1

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA

ALYSON MARLOS DE OLIVEIRA MIRANDA

EFEITO DA LASERTERAPIA SOBRE A PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS

PULPARES CULTIVADAS SOBRE FILMES POLIMÉRICOS

NATAL/RN

2017

2

ALYSON MARLOS DE OLIVEIRA MIRANDA

EFEITO DA LASERTERAPIA SOBRE A PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS

PULPARES CULTIVADAS SOBRE FILMES POLIMÉRICOS

Trabalho de conclusão de curso apresentado ao Curso de Graduação em Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte integrante dos requisitos para obtenção do título de Cirurgião-Dentista. Orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza.

Natal/RN

2017

3

Catalogação na Fonte. UFRN / Departamento de Odontologia Biblioteca Setorial de Odontologia “Profº Alberto Moreira Campos”.

Catalogação na Fonte. UFRN / Departamento de Odontologia

Miranda, Alyson Marlos de Oliveira. Efeito da laserterapia sobre a proliferação de células pulpares cultivadas sobre filmes poliméricos / Alyson Marlos de Oliveira Miranda. – Natal, RN, 2017.

24 f. Orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza. Monografia (Graduação em Odontologia) – Universidade Federal

do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde, Natal, 2017.

1. Materiais Biocompatíveis - Monografia. 2. Regeneração - Monografia. 3. Lasers - Monografia. I. Barboza, Carlos Augusto Galvão. II. Título. RN/UF/BSO BLACK D151

4

EFEITO DA LASERTERAPIA SOBRE A PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS

PULPARES CULTIVADAS SOBRE FILMES POLIMÉRICOS

Trabalho de conclusão de curso apresentado ao Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte integrante dos requisitos para obtenção do título de Cirurgião-Dentista.

Aprovado em: 19 / 06 / 2017

______________________________________________________________________

Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza.

Departamento de Morfologia/UFRN

______________________________________________________________________

Prof. Dr. Antônio de Lisboa Lopes Costa.

Departamento de Odontologia/UFRN

___________________________________________________________________ Prof. Dr. Euler Maciel Dantas.

Departamento de Odontologia/UFRN

5

DEDICATÓRIA

A Deus, por seu infinito amor.

A meus pais, meu porto seguro.

À minha vó Alice, meu colo de Deus.

À Rayane, que não é só um ombro amigo, mas todo um coração.

6

AGRADECIMENTOS

A Deus,

Por guiar minha vida, minha família, minhas atitudes diárias. Tudo o que eu fizer terá

orações que me levará até Ele.

A meus pais,

Pela presença e total dedicação. Em vocês encontro todos os porquês e motivos.

A Rayane,

Pelo companheirismo de sempre. Por tornar o amor um segundo nome, que a vida

me deu de presente.

A meu orientador Carlos Augusto,

Pelo acolhimento e confiança, desde o primeiro momento.

Aos professores Costinha, Edna, Ângela e Lélia,

Pelo apoio ao projeto e por me ajudarem a descobrir verdades, com ética e paixão.

Aos integrantes do grupo de pesquisa Biologia Crânio Facial,

Pela disponibilidade e desejo de ajudar sempre.

Aos amigos que a Odontologia me deu,

Por compartilharmos momentos, muito além das expectativas sobre cada um de nós

e da capacidade de nossas mãos.

7

RESUMO

A engenharia de tecidos é uma ferramenta promissora utilizada para obter reparo

funcional de diversos órgãos, com a utilização de arcabouços biocompatíveis

associados a fatores celulares e teciduais. O objetivo do presente estudo foi avaliar o

estímulo da laser de baixa intensidade (1 J/cm2) sobre a adesão e proliferação de

células pulpares em filme de ácido poliláctico (PLA). Foram avaliados três grupos:

Grupo 1 (controle) – células cultivadas sobre a superfície plástica de placas de cultivo

celular; Grupo 2 – células cultivadas sobre filmes de PLA; Grupo 3 – células cultivadas

sobre filmes de PLA e irradiadas com laser de diodo (InGaAIP) com comprimento de

onda de 660nm e potência de 30mw, dose de 1,0 J/cm² e irradiação emitida de forma

contínua. O experimento foi conduzido em triplicata com os intervalos de tempo 24 e

72h. A viabilidade e proliferação celular foram avaliadas pelo método de exclusão azul

de tripan (24 e 72 h) e fotomicrografia na interface biomaterial-plástico. Os resultados

mostraram proliferação celular em todos os grupos, sendo significativamente maior no

grupo 3 em relação aos grupos 1 (p<0.001) e 2 (p<0.05) no intervalo de 72 horas.

