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1
BRUNA LEAL LIMA MACIEL
ESTADO NUTRICIONAL E EFEITO DA VITAMINA A NA RESPOSTA
IMUNE FRENTE À INFECÇÃO POR LEISHMANIA INFANTUM
NATAL-RN
2013
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
2
BRUNA LEAL LIMA MACIEL
ESTADO NUTRICIONAL E EFEITO DA VITAMINA A NA RESPOSTA
IMUNE FRENTE À INFECÇÃO POR LEISHMANIA INFANTUM
Tese de doutorado apresentada ao Programa de
Pós-graduação em Bioquímica, da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
como requisito parcial para a obtenção do
título de Doutor em Bioquímica
Orientadora: Profª Drª Selma Maria Bezerra
Jerônimo
NATAL-RN
2013
3
Aos meus pais, exímios arqueiros da minha vida. Pelo eterno exemplo de dedicação,
otimismo, sucesso e alegria.
4
AGRADECIMENTOS
A Deus, por tudo o que me foi dado, por estar sempre no controle da minha vida.
Aos meus pais, Noélia Lima e Aldo Lima, pela persistência em me educar e amar, pelos
ombros e ouvidos sempre amigos, pelo incentivo e apoio incondicionais.
Ao meu esposo, Saulo Carneiro Maciel, eterno amigo e namorado, companheiro e
confidente que sempre me ajuda e me inspira.
Aos meus irmãos Breno Lima e Adam Lima, que tão bem me conhecem.
À Graciela Maciel, pela companhia e paciência nos dias difíceis.
Aos amigos Sancha Vale e Roberto Silva, sempre presentes. Pela família de braços
abertos, pronta a nos acolher, pelas conversas e todas alegrias vividas e a serem vividas
juntos.
À Maria Cardoso pela doce amizade, por ter me proporcionado inesquecíveis momentos
que me impulsionaram na execução do trabalho.
À Profa Dr
a Selma Jerônimo pelo espaço de aprendizagem tão generosamente cedido.
Pela confiança e compreensão. Que as sementes plantadas em cada aluno orientado
cresçam, frutifiquem e sejam luz no caminho do ensino, da pesquisa e extensão
compromissados.
À Profa Dr
a Tatjana Keesen pelas aulas e sugestões tão valiosas para o desenvolvimento
desta pesquisa. Pela amizade e companhia, sempre disposta e generosa.
Ao Prof Dr Hênio Godeiro Lacerda pela preciosa ajuda em campo e momentos de
descontração vividos durante a execução do trabalho.
Ao Sr Manoel Fernandes, agente da Fundação Nacional de Saúde, pela essencial
colaboração no trabalho de coleta de dados em campo.
A todos os colegas do Laboratório de Imunogenética pela colaboração tão necessária
para o desenvolvimento deste trabalho. Em especial a Joanna Galvão, João Firmino
Neto e Freire Neto.
5
Ao Departamento de Nutrição – UFRN pela confiança, apoio e incentivo ao
desenvolvimento desta tese. Que cada docente formado possa contribuir com o
crescimento e aprimoramento da ciência da Nutrição.
A todos os professores e funcionários do Departamento de Biquímica – UFRN.
Ao Ballet, por me emprestar equilíbrio, leveza e alegria tão necessários para o
cumprimento das atividades diárias.
E por fim, mas mais importante, às crianças, que voluntariamente participaram deste
estudo. Que este trabalho possa de alguma forma contribuir para aqueles que sofrem
com o calazar.
6
RESUMO
O estado nutricional é importante determinante da resposta à infecção por
Leishmania. No entanto, são poucos os trabalhos que caracterizem as bases moleculares
das associações encontradas entre a desnutrição e a doença. A suplementação de
vitamina A é utilizada em países em desenvolvimento para reduzir a mortalidade por
diarreia e doenças respiratórias. Apesar disso, não existem estudos sobre o papel da
vitamina A na infecção por Leishmania apesar de nosso grupo e outros terem
demonstrando a deficiência de vitamina A durante a leishmaniose visceral (LV). As
células T regulatórias são consideradas células supressoras durante a LV e são induzidas
por metabólitos de vitamina A. Este trabalho teve como objetivo verificar a correlação
do estado nutricional e o efeito da vitamina A na resposta frente à infecção por
Leishmania infantum. Foram estudadas 179 crianças, sendo 31 casos de LV ativa, 33
com história pregressa de LV, 44 DTH+ e 71 DTH- e Anticorpo anti-Leishmania
negativo (DTH-/Ac-). Células mononucleadas de sangue periférico foram isoladas em
um subgrupo de 10 crianças com LV e 16 DTH-/Ac-, sendo cultivadas por 20h sob as
seguintes condições: 1) Meio, 2) Antígenos solúveis de promastigotas de L. infantum
(SLA), 3) Ácido all-trans retinóico (ATRA), 4) SLA + ATRA e 5) Concanavalina A.
As células T CD4+CD25
highFoxp3
+, T CD4
+CD25
-Foxp3
- e monócitos CD14
+ foram
marcadas e estudadas por citometria de fluxo quanto à produção de IL-10, TGF-β e IL-
17. O estado nutricional apresentou-se comprometido nas crianças com LV, que
apresentaram menor IMC/idade e baixas concentrações de retinol sérico quando
comparadas aos controles sadios. Observou-se correlação negativa entre o estado
nutricional (medido por Índice de Massa Corporal/Idade e retinol sérico) e anticorpos
anti-Leishmania e proteínas de fase aguda. Não foi encontrada correlação entre o estado
nutricional e a carga parasitária. O ATRA apresentou efeito distinto nas células Treg e
monócitos: Em crianças saudáveis (DTH-/Ac-), induziu resposta regulatória, com
aumento na produção de IL-10 e TGF-β; e, em crianças com LV, modulou a resposta
imune, diminuindo a produção de IL-10 após o estímulo com SLA. Foi encontrada
correlação positiva entre o IMC/Idade e a produção de IL-17 e correlação negativa entre
o retinol sérico e a produção de IL-10 e TGF-β nas céluas T CD4+CD25
highFoxp3
+ após
estímulo com SLA. Os dados deste estudo permitem concluir que o estado nutricional
comprometido durante a LV é correlacionado com a resposta imune e inflamatória
frente à Leishmania. Além disso, possivelmente, a vitamina A apresenta duplo efeito na
resposta imune: em crianças sadias, promove resposta regulatória; durante a LV, reduz a
produção de IL-10 em células Treg e monócitos. Dessa forma, o uso de vitamina A
durante a LV pode promover a recuperação de pacientes em tratamento para a doença.
Palavras-chave: leishmaniose visceral, ácido all-trans retinóico, IL-10
7
ABSTRACT
Nutritional status is an important determinant to the response against Leishmania
infection, although few studies have characterized the molecular basis for the
association found between malnutrition and the disease. Vitamin A supplementation has
long been used in developing countries to prevent mortality by diarrheal and respiratory
diseases, but there are no studies on the role of vitamin A in Leishmania infection,
although we and others have found vitamin A deficiency in visceral Leishmaniasis
(VL). Regulatory T cells are induced in vitro by vitamin A metabolites and are
considered important cells implicated T CD4+ cell suppression in human VL. This work
aimed to examine the correlation of nutritional status and the effect of vitamin A in the
response against Leishmania infantum infection. A total of 179 children were studied:
31 had active VL, 33 VL history, 44 were DTH+ and 71 were DTH- and had negative
antibody to Leishmania (DTH-/Ac-). Peripheral blood monuclear cells were isolated in
a subgroup of 10 active VL and 16 DTH-/Ac- children and cultivated for 20h under 5
different conditions: 1) Medium, 2) Soluble promastigote L. infantum antigens (SLA),
3) All-trans retinoic acid (ATRA), 4) SLA + ATRA and 5) Concanavalin A. T
CD4+CD25
highFoxp3
+, T CD4
+CD25
-Foxp3
- and CD14
+ monocytes were stained and
studied by flow cytometry for IL-10, TGF-β and IL-17 production. Nutritional status
was compromised in VL children, which presented lower BMI/Age and retinol
concentrations when compared to healthy controls. We found a negative correlation
between nutritional status (measured by BMI/Age and serum retinol) and anti-
Leishmania antibodies and acute phase proteins. There was no correlation between
nutritional status and parasite load. ATRA presented a dual effect in Treg cells and
monocytes: In healthy children (DTH-/Ac-), it induced a regulatory response, increasing
IL-10 and TGF-β production; in VL children it modulated the immune response,
preventing increased IL-10 production after SLA stimulation. Furthermore, we found a
positive correlation between BMI/Age and IL-17 production and negative correlation
between serum retinol and IL-10 and TGF-β production in T CD4+CD25
highFoxp3
+ cells
after SLA stimulus. Our results show a potential dual role of vitamin A in the immune
system: improvement of regulatory profile during homeostasis and down modulation of
IL-10 in Treg cells and monocytes during symptomatic VL. Therefore, the use of
vitamin A concomitant to VL therapy might improve recovery from disease status in
Leishmania infantum infection.
Key words: visceral leishmaniasis, all-trans retinoic acid, IL-10
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Principais áreas endêmicas para LV no mundo.............................. 19
Figura 2. Ciclo de vida da Leishmania spp.................................................... 24
Figura 3. Hepatoesplenomegalia e desnutrição características da LV........... 25
Figura 4. Vias de ação de células Treg durante infecções.............................. 36
Figura 5. Diagrama esquemático demonstrando o ciclo vicioso
desnutrição-infecção e sua relação com a resposta imune.............. 43
Figura 6. Deficiência de vitamina A em crianças pré-escolares.................... 51
Figura 7. Fluxograma da metodologia utilizada para extração de retinol das
amostras de soro.............................................................................. 61
Figura 8. Gráficos representativos das estratégias de análise por citometria
para as células Treg e monócitos. A. Os gráficos de densidade
representam a região de linfócitos (P1), a frequência de células T
CD4+CD25
highFoxp3
+ e a análise de citocinas nestas células
(TGF-β1 é mostrado como exemplo). B. Os gráficos de
densidade representam a região de linfócitos (P1), a frequência
de células T CD4+CD25
-Foxp3
- e a análise de citocinas nestas
células (IL-17 é mostrada como exemplo). C. Os gráficos de
densidade representam a região de monócitos (P2) e IL-10
analisada em monócitos CD14+. Os exemplos mostrados são de
culturas de CMSP por 20h sem nenhum estímulo de paciente
com LV. Os gráficos são representativos de 26 experimentos....... 71
Figura 9. Retinol sérico (µg/dL) da população estudada. *Pós-teste de Tukey
identificou diferença significativa entre grupo LV ativa e demais grupos
estudados. Dados referentes a 2006-2008 foram publicados no trabalho de
Maciel et al. (2008)................................................................................. 80
Figura 10. Correlação entre o IMC/Idade e anticorpos (A) anti-rK39, (B)
anti-SLA, (C) proteína C reativa (D) AGP e (E) carga parasitária. 82
9
Análise realizada em todos os grupos estudados (n =
179).................................................................................................
Figura 11. Correlação entre o Retinol sérico e anticorpos (A) anti-rK39, (B)
anti-SLA, (C) proteína C reativa (D) AGP e (E) carga parasitária.
Análise realizada em todos os grupos estudados (n = 179)............ 83
Figura 12. (A) Frequência de células T CD4+CD25
highFoxp3
+ e sua
produção de (A) IL-10, (B) TGF-β1 e (C) IL-17 após as
diferentes condições testadas.......................................................... 86
Figura 13. (A) Frequência de células T CD4+CD25
-Foxp3
- e sua produção
de (B) IL-10, (C) TGF-β1 e (D) IL-17 após as diferentes
condições testadas........................................................................... 89
Figura 14. (A) Frequência de monócitos CD14+
e sua produção de (B) IL-
10..................................................................................................... 90
Figura 15. Correlação positiva entre o IMC/Idade e a produção de IL-17 em
células T CD4+CD25
highFoxp3
+ após estímulo com SLA............... 91
Figura 16. Correlação negativa entre retinol sérico e produção de (A) IL-10
e (B) TGF-β1 em células T CD4+CD25
highFoxp3
+ após estímulo
com SLA......................................................................................... 93
Figura 17. Ciclo vicioso desnutrição – leishmaniose visceral e sua relação
com a resposta imune...................................................................... 107
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Distribuição dos grupos estudados de acordo com sexo e idade......... 73
Tabela 2. Distribuição da população estudada de acordo com tamanho da
enduração ao teste cutâneo de Montenegro, presença de anticorpos
anti-Leishmania e carga parasitária..................................................... 75
Tabela 3. Hemograma, marcadores proteicos e de inflamação para os grupos
estudados............................................................................................... 76
Tabela 4. Distribuição dos grupos estudados de acordo com IMC/Idade.......... 77
Tabela 5. Distribuição da população estudada de acordo com a faixa etária
utilizada para a classificação do estado nutricional antropométrico
segundo IMC/Idade.............................................................................. 77
Tabela 6. Classificação do estado nutricional antropométrico das crianças com
até 5 anos segundo o IMC/Idade.......................................................... 78
Tabela 7. Classificação do estado nutricional antropométrico das crianças
maiores de 5 anos segundo o IMC/Idade.............................................. 79
Tabela 8. Classificação do retinol sérico na população estudada......................... 80
Tabela 9. Características das crianças com LV e DTH-/Ac- do Subestudo 2
quanto à idade, gênero, anticorpos anti-Leishmania, enduração ao
teste de Montenegro e média de retinol sérico.................................... 85
Tabela 10. Correlação entre o IMC/Idade e a produção de citocinas após
estímulo com SLA nas células T CD4+CD25
highFoxp3
+, T
CD4+CD25
-Foxp3
- e monócitos CD14
+.............................................. 92
Tabela 11. Correlação entre o Retinol sérico e a produção de citocinas após
estímulo com SLA nas células T CD4+CD25
highFoxp3
+, T
CD4+CD25
-Foxp3
- e monócitos CD14
+.............................................. 94
11
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Principais marcadores utilizados para o estudo de células Treg........ 35
Quadro 2. Principais estudos envolvendo outras leishmanioses que
encontraram associação da doença com células Treg........................ 39
Quadro 3. Principais estudos de coorte que determinaram a desnutrição como
fator de risco para o desenvolvimento de LV.................................... 45
Quadro 4. Indicadores antropométricos e classificações utilizadas para
crianças até 5 anos............................................................................. 59
Quadro 5. Indicadores antropométricos e classificações utilizadas para
maiores de 5 anos............................................................................... 60
Quadro 6. Genes estudados, sondas e iniciadores utilizados na PCR em tempo
real para determinação de carga parasitária....................................... 65
12
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Ac Anticorpo
AGP Alfa-1-glicoproteína ácida
APC Células apresentadoras de antígenos
ATRA Ácido all-trans retinóico
cAMP adenosina 3’,5’-monofosfato cíclico
CB Circunferência do braço
CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência
CMSP Células Mononucleadas de Sangue Periférico
ConA Concanavalina A
CR Receptor do complemento
CRP Proteína C-reativa
Ct Cycle threshold
DALY Anos potenciais de vida perdidos ajustados para incapacidade
DAT Teste de aglutinação direta
DTH Resposta de hipersensibilidade tardia
ELISA Ensaio imunoenzimático
ENDEF Estudo Nacional de Despesas Familiares
FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations
HIV Human immunodeficiency virus
HLA Complexo principal de histocompatibilidade
HPLC High pressure liquid chromatography
IDO Indolamina 2,3-dioxigenase
IFI Imunofluorescência indireta
IFN-γ Interferon-γ
Ig Imunoglobulina
IL interleucina
IMC Índice de massa corporal
IQ Distância interquartílica
iTreg T regulatórias induzidas
LAP Peptídeo de latência associado
LC Leishmaniose cutânea
LM Leishmaniose mucosa
LPG Lipofosfoglicano
LTBP Proteína ligadora de latência
LV Leishmaniose visceral
NO Óxido nítrico
OMS Organização Mundial da Saúde
PCR Reação em cadeia da polimerase
PGE2 Prostaglandina E2
PNDS Pesquisa Nacional de Demografia e Saúde da Criança e da
13
Mulher
PNSN Pesquisa Nacional de Saúde e Nutrição
POF Pesquisa de Orçamentos Familiares
QI Quociente de inteligência
RA Ácido retinóico
RAR Receptor nucleico de ácido retinóico
RARE Elementos de resposta ao ácido retinóico
RBP Proteína transportadora de retinol
rK39 Proteína cinesina recombinante 39
ROI Intermediários reativos de oxigênio
ROR Receptor retinóide orphan
RXR Receptor X retinóide
SLA Antígenos solúveis de promastigotas de L. infantum
TGF-β Fator de transformação do crescimento-β
Th T helper
TNF Fator de necrose tumoral
Tr1 T regulatórias 1
Treg T regulatórias
14
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO………………………………………………………………………... 17
1.1. Aspectos gerais da leishmaniose visceral................................................................... 19
1.1.1 Epidemiologia..................................................................................................... 19
1.1.2 Ciclo Biológico................................................................................................... 21
1.1.3 Período de incubação.......................................................................................... 23
1.1.4 Formas clínicas e diagnóstico............................................................................. 23
1.1.5 Tratamento e medidas de prevenção................................................................... 27
1.2. Resposta imunológica frente à infecção por Leishmania.......................................... 30
1.2.1 Células T CD4+ regulatórias: Possível função na infecção por Leishmania...... 32
1.3. Aspectos genéticos do hospedeiro e do parasita na resposta à infecção por
Leishmania............................................................................................................................ 40
1.4. Fatores nutricionais associados com a resposta à infecção por Leishmania........... 41
1.4.1 Estado nutricional, dieta e micronutrientes......................................................... 44
1.4.1.1 Vitamina A: Aspectos gerais e efeitos na resposta imune........................ 49
2. OBJETIVOS………………………………….………………………………………... 55
2.1. Objetivo geral………………………….............................................………………… 55
2.2. Objetivos específicos……………………………..................................……………… 55
3. METODOLOGIA…………………………………………..………………………….. 56
3.1. Considerações éticas..................................................................................................... 56
3.2. Caracterização geral da pesquisa…….……………................................................... 56
3.3. Subestudo 1: Correlação entre o estado nutricional antropométrico e de
vitamina A com a resposta imune/inflamatória e a carga parasitária frente à 56
15
infecção por L. infantum.....................................................................................................
3.3.1. Tipo, período e área do estudo........................................................................... 56
3.3.2. População estudada e tamanho amostral............................................................ 57
3.3.3. Teste de Montenegro.......................................................................................... 58
3.3.4. Teste de rk39 e antígenos solúveis de Leishmania (SLA)................................. 58
3.3.5. Avaliação do estado nutricional antropométrico............................................... 59
3.3.6. Avaliação do estado de vitamina A.................................................................... 60
3.3.6.1 Extração de retinol do soro....................................................................... 60
3.3.6.2 Padrão interno de retinol acetato............................................................... 62
3.3.6.3 Confirmação dos analitos e seus tempos de retenção nas amostras.......... 62
3.3.6.4 Validação do método................................................................................ 62
3.3.6.5 Preparo da curva padrão de retinol........................................................... 63
3.3.6.6 Quantificação do retinol sérico................................................................. 63
3.3.6.7 Condições cromatográficas....................................................................... 63
3.3.7 Determinação das proteínas totais, albumina e globulinas................................. 64
3.3.8. Determinação das proteínas de fase aguda........................................................ 64
3.3.9. Determinação da carga parasitária..................................................................... 64
3.4. Subestudo 2: Efeito da vitamina A em linfócitos T CD4+ reguladores e
monócitos de crianças expostas à infecção por L. infantum............................................ 66
3.4.1 Obtenção de células mononucleares do sangue periférico.................................. 66
3.4.2 Cultura de células................................................................................................ 66
3.4.3 Marcação por imunofluorescência...................................................................... 67
3.4.4 Análise por Citometria de Fluxo......................................................................... 68
16
3.5. Análise estatística.......................................................................................................... 69
4. RESULTADOS....................................…….…………………………………………... 73
4.1. Subestudo 1: Correlação entre o estado nutricional antropométrico e de
vitamina A com a resposta imune/inflamatória e a carga parasitária frente à
infecção por L. infantum..................................................................................................... 73
4.2. Subestudo 2: Análise do efeito da vitamina A em linfócitos T CD4+ reguladores
e monócitos de crianças expostas à infecção por L. infantum.......................................... 84
4.2.1 O ácido all-trans retinóico (ATRA) apresenta efeito distinto na produção de
citocinas em células T CD4+CD25
highFoxp3
+ de crianças com LV e em crianças
saudáveis................................................................................................................................ 84
4.2.2 O ácido all-trans retinóico (ATRA) e diminuiu a produção de IL-17 em
células T CD4+CD25
-Foxp3
- de crianças com LV................................................................ 87
4.2.3 O ácido all-trans retinóico (ATRA) impediu o aumento de IL-10 frente ao
estímulo com SLA em monócitos de crianças com LV........................................................ 88
4.3. Correlação do estado nutricional com a produção de citocinas em células T
CD4+ reguladoras e monócitos após estímulo com SLA.................................................. 91
5. DISCUSSÃO….………………………………………………………………………... 95
6. CONCLUSÃO………………………………………………………………………….. 108
7. REFERÊNCIAS……………………………………………………………………….. 109
8. ANEXO............................................................................................................................. 137
9. APÊNDICES.................................................................................................................... 138
Apêndice 1 – Formulário para coleta de dados de casos de LV............................................ 138
Apêndice 2 – Formulário para coleta de dados em campo.................................................... 142
Apêndice 3 – Publicações relacionadas à tese....................................................................... 145
17
1. INTRODUÇÃO
A infecção por espécies do gênero Leishmania, em humanos ou em caninos,
pode causar manifestações clínicas que variam de infecção assintomática à doença, que
pode ser grave, dependendo da espécie infectante e da competência do sistema imune do
hospedeiro. O gênero Leishmania engloba várias espécies que podem ser patogênicas.
No Brasil, a Leishmania braziliensis é a espécie que mais frequentemente causa as
leishmanioses cutânea (LC) e mucosa (LM), enquanto a Leishmania infantum é a
espécie causadora da leishmaniose visceral (LV), caracterizada pela presença de febre,
perda de peso, anemia, hepatoesplenomegalia, pancitopenia e hipergamaglobulinemia
(BADARO et al., 1986; JERONIMO et al., 2000; WILSON; JERONIMO; PEARSON,
2005).
Os determinates que levam à evolução da infecção para a doença ou para auto
resolução sem apresentação de sintomas característicos de cada uma das leishmanioses
não são integralmente compreendidos. A evolução é dependente de interações
complexas entre os tipos de parasita e as respostas imunes do hospedeiro humano. Estas
últimas são geneticamente determinadas e podem ser influenciadas por uma série de
variáveis ambientais, que incluem fatores relativos à co-morbidades, ao vetor e ao
inóculo inicial (WILSON; JERONIMO; PEARSON, 2005).
O estado nutricional e de micronutrientes essenciais também são fatores que
reconhecidamente podem influenciar na resposta imune (BLÖSSNER; DE ONIS, 2005;
BHASKARAM, 2002; BLOSSNER; DE ONIS, 2013). A desnutrição proteico-calórica
é conhecida como uma das principais causadoras de imunodeficiência, sendo
considerada um fator de risco para desenvolvimento de LV e também um fator
associado com o pior prognóstico da doença (ANSTEAD et al., 2001; BADARO et al.,
1986; CERF et al., 1987; HARHAY et al., 2011; REY et al., 2005). No entanto, até o
momento, pouco se compreende sobre as bases moleculares e imunológicas da
associação do estado nutricional com a resposta à Leishmania. Isso porque a maioria
dos estudos, em humanos, limita-se em avaliar o estado nutricional por meio de
avaliação antropométrica e bioquímica, associando estas variáveis com os conhecidos
fenótipos de resposta à infecção por Leishmania. Não se sabe ao certo se a desnutrição
observada na LV está associada com a resposta imune e inflamatória frente ao parasita
18
ou se com carga parasitária em si. Também não se sabe se o uso de nutrientes
imunomoduladores beneficiariam a resposta ao tratamento da LV.
As infecções, de uma maneira geral, podem depletar tanto o estado nutricional
geral quanto, especificamente, o equilíbrio de micronutrientes, prejudicando a resposta
imune e aumentando a susceptibilidade à novas infecções, em um ciclo vicioso pouco
compreendido (CANTORNA et al., 1996; SCRIMSHAW; TAYLOR; GORDON, 1968;
THURNHAM et al., 2003). Em se tratando de vitamina A, apesar de estudos de coorte
terem consistentemente demonstrado redução da mortalidade por meio de
suplementação deste micronutriente (GLASZIOU; MACKERRAS, 1993), o seu
mecanismo de ação não está completamente compreendido.
Em LV, dados demonstram que há depleção do retinol sérico, antes do
desenvolvimento da doença (BERN et al., 2007), e durante a doença (BERN et al.,
2007; LUZ; SUCCI; TORRES, 2001; MACIEL et al., 2008). No entanto, apesar de a
maioria das áreas endêmicas para LV apresentarem alta prevalência de deficiência
subclínica de vitamina A (BASSETT; WINTER-NELSON, 2010; CHAPPUIS et al.,
2007), e de algumas adotarem o protocolo da Organização Mundial da Saúde para a sua
suplementação (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 1996), o efeito da vitamina A
na resposta imune à Leishmania e a outros patógenos permance desconhecido. Dessa
forma, esta tese apresenta as seguintes hipóteses a serem testadas:
1- O estado nutricional, antropométrico e de vitamina A, está correlacionado
com a resposta imune à infecção por L. infantum;
2- A vitamina A apresenta efeito modulador na resposta imune durante a LV.
19
1.1. Aspectos gerais da leishmaniose visceral
1.1.1 Epidemiologia
No início do século XX, Leishman e Donovan, separadamente, identificaram o
parasita que causa as leishmanioses, o qual Ronald Ross nomeou genericamente
Leishmania. Atualmente, a LV é endêmica em 65 países, da África, Ásia, Europa,
Oriente Médio e Américas, sendo que seis deles (Índia, Bangladesh, Nepal, Sudão,
Etiópia e Brasil) concentram mais de 90% dos casos (SOONG; HENARD; MELBY,
2012; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2010). A Figura 1 demonstra as
principais áreas endêmicas para LV no mundo.
