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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE Faculdade de Medicina

Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas

THIAGO RUBIM BATISTA BELLOTT NASCIMENTO

PREVALÊNCIA DO POLIOMAVÍRUS DE CÉLULAS DE MERKEL (MCPyV)

POR PCR EM TUMORES CUTÂNEOS

Niterói 2016

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THIAGO RUBIM BATISTA BELLOTT NASCIMENTO

PREVALÊNCIA DO POLIOMAVÍRUS DE CÉLULAS DE MERKEL (MCPyV) POR PCR EM TUMORES CUTÂNEOS

Orientador: Prof. Jorge Reis Almeida

Coorientador: Prof. Flávio Barbosa Luz

Niterói

2016

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências Médicas. Área de Concentração: Ciências Médicas.

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THIAGO RUBIM BATISTA BELLOTT NASCIMENTO

PREVALÊNCIA DO POLIOMAVÍRUS DE CÉLULAS DE MERKEL (MCPyV)

POR PCR EM TUMORES CUTÂNEOS

Aprovada em:_____/_____/_____

BANCA EXAMINADORA

-------------------------------------------------- Prof.

--------------------------------------------------

Prof.

-------------------------------------------------- Prof.

Niterói 2016

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências Médicas. Área de concentração: Ciências Médicas

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AGRADECIMENTOS

A conclusão desse curso de mestrado não teria sido possível sem a

ajuda de muitas pessoas do hospital e de fora dele. Desta forma, gostaria de

agradecer profundamente todos os que, de alguma forma, fizeram parte deste

trabalho.

À minha companheira e futura esposa Camila Polis, que sempre me deu

todo o apoio necessário, não só nesse trabalho, mas em todos os outros

planos de vida que temos, o meu muito obrigado.

Aos meus pais, pelo estímulo a seguir uma carreira acadêmica, pelo

carinho e pelo suporte.

Ao meu orientador,prof. Jorge Reis, pelos ensinamentos e pela forma

tranquila com que conduziu os trabalhos.

Ao meu coorientador, Flávio Luz, pelos ensinamentos relacionados ao

projeto e à cirurgia da pele, durante esses dois anos.

À professora Mayra Carrijo Rochael, que me ajudou desde o início a

ingressar no mestrado, e pela paciência que sempre teve comigo.

Ao professor Rafael Brandão Varella, que foi o grande mentor do tema

deste projeto, pela disponibilidade e pelo apoio.

A Camila Baez, que contribuiu de forma fenomenal para a conclusão do

artigo e que controlou minha pressa em concluí-lo.

Às monitoras e estagiárias de Dermatologia, Laís Penedo, Mayra

Sanandres, Mariana Moraes e Fernanda Azevedo, que sempre me ajudaram

muito na coleta das peças cirúrgicas.

À equipe do Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas: à

secretaria, à coordenação e aos professores. Obrigado pela paciência eterna

com minhas dúvidas acerca das disciplinas e prazos. Aos membros da banca,

pelo privilégio de tê-los aqui.

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RESUMO

Em 2008, descobriu-se um novo poliomavírus etiologicamente relacionado e clonalmente integrado ao genoma de 80% dos carcinomas de células de Merkel (CCM). Recentemente o DNA viral também tem sido encontrado em carcinomas basocelulares (CBC) e carcinomas de células escamosas (CEC),mas estes achados são controversos. Portanto, o presente estudo visa avaliar a prevalência deste vírus, o poliomavírus de células de merkel (MCPyV)em tumores cutâneos, através da técnica de reação em cadeia da polimerase aninhada (nested PCR), e correlacionar os resultados com o diagnóstico histopatológico ecom os dados epidemiológicos da população estudada. Um total de 96 tumores, em sua maioria CBC e CEC, extraídos de 79 indivíduos brasileiros foram analisados neste estudo. O DNA do MCPyV foi detectado em 23 das 69 (33,3%) amostras de CBC, em dois dos 11 (18%) casos de CEC, em dois dos quatro casos de Doença de Bowen, e em quatro das onze lesões cutâneas diversas restante. Não houve detecção de DNA viral no único caso de CCM. Apesar da detecção do DNA do MCPyV nestes tumores cutâneos, o seu papel no desenvolvimento destas neoplasias permanece desconhecido e requer investigações adicionais. Palavras-chave: Poliomavírus de células de Merkel (MCPyV); câncer de pele; carcinoma de células escamosas ; carcinoma basocelular ; oncogene.

vii

ABSTRACT

In 2008 a new human polyomavirus etiologically related and clonally integrated into the genome of 80% of Merkel Cell Carcinomas (CCM) was discovered. Recently the virus DNA has also been found in basal cell carcinoma (CBC) and squamous cell carcinoma (CEC), but these findings are controversial. Therefore, the present study intends to assess the prevalence of this virus, the Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) in skin tumors through nested polymerase chain reaction (nPCR), correlating the results with the histopathological diagnosis and with the epidemiological data from the population studied. A total of 96 skin tumors, in their majority CBC and CEC, removed from 76 Brazilian subjects were analyzed in this study. MCPyV DNA was detected in 23 out of 69 (33,3%) basal cell carcinoma samples, in 2 out of 11 (18%) squamous cell carcinoma, 2 out of 4 Bowen disease, and in four out of 11 others skin disorders.There was no DNA detection in the only one case of MCC. Despite the detection of MCPyV DNA in these skin tumors, its role in their development remains unknown and need further investigation. Keywords: Merkel cell polyomavirus (MCPyV); skin cancer; squamous cell carcinoma (CEC); basal cell carcinoma (CBC); oncogene.

viii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Características gerais da população (n = 79) e dos tumores (n = 96).

......................................................................................................... 31  

Tabela 2. Positividade para MCPyV DNA conforme o diagnóstico

histopatológico. ................................................................................ 37  

ix

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Tumores cutâneos não-melanoma. Características da população

estudada. Prevalêcia por etnia. ....................................................... 30  

Figura 2. Tumores cutâneos não-melanoma. Características da população

estudada. Distribuição por faixa etária. ............................................ 31  

Figura 3. Tumores cutâneos não-melanoma. Localização dos tumores. .......... 32  

Figura 4. Tumores cutâneos não melanoma. Subtipos de carcinoma

basocelular. ...................................................................................... 32  

Figura 5. Tumores cutâneos não-melanoma. Subtipos de carcinoma de células

escamosas. ...................................................................................... 33  

Figura 6. Tumores cutâneos não-melanoma. Concordância em relação a

positividade da PCR para em tumores de um mesmo paciente. ..... 34  

Figura 7. Tumores cutâneos não-melanoma. Prevalência das neoplasias. ...... 34  

Figura 8. Tumores cutâneos não-melanoma. Positividade para PCR nos casos

de CBC. ........................................................................................... 35  

Figura 9. Tumores cutâneos não-melanoma. Positividade para PCR nos casos

de CEC. ........................................................................................... 36  

Figura 10. Tumores cutâneos não-melanoma. Positividade para PCR nos casos

de DB. .............................................................................................. 36  

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LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

MCpYV: Merkel CellPolyomavirus/PoliomavírusdasCélulas de Merkel

CCM/MCC: Carcinoma de Células de Merkel/Merkel CellCarcinoma

não-CCM/non-MCC: Não-Carcinoma de Células de Merkel/Non-Merkel CellCarcinoma

CEC/SCC: Carcinoma de Células Escamosas/Squamous Cell Carcinoma

CBC/BCC: Carcinoma Basocelular/Basal Cell Carcinoma

DB/BD: Doença de Bowen/ Bowen disease

CPNM/NMSC: Câncer de Pele Não-melanoma/Nonmelanoma Skin Cancer

HSV-1:Vírus do Herpes Simples, tipo 1/Herpes simplex Virus, type 1

HSV-2:Vírus do Herpes Simples, tipo 2/Herpes simplex Virus, type 2

EBV ou HHV-4: Vírus Epstein-Barr ou Herpesvírus Humano tipo 4/Epstein-Barr Virus or Human Herpes Virustype 4