Esses dados sugerem que o estímulo do laser, nos parâmetros utilizados, aumenta a

proliferação celular, tendo assim uso potencial para aplicações futuras na Odontologia

regenerativa.

Palavras-chave: Lasers. Materiais Biocompatíveis. Proliferação Celular.

8

ABSTRAT

Tissue engineering is a promising tool used to obtain functional repair of several

organs, with the use of biocompatible scaffolds associated with cellular and tissue

factors. The aim of the present study was to evaluate the effect of low laser laser

irradiation (1 J/cm2) on adhesion and proliferation of pulp cells cultured on poly lactic

acid (PLA) films. Three groups were evaluated: Group 1 (control) - cells cultured on

the plastic surface of cell culture plates; Group 2 - cells cultured on PLA films; Group

3 - cells cultured on PLA films and irradiated with diode laser (InGaAIP) with

wavelength of 660nm and power of 30mW, dose of 1 J/cm² and irradiation emitted

continuously. The experiment was conducted in triplicate at intervals of 24 and 72 h.

Cell viability and proliferation were evaluated by the tripan blue exclusion method (24

and 72 h) and photomicrography at the biomaterial-plastic interface. The results

showed cellular proliferation in all groups, being significantly higher in Group 3 in

relation to groups 1 (p <0.001) and 2 (p <0.05) at 72 h. These data suggest that the

stimulation of the laser, in the parameters used, increases the cellular proliferation,

thus having potential use for future applications in regenerative dentistry.

Keywords: Lasers. Biocompatible materials. Cell proliferation.

9

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .................................................................................................... 10

2 METODOLOGIA ................................................................................................. 12

2.1 OBTENÇÃO CELULAR ....................................................................................... 12

2.2 FABRICAÇÃO DO FILME PLA ........................................................................... 12

2.3 CULTIVO CELULAR ........................................................................................... 13

2.4 CULTIVO CELULAR EM FILME DE PLA ............................................................ 13

2.5 IRRADIAÇÃO LASER DE BAIXA INTENSIDADE ............................................... 14

2.6 ANÁLISE DA PROLIFERAÇÃO CELULAR ......................................................... 14

2.7 TESTE DE CONTATO DIRETO .......................................................................... 15

2.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA ..................................................................................... 15

3 RESULTADOS .................................................................................................... 16

4 DISCUSSÃO ....................................................................................................... 18

5 CONCLUSÃO ..................................................................................................... 20

REFERÊNCIAS ................................................................................................. 211

ANEXO................................................................................................................ 23

10

1 INTRODUÇÃO

A regeneração dos tecidos craniofaciais continua a ser um desafio clínico na

Odontologia, constituindo um amplo campo de pesquisa na Engenharia de tecidos. A

perda dos tecidos craniofaciais é ocasionada por uma série de fatores, dentre eles:

traumas, neoplasias e doença periodontal.1 A terapia celular vem sendo amplamente

estudada com o objetivo de melhorar o tempo e a qualidade da cicatrização de

diversos tecidos orais. A associação dessas células com arcabouços biocompatíveis

proporciona um ambiente estrutural favorável ao crescimento celular, que pode ser

potencializado com associação a componentes biomoduladores, dentre eles o laser

de baixa intensidade (LBI).²

O LBI tem sido utilizado em diversas situações clínicas, principalmente em

processos cicatriciais. Em virtude de baixas densidades de energia e comprimento de

onda utilizados, o LBI é capaz de penetrar facilmente nos tecidos resultando em

síntese de fatores de crescimento, aumento da atividade e proliferação celular,

produção de colágeno e angiogênese. A capacidade que o LBI apresenta de estimular