Figura 1. Principais áreas endêmicas para LV no mundo (CHAPPUIS et al., 2007).
A incidência anual da LV é de 0,5 milhão de casos e estima-se que 350 milhões
de pessoas estejam em risco de infecção por Leishmania. A LV causa mais de 50.000
mortes, anualmente, taxa ultrapassada dentro das doenças parasitárias apenas pela
malária. A sua taxa de mortalidade é de 5-10%, mesmo quando instalado o tratamento
específico. Os anos potenciais de vida perdidos ajustados para incapacidade (DALY)
são estimados em 2.357.000, sendo 946.000 para o sexo masculino e 1.410.000 para o
sexo feminino (CHAPPUIS et al., 2007; DESJEUX, 2004; GUERIN et al., 2002;
20
HERWALDT, 1999; MALLA; MAHAJAN, 2006; WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 2010).
A LV é considerada doença reemergente no sul europeu e na África, devido à
co-infecção com o HIV. No sul da Europa 25-70% dos pacientes com LV apresentam
infecção pelo HIV, sendo a Leishmania considerada um parasita oportunista.
Atualmente, sabe-se que a LV pode modificar a progressão do HIV e a imunodepressão
causada por este vírus facilita a progressão da LV (SUNDAR; RAI, 2002).
Na América Latina, a LV foi diagnosticada em 12 países, no entanto, 90% dos
casos pertencem ao Brasil. O primeiro caso brasileiro da doença foi descrito em 1913,
por Migone, no Paraguai, em necrópsia de paciente oriundo de Boa Esperança, no Mato
Grosso. Em 1934, a partir de estudo realizado para febre amarela, foram identificados
mais 41 casos post mortem de LV e, em 1936, foi diagnosticado por Chagas o primeiro
caso de calazar em vida no Brasil (BRASIL.MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006).
No Brasil, a doença é de notificação compulsória desde a década de 80 e está
distribuída nas cinco regiões geográficas. Nos últimos dez anos, a média anual de casos
de LV foi de 3.339 e a incidência de 1,9 casos/100.000 habitantes. De acordo com o
Ministério da Saúde a letalidade da LV aumentou de 3,4% em 1994 para 5,5% em 2008,
o que representou um aumento de 61,8% (BRASIL, 2009a). Na década de 90, cerca de
90% dos casos notificados de LV ocorreram na região Nordeste. Nas últimas décadas,
observou-se a expansão da doença para outras regiões, no entanto, a região Nordeste
ainda representa 48% dos casos no país (BRASIL, 2009a). Além da expansão para
outras regiões, tem ocorrido nas últimas décadas peri-urbanização e urbanização da
doença, até os anos 80 considerada característica das regiões rurais. A redução da LV
nas regiões rurais deve-se principalmente pelo êxodo rural, ocorrido em especial no
Nordeste, a partir da década de 80. As cidades do litoral, passaram a ser, no Nordeste,
os principais polos da doença, uma vez que concentram a maior quantidade de pessoas.
Atualmente, a população considerada mais susceptível é justamente aquela que vive em
moradias precárias ao redor das cidades, onde há o desmatamento e a criação de
condições que permitem a adaptação dos vetores ao ambiente peri-domiciliar. A
exemplo, no Rio Grande do Norte, houve a peri-urbanização da doença em Natal e
Mossoró (JERONIMO et al., 1994), suas maiores cidades, à semelhança de outros
estados no Brasil, como o ocorrido no Ceará em Fortaleza (ALBUQUERQUE et al.,
21
2009), em Minas Gerais em Belo Horizonte (CARVALHO et al., 2010) e no Mato
Grosso do Sul em Campo Grande (CORREA ANTONIALLI et al., 2007).
Classicamente sabe-se que a LV é mais frequente em menores de 10 anos, no
sexo masculino e em presença de desnutrição (BADARO et al., 1986; BRASIL, 2006;
JERONIMO et al., 1994). Acredita-se que a maior susceptibilidade em crianças seja
devida à relativa imaturidade imunológica, que pode ser agravada pela desnutrição,
comum nas áreas endêmicas para LV. Quanto ao gênero, ainda não se conhecem os
motivos para maior susceptibilidade no masculino, mas possivelmente respostas imunes
mediadas por hormônios podem estar envolvidas, uma vez que modelos animais
também têm demonstrado maior susceptibilidade em machos (WILSON; JERONIMO;
PEARSON, 2005).
No entanto, apesar da LV ainda ser mais prevalente em crianças, estudos têm
apontado mudanças no padrão de susceptibilidade à doença (SHAW, 2007). Estudo
realizado no RN demonstrou aumento do número de indivíduos com LV na idade
adulta, possivelmente associada à co-infecção com HIV (NASCIMENTO et al., 2011),
semelhante ao que vem sendo encontrado no sul europeu (DE LA et al., 1985;
DESJEUX, 2004).
1.1.2 Ciclo Biológico
O protozoário do gênero Leishmania, parasita intracelular obrigatório, da ordem
Kinetoplastida e família Trypanosomatidae é o responsável pela infecção. O gênero é
dividido em dois subgêneros Leishmania (Viannia) spp. e Leishmania (Leishmania)
spp., sendo as espécies capazes de atingir os órgãos pertencentes ao último subgênero.
As espécies capazes de causar a LV são a L. donovani e L. infantum, sendo a última
encontrada na Europa, norte da África, China e nas Américas, enquanto a primeira é
encontrada no Sudão, India, Bangladesh. Anteriormente, a espécie de Leishmania
encontrada nas Américas era denomina de L. chagasi, no entanto, estudos genômicos
(MAURICIO; STOTHARD; MILES, 2000) demonstraram que esta era a mesma
espécie encontrada na Europa, trazida para as Américas durante a colonização. Assim,
parece haver uma maior diversidade de zimodemas de L. infantum na Europa do que nas
Américas. A L. donovani está associada com o desenvolvimento de leishmaniose
cutânea pós calazar (post-kala-azar dermal Leishmaniasis – PKDL) após o tratamento
em 10-20% dos casos na Índia e 60% dos casos no Sudão (ZIJLSTRA et al., 2003). A
22
patogênese da PKDL não é compreendida, mas está, possivelmente, relacionada com
uma predisposição genética e resposta imune inadequada à infecção com elevada
produção de IL-10 (ISLAM et al., 2013).
Apesar de ciclos epidemiológicos antroponóticos, nos quais o homem é o
reservatório para o vetor, serem registrados na Índia, no Brasil o ciclo é zoonótico,
sendo a raposa (Dusicyon vetulus), marsupiais (Didelphes albiventris e Didelphes
marsupialis) e o cão (Canis familiaris) considerados os principais reservatórios para o
vetor. O cão parece ser o principal reservatório em ambiente doméstico uma vez que
pode ser portador assintomático do parasita (CHAPPUIS et al., 2007; DEANE, 1961).
Acredita-se que a raposa seja a responsável pelo intercâmbio entre o ciclo doméstico e
silvestre uma vez que possui hábitos peridomiciliares (DEANE, 1961).
Duas espécies fêmeas de vetor, conhecidos por flebotomíneos, estão
relacionadas com a transmissão da doença no Brasil: Lutzomyia longipalpis e Lutzomyia
cruzi, sendo a primeira considerada a principal espécie transmissora da L. infantum
(BRASIL, 2009a). A infecção do flebotomíneo, cuja atividade é crepuscular e noturna,
ocorre quando o mosquito, ao picar e sugar o sangue de animais infectados, ingere
macrófagos infectados com as formas amastigotas de Leishmania. No trato digestivo do
inseto, os macrófagos são rompidos e as formas amastigotas reproduzem-se e
diferenciam-se em promastigotas, que são flageladas. Estas se transformam em
paramastigotas, que colonizam o epitélio do esôfago e a faringe do vetor, e se
diferenciam na forma infectante, as formas promastigotas metacíclicas. Estas formas são
aquelas liberadas juntamente com a saliva quando o flebotomíneo realiza novo repasto
sanguíneo, em vertebrados. Na epiderme do hospedeiro, classicamente, acreditava-se
que as promastigotas metacíclicas eram fagocitadas por células do sistema fagocítico
mononuclear. Estudos recentes demonstraram que as primeiras células recrutadas para o
local da infecção são os neutrófilos, que fagocitam o parasita. Não se sabe como
exatamente os neutrófilos agem na evolução da infecção, mas sabe-se que parasitas
livres e neutrófilos infectados em processo de apoptose são fagocitados por células
dendríticas e macrófagos (JOHN; HUNTER, 2008; RIBEIRO-GOMES et al., 2012).
Nos fagolisossomos dos macrófagos, as promastigotas diferenciam-se em amastigotas,
que se reproduzem, rompem os macrófagos e são liberadas, sendo fagocitadas por novas
células e assim se disseminando para outros tecidos como fígado, baço, medula óssea e
linfonodos (Figura 2) (BRASIL, 2006; CHAPPUIS et al., 2007).
23
1.1.3 Período de incubação
O período de incubação é variável tanto para o homem, como para o cão. No
homem, pode ser de 10 dias a 24 meses, com média entre 2 a 6 meses, e, no cão, varia
de 3 meses a vários anos, com média de 3 a 7 meses (BRASIL, 2009a). No entanto,
pode haver persistência parasitária e desenvolvimento de LV somente quando ocorre
imunossupressão, a exemplo dos relatos de desenvolvimento de LV após quimioterapia
(PIRO et al., 2012; PITINI et al., 2012) e durante a co-infecção com HIV (DE IA LA
et al. 1985; DESJEUX et al, 1995; DESJEUX et al 2003; CRUZ et al. 2006;
NASCIMENTO et al., 2011). Portanto, o período de incubação, entre infecção e
doença, pode estar diretamente relacionado à competência imunológica do infectado.
1.1.4 Formas clínicas e diagnóstico
A infecção por L. infantum possui amplo espectro clínico que, após o estudo
realizado por Badaró et al.. (1986) em área endêmica da Bahia, pôde ser classificado
em: 1) Forma assintomática; 2) Forma subclínica, na qual as pessoas desenvolvem
hepatomegalia, esplenomegalia, tosse, diarréia e febre, podendo esta forma se resolver
espontaneamente ou evoluir para LV; e 3) LV clássica, caracterizada por
hepatoesplenomegalia (Figura 3), febre, caquexia, anorexia, anemia,
hipergamaglobulinemia, hipoalbuminemia, trombocitopenia e leucopenia, manifestada
principalmente por neutropenia e eosinopenia (BADARO et al., 1986; BRASIL,
2009a). No entanto, a maior parte dos infectados são assintomáticos, sendo a proporção
de infecção por L. infantum assintomática versus sintomática de 6 a 8:1 em crianças e
18:1 em adultos (BADARO et al., 1986; WILSON; JERONIMO; PEARSON, 2005).
24
Figura 2. Ciclo de vida da Leishmania spp. (CHAPPUIS et al., 2007)
25
Figura 3. Hepatoesplenomegalia e desnutrição características da LV (MURRAY et al.,
2005a).
Infelizmente, a tríade clássica de sintomas da LV, que são a
hepatoesplenomegalia, febre e pancitopenia, não é específica somente desta doença,
sendo necessários a avaliação do histórico fornecido pelo paciente e testes laboratoriais
específicos (CHAPPUIS et al., 2007; MURRAY et al., 2005a; SRIVIDYA et al., 2012).
O teste mais adequado (em termos custo, especificidade e sensibilidade), ainda
considerado como padrão-ouro para a confirmação da LV, é a detecção parasitológica
de amastigotas em lâminas preparadas com aspirados de medula óssea, linfonodos ou
baço, coradas com Giemsa ou Wright. A especificidade da técnica é alta, mas a
sensibilidade pode variar conforme o tecido utilizado, sendo maior no baço (93-99%)
que na medula (53-86%) ou linfonodos (53-65%) (SIDDIG et al., 1988; SRIVIDYA et
al., 2012). No Brasil, o Ministério da Saúde recomenda, apesar de ser um procedimento
doloroso para o paciente, que sejam realizados aspirados de medula, uma vez que o
risco de hemorragia interna por punção no baço é alto, necessitando de pessoal treinado
para o procedimento (BRASIL, 2006; BRASIL, 2009a; SRIVIDYA et al., 2012). Os
aspirados de medula, baço ou linfonodos podem ser cultivados em meio de cultura
Novy-MacNeal-Nicolle (NNN), com adição de meio NIT ou Schneider para
crescimento in vitro. No entanto, a técnica demanda tempo e o custo é mais elevado, o
26
que impossibilita que as culturas de Leishmania sejam utilizadas na rotina de
diagnóstico das áreas endêmicas (BRASIL, 2006).
Um teste diagnóstico que apresenta boa sensibilidade e pode ser realizado a
partir de sangue periférico ou material coletado de aspirados é a amplificação de
sequências do DNA, de regiões do cinetoplasto ou cromossomais, do parasita por
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). A PCR utilizando DNA de sangue periférico
em pacientes da Índia foi positiva em 93% de pacientes com LV confirmada e 72% nos
pacientes suspeitos (ADHYA et al., 1995). Com a técnica é possível detectar baixas
cargas parasitárias o que permite a detecção de Leishmania em indivíduos
assintomáticos (SMYTH et al., 1992). No entanto, a PCR exige padronização,
necessitando de pessoal treinado, e assim sua utilização permanece restrita aos centros
de pesquisa (MAURYA et al., 2005; SRIVIDYA et al., 2012; WEIRATHER et al.,
2011).
Assim, esforços têm sido realizados visando a padronização de técnicas de uso
prático que sejam não invasivas, sensíveis e específicas para o diagnóstico de LV. Uma
vez que os anticorpos anti-Leishmania encontram-se elevados durante a LV, ensaios
imunológicos têm sido utilizados para o seu diagnóstico, como a imunofluorescência
indireta (IFI), teste de aglutinação direta (DAT) e ensaio imunoenzimático (ELISA).
Apesar de menos invasivos, esses testes apresentam limitações: 1) os títulos de alguns
anticorpos, apesar de diminuírem após o tratamento, permanecem elevados por tempo
indeterminado, limitando o diagnóstico de recidiva da doença; 2) em áreas endêmicas,
para certos anticorpos, parte da população é positiva devido à infecções assintomáticas;
3) Pode haver reação cruzada com anticorpos para antígenos de patógenos causadores
de outras doenças, como hanseníase, tuberculose, doença de Chagas, leishmaniose
tegumentar, esquistossomose e malária (BRASIL, 2006; BRAZ et al., 2002;
CHAPPUIS et al., 2007; SRIVIDYA et al., 2012; SUNDAR; RAI, 2002).
Existem vários antígenos de Leishmania para uso em diagnóstico sorológico da
LV, sendo o de maior potencial a proteína cinesina recombinante 39 (rK39), expressa
em amastigotas de L. infantum e L. donovani. O rK39 é uma proteína com repetição de
sequência de 39 aminoácidos clonada a partir de gene de L. donovani e expressa em E.
coli. Estudos demonstraram especificidade de quase 100% do ELISA para rK39 em
populações do Brasil e Sudão (BURNS, Jr. et al., 1993), China e Paquistão (QU et al.,
27
1994). No Rio Grande do Norte, foi encontrada especificidade de 99,5% e sensibilidade
de 94% (BRAZ et al., 2002), o que indica o ELISA para rK39 como um bom método de
diagnostico da LV. Atualmente, existem testes rápidos simples utilizando
imunocromatografia, com o rK39 impregnado em tiras de papéis de nitrocelulose, com
boa sensibilidade e especificidade. O teste requer apenas uma gota de sangue periférico,
é rápido (leva 15 min) e tem baixo custo. No entanto, o teste apresenta baixa
sensibilidade no continente africano e, como no ELISA, existe o problema de pacientes
curados permanecerem por longos períodos com o teste positivo, uma vez que os
anticorpos contra o rK39 permanecem elevados após a cura (MAIA et al., 2012;
SRIVIDYA et al., 2012).
A avaliação da resposta cutânea de hipersensibilidade tardia (delayed type
hypersensitivity – DTH) a antígenos de Leishmania é conhecida como Teste de
Montenegro. Pacientes em fase sintomática para LV apresentam reação negativa, devido
a imunosupressão, que éreversível, geralmente, após 6 meses de tratamento bem
sucedido. O teste de Montenegro pode ser utilizada como marcador de exposição prévia
à Leishmania e de proteção para o desenvolvimento de formas sintomáticas. (REED et
al., 1986). Este exame não é usado, rotineiramente, para avaliação de exposição à L.
infantum, mas é usado como definidor de infecção por L. braziliensis, quando há
presença de úlceras sugestivas de leishmaniose tegumentar (MAIA et al., 2012). Cabe
ainda ressaltar que em regiões endêmicas para LV, trabalho realizado pelo nosso grupo
no Rio Grande do Norte demonstrou que a infecção por Leishmania pode ser transitória
e que cerca de 15% das pessoas que apresentavam resposta DTH+ podem perdê-la,
possivelmente por resolução da infecção e/ou diminuição da exposição ao parasita
(LACERDA et al., 2013 submetido).
1.1.5 Tratamento e medidas de prevenção
O tratamento clássico da LV é realizado com antimoniais pentavalentes (Sb5+
) e
existem no mercado duas formulações disponíveis: o stibogluconato de sódio
(Pentostam) e o antimoniato-N-metil glucamina (Glucantime) (BRASIL, 2006;
GUERIN et al., 2002; JAMIESON et al., 2007; MCGWIRE; SATOSKAR, 2013;
MURRAY et al., 2005a; SUNDAR; RAI, 2002). O mecanismo preciso de ação dos
antimoniais não é bem compreendido, mas provavelmente a ação se dá diretamente em
28
processos moleculares do parasita e na atividade de macrófagos (BAIOCCO et al.,
2009).
Casos de resistência são raros no Brasil e África, e o Ministério da Saúde
brasileiro recomenda o tratamento com antimoniato-N-metil glucamina por no mínimo
20 dias e no máximo 40, com dose endovenosa ou intramuscular de 20mg/Kg/dia
(BRASIL, 2006; CHAPPUIS et al., 2007; GUERIN et al., 2002; MURRAY et al.,
2005a; SUNDAR; RAI, 2002). O uso da medicação normalmente provoca a morte do
parasita e a regressão rápida dos sintomas da doença, sendo observado um índice de
cura maior que 95% (BERMAN, 2006). No entanto, resistência aos antimoniais tem
sido frequente, inclusive na Índia, onde chega a 65% dos casos. Pacientes graves que
desenvolvem insuficiência renal ou toxicidade cardíaca durante o uso de antimoniais e
em gestantes, indica-se o uso da anfotericina B (BRASIL, 2006; BRASIL, 2009a). Esta
droga é a principal forma alternativa de tratamento, e na Índia no estado de Bihar e
sudeste Europeu, devido à emergência de casos co-infectados com HIV, tem sido a
droga de primeira escolha.
O mecanismo de ação da anfotericina B se dá através da ligação com ergosterol
ou episterol presentes na membrana plasmática do parasito, causando o desequilíbrio da
mesma (CHAPPUIS et al., 2007; GUERIN et al., 2002; MCGWIRE; SATOSKAR,
2013). Considera-se esta a droga leishmanicida mais potente disponível no mercado,
com taxas de cura maiores que 97% e resistência ainda não documentada. No entanto,
existem algumas desvantagens no uso da anfotericina: O tempo prolongado de
tratamento (15 dias de dose, em dias alternados) e os efeitos colaterais dose-
dependentes que incluem febre, tremores, rubor, tromboflebite, hipocalemia,
micocardite e nefrotoxicidade (BRASIL, 2006; OLLIARO et al., 2005).
As formas lipídicas de anfotericina B apresentam menores efeitos colaterais e
têm reduzido tempo de tratamento quando comparadas com a preparação convencional.
As duas formas lipídicas mais acessíveis e disponíveis no mercado, são a anfotericina B
lipossomal (Ambisome) e anfotericina B em dispersão coloidal. Estudo da Organização
Mundial da Saúde (OMS) demonstrou que as menores doses de Ambisome necessárias
para taxas de 95% de cura foram de 6mg/Kg, 14mg/Kg e 21mg/Kg na Índia, Quênia e
Brasil, respectivamente. A eficácia das formas lipídicas de anfotericina B no Brasil e
Índia já foi comprovada, mas infelizmente o alto custo da medicação ainda restringe sua
29
utilização (BRASIL, 2006; GUERIN et al., 2002; OLLIARO et al., 2005). No entanto,
nos últimos anos, tem havido maior disponibilidade de formas lipossomais via acordo
das indústrias farmacêuticas com a Organização Mundial de Saúde, permitindo maior
acessibilidade (MCGWIRE; SATOSKAR, 2013).
Outras drogas também têm sido testadas para o tratamento da LV. A
pentamidina também pode ser indicada quando há falha no tratamento com antimoniais.
No entanto, também apresenta toxicidade e exige internação (SOTO-MANCIPE;
GROGL; BERMAN, 1993). A paromomycin ou aminosina é um antibiótico
aminoglicosídeo que age inibindo a síntese proteica por ligação no RNA 16S
ribossomal. É ativo contra uma grande variedade de patógenos, possui baixo custo e tem
sido utilizada em associação com o stibogluconato de sódio na Índia e África
(OLLIARO et al., 2005; SUNDAR et al., 2011).
Medicamentos orais como o alopurinol, cetoconazol, aminosidina e sitamaquina
foram testados, mas não apresentaram eficácia comprovada para uso eficaz isolado no
tratamento da LV. A miltefosine, desenvolvida inicialmente como uma droga para
terapia do câncer, é a primeira formulação oral com eficácia comprovada para LV. No
entanto, a droga é teratogênica, possui meia vida longa (aproximadamente 150 horas) e
a resistência do parasita é facilmente induzida in vitro, tendo sido relatados casos de
resistência na Índia (MCGWIRE ; SATOSKAR, 2013; OLLIARO et al., 2005).
Embora existam tratamentos efetivos para a LV, a erradicação da doença por
meio de medidas preventivas ainda é o mais desejável em termos de saúde pública. As
medidas de prevenção da LV têm sido direcionadas para redução de vetores, eliminação
de cães soropositivos, e detecção e tratamento precoce de casos da doença. Essas
medidas estão em constante revisão pela comunidade científica e governos, já que o
controle da doença não tem se mostrado efetivo em diversos países, especialmente no
sul europeu e no Brasil. Alguns estudos na Itália, Bangladesh e Nepal demonstraram
que o uso de coleiras e mosquiteiros com inseticidas pode ser uma medida profilática
eficiente (CHAPPUIS et al., 2007; GUERIN et al., 2002; MURRAY et al., 2005a;
OLLIARO et al., 2005).
As vacinas são reconhecidas por serem a melhor alternativa visando a prevenção
de doenças. No entanto, o seu desenvolvimento para a LV tem sido difícil devido à falta
de incentivo financeiro, inadequado conhecimento da patogênese da doença e a
30
complexidade da resposta imune necessária (e ainda desconhecida) para proteção à
Leishmania (EVANS; KEDZIERSKI, 2012).
1.2. Resposta imunológica frente à infecção por Leishmania
A compreensão da resposta imunológica à infecção por Leishmania foi iniciada
com os estudos em camundongos BALB/c, geneticamente susceptíveis à L. major e os
resistentes C57BL/6. A partir desses estudos iniciais foi determinado que a resistência à
infecção estava relacionada com a produção de interleucina (IL)-12 por células
apresentadoras de antígenos e interferon (IFN)-γ por células T (BACELLAR et al.,
1996; GHALIB et al., 1995; MURRAY; RUBIN; ROTHERMEL, 1983).
Reforçando os achados em murinos, diversos estudos em humanos verificaram
que células mononucleadas de sangue periférico (CMSP) de indivíduos com LV após
estímulo com antígenos de Leishmania não apresentam capacidade proliferativa ou
produção de IFN-γ (BACELLAR et al., 1996; CALDAS et al., 2005; CARVALHO et
al., 1985), enquanto que CMSP de indivíduos com infecção assintomática produzem IL-
2, IFN- γ e IL-12 (CARVALHO et al., 1992).
Somando-se a esses achados, observou-se que durante a LV, tanto em modelos
experimentais quanto em humanos, havia uma maior produção de IL-10, IL-4 e IL-13,
citocinas relacionadas com a resposta imune do tipo T helper 2 (Th2), que estimula a
resposta humoral, as respostas alérgicas e contra helmintos (BABALOO; KAYE;
ESLAMI, 2001; CALDAS et al., 2005; NYLEN et al., 2007; SUNDAR et al., 1997;
THAKUR; MITRA; NARAYAN, 2003). Assim, passou-se a acreditar que a LV podia
ser explicada por falha na resposta Th1, que estimula a resposta imune celular, e
pronunciada resposta Th2.
No entanto, segundo discutido por Nylén & Sacks (2007), não parece haver um
defeito inerente na resposta Th1 de indivíduos com LV uma vez que indivíduos curados
são resistentes à novas infecções, tornam-se DTH+ e produzem IFN-γ em resposta ao
estímulo com antígenos de Leishmania (WHITE, Jr. et al., 1992). Além disso, as CMSP
de pacientes com LV respondem ao estímulo com PPD ou superantígeno (NYLEN et
al., 2007; SACKS et al., 1987). Ainda, estudos demonstraram em pacientes com LV
altas concentrações plasmáticas de IFN-γ (KARP et al., 1993; CALDAS et al., 2005), e
IL-12 p40 (CALDAS et al., 2005) e produção elevada de IFN-γ em ensaios de sangue
31
total estimulado com antígenos de Leishmania (GIDWANI et al., 2011; SINGH et al.,
2012).
Assim, o paradigma Th1/Th2 não é suficiente para explicar a resposta
imunológica frente à infecção por Leishmania. Atualmente, acredita-se que respostas
imunes supressoras sejam responsáveis pela falha na ação do IFN-γ, uma vez que este
se encontra alto durante a LV. Nylén & Sacks (2007) ao revisarem a literatura
propuseram que, em indivíduos com infecção assintomática células dendríticas
produzem IL-12 e estimulam células T específicas a produzir IFN-γ e fator de necrose
tumoral (TNF)-α, que por sua vez estimulam macrófagos a eliminar o parasita pela
produção de óxido nítrico (NO) e intermediários reativos de oxigênio (ROI). Existe um
equilíbrio entre as respostas Th1 efetoras e as supressoras (em especial a produção de
IL-10), que limitam o dano tecidual.
