upc ii – microbiologia aula prática laboratorial 1 maria josé correia [email protected]...

UPC II – MicrobiologiaAula prática laboratorial 1

Maria José [email protected]

2015/2016

28-09-2015

mailto:[email protected]

28/09/2015 UPC II - Microbiologia 2015/2016 2

Sumário L1:

Apresentação sucinta do programa das aulas laboratoriais;

Segurança no Laboratório

Noções de desinfeção, assepsia e esterilização

Introdução à microscopia


Programa:

1. O laboratório de Microbiologia (Equipamentos Materiais e Cuidados).

2. Meios de cultura e cultivo de microrganismos (Preparação dos meios para a aula seguinte)

3. Recolha e processamento de amostras (Recolha pelos alunos de uma amostra do biofilme oral e sua inoculação nos meios apropriados)

4. Observação directa de microrganismos (Colorações das amostras do biofilme oral). 2 aulas

5. Observação de preparações definitivas e investigação on line da estrutura e factores de virulência de microrganismos patogénicos e comensais.

12

28set

5 out

12 out

19 Out 26 Out

2 nov

1. Ficha de avaliação com os conteúdos lecionados até 3 de novembro.

2. Identificação de Microrganismos por cultura e testes bioquímicos miniaturizados para identificação de Streptococci. Inclui realização de um antibiograma com o microrganismo identificado. 2 aulas.

3. Identificação molecular de Streptococci orais nas amostras de biofilme. 2 aulas

4. Identificação de um microrganismo por PCR.

5. Ficha de avaliação final (Inclui todos os conteúdos das aulas laboratoriais).

14

9 nov (1h)

16 e 23 nov

30 nov e 7 dez

14 dez

4 jan (1h)

Total 24

Risco biológico em microbiologia

Causar danos: No operador Na comunidade No ambiente


Controlo do risco é assente em:

Manual de boas práticas do conhecimento de todos

Construção e equipamento que garanta a segurança

Organização das atividades no laboratório



Segurança no laboratório: Atitudes:

Usar o senso comum (a maioria dos acidentes de laboratório começa com algo simples);

Estar consciente – conhecer os reagentes antes de os usar (ler os rótulos tomar as medidas necessárias);

Estar protegido – conhecer as práticas e equipamentos que podem aumentar a proteção (máscaras, luvas, etc.).


Segurança no laboratório: Regras gerais:

Nunca COMER, BEBER, FUMAR, aplicar lentes de contacto ou cosméticos!

Nunca cheirar soluções ou reagentes Nunca pipetar com a boca Lavar imediatamente a pele após contacto com

culturas/químicos


Segurança no laboratório:

É especialmente perigoso correr ou brincar em ambientes laboratoriais


Segurança no laboratório: Bancada:

As bancadas de trabalho devem ser mantidas organizadas e limpas

Identificar todo o material utilizando para isso marcadores de vidro apropriados

Manter as lamparinas acesas apenas enquanto são necessários

Os lixos devem ser perfeitamente identificados (contaminado e limpo)

O material de vidro estalado ou partido deve ser imediatamente rejeitado

Colocar as pipetas de vidro sujas em contentores de plástico devidamente identificados para esse fim


Segurança no laboratório: Proteção pessoal:

Usar bata e manter os cabelos compridos apanhados;

Não usar sapatos abertos, chinelos, sandálias; Usar a hotte e a CSB sempre que necessário; Quando abandonar o laboratório retirar a bata e

lavar todas as zonas de pele que possam ter estado expostas a substâncias tóxicas/patogénicas.


Instruções gerais: Ler os protocolos antes de cada aula prática

Desinfetar as mãos e a bancada

No início da aula examinar/registar os resultados das experiências realizadas na aula anterior

Seguir atentamente as instruções fornecidas pelo docente antes de executar o trabalho proposto

Depois de terminar o trabalho de cada aula arrumar a bancada onde trabalhou. Colocar o lixo e o material inoculado nos locais apropriados

Desinfetar a bancada (álcool) e lavar as mãos com sabonete antes de deixar o laboratório

Classificação dos MO infecciososClassificação Manual OMS (2004) ExemplosGrupo 1 Nenhum ou baixo risco para o individuo

e para a comunidade.Saccharomyces crevisiaeBacillus subtilis

Grupo 2 Risco individual moderado e baixo risco para a comunidade

Escherichia coliSalmonella typhimuriumKlebsiela pneumoniaeLegionella pneumophilaShigella flexneri

Grupo 3 Elevado risco individual e baixo risco para a comunidade

Mycobacterium tuberculosisBacillus anthracisCoxiella burnetiiSalmonella typhiYersinia pestis

Grupo 4 Elevao risco individual e para a comunidade

Virus hemorrágicosVirus influenza A H5N1


Nível de segurança de laboratórios



Assepsiaausência de microrganismos Manutenção das condições de

assepsia:

limpar e desinfetar a bancada de trabalho lavar e desinfetar as mãos no início e fim da aula usar bata limpa (sempre) esterilizar o material a utilizar trabalhar à chama ou na câmara de fluxo laminar


Técnicas de esterilização Principais agentes anti-microbianos

Métodos físicos Calor Radiações Filtros

Métodos químicos desinfetante antisséticos


Esterilização pelo calor Calor seco

Oxidação e desnaturação das proteínas Combustão da matéria orgânica Aplicações:

Materiais resistentes a altas temperaturas (ansas, vidros não calibrados, etc.)