HHV-8 ou KSHV: Herpesvírus Humano tipo 8 ou Vírus do Sarcoma de Kaposi/Human Herpes Virus type 8 or Kaposi Sarcoma Virus

HPV: Papilomavírus Humano/Human Papillomavirus

LT-Ag: Antígeno T maior/Large T Antigen

ST-Ag: Antígeno T menor/Small T Antigen

JCPyV: Poliomavírus JC/JC Polyomavirus

BKPyV: Poliomavírus BK/BK Polyomavirus

HIV: Human Immunodeficiency Virus/Vírus da Imunodeficiência Humana

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 12 2. 2 REVISÃO DE LITERATURA 3. 2.1 CÂNCER DE PELE NÃO MELANOMA E CARCINOMA DE CÉLULAS DE

MERKEL 13

2.2 ONCOGÊNESE VIRAL EM HUMANOS 19 2.3 POLIOMAVÍRUS E ONCOGÊNESE 21 3 OBJETIVOS 26 3.1 OBJETIVO GERAL 26 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 26 4 METODOLOGIA 27 4.1. DESENHO DE ESTUDO 27 4.2. LOCAL E PERÍODO DE REALIZAÇÃO DO ESTUDO 27 4.3.1 Critérios de inclusão 27 4.3.2 Critérios de exclusão 27 4.4 COLETA E PROCESSAMENTO DO MATERIAL HISTOPATOLÓGICO 27 4.5 COLETA E PROCESSAMENTO DO MATERIAL PARA DETECÇÃO DO GENOMA VIRAL 28

5 CONSIDERAÇÕES SOBRE OS ASPECTOS ÉTICOS 29 6 RESULTADOS 30 7 DISCUSSÃO 38 8 CONCLUSÕES 44 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 45

12

1 INTRODUÇÃO

Segundo os conceitos atuais, o desenvolvimento do câncer envolve

múltiplas etapas que terminam por causar defeitos genéticos permanentes. Há

alterações em oncogenes, genes supressores de tumores ou genes de

estabilidade, sendo o câncer, portanto, uma doença essencialmente genética.

Sabe-se de longa data que os vírus podem induzir dano cromossômico em

células infectadas e, mais recentemente, vêm se acumulando evidências que

indicam a habilidade de diferentes vírus em induzir mitoses aberrantes e

instabilidade genética, e sua capacidade de interferir nas vias celulares de

reparação do DNA(1).

Entre os vírus envolvidos ou potencialmente envolvidos na oncogênese

estão os da família Herpesviridae, o HPV, os adenovírus e, mais recentemente,

o Poliomavírus de Células de Merkel. Apesar de sua oncogenicidade ser

amplamente descrita na literatura desde 1950, a primeira descrição dos

poliomavírus como agentes etiológicos de neoplasia em seres humanos foi

feita apenas em 2008, com a descrição do Poliomavírus de Células Merkel

(MCPyV), clonalmente integrado a 80% dos carcinomas de células de Merkel

(CCM)(2). Desde então o MCPyV tem sido alvo de grande atenção por parte da

comunidade científica: cogita-se, também, que sua presença possa estar

relacionada a outros tipos de neoplasia. Estudos recentes demonstram que o

MCPyV associa-se também à leucemia linfocítica crônica (3), ao carcinoma

cervical de células escamosas(4), ao câncer de pulmão de células não-

pequenas (5), ao carcinoma basocelular (CBC) e ao carcinoma de células

escamosas (CEC) cutâneo, em pacientes com ou sem imunossupressão (6-

13).

Todavia, ainda se sabe pouco sobre a relação do MCPyV com outros

tipos de câncer e, embora seja improvável que o MCPyV seja a única causa

etiológica para outros tumores cutâneos como o CBC e o CEC, sua influência e

envolvimento nesses tumores requerem investigações adicionais e mais

profundas.

13

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 TUMORES CUTÂNEOS

Os cânceres de pele não-melanomassão os cânceres mais comuns no

ser humano. Aproximadamente 80% são carcinomas basocelulares (CBC) e

20% carcinomas espinocelulares (CEC). Menos de 1% dos cânceres de pele

não-melanoma (CPNM) correspondem a outros tumores cutâneos mais raros,

entre outros o carcinoma de células de Merkel, os linfomas cutâneos eos

tumores anexiais(14-17).

Em contraste com outros tumores cutâneos mais agressivos, como o

melanoma, o CBC e o CEC raramente evoluem com metástases, apresentando

baixa mortalidade. Este fato contribui para que haja uma baixa notificação

dessas neoplasias, tornando um desafio para as instituições de saúde

quantificar sua incidência, oseu grau de morbidade e os gastos em saúde

relacionados por eles determinados (18-20).

Apesar da dificuldade em avaliar a real prevalência dos CPNM, sabe-se

que sua incidência aumentou dramaticamente nos últimos 30-40 anos(21).Sua

incidência é estimada em 230 por 100.000 habitantes nos indivíduos de pele

clara, e de 3,4 por 100.000 habitantes nos de pele escura(22).

O principal fator de risco para o CBC e CEC é a exposição à radiação

ultravioleta. Estudos sugerem que, ao contrário do que ocorre com o CEC, a

exposição solar intermitente e recreacional seja mais importantepara o

desenvolvimento do CBCdo que a radiação UV acumulada(23). Outros fatores

de risco incluem a radiação ionizante, a exposição a agentes químicos (sendo

o arsênico uma causa bem definida de CEC in situ) (24-26).

O carcinoma basocelular (CBC) é a neoplasia mais comum em pessoas

de pele clara, sendo extremamente incomum na pele negra. Tem como

principal fator de risco a exposição aos raios ultravioletas. Outros fatores de

risco descritos são história familiar, imunossupressão e síndromes genéticas

como albinismo, xerodermapigmentoso, síndrome de Gorlin e síndrome de

Bazex. Clinicamente, os CBC podem ser divididos em nodular-ulcerado,

superficial e esclerodermiforme. Podem ou não serpigmentados. Cerca de 80%

14

deles se apresentam na região da cabeça e pescoço. Sua evolução é, na

maioria dos casos, indolente e, apesar do seu potencial de destruição local

com o passar do tempo, somente 0,0028% a 0,55% dos casos apresentam

metástases(26).

Clinicamente, a forma nodular se apresenta como pápulas eritematosas,

com brilho perolado. Há telangiectasias arboriformes sobre as lesões, que

podem ou não ulcerar. A forma superficial costuma acometer o tronco,

apresentando-se como lesões maculares eritematodescamativas, usualmente

acompanhadas de áreas atróficas em que há telangiectasias. O tipo

esclerodermiforme é incomum, apresentando-se geralmente na face com

lesões mal delimitadas e de consistência firme à palpação, de coloração

amarelada ou eritematosa (27).

Histopatologicamente o CBC caracteriza-se por ser uma neoplasia

epitelial de células basalóides, com núcleos volumosos e perda das pontes

intercelulares. Há agrupamento em paliçada das células periféricas e espaços

de retração parênquimo-estromal (fendas) bastante sugestivos. Apesar de não

existir uma classificação histopatológica universalmente aceita, os CBC podem

ser subdivididos nos seguintes subtipos: sólidos ou macronodulares, com ou

sem diferenciação adenoide;micronodulares; císticos ou anexiais;

superficiais;micronodulares; esclerodermiformes; basoescamosos ou

metatípicos; e fibroepiteliais de Pinkus. Todas as formas podem ou não ser

pigmentadas(19). As formas esclerodermiformes, infiltrativas e micronodulares

são as mais agressivas e implicam em maior risco de recidiva. Já as formas

sólidas, superficiais e císticastêm comportamento mais brando(28).