Já na LV, a resposta inata e/ou adaptativa são inadequadas para realizar o
controle da infecção e o parasita induz a produção de altas concentrações de citocinas
inflamatórias, que por sua vez ativam mecanismos anti-inflamatórios, o que inclui a
expansão de células T produtoras de IL-10 (NYLEN; SACKS, 2007).
A IL-10 é considerada uma citocina regulatória, sendo produzida por
macrófagos, células T, células B, células dendríticas e células epiteliais. Essa citocina é
produzida visando proteger os tecidos, como o tecido hepático, de possíveis danos
causados pela resposta inflamatória aguda e possui efeitos na resposta imune inata e
adquirida. Apesar de seu aumento exercer papel protetor dos tecidos, na LV sua ação
imunossupressora pode promover a multiplicação do parasita e a progressão da doença
(GAUTAM et al., 2011; NYLEN; SACKS, 2007). Esse efeito inibidor da resposta
imune foi verificado em modelos experimentais (GAZZINELLI et al., 1992; LI;
CORRALIZA; LANGHORNE, 1999) e humanos de infecção como tuberculose,
malária, hepatite C, esquistossomose, filariose e também nas leishmanioses
(BOUSSIOTIS et al., 2000; CARVALHO et al., 1994; KING et al., 1996;
MACDONALD et al., 2002; MAHANTY et al., 1997; PLEBANSKI et al., 1999).
Na leishmaniose visceral, os mecanismos supressores da IL-10 podem ser assim
resumidos: 1) Inibição da resposta de macrófagos; 2) Diminuição de moléculas co-
estimulatórias, IL-12 e da expressão do MHC de classe II por células dendríticas e
macrófagos; 3) Inibição da maturação e migração de células dendríticas; 4) Indução de
32
células dendríticas produtoras de IL-10, que por sua vez induzem células T produtoras
de IL-10; 5) Aumento da morte celular induzida em células T; 6) Promoção da
sobrevivência de células B e indução de plasmócitos, que contribuem para a progressão
da LV. Em LV observa-se a mudança isotípica de imunoglobulina (Ig) G em IgG1 e
IgG3, que formam imunocomplexos. As células B podem ser uma fonte de IL-10 e os
anticorpos em imunocomplexos podem causar dano tecidual. Os imunocomplexos
induzem ainda macrófagos a produzir IL-10 e citocinas inflamatórias como a IL-6 e
TNF-α, o que por sua vez promove a geração de mais imunocomplexos e mais IL-10
(BOGDAN; GESSNER; ROLLINGHOFF, 1993; KANE; MOSSER, 2001; MILES et
al., 2005; NYLEN; SACKS, 2007). Apesar de se conhecerem vários dos mecanismos
imunossupressores da IL-10, as fontes produtoras dessa citocina durante a LV, além de
macrófagos, ainda não estão claramente definidas.
1.2.1 Células T CD4+ regulatórias: Possível função na infecção por
Leishmania
As células T regulatórias (Treg) são importantes produtoras de IL-10 e fator de
transformação do crescimento β (TGF-β). Por meio da produção dessas citocinas, as
Treg são capazes de diminuir as respostas inflamatórias causadoras de dano tecidual e
respostas imunes efetoras. Apesar de diferentes tipos de Treg terem sido descritas na
literatura, essas células podem ser classificadas em: 1) Treg naturais ou tímicas (nTreg),
que são células T CD4+CD25
highFoxp3
+ produzidas no timo e presentes no sangue antes
da exposição a um patógeno; 2) Treg induzidas (iTreg), aquelas que adquirem função
regulatória durante infecções e processos neoplásicos. As células iTreg incluem: a)
Células T CD4+CD25
−Foxp3
− (Tr1) que secretam IL-10; b) Células Th3 CD4
+CD25
-
Foxp3-
que secretam TGF-β e c) células T CD4+ que passam a expressar Foxp3
(BELKAID, 2007; CARRIER et al., 2007; ID-PERALTA et al., 2011; LIN et al., 2013;
NYLEN ; SACKS, 2007; SAKAGUCHI et al., 2010). Recentemente, recomendou-se
que a nomenclatura das Treg seja padronizada para que: as Treg naturais sejam
denominadas Treg tímicas (tTreg), as Treg induzidas perifericamente (iTreg) de Treg
adaptativas ou periféricas (pTreg) e aquelas induzidas in vitro de Treg induzidas (iTreg)
(ABBAS et al., 2013).
As Treg são importantes para a manutenção da homeostase, prevenção de
doenças autoimunes (como o diabetes melitus tipo 1), limitam doenças inflamatórias
33
crônicas (como a asma e síndrome do intestino irritável) e moderam a inflamação
induzida por patógenos e fatores ambientais. Acredita-se que dentre as principais
funções das Treg está a promoção da tolerância periférica. (VIGNALI; COLLISON;
WORKMAN, 2008). No entanto, as Treg podem bloquear respostas benéficas, de
combate a tumores e de eliminação de vírus e parasitas e, mesmo quando protegem
tecidos de danos durante infecções, por controlarem respostas efetoras exacerbadas,
podem promover a sobrevivência e persistência de patógenos (KRETSCHMER et al.,
2006; ROUSE; SARANGI; SUVAS, 2006). Acredita-se que principalmente as nTreg
são recrutadas para os locais primários de infecção, onde regulam a função de células T
efetoras por mecanismos dependentes e independentes de IL-10 (BELKAID, 2007).
As células Treg em humanos foram primeiramente caracterizadas em 2001 por
diversos grupos como sendo células T CD4+CD25
+ (BAECHER-ALLAN et al., 2001;
DIECKMANN et al., 2001; JONULEIT et al., 2001; LEVINGS; SANGREGORIO;
RONCAROLO, 2001; TAAMS et al., 2002), a partir do dado de que células Treg de
camundongos expressavam CD25 (SAKAGUCHI et al., 1995). Posteriormente,
descobriu-se que o fator de transcrição Foxp3 era o principal gene responsável pelo
desenvolvimento e função das células Treg em camundongos (FONTENOT; GAVIN;
RUDENSKY, 2003; HORI; NOMURA ; SAKAGUCHI, 2003; KHATTRI et al., 2003).
Em seguida, demonstrou-se que o Foxp3 também era um marcador das células Treg em
humanos (RONCADOR et al., 2005).
No entanto, verificou-se que outras células com função regulatória podiam não
apresentar CD25 e/ou Foxp3. Além disso, o CD25 e Foxp3 mostraram-se não
suficientes para a caracterização das células Treg: Estudos em sangue periférico de
humanos demonstraram que até 30% das células T CD4+ também apresentavam-se
como células CD25+. Nesses estudos apenas 1-2% das células com a maior expressão de
CD25 (CD25high
) eram funcionalmente supressoras e podiam ser consideradas Treg
(ALLAN et al., 2007; BAECHER-ALLAN et al., 2001). Assim, o CD25, que é o
receptor α para IL-2, necessária para ativação de células T, passou a ser considerado
insuficiente para o isolamento e estudo de células Treg, uma vez que sua expressão
também está relacionada com ativação celular. Em relação ao Foxp3, estudos também
demonstraram que sua expressão pode ocorrer transitoriamente em T CD4+ ativadas, e
que o padrão de metilação de seu gene influencia na ação supressora de células Treg
Foxp3+. Células T Foxp3
+ com ação supressora apresentam o gene Foxp3
34
completamente demetilado, enquanto que existem células T com baixa expressão de
Foxp3 (Foxp3low
) sem ação supressora e apresentam o gene Foxp3 parcialmente
demetilado (SAKAGUCHI et al., 2010).
Dessa forma, ainda não existem marcadores definitivos para as células Treg,
especialmente para as induzidas, das quais pouco se conhece (CHEN; OPPENHEIM,
2011; GRATZ; ROSENBLUM ; ABBAS, 2013). Dentre os marcadores mais estudados
estão o antígeno citotóxico T-linfocitário 4 (CTLA-4) e a proteína receptora de TNF
induzida por glicocorticoide (GITR), ambas com boa correlação com a expressão de
Foxp3 e CD25 (YAGI et al., 2004). A expressão de CD45RA e CD45RO vem sendo
utilizada para a marcação de células Treg naive e efetoras, respectivamente. No entanto,
estes marcadores também não são exclusivos de células Treg, podendo ser expressos em
células T CD4+ efetoras. Assim, a maioria dos estudos ainda utiliza as combinações de
CD4, CD25 e Foxp3 para o estudo das células Treg (GRATZ; ROSENBLUM; ABBAS,
2013). O Quadro 1 demonstra os principais marcadores utilizados para células Treg.
Existem diversas vias conhecidas de ação das Treg durante infecções, sendo as
principais resumidas na Figura 4. As células nTreg podem limitar as respostas Th1 e
Th2 indiretamente, através da modulação da função de células apresentadoras de
antígenos (APC) ou diretamente, por contato direto com as células T CD4+. A regulação
indireta envolve a liberação de IL-10, TGF-β e adenosina. Ainda, a interação das APC
com o CTLA4 na membrana das nTreg induz a produção da enzima indolamina 2,3-
dioxigenase (IDO) pelas APC, o que leva a degradação de triptofano. Esta redução no
triptofano está associada com inibição da ativação de linfócitos T e promoção da
apoptose dos linfócitos T. A regulação direta das células T pelas nTreg envolve a
produção de adenosina 3’,5’-monofosfato cíclico (cAMP). As Treg também induzem a
formação de células Tr1 via IL-10, por meio da produção de IDO pelas APC. As células
Tr1 por sua vez podem limitar as respostas Th1 e Th2 durante infecções pela produção
de IL-10 e/ou TGF-β.
35
Quadro 1. Principais marcadores utilizados para o estudo de células Treg. Adaptado
Chen & Oppenheim (2011).
Macadores Função/comentários
CD25high
1-2% das células CD4+CD25
+ com maior expressão de CD25 (CD25
high) é
funcionalmente supressora. O uso isolado desse marcador não é indicado para o
isolamento e avaliação de Treg.
Foxp3+
Sua expressão é necessária, mas não suficiente para a caracterização de células Treg.
Células T efetoras quando ativadas podem expressar Foxp3 transitoriamente.
CTLA-4+
É molécula constitutiva de células Treg e preferencialmente se encontra no meio
intracelular. Sua expressão está correlacionada com o efeito supressor de células Treg.
CD103+
(integrina αeβ7)
É fracamente expresso em humanos, podendo ser aumentado em processos
inflamatórios e na presença de TGF-β.
HLA-DR+
Identifica células Treg maduras, diferenciadas perifericamente, responsáveis por
inibição dependente de contato com elevada expressão de Foxp3.
CCR6+ Identifica células Treg de memória e Treg com ação supressora que produzem IL-17.
CD127-/low
A marcação de células T CD4+CD25
+ e CD127
-/low vem sendo também utilizada para
caracterizar Treg. No entanto, células T efetoras quando ativadas também reduzem sua
expressão de CD127.
CD45RO+ (ou
CD45RA-)
A marcação CD45RO+CD25
highFoxp3
+ identifica células Treg com alta atividade
supressora. A marcação CD45RO+CD25
highFoxp3
low identifica células T Foxp3
+ sem
ação supressora que podem produzir citocinas inflamatórias. A marcação
CD45RA+CD25
+Foxp3
low identifica células Treg não ativadas com ação supressora
moderada.
ICOS+
Identifica células Treg de memória. Células Treg ICOS+ produzem IL-10 e apresentam
TFG-β ligado à membrana.
LAG-3+
Constitutivamente expresso em cerca de 3% das Treg de sangue periférico e
aumentado por ativação em pacientes com tumores. Identifica células Treg ativadas e
diferenciadas perifericamente com alto potencial supressor.
LAP+/CD121a
+
/CD121b+
Após a estimulação do receptor de células T (TCR), a expressão de LAP, CD121a e
CD121b pode identificar células Treg Foxp3+ supressoras.
CD39+ Expresso em células Treg Foxp3+ funcionais e de memória.
CD49d-
A ausência de CD49d exclui as células T efetoras CD25+ das Treg. A marcação
CD4+CD25
highCD49d
-CD127
- identifica células Treg Foxp3
+ funcionais altamente
puras.
GITR ou
TNFR2+ (gene
TNFRSF18)
Expresso constitutivamente em cerca de 70% das Treg Foxp3+ de sangue periférico e
em todas as células nTreg. Altamente expresso em células Treg efetoras e de memória.
As células Treg naive apresentam maior expressão que as células T efetoras. Sua
produção aumenta em células Treg ativadas por inflamação e promove a sobrevivência
das Treg em ambinete inflamatório. É considerada por alguns autores como sendo um
dos melhores marcadores para células Treg quando em combinação com CD127-/low
.
Expressa também em células Treg CD8+ induzidas por anti-CD3.
36
Figura 4. Vias de ação de células Treg durante infecções (adaptado BELKAID, 2007).
Ainda, na Figura 4, pode-se observar que durante uma resposta Th1
pronunciada, as células Th1 podem passar a secretar tanto IFN-γ quanto IL-10, esta
última por feedback negativo limita a resposta Th1 (ANDERSON et al., 2007;
BELKAID, 2007). Em LV foi encontrado que células esplênicas de pacientes
apresentam elevada expressão de IFN-γ e IL-10 o que leva a crer que uma parte dessas
células produza as duas citocinas concomitantemente, como resposta ao estímulo
inflamatório (NYLEN; SACKS, 2007).
Não se conhecem os exatos mecanismos promotores da geração de Tr1 e células
T Foxp3+ na periferia. Sabe-se que antígenos (como ovoalbumina em camundongos) e
produtos de patógenos podem estimular APC, que induzem a formação de células Tr1
(Figura 4) (GRATZ ; ROSENBLUM ; ABBAS, 2013). Em presença de meios ricos em
TGF-β há conversão de células T Foxp3- em Foxp3
+, sendo isto bem descrito para a
pele e intestino (BELKAID, 2007).
O TGF-β é também considerada uma importante citocina para a LV. Gantt et al.
(2003) verificaram aumento da forma livre (ativa) do TGF-β em aspirados de medula de
indivíduos com LV e em culturas de macrófagos infectados. Esta forma de TGF-β
prolongou a sobrevivência do parasita em macrófagos. Barral-Netto et al. (1992) em seu
37
estudo verificaram que o TGF-β foi uma citocina que inibiu a ação de macrófagos
contra a infecção por Leishmania tanto in vitro como in vivo.
O TGF-β é uma proteína liberada das células ligada de forma não covalente a
um peptídeo de latência associado (LAP). No meio extracelular este complexo se une a
uma proteína ligadora de latência (LTBP), sendo o complexo armazenado na matriz
extracelular. Para a ação do TGF-β, este precisa ser liberado destes peptídeos e isto é
realizado através de meios físicoquímicos ou por meio de enzimas que agem na LAP ou
LTBP (GANTT et al., 2003).
Trabalhos recentes têm mostrado a importância das Treg na produção de IL-10 e
na supressão das células T CD4+ durante as leishmanioses. Para as formas cutâneas de
leishmaniose, as células Treg parecem implicadas na gravidade da lesão e manutenção
do parasita, conforme observado nos trabalhos listados no Quadro 2.
Em LV ainda são poucos os estudos que procuraram estudar o papel das Treg
durante a infecção e doença (NYLEN et al., 2007; RAI et al., 2012; RODRIGUES et
al., 2009). Nylen et al. (2007) em estudo com LV humana verificaram que células
CD4+CD25
−Foxp3
− são as principais células responsáveis pela elevação do mRNA de
IL-10 no baço. Ao contrário, Rai et al. (2012) demonstraram em seu estudo também em
LV humana um aumento da quantidade de células CD4+CD25
+Foxp3
+ produtoras de IL-
10 na medula e argumentam que possivelmente essas seriam as células responsáveis
pela supressão da resposta efetora de células T observada durante a LV.
Estudo realizado por Rodrigues et al. (2009) infectando L. infantum em
camundongos BALB/c verificou aumento de células T CD3+CD4
+CD25
+,
CD4+CD25
+GITR
+ e
CD4
+CD25
+CD103
+ em baço e linfonodos após 7 dias de infecção.
No mesmo estudo, observou-se também após 7 dias de infecção, aumento da expressão
de Foxp3 em células T CD4+CD25
+. Nestas mesmas células, foi observada maior
produção de TGF-β e IL-10 após a infecção. Ainda, o estudo verificou que as células T
CD4+CD25
-Foxp3
- eram importantes produtoras de IL-10, corroborando os achados de
Nylen et al. (2007).
Cabe ainda ressaltar que as células Treg Foxp3+ exibem plasticidade, e em
ambiente inflamatório (produção de IL-6, IL-23, IL-21 e IL-1β) podem produzir IL-17
(KOENEN et al., 2008; SAKAGUCHI et al., 2010). Células IL-17+Foxp3
+ isoladas em
38
sangue periférico humano foram capazes de produzir tanto IL-17 quanto agir de maneira
supressora, a depender do estímulo realizado (BERIOU et al., 2009; SAKAGUCHI et
al., 2010). No entanto, poucos estudos foram realizados buscando compreender o papel
da IL-17 na LV. Pitta et al. (2009) verificaram na Índia que CMSP de indivíduos com
infecção assintomática produziam mais IL-17 após estímulo com Leishmania, sugerindo
que esta citocina estaria associada com proteção contra a infecção.
Assim, as células Treg em seus diversos fenótipos parecem apresentar
importante papel durante a LV. No entanto, ainda são necessários estudos que busquem
sua caracterização e ação na doença assim como a sua relação com a resposta imune
durante a infecção por Leishmania.
39
Quadro 2. Principais estudos envolvendo outras leishmanioses que encontraram associação da doença com células Treg.
Parasita Hospedeiro Células estudadas Principais achados envolvendo a resposta T regulatória Referência
L. braziliensis Humano CD4
+CD25
+ que apresentaram
CTLA4, Foxp3 e GITR Acúmulo de Treg nas lesões
(CAMPANELLI et al.,
2006)
L. major Camundongo CD4
+CD25
+Foxp3
+ e
CD4+CD25
-Foxp3
-
IL-10 foi produzida por células CD4+CD25
+Foxp3
+ no
entanto as células CD4+CD25
-Foxp3
- foram as principais
produtoras de IL-10 na lesão crônica
(ANDERSON et al.,
2007)
L. braziliensis Humano CD4
+CD25
+ (a maioria
Foxp3+)
Produção de IL-10 por células Treg nas lesões (SALHI et al., 2008)
L. guyanensis Humano mRNA de Foxp3 nas lesões Alta expressão de Foxp3 nas lesões esteve relacionada com falha
terapêutica
(BOURREAU et al.,
2009b)
L. guyanensis Humano mRNA de Foxp3 nas lesões Acúmulo de mRNA de Foxp3 e IDO em lesões de fases
iniciais e associação com a infecção crônica
(BOURREAU et al.,
2009a)
L. donovani Humano CD3+Foxp3
+
Durante a leishmaniose dérmica pós-calazar (PKDL) a
presença das células CD3+Foxp3+ esteve associada com
lesões de maior gravidade
(GANGULY et al.,
2010)
40
1.3. Aspectos genéticos do hospedeiro e o parasita na resposta à infecção por
Leishmania
A resposta imune é também regulada por fatores genéticos. Assim, tem-se
procurado descobrir genes que determinem ou se associem com a resistência e
susceptibilidade à infecção por Leishmania. Existem diversos estudos que comprovam
a relação de determinantes genéticos em murinos e humanos na resposta à Leishmania
(BLACKWELL et al., 2009).
Em estudo realizado por nosso grupo, foi observada a existência de agregação
familiar de infecção por L. braziliensis, na população baiana (CASTELLUCCI et al.,
2005) e L. infantum, no Estado do Rio Grande do Norte (JERONIMO et al., 2004).
Uma varredura do genoma foi realizada utilizando amostras de DNA isolados de
famílias com múltiplos casos de LV, arroladas na área perimetropolitana de Natal
(JERONIMO et al., 2007). Este último estudo permitiu identificar áreas do genoma que
parecem conter genes que regulam a evolução frente à infecção por L. infantum:
marcadores no cromossomo 9 mostraram-se associados à LV, e marcadores nos
cromossomos 15 e 19 com a resposta DTH.
Recentemente, estudo multicêntrico realizado na Índia e Brasil, com a
participação do nosso grupo, detectou que o lócus do HLA-DRB1-HLA-DQA1 do HLA
classe II foi a região associada com LV em ambas as populações. Este resultado sugere
que existem fatores de risco genéticos que determinam a resposta à infecção,
independentemente de variáveis epidemiológicas e do parasita (FAKIOLA et al., 2013).
A espécie do parasita, sua virulência e os fatores condicionantes da virulência no
parasita também influenciam na resposta à infecção (WILSON; JERONIMO;
PEARSON, 2005). Por exemplo, a adesão e a internalização de promastigotas na célula
fagocitária são realizadas por meio da interação da protease GP63 e do lipofosfoglicano
(LPG), presentes na superfície do parasita, com receptores do complemento (CR1 e
CR3) na superfície da célula (BRITTINGHAM et al., 2001).
A GP63 cliva o complemento, moléculas CD4 e digere proteínas intracelulares.
Cisteíno proteases também estão associadas com a virulência do parasita. No estudo de
Gantt et al. (2003) em que se observou aumento da forma livre de TGF-β em aspirados
de medula de indivíduos com LV (L. infantum) e em cultura de macrófagos, a atividade
41
da catespina B foi determinante para o aumento do TGF- β livre o que prolongou a
sobrevivência do parasita nos macrófagos.
1.4. Fatores nutricionais associados com a resposta à infecção por Leishmania
A percepção de que o estado nutricional está associado com a resposta às
infecções é relativamente recente. A primeira revisão da Organização Mundial da Saúde
– OMS sobre o tema foi publicada em 1968 a partir de trabalhos desenvolvidos pelo
grupo do americano Nevin Scrimshaw, na qual se propunham duas formas de interação
entre o estado nutricional e infecções: a sinérgica e a antagônica (SCRIMSHAW;
TAYLOR; GORDON, 1968).
Na interação sinérgica entre o estado nutricional e infecções, parte-se do
pressuposto que a infecção pode agravar a desnutrição e que a desnutrição pode
diminuir a resistência à infecção, sendo a presença simultânea da desnutrição e infecção
pior para o hospedeiro do que o efeito esperado para essas variáveis independentemente.
Assim, noção de que a infecção poderia piorar a desnutrição e vice-versa em um ciclo
vicioso estava estabelecida. Por outro lado, na interação antagônica, propunha-se que,
em alguns casos especiais, a desnutrição poderia diminuir a multiplicação do agente
infeccioso, e assim o efeito combinado da infecção e desnutrição seria menor que o
esperado. Um exemplo descrito foi a observação de que durante a esquistossomose em
presença de desnutrição havia menor formação de granulomas hepáticos, que estão
associados com maior gravidade de doença (KEUSCH, 2003; SCRIMSHAW;
TAYLOR; GORDON, 1968).
Com o passar dos anos, o ciclo vicioso sinérgico mostrou-se de maior relevância
para a saúde (KEUSCH, 2003). Diversos estudos demonstraram que a desnutrição
causa alterações tanto na resposta imune inata quanto adaptativa, que levam a uma
maior susceptibilidade para infecções (MCMURRAY, 1981; MCMURRAY;
WATSON; REYES, 1981; NAJERA et al., 2004). Uma das alterações mais
evidenciadas na literatura é a involução do timo, tanto estruturalmente quanto
funcionalmente, levando a uma resposta reduzida de células T (CHANDRA, 1974;
KEUSCH et al., 1987; NAJERA et al., 2004; SAVINO, 2002). Todos os componentes
do complemento (exceto o C4) apresentam-se diminuídos em pacientes desnutridos,
42
especialmente o C3 e o fator B (CHANDRA, 1975; SIRISINHA et al., 1973; SMYTHE
et al., 1971). Estudos demonstraram, conforme discutido por Cunningham-Rundles et
al.. (2005), que a desnutrição afeta também a função fagocitária e a produção de
citocinas e anticorpos.
Ainda, durante a desnutrição há desequilíbrio na função de barreira exercida pela
mucosa intestinal, com atrofia e aumento dos espaços intercelulares, promovendo a
translocação bacteriana e o aumento de episódios de infecções intestinais (GUERRANT
et al., 2013). Além disso, hoje acredita-se que não somente as infecções intestinais, mas
a própria desnutrição altera a composição da microbiota intestinal – por mecanismos
ainda não bem esclarecidos. Sabe-se que a microbiota, além de agir como barreira
contra patógenos, afeta o processamento de nutrientes, influenciando marcadamente a
resposta imune e metabólica de seu hospedeiro (KAU et al., 2011).
Também na desnutrição, comumente coexistem não apenas o déficit proteico-
calórico, mas também (e muitas vezes somente) a deficiência de micronutrientes,
conhecida como fome oculta, que influencia tanto a susceptibilidade quanto o curso das
infecções (BHASKARAM, 2002). Segundo Blössner & de Onis (2005), mesmo níveis
moderados de deficiência de micronutrientes, tais como ferro, vitaminas, iodo e zinco,
detectados por testes bioquímicos, podem provocar sérios prejuízos à saúde humana.
Por sua vez, as infecções cursam com resposta inflamatória (produção de IL-1,
IL-6, TNF-α, prostaglandina E2 – PGE2), que leva ao aumento das necessidades
nutricionais (pela febre, formação de proteínas de fase aguda e catabolismo), anorexia e
alteração da absorção intestinal, agravando o quadro de desnutrição (BLOSSNER; DE
ONIS, 2013; GUERRANT et al., 2013). A Figura 5 resume o ciclo vicioso desnutrição-
infecção e sua relação com a resposta imune.
Com relação ao impacto na saúde do ciclo desnutrição-infecção, sabe-se que as
infecções entéricas, por exemplo, são responsáveis por atraso no desenvolvimento e
redução no crescimento. A diarreia durante os primeiros 2 anos de vida pode causar em
média, aos 7-9 anos, redução de 8 cm no crescimento e redução de 10 pontos no
quociente de inteligência – QI (GUERRANT et al., 2013). Somado a isso, dados
sugerem que crianças com desnutrição, atraso no crescimento e repetidas infecções
intestinais apresentam risco elevado para o desenvolvimento de obesidade e suas co-
morbidades na vida adulta (VICTORA et al., 2008).
43
Figura 5. Diagrama esquemático demonstrando o ciclo vicioso desnutrição-infecção e
sua relação com a resposta imune.