Equipamento Estufas a 160-180ºC (2 horas) Equipamento de incineração ou queima direta


Esterilização pelo calor Calor húmido

Coagulação das proteínas; destruição de células vegetativas e esporos

É usado com associação à elevada pressão Aplicações:

Meios de cultura e soluções aquosas Materiais pouco resistentes ao calor (plásticos resistentes, etc.)

Sensibilidade a calor húmido




Equipamento/técnicas: Autoclave (atmosfera de vapor de água sob pressão)



Equipamento/técnicas: Pasteurização (aquecimento do produto por um período de tempo

que varia com produto a pasteurizar e a temperatura utilizada).



Equipamento/técnicas: Tindalização (aquecimento a 65-100ºC durante 30-60 min,

intercalado com incubação a 35ºC – ciclos que podem repetir-se até 3 dias)


Esterilização por filtração

Remoção de microrganismos em membranas filtrantes com poro nominal inferior às dimensões bacterianas (0,2 µm).

Aplicações: Produtos termo lábeis, voláteis ou sensíveis a

altas pressões (ex: antibióticos e vitaminas)

Equipamento/técnicas: Filtração com funil (grandes volumes) Filtração com seringa (pequenos volumes) Filtração de ar em câmaras de fluxo laminar

Prescott, Microbiology, 5th edition


Esterilização por radiações Raios X e :

Poder ionizante e elevado poder de penetração - para objectos volumosos

Raios UV: Menor energia, radiação pouco penetrante usada para

esterilização de superfícies Ultra-sons (radiação de alta frequência)

Destruição mecânica de células Raios catódicos (feixes de electrões de intensidade e

velocidade elevadas): Esterilização de material cirúrgico


Esterilização por agentes químicos Agentes bactericidas ou bacteriostáticos (só eliminam as formas vegetativas e não as formas esporuladas)

Sabões, sais biliares e fenóis (alteração da tensão superficial)

Cloro (oxidação de compostos celulares) Álcoois (desnaturação de proteínas e solubilização de

lípidos)

Detergentes germicidas:misturas comerciais de vários agentes bactericidas e bacteriostáticos

Indicadores de esterilização



Introdução à microscopia

Microscópio ótico

instrumento usado para ampliar

constituído por uma parte mecânica e uma parte ótica

OcularTubo Revólver

Objetiva

Platina

DiafragmaCondensador

Fonte de luzPé

Parafuso Macrométrico

Parafuso Micrométrico

Coluna

Prescott, Microbiology, 5th edition


Microscópio ótico - Parte mecânica Pé ou Base – suporta/estabiliza o microscópio Braço ou Coluna – peça fixa à base, serve de suporte a outros constituintes do microscópio.

Tubo ou Canhão –suporta os sistemas de lentes da extremidade superior Platina – peça paralela à base, onde é colocada a preparação a observar, possuindo no centro um orifício que permite a passagem dos raios luminosos concentrados pelo condensador.

Parafuso Macrométrico – engrenagem indispensável para fazer a focagem. Parafuso Micrométrico – elemento que permite movimentos de amplitude reduzida para completar a focagem.

Revólver – peça giratória adaptada à zona inferior do tubo que suporta as objetivas de diferentes ampliações (ex: 10x, 40x, 100x)


Microscópio ótico - Parte ótica

Sistema de Oculares e Sistema de Objetivas – o conjunto de lentes que permitem a ampliação do objecto (a ampliação dada ao microscópio é igual ao produto da ampliação da objetiva pela ampliação da ocular)

Fonte Luminosa lâmpada (iluminação artificial), espelho que reflita a luz solar (iluminação natural).

Condensador – conjunto de lentes convergentes que distribui regularmente, sobre o campo visual do microscópio, a luz emitida pela fonte luminosa.

Diafragma – regula a intensidade luminosa no campo visual do microscópio


Utilização do microscópio

Ligar a lâmpada Ajustar distância interpupilar (oculares) Colocar a lâmina na platina e focar em objetiva 10x Ampliar a imagem, retificar focagem e observar Utilizar óleo de imersão (1 gota) apenas para a objetiva

100x Limpar a objetiva com solução apropriada Quando terminar observação:

Regular a luz para o mínimo e desligar a lâmpada Voltar sempre para a objetiva de menor ampliação Cobrir o microscópio


Objetivos L1:

O aluno deve ser capaz de:

seguir todas as regras de segurança referidas; definir desinfeção, assepsia e esterilização; enumerar os principais processos de esterilização

de material e meios de cultura; descrever as situações específicas em que deve

ser utilizado um determinado método de esterilização;

descrever o modo de atuação dos métodos de esterilização;

utilizar o microscópio da forma mais correta.

Bibliografia

Microbiologia capitulos 18 e 26


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