 -1 1 1 r2 0 -1 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 1 1 r3 0 0 1 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 r4 0 0 0 0 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 -1 -1 r5 0 0 0 0 0 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 r6 0 0 0 0 0 0 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 -1 -1 r7 0 0 1 0 0 0 0 -1 1 0 0 0 0 0 -1 1 0 0 0 r8 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 1 -1 0 0 0 r9 0 0 1 -1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 -1 -1 r10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 1 -1 -1 r11 0 0 1 -1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 -1 1 0 0 0 r12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 1 -1 0 0 0 r13 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 -1 1 1 r14 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 1 0 -1 1 0 0 0 r15 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 r16 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 r17 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 1 -1 -1 r18 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 -1 -1 r19

G=

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 -1 -1 r20

No modelo estequiomtrico proposto, derivado da Figura (9), oito das

reaes foram classificadas como medidas. Essas foram a taxa de consumo de

glicose (vCluc), taxa de produo de CO2 (vCO2), taxa de produo de butirato

(vBut), taxa de produo de etanol (vEtOH), taxa de produo de acetato

(vAct), taxa de consumo de glicerol para produo de dihidroxiacetona

57

(vGlyc1), taxa de produo de 1,3-propanodiol (v1,3Prd), e taxa de produo de

lactato (vLac).

Os fluxos medidos foram o