Assim, apesar de ser reconhecer mundialmente que o ciclo desnutrição-infecção
gera impacto no desenvolvimento e, portanto, prejudica o capital humano futuro, apesar dos
avanços em saúde e da mudança do perfil epidemiológico da população com o advento da
obesidade, a desnutrição permanece como um problema de saúde pública. Ainda, nos países
em desenvolvimento, observa-se a sobreposição dos problemas e gastos em saúde gerados
tanto pela obesidade quanto pela desnutrição, o que vêm sobrecarregando os sistemas de
saúde pública (SAWAYA et al., 2004).
Para se ter uma ideia, de acordo com relatório da Food and Agriculture
Organization of the United Nations – FAO (FAO, 2012), 868 milhões de pessoas ainda
sofrem com a desnutrição e os efeitos negativos da deficiência de micronutrientes afetam
cerca de 2 bilhões de pessoas. Ainda segundo o documento, mais de 100 milhões de
crianças menores de 5 anos apresentam baixo peso, sendo a desnutrição a causa de morte de
mais de 2,5 milhões de crianças por ano.
No Brasil, ao longo das últimas décadas observou-se significativa redução da
desnutrição: o baixo peso caiu de 7,1% para 1,7% e a baixa estatura de 19,6% para 6,7%.
44
Apesar desta redução, ainda persistem altas prevalências de desnutrição em grupos
vulneráveis da população como indígenas (26%), quilombolas (16%), residentes da
região norte (15%), e famílias beneficiárias de programas de transferência de renda
(15%), especialmente crianças e mulheres que vivem em bolsões de pobreza (BRASIL,
2012).
Diversos estudos demonstram que a desnutrição pode cronificar e/ou agravar o
quadro clínico de doenças infecciosas, como a tuberculose (METCALFE, 2005), as
gastroenterites (GUERRANT et al., 2008) e a infecção pelo HIV (CENTEVILLE et al.,
2005). No entanto, apesar de a desnutrição ser considerada fator de risco para a LV
(BADARO et al., 1986; CERF et al., 1987; EVANS et al., 1985), e de a LV e a
desnutrição atuarem sinergicamente agravando o quadro clínico do paciente (REY et
al., 2005), pouca atenção foi dada em pesquisas para se compreender como deve ser
realizado o tratamento nutricional do paciente com LV e quais as bases imunológicas e
moleculares das associações encontradas entre a LV e o estado nutricional.
1.4.1 Estado nutricional, dieta e micronutrientes
Alguns estudos de seguimento em humanos, todos realizados com crianças,
demonstraram que a desnutrição é um fator de risco para o desenvolvimento de LV
(Quadro 3). Dentre o quais, o clássico estudo de Badaró et al. (1986) foi pioneiro ao
demonstrar que crianças que desenvolvem a LV, em sua maioria (77%), são
desnutridas.
Um ponto importante, não considerado nos estudos de seguimento realizados, é
que a exposição à infecção por Leishmania em crianças desnutridas poderia ser maior
do que a exposição em não desnutridas, traduzida em maior número de flebotomíneos e
cães no local de moradia. Dye & Williams (1993) criaram modelos estatísticos
utilizando os dados de Badaró et al. (1986) e Cerf et al. (1987), com a adição de
variáveis de exposição. Os resultados demonstraram que realmente a desnutrição e
também a idade mais jovem (crianças) estava relacionada com o maior risco de
desenvolvimento da doença. Estudos de caso-controle verificaram que a desnutrição
está associada com a LV. Harrison et al.. (1986), em estudo com crianças brasileiras
expostas à infecção por L. infantum avaliaram o estado nutricional utilizando a
circunferência do braço (CB) e a área muscular do braço. Foi encontrado que crianças
com LV (n = 9), que foram seguidas após o tratamento, apresentavam área gordurosa do
45
braço e área muscular do braço que correspondia a 66% e 81% das áreas de seus
familiares sadios (n = 30), pareados por sexo e idade, que viviam na mesma casa. O
estudo encontrou diferenças ainda maiores quando comparou as crianças que
apresentaram LV aos vizinhos sadios (n = 30), pareados por sexo e idade, encontrando
área gordurosa do braço e área muscular do braço correspondentes a 41% e 75% das
áreas encontradas para os vizinhos sadios.
Quadro 3. Principais estudos de coorte que determinaram a desnutrição como fator de
risco para o desenvolvimento de LV.
Autores
(ano)
Local e período
do estudo População Principais achados
BADARÓ
et al. (1986)
e CERF et
al.(1987)
Jacobina – Bahia,
1980-1984
Todas as crianças ≤ 15
anos moradoras de
favelas em torno do
centro da cidade (n =
2246)
56% das crianças eram desnutridas
segundo Peso/idade (45% grau
leve, 11% moderado/grave –
critério de Gomez). Das crianças
que desenvolveram LV, 77% eram
desnutridas (32% grau leve, 45%
moderado/grave).
EVANS et
al. (1992)
Brotas (área rural)
– Ceará,
1987-1990
920 crianças de 10
meses a 11 anos
Entre os que soroconverteram, o
hematócrito foi menor no momento
da soroconversão nos que
desenvolveram LV. Casos
incidentes de LV apresentaram
menores escores-z para
Altura/Idade, Peso/Estatura e
Peso/Idade em relação aos
assintomáticos e soronegativos.
GOMES et
al. (2007)
Raposa –
Maranhão,
2000-2002
241 crianças de 0 a 72
meses (39 com LV, 20
oligossintomáticos, 38
assintomáticos e 144
não infectados)
Os valores médios de albumina e de
escores z para Peso/Idade,
Altura/Idade foram menores quando
comparados aos demais grupos.
Análise múltipla verificou que a
albumina e os escores Z para
Altura/Idade eram preditores para LV
e infecção oligossintomática.
Estudo realizado pelo nosso grupo demonstrou não só que crianças com LV (n =
20) apresentavam menor IMC/idade quando comparadas aos controles sadios (n = 129),
mas também que o maior tempo de amamentação e a maior idade estavam associadas
com a infecção assintomática, sendo essas consideradas variáveis de proteção contra a
LV. Outro modelo de regressão logística multivariada realizado no mesmo trabalho
46
demonstrou que a baixa albumina e menor peso ao nascer mostraram-se como fatores de
risco para o desenvolvimento de LV (MACIEL et al., 2008).
Além dos estudos de caso-controle que demonstram a associação da doença com
a desnutrição, estudo de acompanhamento de casos de LV, realizado por Rey et al.
(2005) demonstrou que a desnutrição moderada e grave está associada com a letalidade,
provando assim que a LV e a desnutrição atuam sinergicamente, piorando o prognóstico
da doença.
Apesar dos estudos acima citados, existe ainda lacuna no que tange à
compreensão das bases moleculares e imunológicas da associação do estado nutricional
com a resposta à Leishmania. Isso porque os estudos em humanos, em sua maioria,
limitam-se a avaliar o estado nutricional por meio de avaliação antropométrica e
bioquímica (medida das concentrações de proteínas totais, albumina, hematócrito e
hemoglobina), associando estas variáveis com os conhecidos fenótipos de resposta à
infecção por Leishmania. Não se sabe ao certo se a desnutrição observada na LV está
associada com a resposta imune/inflamatória e/ou com carga parasitária frente à
infecção pelo parasita. Esta lacuna nos levou a hipotetizar que o estado nutricional
comprometido durante a LV pode estar correlacionado com a resposta
imune/inflamatória montada pelo infectado e não necessariamente com a carga
parasitária. Além disso, a avaliação da carência de micronutrientes específicos é ainda
cara, restrita aos grandes centros de pesquisa, e complicada pela própria infecção, que
pode alterar a distribuição e metabolismo de nutrientes (PRASAD et al., 1997;
THURNHAM et al., 2003), o que leva a uma visão parcial do processo de depleção do
estado nutricional durante a doença.
Em relação à dieta, o primeiro estudo que procurou demonstrar seu o papel
durante a infecção por L. donovani foi publicado em 1960. Nesse estudo, camundongos
albinos com dieta deficiente em piridoxina ou ácido pantotênico ou proteína
apresentaram maior carga parasitária após a infecção (ACTOR, 1960).
Anstead et al. (2001) observaram o efeito da infecção por L. donovani em
camundongos da linhagem BALB/c sob diferentes dietas. Neste estudo, de forma
inédita em modelos animais com leishmanioses, foi levado em consideração o peso para
idade dos camundongos estudados, à semelhança das avaliações realizadas em
humanos. Outro aspecto importante do estudo foi a avaliação de componentes da
47
resposta imune inata, o que não é realizado pela maioria dos estudos que procura
estudar variáveis nutricionais associadas com a LV.
Assim, os camundongos foram alimentados com dietas com baixo teor em
proteínas, calorias, ferro e zinco, e comparados com camundongos alimentados com
dieta normal. Os resultados demonstraram que, nos camundongos com dieta deficiente,
a disseminação de L. donovani era maior no fígado e baço quando comparada aos
animais controle. Foi verificado também que a disseminação apresentada por estes
animais estava correlacionada com o peso para idade, sendo maior naqueles que
apresentavam os menores valores antropométricos. Os camundongos em dieta controle
apresentaram maior retenção do parasita nos lifonodos, o que impediu a disseminação
da infecção para as vísceras (ANSTEAD et al., 2001).
As células de linfonodos dos camundongos em dieta deficiente produziram
níveis aumentados de PGE2. Esta prostaglandina quando bloqueada pelo uso de
indometacina está associada à diminuição de lesões, aumento da produção de óxido
nítrico e INF- em infecção por L. major. Em infecção por L. donovani, verificou-se que
o bloqueio da produção desta prostaglandina diminuiu a disseminação do parasita para
as vísceras (ANSTEAD et al., 2001).
Anstead et al. (2001) também verificaram que os camundongos em dieta
deficiente apresentavam menor atividade da enzima óxido nítrico sintase no fígado e
baço. Os dados do estudo contribuíram para o entendimento de que não só o estado
nutricional, mas a dieta em seu aporte energético-protéico e de micronutrientes estão
associados com a doença e a produção de fatores ligados ao desenvolvimento de
resposta imune efetora.
Em um dos poucos estudos de suplementação de nutrientes e infecção por
Leishmania, Garg et al. (2004) em modelo de hamsters, verificaram que suplementação
profilática de vitamina C em 15 doses diminuiu significativamente a visceralização de
L. donovani, e aumentou o efeito terapêutico do stibogluconato de sódio. No entanto, a
suplementação desta vitamina após o estabelecimento da infecção diminuiu a ação da
droga. A suplementação de ferro e das vitaminas A, B e E, quer utilizadas de maneira
profilática ou terapêutica, promoveram a multiplicação do parasita.
48
Estudos indicaram que durante a LV há deficiência de zinco (LAL et al., 2013;
MISHRA; CARPENTER; SINGH, 2010; VAN et al., 2004). Lal et al. (2013)
observaram concentrações menores de Mg e Zn em pacientes com LV há mais de 3
meses, que apresentaram falha terapêutica, que em pacientes com LV a menos de 4
semanas sem falha terapêutica. Van et al. (2004) verificaram que não somente o zinco,
mas o cobre e a relação Zn/Cu podem influenciar na resposta celular durante a LV. Foi
encontrada deficiência de zinco, aumento das concentrações plasmáticas de cobre e
aumento na relação cobre/zinco nos pacientes com LV. O aumento do cobre plasmático
estava significativamente relacionado com o aumento na produção de IgG anti-
Leishmania, e a relação aumentada cobre/zinco estava também relacionada com o
aumento da resposta Th2 à infecção.
O grupo verificou ainda que a adição de cobre em concentrações fisiológicas em
meio de cultura inibiu a produção de INF-, e adição de zinco não reverteu esta inibição.
Mesmo assim, esses autores sugerem que a suplementação de zinco em indivíduos com
LV poderia ser benéfica, uma vez que estudos in vivo têm demonstrado seu efeito
diminuidor das concentrações de cobre (VAN et al., 2004). Corroborando os dados
deste último estudo, Lal et al. (2013) também encontraram aumento do cobre
plasmático em LV.
Os dados encontrados nestes estudos relacionam-se com os dados da literatura
em relação ao zinco. Prasad et al. (1997) discutem que a produção de INF- em
presença de deficiência de zinco apresenta-se diminuída, enquanto que a produção de
IL-4, IL-6 e IL-10, relacionados com o estímulo da imunidade humoral, não está
afetada. Têm-se evidenciado que, a mudança da resposta celular Th1 para a reposta Th2
ocorre precocemente na presença de deficiência de zinco, agravando e/ou cronificando a
infecção por microorganismos intracelulares (SPRIETSMA, 1997).
Apesar de o ferro ser considerado um micronutriente importante para a resposta
imune, são poucos os trabalhos que verificaram sua deficiência ou efeito durante a
infecção por Leishmania. Em trabalho recente, Lal et al. (2013) verificaram redução no
ferro sérico de pacientes com LV. Vale-Costa et al. (2013) observaram que a injeção de
ferro dextrano em camundongos BALB/c diminuiu a multiplicação de L. infantum em
fígado e baço e que sua via de ação possivelmente se dá pelo estímulo na produção de
espécies reativas de oxigênio e nitrogênio nos macrófagos.
49
Além dos micronutrientes citados acima, a deficiência de vitamina A, avaliada
por meio do retinol sérico, foi encontrada em pacientes com LV (BERN et al., 2007;
LUZ; SUCCI; TORRES, 2001; MACIEL et al., 2008) e em indivíduos saudáveis que
após avaliação desenvolveram LV (BERN et al., 2007).
1.4.1.1 Vitamina A: Aspectos gerais e efeitos na resposta imune
Em 1913, dois grupos independentes, McCollum e Davis, na Universidade de
Wisconsin, e Osborne e Mendel, na Universidade de Yale, identificaram, quase que
simultaneamente, a vitamina A, primeira vitamina a ser descoberta. Atualmente, o
termo vitamina A é empregado genericamente a todos os compostos derivados da B-
ionona que possuem atividade biológica de retinol. O retinol possui a fórmula empírica
C20H30O e contém na sua estrutura química o anel B-ionona ligado a uma estrutura
terpênica. Devido à sua similaridade com o retinol, os compostos dele derivados são
chamados de retinóides. Os retinóides ativos da vitamina A são encontrados em três
formas: a forma álcool (retinol), encontrada no soro, acoplado a proteína de ligação do
retinol (RBP); a aldeído (retinal ou retinaldeído), componente dos pigmentos visuais
dos cones e bastonetes; e a ácida (ácido retinóico), principal forma ativa encontrada no
meio intracelular (SEMBA, 1994).
Na natureza, o retinol é encontrado em sua forma esterificada, ou pré-formada,
em alimentos de origem animal, como fígado, leite e ovos. Em alimentos de origem
vegetal, não são encontrados retinóides, mas carotenóides, que podem produzir retinol
no metabolismo. Por esta propriedade, se diz que os carotenóides são pró-vitamina A,
podendo ser encontrados em vegetais folhosos verde-escuros e nos vegetais e frutas
amarelo-alaranjados. O mais ativo destes é o betacaroteno, um dímero de retinol
(MORA; IWATA; VON ANDRIAN, 2008; SEMBA, 1994). Por ser encontrada na
forma esterificada, a vitamina A é solúvel em solventes orgânicos e insolúvel em
soluções aquosas. Ela é sensível à oxidação na presença de luz, instável ao calor e em
meio ácido, sofrendo isomerização com esses fatores (MORA; IWATA; VON
ANDRIAN, 2008; SEMBA, 1994).
Após a absorção da vitamina A e sua entrada na circulação, os ésteres de retinol
chegam ao fígado, órgão responsável pelo seu armazenamento. Os ésteres de retinol são
continuadamente hidrolizados a retinol e liberados para a circulação, ligados a proteínas
transportadoras de retinol (RBP). Uma vez nas células, o retinol é oxidado por álcool
50
dehidrogenases a retinal, que por sua vez é oxidado por retinal dehidrogenases a ácido
retinóico – RA (BLOMHOFF; BLOMHOFF, 2006). O ácido retinóico pode ser gerado
em múltiplas isoformas, no entanto, a forma all-trans (ácido all-trans retinóico –
ATRA) é a predominante na maioria dos tecidos (HALL et al., 2011; MIC et al., 2003).
A deficiência clínica de vitamina A é manifestada pela cegueira noturna, mancha
de Bitot, xeroftalmia e queratomalácia. Este quadro clínico normalmente é observado
quando as concentrações séricas de retinol se encontram inferiores a 10µg/dL
(0,35µmol/L). Existe ainda a deficiência subclínica de vitamina A, quando as
concentrações séricas de retinol se encontram inferiores a 20µg/dL (0,7µmol/L). Ainda,
dados na literatura sugerem que valores de retinol sérico inferiores a 30µg/dL
(1,05µmol/L) estão associados com disfunção biológica e são responsivos à
suplementação (PILCH, 1987; SEMBA, 1994; SEMBA, 1999). Este último valor é
sugerido por alguns autores como sendo o mais adequado para a identificação da
deficiência subclínica de vitamina A em pré-escolares, gestantes e puérperas (BISWAS
et al. 2000; SOMMER; DAVIDSON 2002; WEST 2002; WONDMIKUN 2002 apud
BRASIL, 2009b).
Estudos ao longo dos anos têm demonstrado que a vitamina A apresenta ação
pleiotrópica, desde a função visual, organogênese, metabolismo até a resposta imune
(CIN-PEREZ et al., 2010; HALL et al., 2011). O seu efeito protetor contra doenças
infecciosas foi verificado em diversos estudos de suplementação em crianças, os quais
demonstraram redução da morbidade por diarreia (RAHMAN et al., 2001), pneumonia
e sarampo (COUTSOUDIS et al., 1992; COUTSOUDIS; BROUGHTON;
COOVADIA, 1991; FAWZI et al., 1993). Este efeito foi reforçado por dados que
demonstraram que a suplementação de vitamina A em crianças após os 6 meses de
idade e menores de 5 anos de populações com deficiência pode reduzir a mortalidade
em torno de 23-30% (GLASZIOU; MACKERRAS, 1993; WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 1998; WORLD HEALTH ORGANIZATION; UNICEF, 1997).
Assim, na década de 80, mesmo sem ainda compreender os mecanismos que
levavam aos efeitos observados nos estudos de suplementação, muitos países em
desenvolvimento adotaram o protocolo da OMS para suplementação de vitamina A. O
protocolo recomenda a suplementação de 200.000 UI para mulheres no pós-parto
imediato, e para crianças de 6 até 59 meses, uma dose a cada seis meses. São
51
recomendados 100.000 UI para crianças de 6 a 11 meses e 200.000 UI para crianças de
12 a 59 meses (GLASZIOU; MACKERRAS, 1993; WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 1998; WORLD HEALTH ORGANIZATION; UNICEF, 1997). No
Brasil, o protocolo foi implementado em 1983 para crianças e em 2001 para puérperas
(BRASIL; UNICEF, 2007).
Apesar da implementação do protocolo de suplementação da OMS em alguns
países, ainda 250 a 500 mil crianças no mundo estão em risco de ficar cegas por
deficiência de vitamina A (UNICEF, 2013). Em especial, países em desenvolvimento
apresentam as maiores prevalências de deficiência de vitamina A, conforme pode ser
visualizado na Figura 6.
Figura 6. Deficiência de vitamina A em crianças pré-escolares no mundo (BASSETT;
WINTER-NELSON, 2010).
No Brasil, não existem estudos abrangentes recentes sobre a prevalência de
deficiência de vitamina A. De acordo com o Ministério da Saúde, estudos isolados
demonstraram que a prevalência de deficiência de vitamina A em crianças menores de 5
anos na região Nordeste varia de 16-32%, na região Norte de 15-32% em pré-escolares
e na região Sudeste de 15-27% em recém-nascidos. Dados da Pesquisa Nacional de
Demografia e Saúde da Criança e da Mulher – PNDS, realizada em 2006, em todo o
Brasil, com 3499 crianças menores de 5 anos, demonstraram que 17,4% apresentavam
52
retinol sérico inferior a 20µg/dL (0,7µmol/L), caracterizando significativa deficiência
subclínica no país (BRASIL, 2009b).
O efeito de redução do risco para doenças infecciosas da vitamina A pode ser em
parte atribuído ao papel de manutenção da integridade de mucosas, estímulo da
proliferação e diferenciação das células epiteliais e produção de IgA (IWATA et al.,
2004; RAHMATHULLAH et al., 2003; SOMMER; DAVIDSON, 2002). Grande parte
da ação do ATRA se dá através de sua ligação a receptores nucleicos de ácido retinóico
(RARs), sendo estes expressos nas isoformas RAR-α, RAR-β e RAR-. Outro
metabólito ativo da vitamina A no núcleo celular é o ácido 9-cis retinóico, que se liga a
receptores X retinóides no núcleo celular (RXR). Estes receptores também apresentam
as isoformas α, β e . Cada receptor RAR e RXR possui domínios específicos no DNA,
através dos quais a atividade de transcrição pode ser afetada. Estes domínios do DNA
são chamados de elementos de resposta ao ácido retinóico, ou RARE (SEMBA, 1994).
A deficiência de vitamina A está associada com a diferenciação de células T
CD4+ em células Th1, secretoras de IFN-γ (CANTORNA; NASHOLD; HAYES, 1995;
ROSS, 2012; SMITH; LEVY; HAYES, 1987). Estudos demonstraram ainda que o RA
promove a resposta Th2 e a produção de IL-4 e IL-5 (HOAG et al., 2002; IWATA;
ESHIMA; KAGECHIKA, 2003; ROSS; CHEN; MA, 2009; STEPHENSEN et al.,
2002; STEPHENSEN; JIANG; FREYTAG, 2004), e aumenta a razão de citocionas Th2
em relação às Th1 (MA; CHEN; ROSS, 2005).
Outro importante subtipo celular CD4+, no qual a vitamina A apresenta papel
inibitório, são as células Th17 (KIMURA; KISHIMOTO, 2010; NOLTING et al.,
2009). Estas células produzem IL-17, IL-23, IL-22, IL-6, TNF-α e quimiocinas, sendo
diferenciadas e induzidas na presença de TGF-β e IL-6. As células Th17 são
importantes nas respostas inflamatórias, especialmente, na mucosa intestinal, onde
funcionam como células efetoras contra patógenos intracelulares, atraindo outras células
inflamatórias para os sítios de inflamação, como neutrófilos. Possivelmente, essas
células também estão associadas com as respostas de autoimunidade e alergia
(KOENDERS; VAN DEN BERG, 2010). Os principais reguladores das células Th17
são dois receptores nucleares, o receptor retinóide orphan (ROR) γt e RORα, assim
chamados por sua homologia com os receptores nucleares retinóides (EBERL;
LITTMAN, 2003; ZIEGLER; BUCKNER, 2009).
53
Ainda, nos últimos anos, tem sido reconhecido que o RA é um dos fatores
críticos que promovem a diferenciação de células iTreg pela indução da expressão de
Foxp3. Na presença de TGF-β, RA e baixas concentrações de IL-6, a indução do Foxp3
nas células iTreg é favorecida (BENSON et al., 2007; MUCIDA et al., 2007;
NOLTING et al., 2009). Esta ação é atualmente aceita como uma dos mecanismos mais
importantes de indução de tolerância oral, uma vez que grande parte dessas células é
induzida na mucosa intestinal (HALL et al., 2011). Ainda, o Foxp3 pode ligar-se
diretamente ao RORγt e RORα, inibindo sua atividade transcricional, o que explica
parte do efeito inibidor do RA na indução de Th17 e o fato de as respostas iTreg e Th17
parecerem opostas (MUCIDA; SALEK-ARDAKANI, 2009).
A vitamina A também é necessária para a migração de células T e B para o
intestino e ativação de células T de memória (ROSS, 2012). Iwata et al. (2004) ao
estudarem ratos deficientes em vitamina A verificaram diminuição das células T
efetoras e de memória na mucosa intestinal. Experimentos in vitro realizados pelo grupo
demonstraram que a presença do ácido retinóico induziu, mesmo na ausência de células
dendríticas, a expressão de receptores que promovem a migração de células T à mucosa
intestinal, o CCR9 e α4β7. As células dendríticas mesentéricas por sua vez
apresentaram alta produção da enzima retinaldeído desidrogenase, importante para a
formação do ácido retinóico. O bloqueio desta enzima nas células dendríticas ou de
receptores de ácido retinóico nas células T diminuiu significativamente a expressão de
CCR9 e α4β7, essenciais para a migração das células T à mucosa intestinal.
Mesmo não se conhecendo exatamente os mecanismos reguladores, é bem
estabelecido que as infecções, de uma maneira geral, podem diminuir o retinol sérico.
Conforme discutido por Thurman et al. (2003) estados infecciosos depletam o retinol
sérico em torno de 24%, e a convalescença em cerca de 11%. Um dos mecanismos das
depleções observadas durante processos infecciosos e febris é o aumento da excreção
renal de retinol e das RBPs. Acredita-se que, nestes episódios, não existe defeito na
função glomerular, uma vez que proteínas com peso molecular ≥ 65kDa não entram nos
túbulos renais. Possivelmente, existe defeito na reabsorção realizada pelas células do
túbulo proximal, o que acarreta em defeito na reabsorção de proteínas de baixo peso
molecular, como a RBP com massa molecular de 21kDa. Isso leva a um aumento da
excreção urinária de RBP e de retinol ligado à RPB. Aproximadamente 85% da RBP no
soro está complexada à proteína transtiretina. Esta proteína não foi encontrada na urina
54
de indivíduos com processos infecciosos agudos, o que reforça a hipótese de que a
excreção aumentada de RPB e retinol na urina seja causada por defeito na função
tubular (MITRA et al., 2002; MITRA; ALVAREZ; STEPHENSEN, 1998).