Outros fatores de pior prognóstico para o CBC seriam : tamanho acima

de 20 mm; área central da face, isto é, situação periocular, nasal e lábios, bem

como o pavilhão auricular; lesões mal delimitadas; lesões recidivantes; e

invasão perivascular ou perineural na histopatologia (20).

O tratamento do CBC costuma depender dos diversos fatores

prognósticos citados, entre os quais o tamanho do tumor, sua localização e tipo

histopatológico. A modalidade terapêutica mais segura é a excisão cirúrgica

15

com margens de segurança. No entanto, outros procedimentos

podemserusados, principalmente em lesões de baixo risco. Estes

procedimentos são a crioterapia e a curetagem, seguidas de

eletrocauterização(20,29).

Os CBC de alto risco que surgem na face, esclerodermiformes,

infiltrativos, micronodulares e recidivantes podem exigir cirurgia micrográfica de

Mohs. Esta técnica cirúrgica inclui uma análise histopatológica intraoperatória

por congelação, que possibilita avaliar quase que 100% das margens

cirúrgicas(19,30).

O carcinoma espinocelular (CEC) é o segunda malignidade cutânea em

frequência, após o CBC. Tem também como fatores de risco a exposição aos

raios ultravioletas e a imunossupressão. O CEC costuma evoluir a partir de

outras lesões cutâneas consideradas pré-cancerosas, como as ceratoses

actínicas, as queilites actínicas, a leucoplasia oral e a radiodermite crônica (19).

Adicionalmente, o CEC pode ocasionalmente evoluir a partir de lesões

crônicas como granuloma venéreo, lúpus vulgar, hanseníase, hidradenite

supurativa, escaras, cicatrizes e úlceras crônicas e exposição crônica a

radiação térmica(20,31).

O risco de evolução para o CEC da pele na ceratose actínica é baixo

avaliado como sendo menor do que um caso por 1.000 habitantes ao ano. Já o

risco de evolução da Doença de Bowen (tipo peculiar de CECin situ) é mais

alto (19).

A associação entre o CEC e os papilomavírus humanos (HPV) ainda não

está completamente estabelecida, mas existem estudos demonstrando a

presença de HPV de alto risco, especialmente o HPV-16, em CEC, doença de

Bowen e CEC periungueal(20).Apesar de o CEC cutâneo apresentar um risco

maior de metástases que o CBC, esse risco continua sendo baixo e é calculado

como sendo menor que 5%(19).

Clinicamente, as lesões de CEC costumam surgir em pacientes com

sinais de fotoenvelhecimento como: ceratoses actínicas, elastoses solares,

16

melanoses solares, telangiectasias, fissuras labiais, entre outros. As lesões são

eritematoescamosas, costumam apresentar aspecto verrucoso e induração das

bases, o que produz uma consistência firme à palpação. Com o crescimento da

lesão, pode haver ulceração e sangramentos espontâneos ou após a

manipulação (20).

O carcinoma verrucoso é uma forma de CEC em que há alto grau de

diferenciação celular, levando a uma intensa hiperceratose que transforma em

desafio a distinção histopatológica entre hiperplasia pseudo-epiteliomatosa e

CEC(20).O CEC pode ser dividido em três subtipos: carcinoma ou epitelioma

cuniculatum localizado nas solas; condiloma genital gigante (tumor de

Buschke-Lowenstein); papilomatose oral florida localizada na boca(19).

Papulose bowenóide é o termo usado para designar as verrugas genitais

causadas pelo HPV-16 e 18 quando há alterações histológicas compatíveis

com CECin situ(19).

É difícil a diferenciação histológica entre CEC e outra neoplasia cutânea

caracterizada pela proliferação de epitélio escamoso altamente diferenciado, o

ceratoacantoma. Para que se possa descartar a hipótese de CEC, os aspectos

clínicos devem ser levados em consideração(19).

As lesões de CEC apresentam crescimento mais rápido que as de CBC,

porém mais lento que as de ceratoacantoma(20). As lesões secundárias às

ceratoses actínicas no dorso da mão são particularmente indolentes, enquanto

que as lesões nos lábios e na área genital costumam ser mais agressivas(19).

Histopatologicamente, o CEC caracteriza-se pela proliferação atípica de

células espinhosas que ultrapassam o limite da membrana basal e invadem a

derme. A visualização da invasão dérmica das células tumorais pode tornar-

seum desafio, já que muitas vezes há hiperplasia pseudo-epiteliomatosa

associada(20). O CEC in situ (localizado somente na epiderme) é conhecido

como Doença de Bowen quando afeta a pele, e como eritroplasia de Queyrat

quando afeta a mucosa da região balanoprepucial. São ambas consideradas

lesões precursoras do CEC invasivo(19). Apesar de haver ainda grande

controvérsia, alguns autores já consideram também a ceratose actínica como

17

um tipo de CEC in situ(32).

A diferenciação histológica do CEC tem como base o grau de

diferenciação que estas células apresentam: pouco, moderadamente ou bem

diferenciado(33). As células bem diferenciadas são poligonais, com núcleo

vesicular, nucléolo proeminente e citoplasma abundante contendo tonofibrilas e

pontes intercelulares bem desenvolvidas. Estas lesões podem apresentar

áreas de maturação com a formação de pérolas ou rolhas córneas

características. As lesões pouco diferenciadas são constituídas por células

anaplásicas com citoplasma basofílico, que não evidenciam sua origem

epidérmica(19).

A diferença histopatológica entre a Doença de Bowen e a ceratose

actínica está em que a Doença de Bowen apresenta displasias de alto grau das

células escamosas de toda a epiderme, enquanto a ceratose actínica

apresenta displasias de grau leve a moderado geralmente presentes nas

camadas mais inferiores da epiderme(19).

Os principais fatores de risco para as metástasesde CEC são o tamanho

do tumor, a sua localização, etiologia, grau de diferenciação histológica e a

presença de imunossupressão. Os CEC em áreas não expostas, assim como

aqueles derivados de lesões crônicas ou de exposições térmicas e ionizantes

têm pior prognóstico(20).

O tratamento do CEC geralmente é feito por excisão cirúrgica com

margens de segurança. Tais margens podem variar de 2 a 6 mm, dependendo

dos fatores prognósticos(20). A radioterapia fica reservada para os tumores de

grandes dimensões, com crescimento rápido e para aqueles em que o

tratamento cirúrgico não pode ser tolerado.

O carcinoma basoescamoso (ou metatípico) costuma apresentar

características histopatológicas de CBC e CEC simultaneamente. A

significância biológica deste padrão patológico estaria associada a uma maior

incidência de metástases (estimadas entre 9 e 10%). Eles representam

aproximadamente 1% de todos os CPNM (19, 20).

18

O carcinoma de células de Merkel é uma neoplasia neuroendócrina rara,

originária dos mecanorreceptores localizados na epiderme, as células de

Merkel. Estima-se que sua incidência seja próxima a 0,24-0,35 por 100.000

habitantes na população norte americana e holandesa. Descrito inicialmente

em 1972 por Toker (34), o carcinoma de células de Merkel tem uma alta

letalidade,com taxas acima de 30%. Sua incidência triplicou nas últimas duas

décadas(35, 36).

Acomete preferencialmente áreas fotoexpostas de pacientes idosos,

caucasianos, com ou sem imunossupressão (incluindo transplantados renais e

HIV positivos). Sua alta associação com outros CPNM sugere que a

fotoexposição também seja um importante fator de risco nesta neoplasia (35).