a proliferação dos mais diferentes tipos celulares tem sido relatada como seu mais

importante efeito fisiológico.²

Dependendo das propriedades físicas e químicas dos biomateriais utilizados

para confecção de arcabouços celulares, esses podem gerar respostas positivas ou

negativas no processo de adesão, proliferação, migração, diferenciação e viabilidade

celular.³ O ácido poliláctico (PLA) é um biomaterial que pertence aos hidroxiácidos e

tem o ácido láctico (α-ácido 2-hidroxipropianóico) como matéria prima. Este

biomaterial é amplamente aceito para aplicações biomédicas devido a suas

propriedades positivas no que se refere à biodegradabilidade, biocompatibilidade e

sua fácil disponibilidade, em virtude do baixo custo.4 Nesse contexto, o ácido

poliláctico vem sendo utilizado como arcabouço para diversos tipos celulares .5,6

O efeito bioestimulatório do LBI tem sido investigado sobre diversas linhagens

celulares como: células-tronco mesenquimais (MSC), células-tronco de ligamento

periodontal humano, células-tronco da polpa de dentes humanos e também sobre

linhagens de pré-osteoblastos MC3T3-E1, oferecendo bons resultados.7,8,9,10 Porém,

até o presente momento, nenhum estudo avaliou o efeito estimulatório do LBI sobre

células pulpares cultivadas em arcabouços de ácido poliláctico (PLA). O objetivo do

11

presente estudo foi avaliar o bioestímulo do laser de baixa intensidade na dose de 1

J/cm2 com comprimento de onda de 660nm e potência de 30mw, sobre a adesão e

proliferação de células pulpares cultivadas sobre filme de PLA.

12

2 METODOLOGIA

2.1 OBTENÇÃO CELULAR

As células foram obtidas após autorização do comitê de Ética em Pesquisa da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (Parecer CAAE:

34913314.4.0000.5537). Foram utilizados três dentes decíduos em estágio final de

esfoliação e extração indicada, obtidos de crianças entre 06 a 12 anos, com bom

estado de saúde sistêmica e bucal, apresentando diagnóstico radiográfico de rizólise

dos terços apical e médio da raiz.

O processo de obtenção das células pulpares ocorreu após a exodontia, no

qual cada dente foi imediatamente mantido em tubo tipo Falcon contendo 5 mL de

meio alfa-MEM em condição hipotérmica (4ºC). Posteriormente, em câmara de fluxo

laminar, os dentes foram submetidos a três lavagens de 10 minutos cada, com uma

solução contendo meio alfa-MEM enriquecido com 10.000 U.I./mL de Penicilina,

10.000 µg/mL de Estreptomicina, 100 mg/mL de Gentamicina e 250 µg/mL de

Anfotericina B, objetivando eliminar possível contaminação.

O tecido pulpar foi cuidadosamente retirado por curetagem e, em seguida, o

extrato foi submetido à digestão enzimática com 3 mg/mL de colagenase I

(Gibco,USA) e 4mg/mL de dispase (Gibco, USA), por 1 hora a 37°C. As culturas foram

mantidas em meio alfa-MEM suplementado com 15% de Soro Fetal Bovino (SFB) a

37ºC em 5% de CO2 até atingirem 70 – 90% de confluência, com troca de meio a cada

três dias.

2.2 FABRICAÇÃO DO FILME DE PLA

Os filmes foram fabricados no Laboratório de Técnicas Histológicas do

Departamento de Morfologia da UFRN, através de uma adaptação da técnica descrita

por Lian et al.11, no qual 5 gramas de PLA foram dissolvidos em 100 mL de clorofórmio

em um agitador magnético durante 30 minutos. Em seguida, o material foi deixado

numa câmara de ventilação, durante duas horas, para evaporação do clorofórmio

residual e, posteriormente, deixado em overnight na estufa. Os filmes obtidos foram

recortados em fragmentos circulares com 1 cm de diâmetro.