No entanto, é reconhecido que o retinol sérico diminuído durante as infecções
prejudica a resposta imune, e essa imunidade prejudicada aumenta a susceptibilidade a
novas infecções em uma relação cíclica pouco compreendida (CANTORNA et al.,
1996; THURNHAM et al., 2003). Em relação à LV, apesar dos níveis de retinol sérico
apresentarem-se diminuídos (BERN et al., 2007; LUZ; SUCCI; TORRES, 2001;
MACIEL et al., 2008), possivelmente devido à excreção aumentada de RBP e retinol na
urina, trabalho realizado pelo nosso grupo utilizando o teste de dose resposta relativo
modificado (MRDR) demonstrou que essa diminuição não está associada
exclusivamente ao processo infeccioso. O MRDR é analisado por uma relação entre o
análogo de vitamina A administrado e o retinol sérico. Portanto, espera-se que esta
relação não sofra a mesma diminuição vista para o retinol sérico em estados infecciosos,
uma vez que a concentração de RBP hepática é a mesma para as duas substâncias
dosadas (SURLES; LI; TANUMIHARDJO, 2006; TANUMIHARDJO et al., 1990;
TCHUM et al., 2006). Além disso, Bern et al. (2007) verificaram que há redução nas
concentrações séricas de retinol antes do desenvolvimento de LV e qualquer sintoma da
doença.
Estes dados nos levaram a hipotetizar que o estado de vitamina A está associado
com a resposta à infecção por Leishmania. Ainda, acreditamos que o ácido all-trans
retinóico pode modular a resposta à infecção por L. infatum em células
CD4+CD25
highFoxp3
+, CD4
+CD25
-Foxp3
- e monócitos, que são importantes células
para a resposta frente à infecção por Leishmania.
55
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
Verificar a correlação do estado nutricional e o efeito da vitamina A na resposta
imune frente à infecção por Leishmania infantum.
2.2. Objetivos específicos
1. Verificar a correlação entre o estado nutricional antropométrico e de vitamina A
com anticorpos anti-Leishmania, proteínas de fase aguda e carga parasitária
frente à infecção por L. infantum;
2. Determinar, in vitro, o efeito da vitamina A na produção de IL-10, TGF-β e IL-
17 em células T CD4+CD25
highFoxp3
+ e T CD4
+CD25
-Foxp3
- de crianças com
LV e de crianças saudáveis de área endêmica para a infecção por L. infantum;
3. Determinar o efeito da vitamina A na produção de IL-10, in vitro, nos
monócitos das crianças estudadas;
4. Verificar a correlação entre o estado nutricional antropométrico e de vitamina A
com a produção de IL-10, TGF-β e IL-17 nas células T CD4+CD25
highFoxp3
+, T
CD4+CD25
-Foxp3
- e monócitos frente ao estímulo com antígenos de
Leishmania.
56
3. METODOLOGIA
3.1. Considerações éticas
A pesquisa em questão foi avaliada e aprovada (CAAE 0087.0.051.000-09) pelo
Comitê de Ética em Pesquisa – CEP da Universidade Federal do Rio Grande do Norte
(Anexo). Os responsáveis legais pelos participantes da pesquisa foram esclarecidos
quanto ao objetivo da pesquisa, sendo a participação consentida pelo responsável legal
através da assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.
3.2. Caracterização geral da pesquisa
Esta pesquisa teve sua metodologia dividida em dois Subestudos, visando o
cumprimento dos objetivos específicos apresentados:
Subestudo 1: Correlação entre o estado nutricional antropométrico e de
vitamina A com a resposta imune/inflamatória e a carga parasitária frente à
infecção por L. infantum.
Subestudo 2: Análise do efeito da vitamina A em linfócitos T CD4+
reguladores e monócitos de crianças expostas à infecção por L. infantum.
A faixa etária de crianças foi escolhida para o desenvolvimento deste estudo por
ser classicamente a mais susceptível à infecção por Leishmania na ausência de
imunossupressão e pela população de crianças ser uma das populações-alvo para
suplementação de vitamina A segundo o protocolo da OMS.
3.3. Subestudo 1: Correlação entre o estado nutricional antropométrico e de
vitamina A com a resposta imune/inflamatória e a carga parasitária frente à
infecção por L. infantum.
3.3.1. Tipo, período e área do estudo
Estudo transversal, realizado de dezembro de 2006 a dezembro de 2012. Os
dados foram coletados em oito municípios do Rio Grande do Norte: Natal,
Paranamirim, Nísia Floresta, Macaíba, Ceará Mirim, São Gonçalo, Touros e Extremoz.
83% dos dados utlizados para este Subestudo foram coletados no período de 2006-2008
para a pesquisa “Associação entre fatores nutricionais e a resposta frente à infecção por
57
Leishmania chagasi”, aprovado pelo CEP/UFRN (CAAE 0079.0.051.000-06), que tinha
como objetivo investigar variáveis nutricionais de risco associadas com a resposta
fenotípica frente à infecção por Leishmania (MACIEL et al., 2008).
3.3.2. População estudada e tamanho amostral
A população estudada foi composta por crianças que apresentaram LV, assim
como seus irmãos sadios. Os indivíduos participantes no estudo foram recrutados a
partir dos casos de LV internados na enfermaria do Hospital Infantil Varela Santiago e
Hospital Giselda Trigueiro em Natal-RN. A resposta fenotípica à infecção por
Leishmania foi determinada pelo teste de hipersensibilidade tardia (ou teste cutâneo de
Montenegro) e ELISA para anticorpos contra rk39 e extrato solúvel de Leishmania
(SLA), segundo metodologia descrita nos itens 3.3.3 e 3.3.4 adiante. Conforme a
resposta fenotípica à infecção, as crianças estudadas foram divididas nos seguintes
grupos:
Grupo 1 - Indivíduos com LV ativa. Foram incluídos neste grupo n = 31
crianças doentes, com diagnóstico de LV confirmado parasitologicamente pela presença
de amastigotas em aspirados de medula óssea, ou através de sinais clínicos evidentes,
sorologia positiva, habitação em região endêmica e resposta positiva ao tratamento.
Grupo 2 - Indivíduos com história de LV. Foram incluídos neste grupo n = 33
crianças que apresentaram LV e receberam tratamento para mesma há mais de um ano.
Grupo 3 - Indivíduos DTH+. Foram incluídos neste grupo n = 44 indivíduos
com teste de hipersensibilidade tardia positivo (DTH+), que nunca apresentaram
sintomas da doença.
Grupo 4 - Indivíduos DTH- e anticorpos anti-Leishmania negativo (DTH-
/Ac- ou controles endêmicos). Foram incluídos neste grupo n = 71 indivíduos sadios
com teste de hispersensibilidade negativo e sorologia negativa para anticorpos anti-
Leishmania.
Foram excluídos do estudo crianças que apresentaram sinais de infecção no
momento da coleta, como febre, tosse, dor de garganta e diarreia, sinais aparentes de
puberdade e/ou idade maior que 14 anos, imunodeficiência, síndrome de Down,
58
problemas neurológicos ou mentais previamente diagnosticados, gestantes e lactantes,
indivíduos com distúrbios digestivos, neoplasias e doenças hematológicas.
Para cada indivíduo, foram coletados cerca de 15mL de sangue para realização
das seguintes dosagens: hemograma, proteínas totais, albumina, globulinas, ELISA para
anticorpo anti-SLA e rK39, retinol sérico, proteína C-reativa, α-1-glicoproteína ácida, e
extração de DNA. Foi aplicado um questionário semi-estruturado para coleta de dados
sócio-econômicos e investigação da história de amamentação, peso ao nascer, presença
de co-morbidades, tempo de tratamento para a LV (no caso de crianças com história da
doença) e uso de medicação e/ou suplementos nutricionais (Apêndices 1 e 2).
O cálculo do tamanho amostral foi realizado utilizando como parâmetro as
concentrações séricas de retinol de estudo piloto realizado em 2007 com 15 casos ativos
de LV e 60 crianças da área endêmica para leishmaniose visceral (20 com infecção
assintomática, 20 com história de leishmaniose visceral e 20 sem infecção por L.
infanutm). O tamanho da amostra para detectar uma diferença significativa entre os
grupos, com poder de 90% e 5% de nível de significância foi de 20 crianças por grupo.
3.3.3. Teste de Montenegro
O Teste cutâneo de Montenegro, que é a resposta DTH ao antígeno de
Leishmania, foi realizado utilizando 25 µg de proteína de L. amazonensis (Centro de
Produção e Pesquisa de Imunobiológicos, Secretaria de Saúde, Paraná, Brazil) com
administração intradérmica. A leitura foi realizada após 48 – 72 h, sendo conferido
resultado DTH+ para os indivíduos que apresentaram formação de enduração ≥ 5 mm.
3.3.4. Teste de rK39 e antígenos solúveis de Leishmania
Os títulos de anticorpos contra os antígenos solúveis de promastigotas de L.
infantum (SLA) e o antígeno recombinante K39 (rK39) foram determinados pelo
método ELISA, segundo metodologia padronizada por Braz et al. (2002).
A obtenção do SLA foi realizada por métodos anteriormente descritos (EVANS
et al., 1989; EVANS et al., 1992). Resumidamente, formas promastigotas de L.
infantum foram lavadas e ajustadas na concentração de 108 promastigotas/mL em PBS
seguidos por repetidos ciclos de congelamento e descongelamento e uma ultrasonicação
final. Após centrifugação, o sobrenadante foi coletado e a concentração de proteína
59
medida pelo método de Lowry (1951). O antígeno foi titulado usando células
mononucleares de sangue periférico de pacientes infectados com L. infantum.
3.3.5. Avaliação do estado nutricional antropométrico
Foram coletados os dados de peso, altura (para maiores de 2 anos),
comprimento, data do nascimento e sexo das crianças. Conforme descrito em nosso
estudo anterior (MACIEL et al., 2008) há compromentimento do IMC/idade nas
crianças com LV, não sendo observadas alterações nos escores z de Altura/Idade,
Peso/Altura e Peso/Idade. Assim, para avaliar a relação do estado nutricional
antropométrico com a resposta frente à infecção por Leishmania, foram utilizados os
escores z para o indicador IMC/idade, calculados a partir das tabelas de referência da
OMS (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2006), com o programa Anthroplus
(disponível em http://www.who.int/growthref/en/). Os pontos de corte para classificação
do estado nutricional por meio deste indicador para as faixas etárias avaliadas podem
ser observados nos Quadros 4 e 5.
Para coleta dos dados antropométricos, foi utilizada balança digital marca
Plenna®
com capacidade para 150Kg, sensibilidade de 100g e estadiômetro portátil
marca Invicta Education®
com capacidade para 2m e sensibilidade de 0,1cm. Para
crianças menores de 2 anos, o comprimento foi aferido utilizando antropômetro com
capacidade para 120cm e sensibiliade de 0,1cm. A estatura/comprimento foi aferida
duas vezes, com erro padrão permitido de ± 0,5cm. Foi utilizado um questionário para
coleta dos dados na enfermaria e campo (Apêndices 3 e 4).
Quadro 4. Classificação do estado nutricional segundo IMC/Idade para crianças até 5
anos (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2006).
Ponto de corte
do escore Z
Classificação do
estado nutricional
< -3 Magreza acentuada
≥ -3 e < -2 Magreza
≥ -2 e < -1 Eutrofia
≥ -1 e ≤ +2 Risco Sobrepeso
> +2 e ≤ +3 Sobrepeso
> +3 Obesidade
60
Quadro 5. Classificação do estado nutricional segundo IMC/Idade para crianças
maiores de 5 anos (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2007).
Ponto de corte
do escore Z
Classificação do
estado nutricional
< -3 Magreza acentuada
≥ -3 e < -2 Magreza
≥ -2 e ≤ +1 Eutrofia
> +1 e ≤ +2 Sobrepeso
> +2 e ≤ +3 Obesidade
> +3 Obesidade grave
3.3.6. Determinação do retinol sérico
A vitamina A foi avaliada pela dosagem de retinol sérico, por meio de
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) ou high pressure liquid
chromatography (HPLC) no Laboratório de Engenharia Bioquímica – Departamento de
Química da UFRN.
3.3.6.1 Extração de retinol do soro
Em 400µL de soro foram adicionados 500µL de etanol 95% para desnaturação
de proteínas. As amostras foram homogeneizadas por 30 segundos. Em seguida, foram
adicionados 500µL de hexano, sendo as amostras homogeneizadas por 1 minuto e
centrifugadas a 7100 x g por 10 minutos. A fase orgânica, que contém o hexano, foi
extraída e reservada para evaporação sob nitrogênio em banho-maria a 37ºC. Foram
realizadas mais duas extrações com hexano conforme descrito acima. Após a
evaporação sob nitrogênio, as amostras foram reconstituídas em 100µL de metanol grau
HPLC, sendo aplicados 50µL no HPLC.
Em 80% das amostras, antes da desnaturação com etanol 95%, foi acrescentado
padrão interno de retinol acetato em uma concentração que conferisse após a
reconstituição 1µg/mL. Este procedimento foi realizado de forma a se manter o controle
da eficiência das extrações (TANUMIHARDJO et al., 1996). A Figura 7 mostra o
fluxograma das extrações das amostras.
Todos os procedimentos foram realizados em duplicata, em ambiente escuro e
em tubos de vidro protegidos com papel alumínio.
61
Figura 7. Fluxograma da metodologia utilizada para extração de retinol das amostras de
soro.
Evaporação em banho-maria a 37oC sob nitrogênio
Reconstituição em 100µL de metanol HPLC
Aplicação no HPLC
(50µL)
Vortex 1 minuto
Centrífuga a 7100 x g / 10 minutos
+ 2 vezes
Vortex 30 segundos
Adição de 500µL de
Hexano
400µL soro
Adição de Padrão interno
de Retinol acetato
Adição de 500µL de Etanol 95%
62
3.3.6.2 Padrão interno de retinol acetato
Para o preparo do padrão interno de retinol acetato, foram realizadas duas
diluições do seu padrão estoque em etanol absoluto retirando-se 100µL de cada solução.
Da segunda diluição, foram retirados 25µL (aproximadamente 0,1µg) e adicionados ao
soro analisado antes do processo de desnaturação com etanol 95%. Esta quantidade
adicionada conferiu uma concentração de 1µg/mL (50ng/50µL) após o processo de
extração para aplicação no HPLC.
A confirmação da recuperação do padrão interno de retinol acetato foi realizada
preparando padrão para aplicação no HPLC a partir de duas diluições do padrão
estoque. Este padrão continha concentração igual à encontrada nas amostras de,
aproximadamente, 50ng/50µL.
3.3.6.3 Confirmação dos analitos e seus tempos de retenção nas amostras
A confirmação da identidade do retinol e retinol acetato nas amostras de soro foi
determinada após adição de padrões de concentrações conhecidas em uma amostra. A
sobreposição dos picos (amostra + [padrão conhecido]) e conseqüente aumento da área
do pico no cromatograma foi então observada. O tempo de retenção da amostra foi
confirmado ao comparar-se com o do padrão. Os tempos de retenção das substâncias
analisadas foram 2,9 minutos e 5,4 minutos para retinol e retinol acetato,
respectivamente.
3.3.6.4 Validação do método
A reprodutibilidade do método foi verificada através da exatidão e precisão que
foram avaliadas pelo teste de recuperação e repetibilidade, respectivamente. O teste de
recuperação foi realizado em 80% das análises através da adição do padrão interno de
retinol acetato. A recuperação do padrão interno foi medida comparando-a com o
padrão para HPLC de mesma concentração. Valores de recuperação entre 80-100%
foram considerados como satisfatórios (AQUINO et al., 2004).
Para análise de precisão, foi aplicado padrão com concentração conhecida de
retinol em cada dia de análise. Foi também realizada aplicação de uma mesma amostra
no início e final das análises. Os coeficientes de variação encontrados foram inferiores a
5%.
63
Os limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) foram calculados utilizando a
curva de calibração para cada analito, de acordo com as seguintes fórmulas:
LD= 3,3 x s e LQ= 10 x s
S S
Onde s é o desvio padrão do coeficiente linear da equação e S é o coeficiente de
angulação da reta (AQUINO et al., 2004; RIBANI et al., 2004).
Os valores encontrados para o retinol de LD foram de 15,52ng, e LQ de
47,04ng. Estes valores asseguraram que a leitura pelo HPLC foi realizada com precisão
e exatidão uma vez que a média de retinol nas amostras estavam acima destes limites,
sendo de 81,04ng/50µL, respectivamente.
3.3.6.5 Preparo da curva padrão de retinol
As curvas padrão de retinol foram realizadas periodicamente a partir de soluções
de seus respectivos padrão estoque. Foram realizadas 6 diluições de concentrações
conhecidas para aplicação no HPLC.
As curvas foram construídas colocando os valores de massa injetada no eixo das
abscissas e suas respectivas áreas no eixo das ordenadas. Foi realizada regressão linear,
sendo considerado o coeficiente de correlação entre as variáveis com valores válidos os
próximos de +1.
3.3.6.6 Quantificação do retinol sérico
Para a quantificação das concentrações de retinol no soro foram utilizadas as
curvas padrão e suas respectivas equações de reta. O retinol sérico foi considerado baixo
ou responsivo ao maior consumo quando < 30 g/dL, inadequado quando entre 20 – 10
g/dL e deficiente quando < 10 g/dL (BALLEW et al., 2001; PILCH, 1987).
3.3.6.7 Condições cromatográficas
A fase móvel foi composta de 100% metanol grau HPLC. Foi utilizado looping
de 50µL, e o fluxo de 1mL/min. O comprimento de onda para detecção foi de 325nm.
Foi utilizada coluna Microsorb MVTM
, C18 (fase reversa), 4,6 x 150mm, com poro de
100 Å e pré-coluna MPLC®
NewGuard®
Holder complete C18 (fase reversa), 3,2 x
15mm, sendo utilizado cromatógrafo da marca SHIMADZU, constituído de duas
64
bombas, desgaseificador modelo DGU-20AS detector modelo SPD-20A, sistema de
integração CBM-20A e software LC solution.
3.3.7 Determinação das proteínas totais, albumina e globulinas
A determinação de proteínas totais foi realizada quantitativamente pelo método
do biureto, a de albumina através do método do verde de bromocresol. Os kits utilizados
foram: Proteínas Totais Cat. 19/Labtest®
Diagnóstica S.A e Albumina Cat. 19/Labtest®
Diagnóstica S.A. A determinação quantitativa de globulinas foi determinada através da
diferença entre proteínas totais e albumina.
3.3.8. Determinação das proteínas de fase aguda
As infecções levam à resposta de fase aguda, elevando determinadas proteínas
no plasma, denominadas proteínas de fase aguda. Para o monitoramento da resposta de
fase aguda foram utilizadas duas dessas proteínas, com diferentes respostas à infecção: a
proteína C-reativa e alfa-1-glicoproteína ácida (AGP). A primeira tem sua concentração
aumentada nas primeiras 6 horas de infecção, com seus níveis máximos atingidos após
24 a 48 horas, decaindo imediatamente após o final do estímulo. A segunda tem sua
concentração máxima atingida após 2 a 5 dias de infecção, permanecendo alta após o
término do estímulo (THURNHAM et al., 2003).
Assim, estas duas proteínas foram utilizadas para a avaliação da resposta de fase
aguda, por meio de teste imunoturbidimétrico. Os pontos de corte utilizados para
proteína C-reativa e AGP foram de 5mg/dL e 100mg/dL, respectivamente
(THURNHAM et al., 2003). Foram utilizados os kits CRP/AUT-000 BioSys®
e
AGP/AUT-000 BioSys®
, respectivamente.
3.3.9. Determinação da carga parasitária
A carga parasitária foi determinada no sangue periférico utilizando-se PCR
quantitativo com sistema de amplificação e detecção TaqMan (Applied Biosystems,
Foster City, CA, EUA).
Os iniciadores e sondas utilizados foram obtidos com base na sequencia gênica
disponível no banco de dados do National Institutes of Health (www.ncbi.nlm.nih.gov)
(WHEIRATHER et al. 2011; MARY et al., 2004), sendo descritos no Quadro 6.
65
O DNA total foi extraído por salting out (MILLER; DYKES; POLESKY, 1988),
sendo colocados 80ng de DNA por poço, amplificado pela PCR com os iniciadores a
3,75µM e sonda de detecção marcada com FAM a 2,5µM para kDNA de Leishmania
infantum. Os demais reagentes foram fornecidos em solução 2X concentrada,
denominada master mix, contendo dNTPs, enzima AmpliTaq Gold® DNA polimerase,
uma referência passiva e tampão de reação Gold PCR (Applied Biosystems, Foster City,
CA, EUA). Foi utilizado um volume final de 10µL por reação em triplicata. Para cada
placa, foram inseridos, em triplicata, controles negativo e positivo, com carga
parasitária conhecida de L. infantum.
Quadro 6. Iniciadores e sonda utilizados na PCR em tempo real para determinação de
carga parasitária por meio de quantificação do kDNA.
Gene/sonda Iniciador Sequência
Tamanho
do
produto
kDNA Foward CTTTTCTGGTCCTCCGGGTAGG
140 pb kDNA RV Reverse CCACCCGGCCCTATTTTACACCAA
Taqman®probe5’F
AM/3’TAMRA - TTTTCGCAGAACGCCCCTACCCGC
O programa da PCR foi o seguinte: (1) um ciclo de 2 minutos a 50ºC; (2) um
ciclo de 10 minutos a 95ºC; (3) 40 ciclos de 15 segundos à 95ºC (desnaturação) e 1
minuto a 60ºC (hibridização e extensão). Os sinais de fluorescência emitidos pelos
fluoróforos das sondas TaqMan® foram detectados pelo equipamento ABI Prism 7500
(Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). A quantificação da carga parasitária foi
realizada por meio de curva padrão, realizada para cada experimento, com quantidades
conhecidas de promastigotas.
Os dados foram analisados por meio do programa Sequence Detection Software
versão 2.0.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), que gera curvas semi-
logarítmicas dos sinais de amplificação. Esse programa fornece o parâmetro ciclo em
que o sinal de fluorescência é significativo, denominado cycle threshold (Ct) (BUSTIN,
66
2000; LIVAK; SCHMITTGEN, 2001). Para cada amostra, o Ct é registrado e
comparado com a curva padrão.
A eficiência das reações (E) foi calculada através da seguinte fórmula: E = 10-1/á
– 1 x 100, onde á é a inclinação da curva (PFAFFL, 2001). Foram considerados valores
de boa eficiência os próximos a -3,3 (LIVAK; SCHMITTGEN, 2001; PFAFFL, 2001).
3.4. Subestudo 2: Efeito da vitamina A em linfócitos T CD4+ reguladores e
monócitos de crianças expostas à infecção por L. infantum.
Células mononucleares de sangue periférico (CMSP) foram isoladas em um
subgrupo de n = 10 crianças com LV e n = 16 controles endêmicos (DTH-/Ac-),
avaliadas entre julho de 2009 e dezembro de 2012. Para tal, foram coletados entre 5 –
10 mL de sangue, colocados em tubos com heparina. O tamanho amostral foi estimado
com base em estudos com metodologia e população semelhantes (BAFICA et al., 2012;
BOTTREL et al., 2001; CLARENCIO et al., 2009). As crianças DTH-/Ac- foram
utilizadas para este estudo, representando o grupo de crianças que no momento da coleta
não apresentavam sinais de infecção por Leishmania.
3.4.1 Obtenção de células mononucleares do sangue periférico
Para obtenção de CMSP, o sangue foi centrifugado em Ficoll-PaqueTM
Plus (GE
Health Care Life Sciences), 2000 x g, 25ºC, por 40 minutos. O anel de CMSP, formado
após a centrifugação, foi recolhido e lavado 2 vezes em solução salina (200 x g, 4ºC, 10
minutos). O precipitado de células foi suspenso em 1mL de salina e a contagem de
células realizada em tubo de microcentrífuga de 1,5mL, com 380L de solução de Turk
e 20L da solução de células. Desta solução, 10L foram colocados em câmara
hemacitométrica de Newbauer e as células contadas em microscópio óptico nos quatro
quadrantes. A média das células foi multiplicada pelo fator de correção da câmara (104)
e pelo fator de diluição (20). As células foram centrifugadas e suspensas em meio
RPMI-1640 na concentração de 1 x 107 células/mL.
3.4.2 Cultura de células
As CMSP isoladas foram cultivadas por 20 h a 37 oC e 5% de CO2 em meio de
cultura RPMI-1640 (Sigma-Aldrich) suplementado com antibióticos (200U/mL de
67
penicilina e 0,1mg/mL de estreptomicina) e 10% de soro autólogo inativado em placas
de 96 poços com 200µL de cultura na concentração 2,5 x 105 células por poço.
Cinco diferentes condições foram utilizadas nas culturas: meio, SLA (10µg/mL)
(NYLEN et al., 2007; SINGH et al., 2012), ATRA (0,25nM), SLA (10µg/mL) + ATRA
(0,25nM) e Concanavalina A – ConA (10µg/mL) (NYLEN et al., 2007; SINGH et al.,
2012). O SLA foi obtido conforme metodologia descrita no item 3.3.2.2.
A concentração utilizada de ATRA foi determinada por titulação, utilizando
marcação com anexina V e Iodeto de Propídio (PI) seguida por análise em citometria de
fluxo. A concentração de 0,25nM foi escolhida por apresentar o melhor perfil tamanho e
granulosidade e baixa marcação de anexina e PI. O ATRA está presente na circulação
em concentração de cerca de 10nM. Sabe-se que a principal fonte de retinóides para as
células in vivo é o retinol ligado à RBP ou ésteres de retinol em quilomícrons
(BLOMHOFF et al., 1990). No entanto, foi demonstrado in vitro e in vivo que o ATRA
pode ser diretamente capturado por células (BLOMHOFF et al., 1992), sendo ele
utilizado como um substituto do retinol ligado à RBP e ésteres de retinol em
quilomícrons em ensaios com linfócitos (ERTESVAG et al., 2002; ERTESVAG et al.,
2009).
3.4.3 Marcação por imunofluorescência
Nas últimas 6h de cultura, foi adicionada brefeldina A (1µg/mL) (eBioscience).
A placa foi então retirada da estufa e centrifugada por 10 minutos a 4ºC. O sobrenadante
foi desprezado e as células suspensas por agitação. Os anticorpos marcadores de
superfície foram adicionados, conforme titulação padronizada em nosso laboratório, em
um volume final de 20L. Foram utilizados anticorpos marcados com diferentes
fluorocromos, cada um dirigido contra uma dada molécula de superfície, a saber: CD4
APC-Cy7 (BD Biosciences), CD25 PE-Cy7 (eBioscience), CD14 PerCP (eBioscience),
Foxp3 Alexa fluor 488 (BD Biosciences) e TGF- β1 PerCP (R & D Systems).