Os carcinomas de células de Merkel costumam apresentar-se com

lesões eritematosas ou violáceas, solitárias, em forma de domo, assintomáticas

e de rápido crescimento, acometendo principalmente as áreas fotoexpostas da

cabeça e doe pescoço (35). Suas principais características podem ser

resumidas através do acrônimo em inglês AEIOU: A, de

asymptomatic/assintomático; E, de expandingrapidly/expansão rápida; I, de

Immunosuppression/imunossupressão; O,de older than 50 years/idade acima

de 50 anos; e U,de UV exposed site in a fair-skinned individual/exposição aos

raios UV em indivíduo de pele clara (37).Tal como o sarcoma de Kaposi, o

carcinoma de células de Merkel ocorre mais frequentemente em pacientes com

história de imunossupressão (transplantados e HIV positivos)(2).

A histologia do tumor caracteriza-sepela presença de células pequenas,

arredondadas, localizadas na derme a uma profundidade variável. A coloração

pela hematoxilina-eosina revela células de morfologia monomórfica, citoplasma

escasso e hiperbasofílico e núcleo hipercromático e arredondado, podendo

apresentar padrão de crescimento trabecular, sólido ou difuso(38). A

imunoistoquímica revela positividade para a citoqueratina 20 (CK20+) e

negatividade para a citoqueratina 7 (CK7-). A positividade para marcadores

neuroendócrinos como a sinaptosina e a cromogranina A é sugestiva.

Atualmente, a detecção dos antígenos virais do MCPyV é usada como

marcador diagnóstico(19).

19

O tratamento cirúrgico é geralmente feito mediante excisão cirúrgica com

ampla margem de segurança. Como, porém, as metástases ocorrem

precocemente em 30 a 50% dos casos, a radioterapia geralmente é associada

ao tratamento (30).

2.2. ONCOGÊNESE VIRAL EM SERES HUMANOS

A oncogênese é uma via multifatorial e o estudo dos sistemas virais

suporta a noção de que o desenvolvimento do tumor ocorre pela acumulação

de eventos múltiplos, enquanto a presença do DNA viral nas células tumorais

não é, necessariamente, um fator causal. Muitos caminhos levam à

oncogênese viral. A transformação celular causada por uma infecção viral que

conduz à ativação de oncogenes ou à inativação de genes supressores de

tumor, é um dos principais mecanismos da oncogênese viral. A expressão de

um oncogene consiste no principal mecanismo oncogênico no caso de alguns

retrovírus, enquanto a inativação do gene supressor de tumor pode ser o

resultado da infecção por alguns vírus de DNA como os poliomavírus,

papilomavírus e adenovírus. Para estes últimos, a inibição/degradação das

proteínas regulatórias p53 e pRb consiste na estratégia principal. Além disso, a

inflamação crônica, muitas vezes causada por outros agentes infecciosos, pode

aumentar o risco de câncer, como no caso dos cânceres de cólon, na colite

ulcerativa. A competência do sistema imunitário também é fundamental para o

controle do processo infeccioso/oncogênico, sendo o imunocomprometimento

um dos principais fatores de risco para a progressão para neoplasias(39,40).

Entre os agentes virais envolvidos ou potencialmente envolvidos na

oncogênese em seres humanos estão os vírus da família Herpesviridae, o

HPV, o adenovírus e, mais recentemente, o Poliomavírus de Células de Merkel.

A família Herpesviridae compreende oito diferentes tipos de vírus, e muitos

deles já foram detectados em espécimes obtidos de neoplasias humanas (41).

Os vírus Herpes simplex (HSV-1, HSV-2) podem infectar, potencialmente,

qualquer local do corpo, muito embora as infecções da pele, mucosa genital,

oral, olhos, ânus, reto e do sistema nervoso central sejam as mais comuns.

Tem-se sugerido que o HSV-1 tem a capacidade de transformar células in vitro,

possivelmente criando um potencial oncogênico in vivo(42), enquanto o HSV-2

é tido como um cofator possível no desenvolvimento de câncer do colo

20

uterino (41). O vírus de Epstein-Barr (EBV ou HHV-4) associa-se a um grande

número de doenças malignas, incluindo o linfoma de Burkitt, o linfoma de

células B em pacientes imunodeficientes e a doença de Hodgkin. O EBV foi

encontrado no epitélio cervical e as sequências genômicas detectadas em

biópsias cervicais de pacientes com carcinoma invasivo sugerem um possível

papel do EBV na gênese dos carcinomas genitais (43). O DNA do EBV foi

também detectado na uretra de homens com gonorreia, levantando questões

sobre a propagação deste vírus para o trato urogenital. O citomegalovírus

humano (CMV ou HHV-5) causa doença similar à mononucleose, doença

neonatal e infecção sistêmica em imunocomprometidos, e tem sido associado

ao adenoma nefrogênico(44). O herpesvírus humanos tipo 6 (HHV-6) foi

detectado em uma série de pacientes com câncer de bexiga no

Mediterrâneo(45). O herpesvírus humano tipo 8 (HHV-8), também conhecido

como o herpesvírus do Sarcoma de Kaposi (KSHV) caracteriza-se por ser,

juntamente com o EBV, um dos herpesvírus mais notadamente oncogênicos.

Infecta principalmente pacientes HIV-positivos e provoca desde lesões

epiteliais esparsas até lesões disseminadas e fatais(46).

Os papilomavírus humanos (HPV) constituem um grupo grande e diverso

de vírus, com 174 tipos completamente caracterizados e novos tipos sendo

continuamente descritos (47). Os HPV são classificados em função do seu

tropismo tecidual. Os alfa-HPV infectam as mucosas, enquanto os beta, gama,

nu e mu-HPV infectam a pele. Os HPV das mucosas distinguem-se pelo seu

potencial de malignidade. Os HPV de baixo risco incluem ostipos 6, 11, 40, 42,

43, 44, 54, 61, 70, 72 e 81, que podem causar lesões de baixo grau, como

condilomas e lesões cervicais benignas e raramente são encontrados em

doenças malignas (48). Os HPV de alto risco, que incluem os tipos 16, 18, 31,

33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 e 66 ganharam notoriedade por serem os

principais agentes causadores do carcinoma cervical uterino (49).

Além de presentes no carcinoma cervical uterino, os HPV de alto risco

foram também encontrados em 26% dos carcinomas de células escamosas da

cabeça e pescoço, independentemente da ausência dos principais fatores de

risco (uso de tabaco e álcool, má higiene bucal e pré-disposição genética).

Dentro do grupo heterogêneo dos carcinomas de células escamosas de cabeça

21

e pescoço, quase 70% de todos os casos de carcinomas orofaríngeos e

tonsilares são HPV-positivos em países desenvolvidos. Apesar disso, não

existe rotina para o rastreamento de lesões precoces por HPV nas amígdalas e

orofaringe (50).

Os adenovírus têm sido encontrados em vários tumores, incluindo

sarcomas, adenocarcinomas, retinoblastomas, neuroectodérmico e tumores da

glândula mamaria, bem como no carcinoma do pulmão de pequenas células.

Ele infecta o hospedeiro através da boca, nasofaringe ou conjuntiva. Logo após

a infecção, o DNA viral penetra o núcleo e os seus primeiros produtos

interagem com as proteínas supressoras de tumor, como a p53 e a do

retinoblastoma. Além disso, os produtos dos genes E3 e E4 inibem a

apoptose (51). O papel cancerígeno dos adenovírus já foi demonstrado

previamente in vitro e in vivo. In vitro, as investigações mostraram a produção

de proteínas específicas do adenovírus nas células transformadas. Recentes

estudos in vivo revelaram sorotipos de adenovírus em tumores cerebrais de

crianças. Subtipos de adenovírus também foram detectados em espécimes de

nódulos linfáticos humanos acometidos por linfomas e leucemias

linfocíticas (40).