13

2.3 CULTIVO CELULAR

As células pulpares foram cultivadas em meio de cultura α-MEM (Cultilab)

suplementadas com 10% de Soro Fetal Bovino (SFB; Gibco, USA) com 1% de

antibiótico, em garrafas de cultivo celular de 75 cm2. Foram mantidas a 37ºC em 5%

de CO2 até atingirem 80 a 90% de confluência, com troca de meio a cada três dias.

O experimento foi conduzido em triplicata com três grupos experimentais

(Figura 1), em dois intervalos de tempo após irradiação.

• Grupo 1 - Células pulpares cultivadas sobre a superfície da placa.

• Grupo 2 - Células pulpares cultivadas sobre biofilme de ácido poliláctico.

• Grupo 3 - Células pulpares cultivadas sobre biofilme de ácido poliláctico e

submetidas à laserterapia de baixa intensidade.

Figura 1: Desenho experimental da distribuição dos grupos na placa de cultura de 24 poços. Preto: Grupo 1; Verde: Grupo 2; Vermelho: Grupo 3. Os espécimes do Grupo

3 foram cultivados deixando-se o intervalo de um poço em vazio para evitar dispersão não intencional da irradiação.

2.4 CULTIVO CELULAR EM FILME DE PLA

As fibras de PLA foram esterilizadas de acordo com o protocolo adaptado de

Mansourizadeh et al.12 sobre raio ultravioleta (UV) por 3 horas, em seguida imersas

em etanol 70% durante 30 minutos e lavadas três vezes com solução salina

tamponada com fosfato (PBS) por 15 minutos cada e finalmente cultivadas overnight

em meio completo (αMEM, 10% SFB, 1% Antibióticos) com objetivo de aumentar a

hidrofilicidade do biomaterial. As células foram então cultivadas sobre cada arcabouço

de PLA em uma densidade padronizada de 2x104 células/cm2.

14

2.5 IRRADIAÇÃO COM LASER DE BAIXA INTENSIDADE

A irradiação com laser de baixa intensidade foi realizada logo após o

plaqueamento das células nos seus respectivos poços. O aparelho utilizado para as

irradiações foi um Laser diodo de InGaAIP (Kondortech – Bio Wave LLLT Dual, Brasil),

com os parâmetros listados na Tabela 1.

Tabela 1 – Parâmetros utilizados do Laser de Baixa Intensidade.

Potência

Comprimento de onda

30mW

660nm

Dose 1,0J/cm²

0,01cm2 Diâmetro da ponta

Modo de ação

Tempo

Contínuo

40s

FONTE: Grupo de Pesquisa Biologia Crânio Facial da UFRN.

2.6 ANÁLISE DA PROLIFERAÇÃO CELULAR

Foi utilizado o método de exclusão por azul de tripan, após os intervalos de

tempo 24 e 72h, seguindo o seguinte protocolo: lavagem com PBS, adição de 500 µl

de tripsina (5 minutos), adição de 500µl meio α-MEM para inativar a tripsina,

passagem da amostra para cada tubo cônico de 15ml correspondente. Em seguida,

foi coletado, separadamente, 10µl da amostra e misturados com 10µl de azul de tripan.

Logo após, levado a câmera de Neubauer. Em seguida, para obtenção da estimativa

do número de células foi realizado o seguinte cálculo:

Número total de células contadas X fator de diluição

4X 104

15

2.7 TESTE DE CONTATO DIRETO

Foram obtidas fotomicrografias da interface filme de PLA/placa de cultura

(Figura 2) em cada grupo experimental, nos dois intervalos de tempo estudados (24 e

72 horas), utilizando-se Microscópio Invertido (Eclipse Ti-U – Nikon) do Laboratório de

Biotecnologia de Polímeros Naturais (BIOPOL/ DBQ/ UFRN).

Figura 2 – Modelo da fotomicrografia da interface filme de PLA/placa de cultura.

Em seguida, as fotos obtidas foram comparadas entre os diferentes períodos

de observação para avaliação qualitativa da proliferação celular na placa de cultura

e/ou sobre o filme de PLA.

2.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA

A diferença entre os grupos para cada um dos tempos estudados (24 e 72

horas) foi analisada pelo teste estatístico de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney,

considerando um intervalo de confiança de 95%.