A placa foi incubada a 4ºC por 15 minutos ao abrigo da luz. Terminado o
período de incubação, foi realizada lavagem das células adicionando 150L de PBS em
cada poço. Em seguida, a placa foi centrifugada por 10 minutos a 4ºC. Ao final da
centrifugação, a placa foi vertida para retirar o sobrenadante e, em seguida, agitada para
68
suspender as células. Foram adicionados 100L de PBS e 100L de solução de
formaldeído 4%, deixando as células fixarem 20 minutos à temperatura ambiente.
A solução de fixação foi removida por centrifugação e as células lavadas com
150L de PBS. Foi realizada a permeabilização celular, incubando as células por 10
minutos com solução de saponina 0,5% à temperatura ambiente. Ao final do período de
incubação, a placa foi centrifugada por 10 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi
desprezado e a placa agitada. Foram adicionados 20L da solução de anticorpos anti-
citocinas de marcação intracelular, adequadamente diluídos em solução de saponina
0,5%, a saber: IL-10 APC (BD Biosciences) e IL-17F PE (eBioscience). As amostras
foram incubadas por 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, as células foram
lavadas, por centrifugação, sendo adicionados 150L da solução de saponina por poço.
Esse procedimento foi repetido por 2 vezes, sendo, na última vez, as células lavadas
com WashB. Após desprezar o sobrenadante e agitar a placa, as células foram diluídas
em 100L de PBS e 100L de solução de formaldeído 4%. O volume final de 200L de
solução contendo as células marcadas foi transferido para tubos próprios para leitura no
citômetro de fluxo. As células foram mantidas a 4ºC, ao abrigo da luz para manutenção
das fluorescências até a leitura no citômetro, realizada em no máximo 48h.
3.4.4 Análise por Citometria de Fluxo
Foi utilizado citômetro de fluxo - BD FACSCanto II (BD Biosciences) para
avaliação das células marcadas com os anticorpos monoclonais fluorescentes, segundo
metodologia descrita acima. Para aquisição dos dados, foram coletados 30000 eventos.
Inicialmente, as populações celulares de interesse foram selecionadas baseadas
no perfil de tamanho (FSC) e granulosidade (SSC) e expressão de marcadores
fenotípicos. Em seguida, os gráficos de fluorescência foram montados. A delimitação
dos quadrantes foi definida a partir do posicionamento de células marcadas com os
controles de isotipo (imunoglobulina de camundongo do mesmo isotipo dos anticorpos
utilizados nas marcações para as análises de fluorescência, conjugados com FITC, PE e
PerCP). Nestas marcações, os quadrantes foram posicionados de forma que, no mínimo,
99% das células se encontrassem no quadrante inferior esquerdo. A partir do
posicionamento das células nestes gráficos, foi realizada a determinação da freqüência
de células simples-positivas, presentes nos quadrantes superior esquerdo (UL) e inferior
69
direito (LR); a freqüência de células duplo-positivas, presentes no quadrante superior
direito (UR), e a freqüência de células negativas, posicionadas no quadrante inferior
esquerdo (LL). Definido o posicionamento dos quadrantes, a análise dos dados foi
realizada utilizando o programa Flowjo, versão 7.6.5 (Tree Star Inc, Ashland, OR,
USA).
As estratégias específicas utilizadas para selecionar as células T
CD4+CD25
highFoxp3
+, T CD4
+CD25
-Foxp3
- e monócitos CD14
+ podem ser observadas
nos gráficos de densidade mostrados na Figura 8. As células T foram marcadas e
analisadas para a produção de TGF-β1, IL-10 e IL-17, enquanto os monócitos para IL-
10.
3.5. Análise estatística
O teste do Qui-quadrado foi utilizado para detectar as diferenças entre os grupos
de crianças e as variáveis categóricas em estudo. No caso de tabelas 2 x 2 com variáveis
categóricas distribuídas de forma a se ter frequência inferior a 5 em alguma célula, foi
utilizado o teste exato de Fisher. As variáveis quantitativas foram testadas quanto a sua
normalidade utilizando o teste de Kolmogorov-Smirnov. As que seguiram distribuição
normal foram apresentadas na forma de média ± desvios-padrão (dp), enquanto que as
variáveis sem distribuição normal foram apresentadas na forma de mediana e distância
interquartílica (IQ) – mediana (IQ). Para testar se as variáveis quantitativas com
distribuição normal diferiam entre os grupos estudados foi utilizado o one-way ANOVA
e pós-teste de Tukey, enquanto que para as variáveis sem distribuição normal utilizou-se
o teste de Kruskal-Wallis e pós-teste de Dunns.
Para as análises de correlação entre as variáveis dependentes, representativas do
estado nutricional (IMC/Idade e retinol sérico), e as independentes, representativas da
infecção (anti-SLA, anti-rK39, proteína C-reativa, AGP e carga parasitária), foi
utilizado o coeficiente linear de Pearson (r), uma vez que estas variáveis apresentaram
distribuição normal.
As variáveis relacionadas ao Subestudo 2, de frequência de células e produção
de citocinas nas células T CD4+CD25
highFoxp3
+, T
CD4
+CD25
-Foxp3
- e monócitos
CD14+ não apresentaram distribuição normal e para verificar diferenças na produção de
Foxp3 e citocinas nas diferentes condições de cultura testadas foram utilizados os
70
seguintes testes: 1) Mann-Whitney para comparação entre pacientes com LV e controles
endêmicos; 2) Wilcoxon para comparar as culturas não-estimuladas e estimuladas em
um mesmo grupo. Para testar se o estado nutricional (IMC/Idade e retinol sérico)
influenciaria na produção de citocinas dentro do grupo de células estudadas, foi
realizada a correlação de Spearman (r2).
A análise estatística foi realizada utilizando o Statistical Package for Social
Sciences versão 11.5 (SPSS Inc. Chicago, IL) e o programa Graph Pad Prism versão
3.0 (Graph Pad Software, San Diego, CA). Para todos os testes realizados foram
considerados significativos os valores de p inferiores a 0,05.
71
FSC
SS
C
A
C
B FSC
SS
C
CD4-CD25-
em P1
CD4 APC-Cy7
CD
25 P
E-C
y7
FSC
SS
C
CD4+CD25High
em P1
Foxp3+ em
CD4+CD25High
TGF-β1 em
CD4+CD25HighFoxp3+
Foxp3- em
CD4-CD25-
CD14+ em
P2
IL-10 em CD14+
IL-17 em CD4-
CD25- Foxp3-
Figura 8. Gráficos representativos das estratégias de análise por citometria para as
células Treg e monócitos. A. Os gráficos de densidade representam a região de
linfócitos (P1), a frequência de células T CD4+CD25
highFoxp3
+ e a análise de citocinas
nestas células (TGF-β1 é mostrado como exemplo). B. Os gráficos de densidade
72
representam a região de linfócitos (P1), a frequência de células T CD4+CD25
-Foxp3
- e a
análise de citocinas nestas células (IL-17 é mostrada como exemplo). C. Os gráficos de
densidade representam a região de monócitos (P2) e IL-10 analisada em monócitos
CD14+. Os exemplos mostrados são de culturas de CMSP por 20h sem nenhum
estímulo de paciente com LV. Os gráficos são representativos de 26 experimentos.
73
4. RESULTADOS
4.1. Subestudo 1: Correlação entre o estado nutricional antropométrico e de
vitamina A com a resposta imune/inflamatória e a carga parasitária frente à
infecção por L. infantum.
Para este Subestudo, um total de 179 crianças foram avaliadas, sendo n = 31
com LV ativa, n = 33 com história de LV, n = 44 DTH+, n = 71 DTH-/Ac-. Conforme
Tabela 1, pode-se observar que a idade média das crianças em estudo foi de 8,7 ± 3,8
anos,. Em relação ao sexo (Tabela 1), não foi observada diferença significativa entre os
grupos estudados (Qui-quadrado, p = 0,641), sendo 46,9% das crianças do sexo
masculino e 53,1% do sexo feminino. De acordo com o cartão de vacinação das crianças
em estudo, todas receberam em média 2 doses de vitamina A em campanhas de
vacinação, sendo que nenhuma havia recebido suplementação nos dois meses que
antecederam a coleta.
Tabela 1. Distribuição dos grupos estudados de acordo com sexo e idade.
Variáveis
Total DTH-/Ac- DTH+ História de
LV
LV ativa
p valor
(n = 179) (n = 71) (n = 44) (n = 33) (n = 31)
Idade (anos)
(média ± dp) 8,7 ± 3,8 8,1 ± 3,5 10,9 ± 2,6 10,1 ± 3,3 5,6 ± 4,2 < 0,0005*
Sexo n (%)
Masculino 84 (46,9) 36 (50,7) 22 (50,0) 14 (42,4) 12 (38,7) 0,641
Feminino 95 (53,1) 36 (49,3) 22 (50) 19 (57,6) 19 (61,3)
*O pós-teste de Tukey indicou diferença significativa entre o grupo LV ativa e demais grupos.
Dados referentes a 2006-2008 foram publicados no trabalho de Maciel et al. (2008).
A Tabela 2 demonstra a distribuição dos grupos estudados de acordo com o
tamanho da enduração ao teste de Montenegro, presença de anticorpos anti-Leishmania
e carga parasitária. O tamanho de enduração ao teste cutâneo de Montenegro foi maior
nas crianças com história de LV, sendo de 11,4 ± 4,0 mm, 7,4 ± 3,4 mm nas crianças
DTH+ e 1,5 ± 1,7 mm nas crianças DTH-/Ac- (ANOVA, p < 0,0005). Em relação aos
74
anticorpos anti-Leishmania, observa-se que a maioria das crianças com LV ativa
apresentaram anticorpos anti-rK39 (87,1%) e anti-SLA (93,5%). Parte das crianças com
história de LV ainda apresentava anticorpos anti-rK39 (30,3%) e anti-SLA (12,1%).
Dentre as crianças DTH+, 4,5% e 15,9% apresentaram anti-rK39 e anti-SLA positivo,
respectivamente.
Em relação à carga parasitária, observou-se que as crianças com LV
apresentaram quantidade de Leishmania significativamente maior (ANOVA, p < 0,005)
quando comparadas aos demais grupos estudados. Entre os grupos de crianças com
história de LV, DTH+ e DTH-/Ac- não foram encontradas diferenças significativas.
A Tabela 3 demonstra os dados de hemograma e proteínas séricas das crianças
estudadas. Para estas dosagens, foram disponíveis amostras suficientes de sangue para
159 crianças, sendo 31 crianças com LV ativa, 32 com história de LV, 39 DTH+ e 57
DTH-/Ac-. Conforme esperado como sintomatologia da LV, observaram-se valores
significativamente menores de hematócrito, hemoglobina, leucócitos e plaquetas para as
crianças com LV ativa (EVANS et al., 1985; JERONIMO et al., 1994; JERONIMO et
al., 2004; PASTORINO et al., 2002), com valores de Mediana (IQ) de 23,0 (6,0), 7,3
(2,4), 3100 (1950) e 135178 ± 109477, respectivamente. Também foram observados,
nas crianças com LV ativa, valores normais de proteínas totais (8,0 ± 1,4 g/dL), menor
concentração de albumina (3,0 ± 0,7 g/dL) e maior concentração de globulina (5,0 ± 1,4
g/dL) quando comparado aos demais grupos. Estes dados também estão de acordo com
os achados de inversão da relação albumina:globulina encontrados nos pacientes com
LV (PASTORINO et al., 2002).
Para as dosagens de proteínas de fase aguda (Tabela 3), estiveram disponíveis
amostras suficientes de sangue para 145 crianças, sendo 20 LV ativa, 32 com história de
LV, 39 DTH+ e 54 DTH-/Ac-. Verificou-se que as crianças com LV ativa apresentaram
as maiores concentrações de Proteína-C reativa e AGP, com valores médios de 5,7 ± 5,9
mg/dL e 144,9 ± 43,6 mg/dL, respectivamente. Estes valores diferiram
significativamente dos demais grupos estudados (ANOVA, p < 0,0005) e estão de
acordo com o estado infeccioso das crianças com LV ativa estudas (THURNHAM et
al., 2003). Dentre as crianças sem LV estudadas, nenhuma apresetou Proteína-C reativa
e AGP acima de 5 mg/dL e 100 mg/dL, respectivamente (MACIEL et al., 2008).
75
Tabela 2. Distribuição dos grupos estudados de acordo com tamanho da enduração ao teste cutâneo de Montenegro, presença de anticorpos anti-
Leishmania e carga parasitária.
Variáveis
DTH-/Ac- DTH+ História de LV LV ativa p valor
(n = 71) (n = 44) (n = 33) (n = 31)
Enduração ao Teste de
Montenegro (mm)
Média ± dp
1,5 ± 1,7 7,4 ± 3,4 11,4 ± 4,0 ϕ < 0,0005*
Anti-rK39
Positivo n (%) 0 (0,0) 2 (4,5) 10 (30,3) 27 (87,1) < 0,0005
Negativo n (%) 71 (100,0) 42 (95,5) 23 (69,7) 4 (12,9)
Anti-SLA
Positivo n (%) 0 (0,0) 7 (15,9) 4 (12,1) 29 (93,5) < 0,0005
Negativo n (%) 71 (100,0) 37 (84,1) 29 (87,9) 2 (6,5)
Carga parasitária
(promastigotas/80ng de DNA) 0,042 ± 0,116 1,400 ± 1,253 0,167 ± 0,705 23,020 ± 17,290 0,0179
§
ϕNão realizado no grupo; *O pós-teste de Tukey indicou diferença significativa entre todos os grupos estudados; §O pós-teste de Tukey de indicou
diferença significativa entre o grupo LV ativa e demais grupos. Dados referentes a 2006-2008 foram publicados no trabalho de Maciel et al. (2008).
76
Tabela 3. Hemograma, marcadores proteicos e de inflamação para os grupos estudados.
Hemograma e proteínas Total
(n = 159)
DTH-/Ac-
(n = 57)
DTH+
(n = 39)
História de LV
(n = 32)
LV ativa
(n = 31) p valor
Hematócrito (%) - Mediana (IQ) 33,7 (7,0) 35,9 (5,0) 37,0 (4,0) 37 (4,8) 23,0 (6,0) < 0,0005*
Hemoglobina (g/dL) - Mediana (IQ) 11,8 (2,3) 12,0 (1,4) 12,5 (1,2) 12,3 (1,9) 7,3 (2,4) < 0,0005*
Leucócitos (n° absoluto) - Mediana (IQ) 7800 (4250) 8300 (4150) 9100 (4900) 7900 (2825) 3100 (1950) < 0,0005*
Plaquetas (n°) - Média ± dp 304065 ± 134825 345291 ± 101072 320815 ± 110994 362935 ± 115983 135178 ± 109477 < 0,0005*
Proteínas totais (g/dL) - Média ± dp 8,2 ± 1,4 8,1 ± 1,5 8,2 ± 1,1 8,5 ± 1,4 8,0 ± 1,4 0,494
Albumina (g/dL) - Média ± dp 4,1 ± 0,9 4,3 ± 0,8 4,4 ± 0,9 4,5 ± 0,5 3,0 ± 0,7 < 0,0005*
Globulinas (g/dL) - Média ± dp 4,1 ± 1,1 3,7 ± 1,0 3,8 ± 0,8 4,2 ± 1,3 5,0 ± 1,4 < 0,0005*
Proteína C-reativa (mg/dL) - Média ± dp§ 1,6 ± 2,7 1,0 ± 0,5 0,8 ± 0,7 0,9 ± 0,5 5,7 ± 5,9 < 0,0005*
AGP (mg/dL) - Média ± dp§ 84,4 ± 35,7 67,3 ± 19,2 78,1 ± 24,7 78,8 ± 22,3 144,9 ± 43,6 < 0,0005*
§Para as dosagens de Proteína C-reativa e AGP estiveram disponíveis amostras de n = 145 crianças, sendo 20 LV ativa, 32 com história de LV, 39 DTH+ e 54 DTH-/Ac-
(MACIEL et al., 2008). *Pós-teste de Tukey ou Dunns indicaram diferença significativa entre o grupo LV ativa e demais grupos. Dados referentes a 2006-2008 foram
publicados no trabalho de Maciel et al. (2008).
77
Em relação ao IMC/idade, observou-se que os pacientes com LV apresentaram
escores z significativamente menores quando comparados aos demais grupos estudados
(ANOVA, p < 0,0005), sendo a média no grupo das crianças com LV de -1,04 ± 1,39
escores z (Tabela 4).
Tabela 4. Distribuição dos grupos estudados segundo escore z médios para IMC/Idade.
Indicador
antropomético
(escores z)
Total DTH-/Ac- DTH+ História de
LV
LV ativa
p valor (n = 179) (n = 71) (n = 44) (n = 33) (n = 31)
Média ± dp Média ± dp Média ± dp Média ± dp Média ± dp
IMC/Idade -0,29 ± 1,07 0,05 ± 0,92 -0,36 ± 0,79 -0,29 ± 1,11 -1,04 ± 1,39 < 0,0005*
*Pós-teste de Tukey indicou diferença significativa entre o grupo LV ativa e demais grupos. Dados
referentes a 2006-2008 foram publicados no trabalho de Maciel et al. (2008).
Para a classificação do estado nutricional, foram consideradas as faixas etárias
de 0 a 5 anos, 5,1 a 10 anos e maiores de 10 anos, conforme as tabelas de referência da
OMS. A Tabela 5 demonstra a distribuição das crianças segundo as faixas etárias
consideradas. Observou-se que 20,1% das crianças estudadas encontravam-se na faixa
etária de 0 a 5 anos, 39,7% na faixa de 5,1 a 10 anos e 40,2 maiores de 10 anos. Pode-se
observar pela Tabela 5 que não foram encontradas crianças DTH+ menores que 5 anos
neste estudo. Este achado está de acordo com os estudos que observaram aumento da
resposta protetora contra a infecção por Leishmania em indivíduos mais velhos
(BADARO et al., 1990; CRESCENTE et al., 2009; REED et al., 1986).
Tabela 5. Distribuição da população estudada de acordo com a faixa etária utilizada
para a classificação do estado nutricional antropométrico segundo IMC/Idade.
Idade
(anos)
Total DTH-/Ac- DTH+ História
de LV
LV ativa p valor,
Qui-
quadrado n (%) n (%) n (%) n (%) n (%)
0 – 5 36 (20,1) 13 (18,3) 0 (0,0) 4 (12,1) 19 (61,3)
< 0,0005 5,1 – 10 71 (39,7) 40 (56,3) 16 (36,4) 11 (33,3) 4 (12,9)
> 10 72 (40,2) 18 (25,4) 28 (63,6) 18 (54,5) 8 (25,8)
TOTAL 179 (100,0) 71 (100,0) 44 (100,0) 33 (100,0) 31 (100,0)
78
Quanto ao IMC/Idade para crianças de até 5 anos (Tabela 6), observou-se que a
maioria das crianças (63,9%) apresentou risco de sobrepeso. Apesar de não ter sido
observada diferença significativa entre os grupos estudados (Qui-quadrado, p = 0,270),
apenas no grupo de crianças com LV ativa foi observado percentual de crianças com
magreza acentuada (5,3%) e magreza (15,8%).
Em relação ao IMC/Idade para os maiores de 5 anos (Tabela 7), observou-se a
maiora na faixa de eutrofia (86,0%). Apesar de não haver diferença significativa entre
os grupos estudados (Qui-quadrado, p = 0,167), também se observou que as crianças
com LV apresentavam maior percentual de indivíduos com magreza (16,7%) quando
compado aos demais grupos, que apresentaram percentuais de 1,7%, 6,8% e 6,9%, nos
grupos DTH-/AC-, DTH+ e com história de LV, respectivamente.
Tabela 6. Classificação do estado nutricional antropométrico das crianças com até 5
anos segundo o IMC/Idade.
IMC/Idade
(escores z)
Total DTH-/Ac- DTH+ História de
LV
LV ativa p valor,
Qui-
quadrado n (%) n (%) n (%) n (%) n (%)
Magreza
acentuada 1 (2,8) 0 (0,0) - 0 (0,0) 1 (5,3)
0,270
Magreza 3 (8,3) 0 (0,0) - 0 (0,0) 3 (15,8)
Eutrofia 8 (22,2) 1 (7,7) - 0 (0,0) 7 (36,8)
Risco
sobrepeso 23 (63,9) 11 (84,6) - 4 (100,0) 8 (42,1)
Sobrepeso 1 (2,8) 1 (7,7) - 0 (0,0) 0 (0,0)
Obesidade 0 (0,0) 0 (0,0) - 0 (0,0) 0 (0,0)
TOTAL 36 (100,0) 13 (100,0) 0 (100,0) 4 (100,0) 19 (100,0) Dados referentes a 2006-2008 foram publicados no trabalho de Maciel et al. (2008).
79
Tabela 7. Classificação do estado nutricional antropométrico das crianças maiores de 5
anos segundo o IMC/Idade.
IMC/Idade
(escores z)
Total DTH-/Ac- DTH+ História de
LV
LV ativa p valor,
Qui-
quadrado n (%) n (%) n (%) n (%) n (%)
Magreza
acentuada 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)
0,167
Magreza 8 (5,6) 1 (1,7) 3 (6,8) 2 (6,9) 2 (16,7)
Eutrofia 123 (86,0) 51 (87,9) 40 (90,9) 23 (79,3) 9 (75,0)
Sobrepeso 12 (8,4) 6 (10,4) 1 (2,3) 4 (13,8) 1 (8,3)
Obesidade 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)
Obesidade
grave 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)
TOTAL 143 (100,0) 58 (100,0) 44 (100,0) 29 (100,0) 12 (100,0) Dados referentes a 2006-2008 foram publicados no trabalho de Maciel et al. (2008).
Em relação ao estado de vitamina A, observou-se que as crianças com LV
apresentaram menores valores de retinol sérico quando comparadas aos demais grupos
de crianças saudáveis (Figura 9). As médias encontradas foram de 29,90 ± 11,83 µg/dL,
31,44 ± 11,26 µg/dL, 30,68 ± 9,83 µg/dL, 22,08 ± 12,18 µg/dL para os grupos DTH-
/Ac-, DTH+, história de LV e LV ativa, respectivamente (ANOVA, p =0,006).
Ao se analisar a distribuição das crianças estudadas conforme faixas de retinol
sérico (Tabela 8), observou-se, no geral, alta prevalência de crianças com retinol sérico
entre 20 e 29,9 µg/dL (36,9%). O grupo das crianças com LV ativa apresentou
significativo percentual de indivíduos com retinol sérico < 10 µg/dL (14,8%) quando
comparado aos demais grupos estudados, que não apresentaram crianças com retinol
sérico < 10 µg/dL (Qui-quadrado, p = 0,004).
80
0
10
20
30
40
LV ativa
História de LV
DTH+
DTH-/Ac-
Anova, p = 0,006
*
Re
tin
ol
sé
ric
o (
g/d
L)
Figura 9. Retinol sérico (µg/dL) da população estudada. *Pós-teste de Tukey identificou
diferença significativa entre grupo LV ativa e demais grupos estudados. Dados referentes a 2006-2008
foram publicados no trabalho de Maciel et al. (2008).
Tabela 8. Classificação do retinol sérico na população estudada.
Dados referentes a 2006-2008 foram publicados no trabalho de Maciel et al. (2008).
Uma vez que o IMC/Idade e retinol sérico mostraram-se associados com a
resposta fenotípica à infecção por L. infantum (Maciel et al. 2008), essas duas variáveis
foram utilizadas como parâmetro para testar a hipótese de que o estado nutricional está
correlacionado com a resposta imune/inflamatória à infecção e não necessariamente
com a carga parasitária. A Figura 10 demonstra as correlações entre IMC/idade e a
produção de anticorpos (A) anti-rK39, (B) anti-SLA, (C) proteína C reativa (D) AGP e
(E) carga parasitária. Houve correlação negativa significativa entre o IMC/Idade e os
anticorpos anti-rK39 (r = -0,303, p < 0,0001), anti-SLA (r = -0,143, p = 0,061) e as
concentrações de proteína C-reativa (r = -0,331, p < 0,0001) e AGP (r = -0,231, p =
0,006) (Figura 10). No entanto, pode-se perceber (Figura 10-E) que não houve
correlação entre o IMC/idade e a carga parasitária (r = 0,083, p = 0,373).
Retinol
sérico
(µg/dL)
Total DTH-/Ac- DTH+ História de
LV
LV ativa p valor,
Qui-
quadrado n (%) n (%) n (%) n (%) n (%)
< 10 4 (2,4) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 4 (14,8)
0,004 10 – 19,9 32 (19,0) 12 (17,9) 7 (16,3) 4 (12,9) 9 (33,3)
20 – 29,9 62 (36,9) 29 (43,3) 15 (34,9) 10 (32,3) 8 (29,6)
≥ 30 70 (41,7) 26 (38,8) 21 (48,8) 17 (54,8) 6 (22,2)
TOTAL 168 (100,0) 67 (100,0) 43 (100,0) 31 (100,0) 27 (100,0)
81
A Figura 11 demonstra as correlações entre o retinol sérico e os anticorpos (A)
anti-rK39, (B) anti-SLA, (C) proteína C reativa (D) AGP e (E) carga parasitária. À
semelhança do encontrado para o IMC/Idade, foi encontrada correlação negativa
significativa entre o retinol sérico e anti-rK39 (r = -0,175, p = 0,025), anti-SLA (r = -
0,167, p = 0,032) e AGP (r = -0,300, p = 0,002). No entanto, não se verificou correlação
entre o retinol sérico e proteína C-reativa (r = -0,030, p = 0,719) e também não sendo
encontrada correlação com a carga parasitária (r = -0,086, p = -0,356).
82
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
-5.0
-2.5
0.0
2.5
5.0
100 200 300
Pearson, r = 0.083, p = 0.373
Carga parasitária (promastigotas/80ng de DNA)
IMC
/id
ad
e (
es
co
res
z)
0 2 4 6 8 10
-5.0
-2.5
0.0
2.5
5.0Pearson, r = -0.331, p < 0.0001
Proteína C reativa (mg/dL)
IMC
/id
ad
e (
es
co
res
z)
C
0 1 2 3
-5.0
-2.5
0.0
2.5
5.0Pearson, r = -0.303, p < 0.0001
rK39 OD (405nm)
IMC
/Id
ad
e (
sc
ore
s z
)
0 1 2 3
-5.0
-2.5
0.0
2.5
5.0Pearson, r = -0.143, p = 0.061
SLA OD (405nm)
IMC
/Id
ad
e (
es
co
res
z)
A B
D
30 60 90 120 150 180 210
-5.0
-2.5
0.0
2.5
5.0Pearson, r = -0.231, p = 0.006
AGP (mg/dL)
IMC
/Id
ad
e (
es
co
res
z)
E
Figura 10. Correlação entre o IMC/Idade e anticorpos (A) anti-rK39, (B) anti-SLA, (C)
proteína C reativa (D) AGP e (E) carga parasitária. Análise realizada em todos os
grupos estudados (n = 179).