2.3. POLIOMAVÍRUS E ONCOGÊNESE

O primeiro poliomavírus foi isolado em 1953 por Ludwik Gross e recebeu

este nome por ser o agente causal de múltiplos tumores em roedores (do

Grego poli, múltiplos, e oma, tumor). Desde então, foram sendo descobertas

novas espécies de poliomavírus e, atualmente, a família Polyomaviridae possui

3 gêneros e 22 espécies, das quais seis foram descobertas após 2008 (36).

Os poliomavírus humanos são vírus DNA nãoenvelopados com

partículas virais icosaédricas de aproximadamente 45 µm. Seu genoma viral é

composto de um DNA circular de duplafita, com cerca de 3500 pares de bases,

dividido em três regiões, duas codificantes e uma não codificante. A região

precoce (early region) é a responsável pela codificação do antígeno T maior

(LT-Ag) e do antígeno T menor (ST-Ag). Ambos são oncoproteínas virais com

função de replicação. A região tardia (late region) codifica proteínas virais

estruturais, como VP1, VP2 e VP3. A região nãocodificante é responsável pelo

controle da replicação viral(18).

22

O genoma dos poliomavírus não é capaz de codificar as proteínas

necessárias para a sua própria replicação, de modo que esses microrganismos

necessitam utilizar a maquinaria do hospedeiro, particularmente ativa durante a

fase S do ciclo celular. Para tal, os poliomavírus utilizam as proteínas

expressas precocemente durante seu ciclo biológico, os antígenos Large T (LT-

Ag) e Small T (ST-Ag). O LT-Ag interfere na atividade de duas importantes

proteínas que regulam a progressão do ciclo celular: os produtos dos genes

supressores tumorais RB1 e TP53, denominados pRb e p53, respectivamente.

Está bem definido que o comprometimento das funções de pRb e p53 por LT-

Ag resulta na estimulação exacerbada do ciclo celular, favorecendo a

transformação celular. Por outro lado, a função do ST-Ag é menos clara:

embora não seja essencial para a replicação viral em cultura de tecidos, para a

transformação celular ou para a indução tumoral, o ST-Ag aumenta a

transformação mediada pelo LT-ag e é necessário para que se possa

completar a transformação de células humanas in vitro (18).

Sabe-se que importantes doenças causadas por poliomavírus ocorrem

em paciente imunossuprimidos, entre as quais a leucoencefalopatia multifocal

progressiva em pacientes com SIDA, causada pelo poliomavírus JC (JCPyV), e

a cistite hemorrágica em pacientes submetidos a transplantes alogênicos de

células tronco hematopoiéticas, causada pelo poliomavírus BK (BKPyV).Além

da relação causal entre o MCPyV e o CCM, um papel do BKPyVe do JCPyV na

transformação celular in vivo em seres humanos tem sido proposto desde seu

isolamento, em 1971, embora permaneça controverso (52,53). Diversos

estudos têm associado o genoma do BKPyV e a expressão da oncoproteína

LT-Ag a carcinomas uroteliais de bexiga, ao câncer de próstata e ao câncer de

túbulos renais, sugerindo uma participação viral na oncogênese, através da

interação do LT-Ag com p53 e pRb(54-57).Por outro lado, a presença do DNA

do JCPyV, assim como de transcritos do LT-Ag, têm sido descritos com

frequência de até 75% em tumores cerebrais como o oligodendroglioma, o

glioblastoma, o oligoastroblastoma e o meduloblastoma (58-62), e com

frequência de aproximadamente 60% dos carcinomas gástricos e de cólon(63-

65).Em contraste com a detecção do genoma viral em neoplasias, descreve-se

23

também uma considerável parcela de tumores negativos para os vírus BKPyV

e JCPyV, obscurecendo o papel da infecção viral persistente na oncogênese.

A primeira descrição de poliomavírus como agente etiológico de neoplasia

em seres humanos foi feita apenas em 2008, com a descrição do poliomavírus

dasCélulas de Merkel (MCPyV), presente em cerca de 80% dos casos de

carcinoma de células Merkel (CCM) (2).Nesta neoplasia cutânea de origem

neuroendócrina, o genoma do MCPyV sofre integração ao genoma celular

anteriormente à expansão clonal das células neoplásicas, além de apresentar

mutações tumor-específicas como o truncamento do antígeno T maior (2,66).

Tais mutações também têm sido relatadas em diversos outros tumores, comoa

leucemia linfocítica crônica (3,67,68), câncer de pulmão de células não-

pequenas (non-small cell lung cancer) (5), câncer de células escamosas e

adenocarcinomas cervicais (4). Mais recentemente, após outros estudos

confirmarem a forte relação causal entre o MCPyV e o CCM(69,70), o genoma

viral também foi encontrado em cânceres de pele não-melanoma, como o

carcinoma de células basais e o carcinoma de células escamosas, com uma

prevalência em torno de 13 a 72% (6,12,39). No entanto, ainda não há

comprovação do caráter etiológico do MCPyV em malignidades diferentes

doCCM.

Estudos epidemiológicos estabeleceram que é comum a infecção pelo

MCPyV na população em geral. Ensaios imunoenzimáticos específicos para a

proteína maior do capsídeo viral VP1 demonstraram que mais de 80% da

população adulta possui anticorpos circulantes, em contraste com a quase

inexistência desses anticorpos crianças pequenas (71-75). O DNA viral

também tem sido encontrado na saliva, na urina eem uma grande variedade de

tecidos humanos, como os do trato respiratório,linfonodos e trato

gastrointestinal, ainda que em frequências mais baixas, quando comparadas

com a frequência com que é descrito na pele(6,66,76-82,92).

Desta forma, está cada vez mais claro o grande potencial que os vírus

têm de causar lesões oncogênicas em qualquer tecido humano. Sendo a pele

um órgão de grande dimensão, seria de se esperar que esses vírus também

estivessem associados a neoplasias cutâneas. O fácil acesso para remoção de

amostras teciduais para estudo e o fato de que os cânceres de pele não-

24

melanoma serem as neoplasias mais frequentes do homem, tornam a pele um

ótimo órgão-alvo para a pesquisa da relação entre vírus e oncogenicidade. É

possível que o potencial oncogênico do MCPyV, associado a fatores genéticos

e ambientais, leve ao desenvolvimento de outros CPNM.

No Brasil, estudos envolvendo a detecção de agentes virais em

neoplasias cutâneas são infrequentes, se não inexistentes. Desta forma,

questões relevantes envolvendo a ocorrência, carga viral e investigação do

papel etiológico de viroses nos tecidoscutâneos permanecem em aberto.

26

3 OBJETIVOS

• Identificar a prevalência do MCPyV em tumores cutâneos, mediante PCR.

• Correlacionar os achados dePCR com os tipos histológicos e os dados

epidemiológicos da população estudada.

27

4 METODOLOGIA

4.1. DESENHO DO ESTUDO

Trata-se de um estudo observacionalde corte transversal.

4.2. LOCAL E PERÍODO DE REALIZAÇÃO DO ESTUDO

O presente estudo foi realizado no Laboratório Multiusuário de Apoio à

Pesquisa em Nefrologia e Ciências Médicas (LAMAP), localizado no Hospital

Universitário Antônio Pedro (HUAP/UFF). As análises histopatológicas foram

realizadas no Laboratório de Técnica Histológica do Serviço de Anatomia

Patológica do Hospital Universitário Antônio Pedro (HUAP/UFF). As cirurgias

da pele foram realizadas no Centro Cirúrgico do Hospital Universitário Antônio

Pedro (HUAP/UFF). As técnicas de identificação do genoma viral foram

realizadas no Laboratório de Virologia do Hospital Universitário Clementino

Fraga Filho (HUCFF/UFRJ) no período de janeiro 2014 a dezembro de 2015.