16

3 RESULTADOS

A proliferação das células pulpares analisada pelo método de coloração azul

de tripan é ilustrada na Figura 3. Todos os grupos apresentaram um incremento no

número de células com o decorrer do experimento, sendo que o Grupo 3 (células

cultivas sobre arcabouço de PLA e submetidas à laserterapia) exibiu um número de

células significativamente maior do que o Grupo 1 (p<0.001) e o Grupo 2 (p<0.05) no

intervalo de 72 h.

Figura 3 – Número médio (± desvio-padrão) de células pulpares dos três grupos nos

intervalos de 24 e 72 horas pelo teste do azul de tripan. Asteriscos representam

diferença estatisticamente significativa: *p<0.05; ***p<0.001; teste de Mann-Whitney.

Ao longo das 72 horas de experimento, podemos ver uma crescente

proliferação celular na interface do biomaterial com a placa de cultura, onde as células

apresentaram uma morfologia adequada ao seu tipo celular. O Grupo 3 mostrou

visivelmente um maior crescimento celular em comparação com os Grupos 1 e 2

(Figura 4).

*

***

G1 G2 G3 G1 G2 G3

17

Figura 4 - Fotomicrografias da interface filme de PLA (P) / placa de cultura (C) em

diferentes intervalos de tempo. A crescente proliferação celular na placa de cultura e

na interface com o filme de PLA durante o período da análise indica que,

provavelmente, também há um significativo número de células em sua superfície,

além de mostrar que o PLA não está impedindo a proliferação celular. Aumento: 10x.

0h

24h

72h

18

4 DISCUSSÃO

A utilização de células pulpares traz uma perspectiva de aliar qualidade aos

materiais de substituição tecidual, concedendo acréscimo de componente celular ao

material, conferindo-lhe maior capacidade regenerativa. Todavia, a obtenção de uma

quantidade considerável de um tipo celular específico é um fator importante na

regeneração tecidual. Por conseguinte, terapias que proporcionem um aumento na

taxa proliferativa das células em cultura é de grande interesse para a engenharia de

tecidos.13

No contexto da odontologia regenerativa, selecionar um arcabouço apropriado

à adesão celular torna-se um componente essencial. O arcabouço de ácido poliláctico

pode ser confeccionado para mimetizar a matriz extracelular, possibilitando suporte

mecânico para a implantação celular 14. Wang X et. 15 investigaram a proliferação

celular de células da polpa de dentes decíduos cultivadas sobre arcabouços de ácido

poliláctico, no qual obtiveram resultados significativos de aumento do número de

células quando comparados ao grupo controle. Esse fato foi confirmado no presente

estudo, ao verificar uma taxa considerável de proliferação celular após 72h, sugerindo

que o filme estrutural de PLA possui boa biocompatibilidade com as células pulpares,

servindo como possível arcabouço para usos in vivo.

No presente estudo o LBI mostrou-se uma ferramenta potencial para estimular

o crescimento de células pulpares. A literatura mostra que a fotobiomodulação é uma

alternativa útil para o estímulo da proliferação de diferentes tipos celulares 16.

Tuby, Maltz e Dian 17, usando doses de 1,0 e 3,0 J/cm² em células-tronco

mesenquimais e cardíacas, mostraram que o LBI promoveu um aumento significativo

dos dois tipos celulares após a aplicação do laser, quando comparados ao grupo

controle. Hou et al. 18 utilizando doses de 0,5, 1,0, 2,0 e 5,0 J/cm² em células-tronco

mesenquimais da medula óssea a LBI, mostrou aumento na população celular

significativamente maior no grupo submetido à irradiação, quando comparado ao

grupo controle, sendo a dose de 1,0 J/cm² a mais efetiva. Os resultados do presente

estudo reforçam a eficácia do LBI, com utilização da dose de 1,0 J/cm², em aumentar

a proliferação celular in vitro, sugerindo que a terapia com Laser apresenta um efeito

bioestimulatório dependente da dose a ser utilizada. Outrossim, essa taxa proliferativa

respalda-se na possível conversão de energia fotônica em energia química, na forma

19

de adenosina trifosfato (ATP), o que melhora as funções celulares, contribuindo para

o aumento da população de células e mantendo suas características de integridade 2.