83
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
0
10
20
30
40
50
60
70Pearson, r = -0.167, p = 0.032
SLA OD (405nm)
Re
tin
ol
sé
ric
o (
g/d
L)
0 1 2 3
0
10
20
30
40
50
60
70Pearson, r = -0.175, p = 0.025
rK39 OD (405nm)
Re
tin
ol
sé
ric
o (
g/d
L)
30 60 90 120 150 180 210
0
10
20
30
40
50
60
70Pearson, r = -0.300, p = 0.002
AGP (mg/dL)
Re
tin
ol
sé
ric
o (
g/d
L)
0 2 4 6 8 10
0
10
20
30
40
50
60
70Pearson, r = -0.030, p = 0.719
Proteína C reativa (mg/dL)
Re
tin
ol
sé
ric
o (
g/d
L)
A B
C D
E
0.0 0.5 1.0
0
10
20
30
40
50
60
70
100 200 300
Pearson, r = -0.086, p = 0.356
Carga parasitária (promastigotas/80ng de DNA)
Re
tin
ol
sé
ric
o (
g/d
L)
Figura 11. Correlação entre o Retinol sérico e anticorpos (A) anti-rK39, (B) anti-SLA,
(C) proteína C reativa (D) AGP e (E) carga parasitária. Análise realizada em todos os
grupos estudados (n = 179).
84
4.2. Subestudo 2: Análise do efeito da vitamina A em linfócitos T CD4+
reguladores e monócitos de crianças expostas à infecção por L. infantum
Foi realizada cultura de células isoladas de crianças com LV (n = 10) e crianças
residentes em área endêmica (n = 16), sem sinais aparentes de infecção por Leishmania
(Ac-/DTH-), nas condições descritas anteriormente. A Tabela 9 demonstra as
características das crianças estudadas, quanto à idade, gênero, anticorpos anti-
Leishmania, enduração ao teste de Montenegro, IMC/Idade e média de retinol sérico. A
idade não diferiu significativamente entre os grupos de crianças estudados, sendo a
mediana de 8,4 anos. Também não foi observada diferença significativa em relação ao
gênero entre os grupos estudados, sendo 53,8% do sexo masculino. Todas as crianças
com LV apresentaram anticorpo anti-rK39 positivo. Em relação ao anticorpo anti-SLA,
80% das crianças com LV foram positivas. As crianças DTH-/Ac apresentaram a
mediana de enduração ao Teste de Montenegro de 0,0 (0,0) mm. Apesar de a mediana
de IMC/Idade ser inferior no grupo LV que nos controles endêmicos (-0,55 e 0,02,
respectivamente) não foi observada diferença estatisticamente significativa entre os
grupos (Mann-Whitney, p = 0,557). Em relação ao retinol sérico, foram observados
valores significativamente menores (Mann-Whitney, p = 0,013) nas crianças com LV
que nos controles endêmicos.
4.2.1 O ácido all-trans retinóico (ATRA) apresenta efeito distinto na
produção de citocinas em células T CD4+CD25
highFoxp3
+ em crianças com LV e
em crianças saudáveis
A Figura 12 demonstra a frequência de células T CD4+CD25
highFoxp3
+ e sua
produção das citocinas IL-10, TGF-β e IL-17 nas diferentes condições testadas: meio,
SLA, ATRA, ATRA + SLA e ConA para os DTH-/Ac- e casos de LV. As crianças com
LV apresentaram menor frequência de células T CD4+CD25
highFoxp3
+ quando
comparadas aos controles endêmicos (Mann-Whitney, p = 0.011) (Figura 12-A). No
entanto, após todos os estímulos testados, os controles endêmicos e pacientes com LV
aumentaram a frequência dessas células não sendo detectadas diferenças entre os grupos
(Figura 12-A).
Em relação à produção de citocinas por células T CD4+CD25
highFoxp3
+ nas
diferentes condições testadas, pacientes com LV apresentam resposta diferenciada
85
quando comparados aos controles endêmicos: Após estímulo com SLA, os pacientes
aumentaram significativamente a produção de IL-10, enquanto que nos controles
endêmicos isso não é observado (Figura 12-B). O ATRA aumentou significativamente a
produção de IL-10 nos controles endêmicos, o que não é observado nos pacientes com
LV (Figura 12-B). No entanto, o uso de ATRA juntamente com SLA impediu o
aumento na produção de IL-10 observado quando se estimula as células de crianças com
LV com SLA (Figura 12-B). Interessantemente, nos controles endêmicos, o uso de
ATRA + SLA estimulou a produção de IL-10. Similarmente, o ATRA induziu
significativamente a produção de TGF-β1 em células T CD4+CD25
highFoxp3
+ dos
controles endêmicos (Wilcoxon, p = 0.037), mas não em crianças com LV (Figura 12-
C).
Ainda, nas células T CD4+CD25
highFoxp3
+, o SLA estimulou significativamente
a produção de IL-17 nos DTH-/Ac- (Wilcoxon, p = 0.009), o que não foi verificado em
crianças com LV (Figura 12-D). Nessas células o ATRA utilizado sozinho ou com SLA
não produziu efeito na produção de IL-17 em pacientes e controles endêmicos (Figura
12-D).
Tabela 9. Características gerais das crianças com LV e DTH-/Ac- do Subestudo 2.
Variáveis
Total
n = 26
DTH-/Ac-
n = 16
LV ativa
n = 10 p* valor
Idade (anos)
Mediana (IQ) 8,4 (6,5) 8,8 (6,3) 7,9 (7,8) 0,815
Gênero Masculino
N (%) 14 (53,8) 11 (68,8) 3 (30,0) 0,063
Anti-rK39 positivo
N (%) 10 (38,5) 0 (0,0) 10 (100,0) < 0,0005
Anti-SLA positive
N (%) 8 (30,8) 0 (0,0) 8 (80,0) < 0,0005
Teste de Montenegro (mm) - Mediana (IQ) 0 (0,0) 0 (0,0) ϕ -
IMC/idade (escores z)
Mediana (IQ) -0,10 (1,82) 0,02 (1,65) -0,55 (1,88) 0,557
Retinol sérico (µg/dL) – Mediana (IQ) 25,23 (8,77) 25,69 (3,97) 20,34 (13,17) 0,013
Não realizado no grupo; *Para as variáveis quantitativas foi utilizado o teste Mann-Whitney, para as
variáveis categóricas o teste exato de Fisher.
86
0
10
20
30
40
50
*
**
Meio SLA ATRA SLA + ATRA ConA
*
*
**
***
% C
D4
+C
D25
hig
hF
oxp
3+
0
10
20
30
*
Pacientes com LV
**
*
*
Meio SLA ATRA SLA + ATRA ConA
*
Controles endêmicos (DTH-/Ac-)
% I
L-1
0 e
m C
D4
+C
D25
hig
hF
ox
p3
+
0
10
20
30
**
Meio SLA ATRA SLA + ATRA ConA
% I
L-1
7 em
CD
4+C
D25
hig
hF
oxp
3+
0
10
20
30
40
*
Meio SLA ATRA SLA + ATRA ConA
*
*
*
% T
GF
- 1
em
CD
4+C
D25
hig
hF
oxp
3+
A B
C D
Figura 12. (A) Frequência de células T CD4+CD25
highFoxp3
+ e sua produção de (A) IL-10, (B) TGF-β1 e (C) IL-17 após as diferentes condições
testadas. Os gráficos são referentes à n = 16 controles endêmicos e n = 10 pacientes com LV ativa. Barras representam mediana e distância
interquartílica.* p < 0,05; ** p < 0,01.
87
4.2.2 O ácido all-trans retinóico (ATRA) e diminuiu a produção de IL-17 em
células T CD4+CD25
-Foxp3
- de crianças com LV
A Figura 13 demonstra a frequência de células T CD4+CD25
-Foxp3
- e sua
produção das citocinas IL-10, TGF-β e IL-17 nas diferentes condições testadas: meio,
SLA, ATRA, ATRA + SLA e ConA para os DTH-/Ac- e casos de LV. Pode-se observar
que não houve diferença na frequência dessas células entre os grupos e condições
estudadas (Figura 13-A). No entanto, observou-se que as células T CD4+CD25
-Foxp3
-
de pacientes com LV responderam ao SLA com produção aumentada de IL-10
(Wilcoxon, p = 0,0313), o que não é observado em controles endêmicos (Figura 13-B).
Semelhante ao encontrado para as células T CD4+CD25
highFoxp3
+, após o estímulo com
ATRA, observou-se aumento significativo na produção de IL-10 pelas células T
CD4+CD25
-Foxp3
- apenas nos controles endêmicos, quer com ou sem a presença de
SLA (Figura 13-B). Nos casos de LV, assim como para as células T
CD4+CD25
highFoxp3
+, o ATRA juntamente com SLA impediu o aumento na produção
de IL-10 observado quando se estimula as células de crianças com LV somente com
SLA (Figura 13-B).
Em relação à produção de TGF-β1 (Figura 13-C), as células T CD4+CD25
-
Foxp3-
não responderam aos estímulos utilizados com maior ou menor produção. No
entanto, observou-se que os pacientes com LV apresentaram significativamente menor
produção de TGF-β1 neste tipo celular quando comparados aos controles endêmicos.
Através da análise da Figura 13-D observa-se que as células T CD4+CD25
-
Foxp3- de controles endêmicos aumentaram, significativamente, a produção de IL-17
(Wilcoxon, p = 0.013) após estímulo com SLA, enquanto que em pacientes com LV
esse efeito não é observado. Ainda, pode-se observar (Figura 13-D) que o ATRA
reduziu a produção de IL-17 em crianças com LV (Wilcoxon, p = 0.039). Não se
observou efeito do uso de ATRA + SLA nas células T CD4+CD25
-Foxp3
- de controles e
pacientes em relação à produção de IL-17 (Figura 13-D).
88
4.2.3 O ácido all-trans retinóico (ATRA) impediu o aumento de IL-10 frente
ao estímulo com SLA em monócitos de crianças com LV
A Figura 14 demonstra a frequência de monócitos CD14+
e sua produção de IL-
10 nas diferentes condições testadas para os indivíduos DTH-/Ac- e para os casos de
LV. Em relação à frequência de monócitos, observa-se pela Figura 14-A que não houve
diferença significativa quando se comparam as diferentes condições estudadas dentro de
um mesmo grupo, exceto para ConA nos controles endêmicos, onde se observou menor
frequência de monócitos CD14+
(Wilcoxon, p = 0,004). No entanto, ao comparar os
controles com as crianças com LV, foram verificadas frequências significativamente
menores de monócitos CD14+
nas crianças com LV em todas as condições testadas,
exceto ConA.
Também foi avaliada a produção de IL-10 nos monócitos CD14+ (Figura 14-B).
Os pacientes com LV produziram quantidades significativamente maiores de IL-10
nessas células após o estímulo com SLA quando comparados ao meio (Wilcoxon, p =
0.023) e aos controles endêmicos (Mann-Whitney, p = 0.002). Similarmente, assim
como nas demais células estudadas, o ATRA aumentou significativamente a produção
de IL-10 em monócitos de controles endêmicos, mas não em crianças com LV.
Novamente, o uso de ATRA + SLA nas crianças com LV impediu o aumento de IL-10
observado após o estímulo com SLA (Figura 14-B). No entanto, nos controles
endêmicos, o uso de ATRA + SLA estimulou a produção de IL-10.
É importante observar que em todos os experimentos de cultura de células
citados acima, a ConA foi utilizada como um controle positivo da estimulação e
proliferação de CMSP (LIJNEN; SAAVEDRA; PETROV, 1997). Fazendo uma análise
das Figuras 12 a 14 pode-se perceber que as frequências de células e a produção de
citocinas frente aos estímulos demonstrados podem ser consideradas específicas aos
estímulos utilizados.
89
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
**
*
**
Controles endêmicos (DTH-/Ac-)
Pacientes com LV
Meio SLA ATRA SLA + ATRA ConA
*
% I
L-1
0 em
CD
4+ C
D25
- Fo
xp3-
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
**
Meio SLA ATRA SLA + ATRA ConA
**
**
*
%TG
F-
1 em
CD
4+ C
D25
- Fo
xp3-
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
**
Meio SLA ATRA SLA + ATRA ConA
*
% I
L-1
7 em
CD
4+ C
D25
- Fo
xp3-
A B
C
0
20
40
60
80
100
Medium SLA ATRA SLA + ATRA ConA
CD
4+C
D25
-Fo
xp3-
D
Figura 13. (A) Frequência de células T CD4+CD25
-Foxp3
- e sua produção de (B) IL-10, (C) TGF-β1 e (D) IL-17 após as diferentes condições
testadas. Os gráficos são referentes à n = 16 controles endêmicos e n = 10 pacientes com LV ativa. Barras representam mediana e distância
interquartílica.* p < 0,05; ** p < 0,01.
90
0
5
10
15
*
*
*
*
*
Meio SLA ATRA SLA + ATRA ConA
**
% I
L-1
0 e
m C
D1
4+
0
20
40
60
80
100
Medium SLA ATRA SLA + ATRA ConA
Controles endêmicos (DTH-/Ac-)
Pacientes com LV
**
** * ***
% M
on
ócit
os
CD
14
+
A
B
Figura 14. (A) Frequência de monócitos CD14+
e sua produção de (B) IL-10. Os
gráficos são referentes à n = 16 controles endêmicos e n = 10 pacientes com LV ativa.
Barras representam mediana e distância interquartílica.* p < 0,05; ** p < 0,01.
91
4.3. Correlação do estado nutricional com a produção de citocinas em células T
CD4+ reguladoras e monócitos após estímulo com SLA
Uma vez que o IMC/Idade e retinol sérico mostraram-se associados com a
resposta fenotípica, com a produção de anticorpos anti-Leishmania e com a resposta
inflamatória à infecção por L. infantum, essas duas variáveis foram utilizadas como
parâmetro para testar se o estado nutricional está correlacionado com a produção de
citocinas frente ao estímulo com SLA nas células T CD4+ e monócitos estudados nos
experimentos demonstrados nas Figuras 12, 13 e 14.
Conforme pode ser observado na Figura 15, foi observada correlação positiva
significativa entre o IMC/Idade e a produção de IL-17 nas células T
CD4+CD25
highFoxp3
+ (r = 0,485, p = 0,019). Para as demais citocinas e tipos celulares
não foi encontrada correlação significativa, conforme pode ser observado na Tabela 10.
-2.5 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
0
15
30
45
Sperman, r2 = 0,485
p = 0,019
IMC/idade (escores z)
% IL
-17 e
m C
D4
+C
D25
hig
hF
oxp
3+
Figura 15. Correlação positiva entre o IMC/Idade e a produção de IL-17 em células T
CD4+CD25
highFoxp3
+ após estímulo com SLA. Análise realizada em n = 16 controles
endêmicos e n = 10 pacientes com LV ativa.
92
Tabela 10. Correlação entre o IMC/Idade e a produção de citocinas após estímulo com
SLA nas células T CD4+CD25
highFoxp3
+, T CD4
+CD25
-Foxp3
- e monócitos CD14
+.
IMC/Idade
Citocinas/Tipo celular
Coeficiente de Spearman
(r2)
p valor
IL-10 em céls. T CD4+CD25
highFoxp3
+ 0,161 0,462
TGF-β em céls. T CD4+CD25
highFoxp3
+ 0,397 0,161
IL-10 em céls. T CD4+CD25
-Foxp3
- 0,057 0,797
TGF-β em céls. T CD4+CD25
-Foxp3
- -0,111 0,615
IL-17 em céls. T CD4+CD25
-Foxp3
- 0,118 0,582
IL-10 em monócitos CD14+ -0,174 0,506
Em relação ao retinol sérico, foi encontrada correlação negativa significativa
entre o retinol sérico e a produção de IL-10 em células T CD4+CD25
highFoxp3
+ após
estímulo com SLA (Spearman, r = -0.434, p = 0.0386), conforme mostrado na Figura
16-A. Na Figura 16-B observa-se que também foi encontrada correlação negativa
significativa entre o retinol sérico e a produção de TGF-β1 em células T
CD4+CD25
highFoxp3
+ (Spearman, r = -0.507, p = 0.0190). Não foram encontradas
correlações entre o retinol sérico para IL-17 em células T CD4+CD25
highFoxp3
+ e
citocinas nas demais células estudadas, conforme Tabela 11.
93
0 10 20 30 40 50
0
10
20
30
40
Sperman, r 2 = -0,434
p = 0,039
Retinol sérico ( g/dL)
% IL
-10 e
m C
D4
+C
D25
hig
hF
oxp
3+
0 10 20 30 40 50
0
10
20
30
40
50
Sperman, r 2 = -0,507
p = 0,019
Retinol sérico ( g/dL)
% T
GF
-beta
1 e
m C
D4
+C
D25
hig
hF
oxp
3+
A
B
Figura 16. Correlação negativa entre retinol sérico e produção de (A) IL-10 e (B) TGF-
β1 em células T CD4+CD25
highFoxp3
+ após estímulo com SLA. Análise realizada em n
= 16 controles endêmicos e n = 10 pacientes com LV ativa.
94
Tabela 11. Correlação entre o Retinol sérico e a produção de citocinas após estímulo
com SLA nas células T CD4+CD25
highFoxp3
+, T CD4
+CD25
-Foxp3
- e monócitos
CD14+.
Retinol sérico
Citocinas/Tipo celular
Coeficiente de Spearman
(r2)
p valor
IL-17 em céls. T CD4+CD25
highFoxp3
+ -0,089 0,693
IL-10 em céls. T CD4+CD25
-Foxp3
- 0,255 0,253
TGF-β em céls. T CD4+CD25
-Foxp3
- -0,291 0,189
IL-17 em céls. T CD4+CD25
-Foxp3
- 0,186 0,406
IL-10 em monócitos CD14+ 0,311 0,300
95
5. DISCUSSÃO
Conforme discutido por Nascimento et al. (2011) o novo padrão epidemiológico
da LV no Rio Grande do Norte tem sido caracterizado por maior incidência da doença
nos grandes municípios do estado, Natal e Mossoró, caracterizando o processo de
periurbanização da doença. Aliado a essa observação, verificou-se o aumento na
incidência de casos de LV em adultos, especialmente associado com a infecção por
HIV. No entanto, a população mais susceptível à LV no Brasil ainda é considerada a de
crianças, com idade inferior a 5 anos (JERONIMO et al., 2000; JERONIMO et al.,
2004; SILVA et al., 2001).
Na realidade, o padrão de urbanização da LV acompanhou a transição
demográfica vivenciada pelo país. Na década de 50, 66% da população vivia em meio
rural. Em 2000, 80% da população vivia em centros urbanos (BATISTA; RISSIN,
2003). Então, assim como o perfil da LV, o estado nutricional da população brasileira
também se modificou. Batista-Filho e Rissin (2003) comprovaram este fato através da
análise de três estudos brasileiros: O Estudo Nacional de Despesas Familiares –
ENDEF, realizado em 1974/75; a Pesquisa Nacional de Saúde e Nutrição – PNSN, de
1989 e a Pesquisa Nacional de Demografia e Saúde – PNDS, realizada em 1995/96. No
ENDEF, a desnutrição, medida através do baixo Peso/Idade em menores de 5 anos foi
prevalente em 20,1% das crianças. Na PNDS, em apenas 5,6% (BATISTA; RISSIN,
2003).
Pesquisa realizada em 2005 pelo Ministério do Desenvolvimento Social e
Combate à Fome em crianças menores de 5 anos no semi-árido do Nordeste também
verificou redução da desnutrição, ao se comparar com as prevalências dos estudos
anteriores descritos acima. No Rio Grande do Norte o baixo Peso/Idade foi prevalente
em 2,3% das crianças, o baixo Peso/Altura em 1,6% das crianças e a baixa Altura/Idade
em 5,5% (BRASIL, 2005).
Dados mais recentes da Pesquisa de Orçamentos Familiares realizada em
2008/2009 pelo Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística – IBGE também
confirmam a transição nutricional. Para crianças maiores de 5 anos de idade a
prevalência de déficit no IMC/Idade foi de 4,1%. Já o excesso de peso foi diagnosticado
96
em cerca de 1/3 das crianças avaliadas, excedendo em mais de oito vezes a frequência
de déficit de peso. Ainda na POF, para menores de 5 anos estão disponíveis as
prevalências de baixa Altura/Idade, que foram de 6,3% em meninos e 5,7% em
meninas. Para crianças entre 5 e 9 anos de idade, o percentual de baixa Altura/Idade foi
de 6,8% (IBGE, 2010a).
Apesar da transição nutricional brasileira, com consequente redução nas
prevalências de déficits nutricionais em geral, na população endêmica para LV em
estudo, as prevalências de baixa Altura/Idade, de 10%, baixo Peso/Idade de 6%, e baixo
IMC/Idade (8,4%) (MACIEL et al., 2008), são superiores às demonstradas no estudos
brasileiros descritos acima, indicando que a desnutrição ainda é prevalente nesta
população.
Ao contrário dos dados encontrados em nossa população, onde se encontrou
prevalência de 10% de baixa Estatura/Idade (MACIEL et al., 2008), estudos anteriores,
realizados na década de 80 e 90 por Badaró et al. (1986), Cerf et al. (1987), Evans et al.
(1992) observaram maior prevalência de compromentimento na Estatura/Idade, que
representa o efeito cumulativo do estresse nutricional sobre o crescimento esquelético,
sendo um indicativo da presença de desnutrição crônica ou pregressa. Cerf et al. (1987)
por exemplo, verificaram 82% de baixa estatura para idade nas crianças com LV
estudadas, e 55% nas crianças saudáveis estudadas.
A menor prevalência de Estatura/Idade comprometida encontrada em nossa
população também pode ser atribuída à transição nutricional vivenciada pelo país, que
diminuiu de forma geral a prevalência do nanismo (BATISTA; RISSIN, 2003). Ainda,
houve melhora nos serviços de saúde locais, com a implantação do Programa Saúde da
Família, o que contribui para maior agilidade no diagnóstico e encaminhamento de
crianças para tratamento, diminuindo assim o comprometimento do crescimento linear
gerado pela infecção prolongada.
É interessante observar que ao se avaliar no presente estudo todas as
classificações para o IMC/Idade, considerando-se tanto a magreza quanto o
sobrepeso/obesidade – o que não foi realizado em nosso estudo anterior (MACIEL et
al., 2008), observou-se que a prevalência de risco de sobrepeso foi consideravelmente
maior que a de magreza em crianças menores de 5 anos, de 63,9% vs 8,3%,
respectivamente (Tabela 6). Para os maiores de 5 anos, a mesma tendência foi
97
observada para sobrepeso e magreza, com percentuais de 8,4% e 5,6% respectivamente
(Tabela 7). Os dados apontam, portanto, para a existência de um quadro misto de
desequilíbrio do estado nutricional na população endêmica para LV estudada, onde há
tanto alta prevalência de risco de sobrepeso e sobrepeso quanto considerável percentual
de magreza. O dado é, em termos de saúde pública, extremamente preocupante, uma
vez que a população em questão pode apresentar risco elevado não somente para o
desenvolvimento de doenças infecciosas, mas também de doenças crônicas não-
transmissíveis, o que, conforme discutido por Sawaya et al. (2004), sobrecarrega
sobremaneira os serviços de saúde.
É importante citar que ainda não se conhece o impacto do sobrepeso e obesidade
na resposta imune frente à infecção por Leishmania, tão pouco o efeito da transição
nutricional obsevada em nossa população, em termos de pressões evolutivas, sobre o
patógeno. É bem sabido que o tecido gorduroso branco, em especial o visceral, que
facilmente se comunica com o sistema portal, produz uma série de moléculas
inflamatórias, conhecidas como adipocinas, como a leptina, a adiponectina, IL-6 e TNF-
α, que apresentam efeito local e sistêmico. Ainda, o tecido gorduroso branco é também
composto por macrófagos, aos quais se atribui parte da produção das adipocinas e a
manutenção do perfil inflamatório encontrado durante a obesidade (FANTUZZI, 2005;
RAUCCI et al., 2013). Assim, resta-se compreender qual o papel dos adipócitos e
macrófagos deste tecido durante a exposição à Leishmania e como esta interação poderá
modificar a resposta imune do hospedeiro, o patógeno e, como possível consequência, o
tratamento e perfil epidemiplógico da infecção por Leishmania no país.
Além do impacto no estado nutricional antropométrico, a deficiência de vitamina
A é uma característica da LV já demonstrada pelo nosso grupo (MACIEL et al., 2008) e
outros (BERN et al., 2007; LUZ; SUCCI; TORRES, 2001), revisitada nos dados aqui
apresentados (Figura 9 e Tabela 9). Como demonstrado anteriormente em nosso estudo,
pelo uso do teste de dose resposta relativo modificado (MRDR), a deficiência de
vitamina A encontrada não pode ser atribuída exclusivamente à resposta inflamatória
frente à infecção por Leishmania (MACIEL et al., 2008).
Em países em desenvolvimento, estima-se que baixas concentrações plasmáticas
de retinol, < 20µg/dL (0,7µmol/L), também chamada de deficiência marginal ou
subclínica de retinol, variem de 11 a 40% em crianças menores de 5 anos
98
(GRAEBNER; SAITO; DE SOUZA, 2007). Segundo a OMS, a prevalência de maior
que 10% de retinol sérico inferior a 20µg/dL caracteriza a hipovitaminose A como um
problema de saúde pública na população estudada (WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 1996).
No Brasil, estudos demonstraram a deficiência de vitamina A variando de 21 a
49% de crianças pré-escolares, sendo, portanto o país classificado com alto índice de
deficiência subclínica da vitamina (FERRAZ et al., 2004; GRAEBNER; SAITO; DE
SOUZA, 2007; MARTINS; SANTOS; ASSIS, 2004; PAIVA et al., 2006; SANTOS et
al., 1996). Neste estudo, foi encontrada prevalência de 21,4% de deficiência marginal
de vitamina A, o que também caracteriza na população estudada a hipovitaminose A
como um problema de saúde pública (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 1996).