4.3. CARACTERÍSTICAS DA POPULAÇÃO

Pacientes atendidos pelo Serviço de Dermatologia do Hospital

Universitário Antônio Pedro (HUAP/UFF) com indicação clínica de biópsia

cutânea ou excisão cirúrgica de tumores cutâneos foram incluídos na pesquisa.

4.3.1. Critérios de inclusão

• Indicação de abordagem cirúrgica de tumor cutâneo.

• Assinatura do termo de consentimento Livre e Esclarecido por escrito.

4.3.2. Critérios de exclusão

• Qualquer impossibilidade técnica para a coleta e o fornecimento de

amostra clínica.

• Não assinatura do termo de consentimento Livre e Esclarecido por

escrito.

4.4. COLETA E PROCESSAMENTO DO MATERIAL HISTOPATOLÓGICO

Após excisão cirúrgica da lesão com margem de segurança, um

pequeno fragmento foi separado do tecido excisado para análise molecular por

PCR. O material foi então embebido em formol e encaminhado para análise

histopatológica conforme a rotina do Hospital Universitário Antônio Pedro

28

(HUAP/UFF). As lâminas coradas pela hematoxilina-eosina foram analisadas

por patologista experiente, que emitiu um laudo diagnóstico final.

4.5. COLETA E PROCESSAMENTO DO MATERIAL PARA DETECÇÃO DO

GENOVA VIRAL

Fragmentos daslesões cirurgicamente removidasforam coletados em

microtubosestéreis de 2 mL, contendo solução de RNAlater ® (Life

Technologies) destinada à preservação do RNA, e estocados a -80oC até o

processamento da amostra.

A técnica de PCR em tempo real foi empregada para detecção do

genoma e do RNA mensageiro dos vírus estudados, uma vez que tais agentes

podem ser encontrados de forma latente no hospedeiro.No caso de detecção

positiva do DNA viral na amostra clínica, o RNA previamente extraído foi

submetido à RT-PCR para síntese decDNA através do kit AccessQuick ® RT-

PCR System (Promega), de acordo com as instruções do fabricante. Após este

passo, o DNA e cDNA das amostras foram submetidas a PCR em tempo real

pela metodologia Taqman ® (Life Technologies) utilizando-se primers e

probesadequados à detecção do LT3, conforme descrito Baez et al. (2009). A

leitura do experimento foi realizada no aparelho StepOne Plus ® (Life

Technologies), localizado no Laboratório de Virologia da UFRJ.

29

5 CONSIDERAÇÕES SOBRE OS ASPECTOS ÉTICOS

O estudo é um estudo de associação (transversal cruzado) e não interfere

na rotina de investigação e acompanhamento dos pacientes do HUAP/UFF. A

indicação de biópsia para o estudo histopatológico foi feita durante a rotina

investigativa do Hospital, de maneira que nenhum material foi coletado

exclusivamente para fins desta pesquisa.

É necessário ressaltar que a pesquisa está em consonância com a

Resolução 196/96, do Conselho Nacional de Saúde sendo, portanto, garantida

a privacidade dos sujeitos da pesquisa quanto aos dados confidenciais nela

envolvidos.

Não houve armazenamento em Biobanco, sendo as amostras mantidas

em freezer -80ºC apenas até o momento do uso, conforme as normas de

Biorrepositório (resolução 441/11). Após o uso, as amostras foram descartadas

segundo as normas do Nível de Biossegurança 2 (NB-2).

O presente estudo foi devidamente aprovado pelo Comitê de Ética em

Pesquisa do HUAP/UFF (CAAE:26400313.1.0000.5243– Anexo 1). Todas as

atividades foram realizadas apenas após a assinatura do Termo de

Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE, Apêndice 1) por parte dos

voluntários.

30

6 RESULTADOS

Foram incluídos no presente estudo 79 pacientes, 44 homens (56%) e

35 mulheres (44%) com idade de 67,05 anos, em média. A maioria foi

considerada como etnicamente branca (86%).As características gerais clínico-

epidemiológicas da populaçãoestudada estão descritas nas Tabelas 1 e 2, e

nas Figuras 1 e 2.

Figura 1. Tumores cutâneos não-melanoma. Características da população estudada.

Prevalência por etnia.

31

Figura 2. Tumores cutâneos não-melanoma. Características da população estudada.

Distribuição por faixa etária.

Um total de 96 tumores foi incluído no estudo, a maior parte localizada

na cabeça e no pescoço (71,8%), seguindo-se os membros (17,8%) e o tronco

(10,4%). Houve 69 casos de carcinoma basocelular (71,8%), 11 casos de

carcinoma de células escamosa (11,5%),quatrocasos de doença de Bowen

(DB, 4,2%) e um caso de carcinoma de células de Merkel (1%). Houve também

11 casos de condições cutâneas diversas (11,5%), entre as quais cinco

ceratoses actínicas, um dermatofibrossarcoma protuberans, um

dermatofibroma, um neuroma, um ceratoacantoma, um poroma écrino e um

cisto folicular. Os dados topográficos e histopatológicos estão resumidos na

Tabela 1 e naFigura 3.

Tabela 1. Características gerais da população (n = 79) e dos tumores (n = 96). Idade (média em anos, variação) ....................................................... 67 (23–93) Sexo (masculino/feminino, % masculino) ...................................... 44/35 (55,7%) Localização do tumor (n = 96) Cabeça e pescoço (n = 69) ............................................................. 71.8% Membros (n = 17) ............................................................................ 17.8% Tronco (n = 10) ............................................................................... 10.4% Etnia (n = 79) Branca (n = 68) .................................................................................. 86% Parda (n = 9) ...................................................................................... 11% Negra (n = 2) ........................................................................................ 3%

32

Figura 3. Tumores cutâneos não-melanoma. Localização dos tumores.

Os subtipos histológicos encontrados no carcinoma basocelular foram:

nodular, superficial, infiltrativo, metatípico e micronodular. Os subtipos

histológicos encontrados no carcinoma de células escamosas foram: bem

diferenciado, moderadamente diferenciado e pouco diferenciado (Figuras 4 e

5).

Figura 4. Tumores cutâneos não melanoma. Subtipos de carcinoma basocelular.

33

Figura 5. Tumores cutâneos não-melanoma. Subtipos de carcinoma de células escamosas.

Dos 79 pacientes, 13 apresentavam mais de um tumor. Destes, onze

pacientes apresentavam dois tumores, um apresentava três tumores e um

apresentava cinco tumores.

Dos onze pacientes que apresentavam dois tumores, dois tinham

positividade para o MCPyV em ambas as lesões; cinco tinham uma amostra

negativa e outra positiva; e quatro não tinham evidências da presença do

MCPyV em nenhuma das lesões.

Os dois outros pacientes, com três e cinco tumores cada um, mostraram

negatividade em todas as lesões.

No grupo de pacientes acometidos por mais de uma lesão houve,

portanto, detecção do genoma do MCPyV, em 9 dos 30 tumores (30%). Nestes

pacientes, a concordância de positividade ou negatividade de todas as lesões

ocorreu em 8 dos 13 pacientes (6 com todos os tumores negativos e 2 com

todos os tumores positivos), ou seja, em 61,5%. O total de lesões positivas

neste grupo de pacientes foi de 9 sobre 29 lesões, ou seja, de 31%.

34

1

Figura 6. Tumores cutâneos não-melanoma. Concordância em relação a positividade da PCR para em tumores de um mesmo paciente.

Figura 7. Tumores cutâneos não-melanoma. Prevalência das neoplasias.