Ainda, a baixa média encontrada de doses de vitamina A recebidas em campanhas de
vacinação nas crianças estudadas (2 doses) indica que as campanhas de suplementação
de vitamina A precisam ser melhoradas nas áreas em estudo.
É interessante aqui ressaltar que, conforme descrito por Batista-Filho et al.
(2003), a transição nutricional brasileira ocorre com aumento da obesidade, mas
também com aumento da anemia por deficiência de ferro, levando um paradoxo
epidemiológico (BATISTA et al., 2008). Infelizmente, ainda não existem dados
consistentes que justifiquem a associação encontrada. No entanto, a possibilidade mais
plausível seria o consumo de uma alimentação rica em calorias, com alto percentual de
carboidratos simples, pouco variada e (portanto) pobre em micronutrientes essenciais,
conforme demonstrado em alguns estudos brasileiros (BEZERRA et al., 2013;
BEZERRA; SICHIERI, 2009; DA VEIGA et al., 2013; IBGE, 2010b LIMA et al.,
2013; MALTA et al., 2010). Nossos dados de alta prevalência subclínica de deficiência
de vitamina A em uma população com significativa prevalência de risco de sobrepeso e
sobrepeso somam-se aos achados de anemia, corroborando o paradoxo epidemiológico
observado no Brasil.
Um ponto importante a ser discutido quanto aos dados de estado nutricional aqui
apresentados é o fato de 83% destes terem sidos coletados entre 2006-2008. Cabe
salientar que são poucos os grandes estudos de referência do estado nutricional de
crianças ou adolescentes realizados no Brasil, sendo escassos dados mais atuais
representativos. Além disso, nossos dados mais recentes, referentes aos coletados para o
99
Subestudo 2, demonstram que o estado nutricional comprometido ainda é uma
característica da LV, comprovado pelo baixo retinol sérico (Tabela 9), e ainda que, tanto
o IMC/idade quanto o retinol sérico estão correlacionados com a produção de citocinas
importantes para a resolução da infecção por Leishmania, conforme demonstrado nas
Figuras 15 e 16, respectivamente. Não obstante, mais importante que a temporalidade e
os determinantes macro a ela associados, que podem influenciar o estado nutricional, o
estudo aqui apresentado demonstra como, em bases moleculares, o estado nutricional se
correlaciona com a resposta imune, a resposta inflamatória e a carga parasitária frente à
infecção por Leishmania.
Nos dados aqui apresentados, foi demonstrado que o estado nutricional, medido
tanto pelo IMC/Idade (Figura 10) quanto pelo retinol sérico (Figura 11) está
negativamente correlacionado com a produção dos anticorpos anti-Leishmania, anti-
SLA e anti-rK39, e as proteínas de fase aguda, proteína C-reativa e AGP, indicando que
quanto maior a produção dos anticorpos e proteínas de fase aguda, pior o estado
nutricional. Estes dados estão de acordo com os estudos que comprovam que a infecção
compromete significativamente o estado nutricional (BLOSSNER; DE ONIS, 2013;
GUERRANT et al., 2008; GUERRANT et al., 2013; SCRIMSHAW; TAYLOR ;
GORDON, 1968).
Foi interessante observar que a carga parasitária não esteve correlacionada com
o estado nutricional. Poderia ser levantada a hipótese de que isto foi observado uma vez
que a carga parasitária foi medida em sangue periférico e não nos locais onde há maior
presença do parasita, como medula, fígado e baço. No entanto, verificou-se que, mesmo
no sangue periférico, a carga parasitária foi significativamente maior em casos de LV
que em controles (Tabela 2). Assim, o dado de ausência de correlação entre a carga
parasitária e estado nutricional corrobora a hipótese de que a resposta imune e
inflamatória do hospedeiro frente à infecção por Leishmania e não a presença do
parasita em si é determinante para a depleção do estado nutricional observada em
pacientes com LV. Claramente, fatores imunogenétios estão associados com esta
resposta à infecção por Leishmania, o que já foi comprovado por diversos estudos
(FAKIOLA et al., 2013; JAMIESON et al., 2007; JERONIMO et al., 2007). No
entanto, o conhecimento dessas vias de regulação genéticas da resposta imune ainda não
foram suficientes para o estabelecimento de ações efetivas que promovam a resolução
da infecção de maneira assintomática e eficiente.
100
Um questionamento importante a ser realizado, que não é possível determinar
pelo tipo de estudo aqui apresentado, é se o comprometimento do IMC/idade e retinol
sérico observados antecederam a infecção por Leishmania e o desenvolvimento de LV
ou se estas características são consequência da doença per si. Conforme anteriormente
discutido (MACIEL et al., 2008), esta questão só poderia ser respondida por meio de
estudo de coorte em indivíduos expostos à infecção por L. infantum. Infelizmente, os
casos de LV no Rio Grande do Norte estão distribuídos por ampla região geográfica, o
que torna inviável, nas atuais condições de infraestrutura para pesquisa no estado, o
acompanhamento de todos os focos endêmicos. Somando-se a isso, o número de casos
de LV por ano não é alto, o que levaria à necessidade de tamanho amostral grande, de
difícil acompanhamento.
Todavia, os estudos que demonstraram a desnutrição como fator de risco para o
desenvolvimento de LV (BADARO et al., 1986; CERF et al., 1987; EVANS et al.,
1992) e os dados na literatura que mostram desnutrição em casos de LV ativa (EVANS
et al., 1985; EVANS et al., 1992; GOMES et al., 2007; HARRISON et al., 1986;
MACIEL et al., 2008), em especial relacionada à gravidade da doença (REY et al.,
2005), somados aos resultados de correlação mostrados no presente estudo levam a
inferir que as duas hipóteses são perfeitamente aplicáveis para a LV: tanto a desnutrição
aumenta o risco de desenvolvimento da doença, quanto a LV agrava a desnutrição,
corroborando com o clássico ciclo vicioso apresentado por Scrimshaw, Taylor e Gordon
(1968).
É bem documentado que os nutrientes podem influenciar a resposta immune
(KAU et al., 2011; MAGGINI et al., 2007) e que a resposte imune pode agir
sinergicamente com o tratamento (DOENHOFF et al., 1991). Assim, a eficácia das
drogas pode ser melhorada se elas forem utilizadas com imunoestimulantes
(ADINOLFI et al., 1985; HAIDARIS; BONVENTRE, 1983). Modelos experimentais
em LV mostraram que antagonizar o efeito de IL-10 aumenta o poder leishmanicida do
antimônio pentavalente (MURRAY et al., 2005b; MURRAY et al., 2003). Apesar
disso, poucos estudos procuraram utilizar nutrientes como imunomoduladores em LV,
apesar de ser documentado que a desnutrição aumenta o risco de desenvolvimento de
LV com elevada morbidade e mortalidade (BADARO et al., 1986; CERF et al., 1987;
REY et al., 2005).
101
Neste estudo, foi observado efeito distinto da vitamina A em células Treg e
monócitos, a depender dos grupos estudados: Em crianças saudáveis, observou-se
indução de resposta regulatória, com aumento da produção de IL-10; em crianças com
LV, observou-se que o ácido all-trans retinóico (ATRA) impediu o aumento de IL-10
após o estímulo com antígenos de Leishmania (Figuras 12, 13 e 14). Além disso, foi
demonstrada a correlação entre o estado nutricional, medido antropométricamente e por
meio do retinol sérico, com citocinas importantes para a resposta frente à infecção por
Leishmania (Figuras 15 e 16).
Observou-se que as células T CD4+CD25
highFoxp3
+, CD4
+CD25
-Foxp3
- e
monócitos de crianças com LV não se mostraram responsivas com aumento de citocinas
após o estímulo com ATRA. Contudo, em pacientes com LV o SLA induziu a produção
de IL-10 em células T CD4+CD25
highFoxp3
+ (Figura 12-B), células T CD4
+CD25
-
Foxp3- (Figura 13-B) e monócitos (Figura 14-B), enquanto que nas crianças DTH-/Ac-
esse efeito não foi observado. Esses resultados reforçam os encontrados por Rai et al.
(2012), Nylén et al. (2007) e Miles et al. (2005), que encontraram em LV alta produção
de IL-10 em nTreg, Tr1 e monócitos, respectivamente.
Curiosamente, ao estimular as CMSP com ATRA + SLA não se observa efeito
significativo nas células de pacientes com LV (Figuras 12, 13 e 14). Isso pode indicar
um possível efeito benéfico do ATRA. Contrariamente, em controles endêmicos o uso
de ATRA aumentou a produção de IL-10 e TGF-β1 em células T CD4+CD25
highFoxp3
+
(Figuras 12-B e 12-C) e IL-10 em células T CD4+CD25
-Foxp3
- (Figura 13-B) e
monócitos (Figura 14-B). Além disso, o uso de ATRA + SLA nos controles endêmicos
também aumentou a produção de IL-10 e TGF-β1 em células T CD4+CD25
-Foxp3
-
(Figuras 13-B e 13-C) e IL-10 em monócitos (Figura 14-B). Estes resultados nas
crianças saudáveis podem indicar o potencial de indução de resposta regulatória da
vitamina A em condições homeostáticas, após uma infecção. Estudos recentes têm
demonstrado esse papel regulador da vitamina A, testando-a com sucesso em modelos
de doenças auto-imunes, onde uma redução por meio de células Treg das respostas Th1
e Th17 se faz necessária (DI et al., 2013; MA et al., 2013).
No entanto, o papel das Treg nas leishmanioses permanece controverso. Apesar
da habilidade dessas células em suprimir uma resposta imune exacerbada ao parasita, a
maioria dos estudos tem mostrado que as Treg parecem promover uma resposta
102
reguladora aumentada, permitindo a sobrevivência, replicação e persistência do parasita
(CARRIER et al., 2007; ID-PERALTA et al., 2011; NYLEN; GAUTAM, 2010;
SAKAGUCHI et al., 2010). Os resultados aqui apresentados demonstram que as células
Treg e monócitos de crianças com LV apresentam resposta diferenciada aos estímulos
com SLA e ATRA quando comparadas aos controles endêmicos. Esses resultados
indicam que há, possivelmente, falha na função das células aqui estudadas durante a
LV. A hipótese de falha na função de células Treg foi recentemente testada por Costa et
al. (2013) durante a infecção por L. braziliensis. Surpreendentemente, o grupo concluiu
que, durante a leishmaniose mucosa, o excesso de ativação das Treg reduz a eliminação
do parasita. No entanto, como já colocado, os dados em LV ainda não são conclusivos
(NYLÉN et al., 2007; RAI et al. 2012).
Uma possibilidade para explicar a ausência de resposta após o estímulo com
ATRA nas células das crianças com LV neste estudo é que durante a LV pode haver
exaustão celular, o que já foi demonstrada para células T CD8+ (GAUTAM et al., 2013;
JOSHI et al., 2009). No entanto, frente ao SLA, as células estudadas apresentam
resposta de aumento de produção de IL-10, o que talvez sinalize a necessidade de mais
estudos para comprender se mecanismos inibitórios impedem a ativação das células
estudadas. Ainda, no presente estudo, foi encontrada baixa frequência de células T
CD4+CD25
highFoxp3
+ em CMSP (Figura 12-A), o que corrobora os dados encontrados
por Nylén et al. (2007). Depois de todos os estímulos testados, houve aumento na
frequência das células T CD4+CD25
highFoxp3
+ (Figura 12-A). Este resultado pode
indicar que não existe falha na expansão de células T CD4+CD25
highFoxp3
+ durante a
LV, mas possivelmente homing diferenciado dessas células para órgãos alvo da
infecção. Nylén et al. (2007) não observaram aumento dessas células no baço, no
entanto, Rai et al. (2012) observaram aumento dessas células na medula.
Surpreendentemente, este estudo observou menor produção de TGF-β1 por
células T CD4+CD25
-Foxp3
- em crianças com LV que nos controles endêmicos (Figura
13-C). Esse resultado pode ser explicado pela população de células avaliada: Apesar de
ser sabido que o TGF-β está aumentado na LV humana (GANTT et al., 2003), poucos
estudos procuraram identificar a(s) fonte(s) produtora(s) dessa citocina.
Neste estudo também foi analisada a produção de IL-17 em células Treg, uma
vez que foi demonstrado que estas células exibem plasticidade e podem produzir IL-17
103
na presença de IL-6 (WEAVER; HATTON, 2009; XU et al., 2007). Interessantemente,
os controles endêmicos apresentaram após o estímulo com SLA pronunciada produção
de IL-17 nas células T CD4+CD25
highFoxp3
+ e CD4
+CD25
-Foxp3
-, enquanto que nas
crianças com LV esse efeito não foi observado (Figuras 10-D e 11-D). Este dado
corrobora os resultados de Pitta et al. (2009) que encontraram em CMSP de indivíduos
saudáveis aumento na produção de IL-17 após estímulo com L. donovani, o que sugere
que esta citocina pode ser protetora na resposta contra a infecção por Leishmania.
Nossos resultados de redução na produção de IL-17 em células CD4+CD25
-
Foxp3- de crianças com LV e expansão de células T CD4
+CD25
highFoxp3
+ induzidos
por ATRA estão de acordo com dados na literatura que têm demonstrado que o ATRA
estimula a conversão de células T em Treg e reduz a conversão de Th17 (ELIAS et al.,
2008; MUCIDA et al., 2007; NOLTING et al., 2009; WEAVER; HATTON, 2009;
XIAO et al., 2008; ZIEGLER; BUCKNER, 2009).
Cabe ainda ressaltar que o efeito do ATRA em células parece ser dose-
dependente. Dawson et al. (2006) observaram que doses de 1, 10 e 100 nM em CMSP
apresentaram efeito significativamente maior no aumento da produção de IL-5, IL-4 e
redução da produção de IFN-γ, medida por meio de ELISA do sobrenadante da cultura.
Elias et al. (2008), em estudo utilizando citometria de fluxo, com células T esplênicas e
de linfonodos de camundongos, observaram que doses crescentes de ATRA, de 1 nM,
100 nM e 10 µM, diminuiram progressivamente a produção de IL-17 e doses de 10 pM,
10 nM e 10 µM aumentaram progressimente a expressão de Foxp3. Um ponto frágil na
análise destes estudos é que experimentos visando observar viabilidade ou morte celular
após a cultura com ATRA não foram demonstrados. No entanto, os dados indicam que,
possivelmente, o efeito do ATRA é linear, uma vez que não foi observada inversão em
sua ação com aumento das doses utilizadas em cultura.
Outra questão importante é que ainda são escassos na literatura dados que
permitam extrapolar as concentrações utilizadas em cultura para doses de
suplementação de vitamina A. Também, ainda não se sabe o efeito em termos
quantitativos dos suplementos de vitamina A recomendados pela OMS nas
concentrações séricas e intracelulares de ATRA, o que torna difícil a aplicação dos
estudos in vitro realizados com vitamina A.
104
No presente estudo, a produção de IFN-γ não foi avaliada uma vez que os dados
na literatura já demonstraram que as CMSP de pacientes com LV não possuem a
habilidade de produzir essa citocina frente ao estímulo com antígenos de Leishmania
(BACELLAR et al., 1996; CALDAS et al., 2005; CARVALHO et al., 1985), apesar de
ter sido encontrada elevada produção de IFN-γ em sangue total de pacientes com LV
(KARP et al., 1993; SINGH et al., 2012). Além disso, sabe-se que o ATRA inibe a
expressão do IFN-γ possivelmente por agir diretamente em seu promotor (CIPPITELLI
et al., 1996; DAWSON et al., 2006).
Como já colocado, são poucos os estudos na literatura que enfocaram o papel de
nutrientes na infecção por Leishmania. Garg et al. (2004) em modelo de hamsters
infectados com L. donovani observaram que suplementos de vitamina A utilizados antes
ou após a infeção promoveram a carga parasitária esplênica. Reciprocamente, nosso
estudo demonstrou que o ATRA aumentou IL-10 e TGF-β1 em células Treg e IL-10 em
monócitos isolados de crianças sadias. No entanto, em crianças com LV o ATRA
utilizado juntamente com antígenos de Leishmania impediu o aumento na produção de
IL-10 após o estímulo com SLA, o que pode indicar efeito modulador do ATRA durante
a doença em humanos.
Infelizmente, ainda não existem mecanismos propostos que possam explicar os
achados encontrados para vitamina A deste estudo. Porém, cabe ressaltar que este é,
possivelmente, o primeiro trabalho que demonstra, em LV humana, a ação da vitamina
A em células importantes para LV e a correlação do estado nutricional (avaliado por
meio do IMC/Idade e retinol sérico) com citocinas importantes para o desfecho da
infecção por Leishmania, como a IL-10, o TGF-β e a IL-17. Assim, estes dados
reforçam a noção de que o estado nutricional é importante para a resposta imune frente
à Leishmania.
Em relação à correlação positiva encontrada para a IL-17 e o IMC/Idade (Figura
15), cabe salientar que além dos achados de Pitta et al. (2011) descritos anteriormente,
Ghosh et al. (2013) verificaram que o efeito da curdlana, uma β-glucana produzida pela
bactéria não patogênica Alcaligenes faecalis, na redução da carga parasitária de
camundongos BALB/c infectados com L. donovani foi dependente de IL-17.
As células Th17 são células T CD4+ que foram inicialmente caracterizadas pela
produção de IL-17 (HARRINGTON et al., 2005; HARRINGTON et al., 2006). Esta
105
citocina aumenta a expressão de citocinas proinflamatórias como a IL-6, TNF-α e
quimiocinas que recrutam neutrófilos (RUDDY et al., 2004; LAAN et al., 1999).
Estudo realizado por Khader et al. (2007) verificou que a IL-17 é uma importante
citocina para a indução da resposta Th1 durante a infecção com Mycobacterium
tuberculosis. Estudos também demonstraram que a IL-17 apresenta importante papel na
proteção à infecções por fungos (LOURES et al., 2009; KELLY et al., 2005).
Dessa forma, partindo-se do pressuposto de que a produção de IL-17 pode ser
benéfica à resolução da infecção por espécies de Leishmania com capacidade de
disseminação para os órgãos, os nossos dados de correlação positiva entre o IMC/Idade
e produção de IL-17 em células T CD4+CD25
highFoxp3
+ (Figura 15) demonstram a
importância do estado nutricional para a resposta imune protetora à infecção por
Leishmania.
A correlação negativa encontrada entre o retinol sérico e IL-10 e TGF-β em
células T CD4+CD25
highFOXP3
+ (Figura 16) está de acordo com os resultados de
Stephensen et al. (2004) que, usando um modelo experimental de imunização,
demonstraram que a deficiência de vitamina A no momento da exposição ao antígeno
está associada com aumento nas células T produtoras de IL-10. No entanto, o grupo não
identificou se essas células tratavam-se células Th2 ou Treg. Já no estudo realizado por
Maynard et al. (2009) foi verificado que durante a deficiência de vitamina A
camundongos C57BL/6 apresentam aumento nas células Treg produtoras de IL-10.
Tomados em conjunto esses dados indicam que durante a deficiência de vitamina A, as
células Treg podem ser importantes produtoras de IL-10.
Assim, os resultados deste trabalho demonstram que, durante a LV, células Treg
e monócitos apresentam diferentes respostas frente a estímulos quando comparadas às
células de controles saudáveis, o que reforça que estas células apresentam papel
importante durante a doença. Além disso, observou-se que a vitamina A pode apresentar
duplo efeito na regulação da resposta imune: Promoção de resposta regulatória durante a
homeostase e modulação da produção de IL-10 durante a LV. Dessa forma, o uso de
vitamina A durante o tratamento da LV pode promover a recuperação; no entanto, mais
estudos são necessários. O estudo também demonstra a importância da manutenção do
estado nutricional adequado, visando promover a produção de IL-17 e manter em
106
concentrações adequadas a produção de IL-10 e TGF-β por células Treg, que podem
promover a persistência e replicação do parasita.
Ainda, os resultados do presente estudo e a literatura aqui citada (BADARO et
al., 1986; CERF et al., 1987; EVANS et al., 1992; REY et al., 2005; SCRIMSHAW;
TAYLOR; GORDON, 1968) nos permitiram resumir nossos achados, propondo um
modelo de relação entre a desnutrição e a LV, em um ciclo vicioso, onde a desnutrição
pode agravar a LV, e vice-versa, contribuindo para a compreensão de como se dá, em
termos moleculares, a relação das variáveis nutricionais aqui estudadas com a resposta
imune frente à infecção por Leishmania (Figura 17).
Por fim, este estudo enfatiza a importância do estado nutricional adequado e de
um único metabólito de vitamina A para a resposta imune frente à infecção por
Leishmania. Cabe ressaltar que as variáveis estudadas (estado nutricional e de vitamina
A) podem ser, em termos de saúde pública, controladas e modificadas, uma vez que são
essencialmente determinadas por hábitos culturais e sócio-econômicos e acesso à
alimentação. Fatores imunogenéticos estão claramente implicados com o desfecho da
infecção por Leishmania. Todavia, pesquisas que busquem por variáveis mais
facilmente modificáveis e de retorno à população enferma devem ser estimuladas,
visando a redução da morbi-mortalidade por leishmaniose visceral.
107
Figura 17. Ciclo vicioso desnutrição – leishmaniose visceral e sua relação com a
resposta imune.
108
6. CONCLUSÃO
Os resultados mostrados neste trabalho permitem concluir que:
O estado nutricional comprometido durante a LV está correlacionado com a
resposta imune e inflamatória frente à infecção por Leishmania.
O ácido all-trans retinóico apresentou duplo efeito nas células Treg e
monócitos estudados: Em crianças saudáveis, promoveu resposta regulatória,
com aumento da produção de IL-10 e TGF-β; em crianças com LV, modulou
a resposta imune favoravelmente, evitando o aumento de IL-10 após o
estímulo com antígenos de Leishmania.
A correlação entre o estado nutricional e produção de citocinas frente ao
estímulo com antígenos de Leishmania confirmam a importância do estado
nutricional adequado para a manutenção de resposta imune favorável à
resolução da infecção por L. infantum.
109
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2003.
137
8. ANEXO
APROVAÇÃO DO ESTUDO NO COMITÊ DE ÉTICA - UFRN
138
9. APÊNDICES
APÊNDICE 1 – FORMULÁRIO PARA COLETA DE DADOS DE CASOS DE LV
139
140
141
142
APÊNDICE 2 – FORMULÁRIO PARA COLETA DE DADOS EM CAMPO
143
144
145
APÊNDICE 3 – PUBLICAÇÕES RELACIONADAS À TESE
Artigo publicado em revista científica:
1. Amaral CT, Pontes NN, Maciel BL, Bezerra HSM, Triestea ANAB, Jeronimo
SMB, McGowan SE, Dantas VM. Vitamin A deficiency alters airway resistance in
children with acute upper respiratory infection. Pediatric Pulmonology, 48:481-489,
2013.
Artigos aceitos para publicação:
1. Maciel BL, Valverde JG, Rodrigues-Neto JF, Freire-Neto FP, Keesen T, Jeronimo
SMB. Dual immune modulatory effect of vitamin A in human visceral leishmaniasis.
Plos One, FI = 3,73
2. Lacerda HG, Monteiro GR, Queiroz PV, Pontes NN, Rodrigues-Neto JF, Maciel BL,
Queiroz JW, Pearson RD, Wilson ME, Jeronimo SMB. The natural history of
asymptomatic infection with the protozoan Leishmania infantum.
Plos Neglected Tropical Diseases, FI = 4,69.
Artigo – short report a ser submetido à revista The American Journal of Tropical
Medicine and Hygiene, FI = 2,53 (em Anexo)
1. Maciel BL, Valverde JG, Lacerda HG, Jeronimo SMB. Nutritional status in human
visceral leishmaniasis is correlated to the immune and inflammatory response against
Leishmania.
Resumos publicados em anais de congressos:
1. Valverde JG, Rodrigues-Neto JF, Maciel BL, Keesen T, Jeronimo SMB.
Lymphocyte activation profile is influenced by the method of cell culture: whole blood
146
assay versus peripheral blood mononuclear cells. In: XXXVIII Congress of the
Brazilian Society of Immunology, 2013, Natal, RN.
2. Maciel BL, Valverde JG, Rodrigues-Neto JF, Freire-Neto FP, Nascimento PP,
Monteiro GR, Pontes NN, Keesen T, Jeronimo SMB. Vitamin A modulation of
regulatory T cells in human visceral Leishmaniasis. In: Fifth World Congress on
Leishmaniasis, 2013, Ipojuca, PE.
3. Maciel BL, Valverde JG, Rodrigues-Neto JF, Freire-Neto FP, Nascimento PP,
Monteiro GR, Pontes NN, Keesen T, Jeronimo SMB. Nutritional variables associated
with the response of Leishmania infantum infection. In: 17th
Tropical Medicine
Research Center & 5th
Annual Meeting INCT-Biomedicine, 2013, Fortaleza.
4. Lacerda HG, Maciel BL, Lima ID, Pontes NN, Pearson RD, Wilson ME, Jeronimo
SMB. História natural da infecção assintomática por L. infantum chagasi. In: I
Simpósio do Instituto de Medicina Tropical do Rio Grande do Norte, 2012, Natal.
5. Maciel BL, Freire-Neto FP, Rodrigues-Neto JF, Keesen T, Jeronimo SMB. Vitamin
A modulation of IL-10 and IL-17 in human CD4+ cells stimulated with soluble
Leishmania infantum antigens. In: 6th
Congress of the International Society of
Nutrigenetics / Nutrigenomics, 2012, São Paulo.
6. Amaral CT, Pontes NN, Maciel BL, Triestea ANAB, Bezerra HSM, Jeronimo
SMB, McGowan SE, Dantas VM. Deficiência de vitamina A e resistência respiratória
em crianças após infecção de vias aéras superiores. In: 13o Congresso Brasileiro de
Pneumologia Pediátrica, 2011, Salvador.
7. Maciel BL, Lacerda HG, Queiroz JW, Pontes NN, McGowan SE, Jeronimo SMB.
Impact of Leishmania chagasi infection on nutritional status and development. In: 14th
Tropical Medicine Research Center Meeting and V International Symposium in
Biomedicine, 2010, Fortaleza-CE. Advanced Topics in Biomedicine, 2010.