No grupo dos 69 CBC, 23 lesões (33,3%) foram positivas para presença

do vírus; duas lesões dos 11 CEC (18%) foram também positivas. Dois dos

quatrocasos de DB (50%) foram positivos. Em 4 amostras das 11 condições

cutâneas diversas houve também positividade (36,3%).Entre as condições

diversas positivas contavam-se duas ceratoses actínicas; um

dermatofibrossarcoma protuberans, um ceratoacantoma. Os dados relativos

àcorrelação entre positividade da PCR e o tipo histológico encontram-se na

Tabela 2 e nas Figuras 4,5 e 6.

Não houve diferença significativa entre os subtipos de CBC e a presença

do MCPyV. Nas 34 amostras de CBC nodular, 11 possuíam o DNA viral (32%);

nas 24 amostras de CBC infiltrativo, nove possuíam o DNA viral (37,5%); nas

sete amostras de CBC superficial, duas possuíam o DNA (28,5%); nas três

amostras de CBC metatípico, uma apresentou o DNA (33,3%); a única amostra

de CBC micronodular foi negativa para a pesquisa do DNA viral.

35

Figura 8. Tumores cutâneos não-melanoma. Positividade para PCR nos casos de CBC.

36

Figura 9. Tumores cutâneos não-melanoma. Positividade para PCR nos casos de CEC.

Figura 10. Tumores cutâneos não-melanoma. Positividade para PCR nos casos de DB.

37

Tabela 2. Positividade para MCPyV DNA conforme o diagnóstico histopatológico. BCC SCC BD MCC Outros Geral Amostras N 69 11 4 1 11 96 % 71,8% 11,5% 4,2% 1% 11,5% 100% MCPyV DNA N 23 2 2 --- 4* 31 % 33,3% 18% 50% --- 36,3% 32.2% * As quatro condições outras em que houve positividade para o MCPyV foram duas ceratoses actínicas, um dermatofibrossarcoma protuberans, um ceratoacantoma. MCPyV: Poliomavírus de células de Merkel; BCC: carcinoma basocelular; SCC: carcinoma espinocelular; DB: doença de Bowen; MCC: Carcinoma de células de Merkel. Outros: diversas lesões cutâneas incluindo: ceratose actínica, dermatofibrossarcoma protuberans, neuroma, ceratoacantoma e cisto folicular.

38

7 DISCUSSÃO

Múltiplos fatores contribuem para a etiologia do CBC e do CEC, como a

exposição aos raios ultravioletas e a imunossupressão, fatores de risco

também presentes no carcinoma de células de Merkel (CCM)(6,8). Da mesma

forma que ocorre no CCM e no Sarcoma de Kaposi, onde a oncogenicidade

viral associada a imunossupressão leva ao desenvolvimento do câncer, os

CBC e os CEC também poderiam ter um agente viral envolvido em sua

patogênese. O carcinoma de células de Merkel (MCPyV) foi o primeiro

poliomavírus associado ao desenvolvimento de câncer em seres humanos e,

desde de sua descoberta em 2008(2), seu potencial oncogênico em outras

neoplasias cutâneas têm sido objeto de diversos estudos (6-9,11-13).

Feng e colaboradores (2) descreveram a presença do MCPyV em 80%

dos casos de CCM pela técnica de PCR, detectando a sua presença com o

emprego do primer para o lócus do antígeno T (LT1 e LT3) e para o gene da

proteína do capsídeo viral (VP1). Também foi descrita a inclusão do genoma

viral nestes tumores mediante a técnica de Southern blotting.

Após sua descoberta, estudos posteriores confirmaram, em todo o

mundo, a associação entre o MCPyV e o CCM(93). Estudos feitos na

população norte-americana e europeia detectaram a presença do MCPyV em

69 a 100% dos casos de CCM. Estudos levados a cabo com a população

australiana detectaram uma taxa menor, próxima a 25% (69,70,93).

Estudos sorológicos, analisando a presença de anticorpos contra as

proteínas do capsídeo viral (VP1) pelo método de ELISA, demonstraram que a

exposição ao MCPyV ocorre já na primeira infância, com o desenvolvimento de

infecção assintomática. Cerca de 20 a 40% das crianças entre 1 e 5 anos de

idade já possuem anticorpos contra o MCPyV. Essa prevalência sobe para

60% em adultos jovens de 20 anos, chegando a níveis superiores a 80% nos

adultos de mais idade (94-96).

Ainda se sabe pouco sobre a história natural e sobre a via de infecção

do MCPyV em seres humanos. A detecção do DNA viral na pele de adultos

hígidos sugere que a infecção ocorra por contato pele a pele, mas o modelo

exato de transmissão, o sítio de infecção primária e a existência ou não de

39

infecção latente ainda não foram caracterizados(35). A correlação de altos

níveis de anticorpos detectáveis com a presença do DNA viral na pele também

sugere que este órgão seja o sítio primário de infecção, embora isto não exclua

outros possíveis sítios primários. Diversos estudos também relataram a

presença do DNA viral em diversos outros tecidos, como os do trato

respiratório, intestinal e linfonodos, bem como na saliva e na urina. A carga

viral é, porém, menor quando comparada com a da pele(66,76-91). Entretanto,

a presença do vírus no trato gastrointestinal e respiratório também sugere que

a via de transmissão possa ser fecal-oral ou respiratória(36). Estes dados

corroboram a ideia de que, assim como os herpesvírus, o MCPyV possa

desenvolver uma infecção persistente por toda a vida do indivíduo.

A detecção do DNA viral em 33,3% dos carcinomas basocelulares no

presente estudo, utilizando a técnica do PCR para detecção da LT3, é similar

ao que é encontrado na maioria dos estudos internacionais, que demonstram

taxas que variam entre 13 e 72,2%, geralmente maiores em

imunossuprimidos(6-9,11-13). Mertz e colaboradores (6) encontraram

positividade para o vírus em 28 de 71 (39,4%) CBC retirados de pacientes

imunocompetentes. Essa taxa subiu para 47,1% em imunossuprimidos, onde 8

de 17 CBC albergavam o DNA viral. Em contraste com a frequente detecção

viral por PCR neste estudo, a imunoistoquímica para a pesquisa do antígeno T

maior (LT-Ag) no tecido tumoral foi positiva somente em dois dos 17 casos de

CBC que acometiam pacientes imunossuprimidos, sendo negativa em todos

CBC dos pacientes imunocompetentes.

A não detecção da expressão do LT-Ag por imunoistoquímica do MCPyV

na quase totalidade dos casos de CBC sugere, quando comparada aos 85% de

positividade nos casos de CCM, que a presença do vírus nos CBC não seja

primordial para o seu desenvolvimento(6). Este resultado é corroborado por um

estudo de Reisinger e colaboradores(9),em que foi negativa a pesquisa do LT-

Ag viral por imunoistoquímica em lesões de CBC e CEC retiradas de 20

pacientes imunocompetentes com história prévia de CCM.

O presente estudo corrobora os dados de Kassem e colaboradores (12),

que demonstraram a presença do MCPyV em 36 de 96 (37,5%) CBC

acometendo pacientes imunocompetentes. Em relação aos CBC de pacientes

40

imunossuprimidos, os valores foram supreendentemente altos, sendo positivos

72,2% dos casos.

Apesar do pequeno número de casos, a presença do MCPyV em 18%

dos carcinomas de células escamosas no presente estudo também está em

consonância com estudos prévios, que descrevem taxas que variam entre 13 e

52%. Kassem e colaboradores (12) descrevem a presença de MCPyV em 7 de

28 casos (25%) de CEC em pacientes imunocompetentes. Semelhante ao que

ocorreu com os CBC, o percentual foi de 52% em pacientes imunossuprimidos.

Kassem e colaboradores também descrevemuma alta positividade na doença

de Bowen, com 17,4% de positividade entre pacientes imunocompetentes e

69% entre pacientes imunossuprimidos. Rollison e colaboradores (7)

descreveram um percentual de 38% de positividade do MCPyV DNA em

amostras de tecido congelado fresco de CEC obtidos de pacientes

imunocompetentes. A presença do MCPyV DNA se associou a altos níveis de

anticorpos anti-MCPyV circulantes. Este expressivo percentual em pacientes

imunocompetentes pode ter se devido ao fato do tecido ter sido estudado

imediatamente após sua retirada e não após processamento do material em

blocos de parafina, o que levaria à degradação parcial do material genético

presente.

Dworkin e colaboradores (11) descreveram uma positividade de 15%

para a presença de MCPyV em CEC de pacientes imunocompetentes. Além da

positividade nos CEC, também se descreveu uma positividade de 17% na pele

adjacente ao tumor (21 de 58 amostras). Houve, entre os casos pareados

(tumor e pele adjacente ao tumor), uma concordância (presença ou ausência

do DNA viral em ambos os espécimes) de 87%. Esse achado sugere que,

apesar da ausência de alterações histológicas específicas, o vírus já poderia

estar presente na área perilesional, levando ao futuro desenvolvimento da

lesão tumoral.

Garneski e colaboradores (70) encontraram, semelhantemente, uma

taxa de 13% de positividade do MCPyV em CEC. Duas das 15 lesões de CEC

estudadas albergavam o DNA viral.

Murakami e colaboradores (8) encontraram quatro de 30 (13%) CEC

positivos para MCPyV, sendo que, desses quatro, dois também eram positivos

41

para a presença do LT-Ag pela imunoistoquímica. Também foi descrito no

mesmo estudo uma total negatividade para a presença do MCPyV em 10 casos

de CBC, não obstante o pequeno número total de casos dificultar a análise.

Ridd e colaboradores (13),discordando dos achados descritos até então

em outros estudos, descreveram uma taxa baixíssima de MCPyV em CPNM de

imunossuprimidos por transplante renal. Neste estudo, que englobou 85 CEC,

37 ceratoses actínicas e 28 doenças de Bowen, em apenas uma amostra de

ceratose actínica demonstrou-se a presença do vírus, por PCR.

A presença mais frequente do vírus nos CBC e CEC de pacientes

imunossuprimidos, descrita pelos autores, reforça a hipótese de que a

imunossupressão pode influenciar a oncogênese viral, seja criando um

ambiente mais permissivo para o desenvolvimento da neoplasia quando esta já

exista previamente, seja propiciando o seu aparecimento. Reisinger e

colaboradores (9), por sua vez, entendem que a maior frequência de detecção

viral em imunossuprimidos se deva à perda do controle da replicação viral

decorrente da imunodeficiência, o que levaria ao achado acidental do vírus

nestes tumores. No entanto, neste estudo, os resultados encontrados em

relação à imunossupressão não são passíveis de análise, já que somente dois

pacientes tinham imunodeficiência.

No presente estudo, 13 pacientes tinham mais de um tumor

simultaneamente. Houve concordância de 61,5% para a presença ou ausência

do vírus nos distintos tumores de um mesmo paciente. Entre os pacientes com

lesões múltiplas, 15,3% mostraram positividade para o DNA viral em todas as

lesões; 46,2% mostraram negatividade em todas as lesões; e os 38,5%

restantes tinham, em um mesmo paciente, lesões positivas e negativas. A alta

taxa de concordância para diferentes lesões em um mesmo indivíduo se

assemelha aos 81% descritos por Rollison e colaboradores (7) em pacientes

com lesões simultâneas de CEC. Dworkin e colaboradores (11), entretanto,

relataram menor taxa de concordância para presença do MCPyV em tumores

diversos de um mesmo paciente, descrevendo somente 6 de 31 pacientes

(19%) com lesões simultaneamente positivas por PCR.

No presente estudo, a única amostra de carcinoma de células de Merkel

proveniente de um paciente imunossuprimido (HIV positivo) foi negativa para a

42

presença do DNA viral, o que contraria os resultados descritos em outros

estudos. O mesmo indivíduo também apresentava também dois CBCnegativos

para o DNA viral. Este fato pode justificar-se pela possibilidade de que a lesão

deste paciente se encontre entre os 10 a 15% de CCM negativos para o

MCPyV, descritos na população americana(2).

Diferentes estudos descreveram ora a presença, ora a ausência, do

MCPyV em amostras de pele sadia. Mertz e colaboradores (6) encontraram um

percentual de 21,3% de positividade, com 10 de 47 amostras de pele sadia

positivas para o MCPyV. É importante ressaltar que as amostras consideradas

como sendo de pele normal, caracterizavam-se, neste estudo, por afecções

benignas como: margens de cicatrizes, margens de segurança de tumores

diversos (CPNM, mama, hemangioma, lipoma), úlceras, cistos pilonidais, cistos

epidérmicos. Supõe-se que a heterogeneidade dos espécimes considerados

como pele sã tenha levado a essa considerável positividade para o MCPyV.

Dworkin e colaboradores (11) encontraram 17% de positividade em

espécimes de pele adjacente ao tumor. Como mencionado anteriormente, dada

a alta taxa de 87% de concordância descrita neste estudo para presença do

vírus no tumor e na pele a ele adjacente, também há questionamentos sobre a

classificação dessas amostrasde pele como pele normal. Garneski e

colaboradores (70) não encontraram positividade viral em nenhuma das 15

amostras de pele sadia, o mesmo resultado sendo descrito por Kassem (12)

em um total de 6 amostras de pele normal.

Estudos utilizando suabes cutâneos para a pesquisa de MCPyV em pele

sadia mostraram resultados discordantes. Foulongne e colaboradores (84)

descreveram 80% de positividade para MCPyV em swabs cutâneos de

pessoas saudáveis: 56 dos 70 pacientes da população estudada tinham o DNA

viral. No entanto, o mesmo autor, em outro estudo, demonstrou uma

prevalência de MCPyV pela técnica de PCR baixa (17%) em amostras de

tecido de pele sadia: somente um dos 6 casos estudados tinha o DNA

viral (90).

Loyo e colaboradores (79) descrevem a presença do MCPyV em 7 de 9

amostras de pele sadia, porém em níveis extremamente interiores aos

descritos para os CCM. Esses resultados, apesar de por vezes contraditórios,

43

sugerem que o MCPyV seja um vírus ubíquo, com ampla distribuição pelo

ambiente.

Em resumo, demonstra-se que o genoma do MCPyV é frequentemente

encontrado por PCR em lesões de CBC e CEC. Adicionalmente, o fato de se

encontrar o DNA viral em algumas amostras de pele sadia e o fato de que mais

de 80% dos adultos possuem anticorpos anti-MCPyV indicam a possível

ubiquidade e capacidade de infecção persistente desse poliomavírus (6).

O presente estudo foi o primeiro estudo brasileiro a fornecer dados sobre

a prevalência do MCPyV em CPNM. Seus resultados corroboram os de outros

estudos internacionais sobre o assunto.

Dessa forma, o MCPyV tem grande potencial de estar envolvido no

desenvolvimento de uma fração dos CPNM, principalmente nos pacientes

imunossuprimidos. Sua comprovada capacidade oncogênica, associada a

possíveis fatores ambientais e individuais, poderia ser o gatilho para a

transformação tumoral.

44

8 CONCLUSÕES

Os resultados encontrados indicam a presença e um possível

envolvimento do MCPyV no desenvolvimento em uma fração de outros tumores

cutâneos que não o carcinoma de células de Merkel.

A presença do DNA viral em 33,3% das amostras de carcinoma

basocelular sugere um papel do MCPyV na gênese de pelo menos alguns

subgrupos destes tumores.

A detecção de 18% de positividade do MCPyV em amostras de

carcinoma de células escamosas não afasta um papel do vírus no

desenvolvimento deste tumor.

45

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