Em relação à laserterapia em células de origem dentária, Moura-Netto et al. 19

submeteram células-tronco de dentes decíduos à irradiação com LBI em doses de 3,0

e 5,0 J/cm², sendo as células submetidas a diferentes estágios nutricionais.

Constataram uma taxa de crescimento celular significativamente maior nos grupos

submetidos ao laser, quando comparados ao controle. Soares et al. 13 observaram o

efeito bioestimulador do LBI em células-tronco do ligamento periodontal. A dose é um

componente importante na influência dos resultados de proliferação celular 20. No

presente estudo foi utilizada a dose de 1,0 J/cm², a qual promoveu uma significativa

bioestimulação, comparando-se ao grupo controle, sugerindo que essa dose não

danificou os fotorreceptores, o que ocasionou um aumento do efeito biomodulador.

Além disso, a análise quantitativa das células em diferentes intervalos de tempo (24 e

72h) apontam, através de testes estatísticos, um comportamento crescente de adesão

e proliferação celular nos grupos estudados (PLA e laser /PLA). Esses resultados são

concordantes com os achados de Moura-Netto, Zaccara e Soares 19,20.13.

20

5 CONCLUSÃO

Os resultados do presente estudo apresentam relevância clínica posto que a

utilização do LBI representa uma bioestimulação eficaz na terapia associada a células-

tronco, conferindo uma base para avanços da utilização dessas células em processos

regenerativos. Aliando-se a isso, o arcabouço de ácido poliláctico confere uma

microestrutura biocompatível ao desenvolvimento celular. Em suma, o presente

estudo revelou que o bioestímulo do laser com dose de 1,0 J/cm², associado à base

de biofilme polimérico, promoveu aumento da proliferação celular.

21

REFERÊNCIAS

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12 Mansourizadeh, F.; Asadi, A.; Oryan, S.; Nematollahzadeh, A.; Dodel, M. & Asghari-Vostakolaei, M. PLLA/HA Nano composite scaffolds for stem cell proliferation and differentiation in tissue engineering. Molecular Biology Research Communications. 2013 2(1-2):1-10.

22

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18. Hou JF, Zhang H, Yuan X, Li J, Wei YJ, Hu SS. In vitro effects of low-level laser irradiation for bone marrow mesenchymal stem cells: proliferation, growth factors secretion and myogenic differentiation. Lasers Surg Med. 2008 Dec;40(10):726-33

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20. Zaccara IM, Ginani F, Mota-Filho HG, Henriques ÁC, Barboza CA. Effect of low-level laser irradiation on proliferation and viability of human dental pulp stem cells. Dec, 2015 30(9):2259-64

23

ANEXO

As normas adotadas nessa monografia seguiram as instruções aos autores para

submissão de artigo no Journal of Applied Oral Science.

NORMALIZAÇÃO TÉCNICA

O manuscrito deve ser digitado da seguinte forma:1,5 de espaçamento em fonte arial

de 11 pts, com margens de 3 cm de cada lado, em uma página a4, somando até 15

páginas, incluindo as ilustrações (gráficos, fotografias, tabelas, etc). Os autores devem

manter uma cópia do manuscrito para possíveis pedidos.

CITAÇÃO DOS AUTORES

A citação dos autores no texto pode ser realizada de duas maneiras:

1) Apenas numérico: "e interfere com o sistema bacteriano e sistema de tecido 3,4,7-

10 ". As referências devem ser citadas em uma ordem numérica ascendente dentro do

parágrafo.

2) ou alfanumérico

Um autor - Silva 23 (1986)

Dois autores - Silva e Carvalho 25 (1987)

Três autores - Ferreira, Silva e Martins 27 (1987)

Mais de três autores - Silva, et al. 28 (1988)

Caracteres de pontuação, como períodos e vírgulas, devem ser colocados após a

citação numérica dos autores. Ex: Ferreira 38 .

REFERÊNCIAS

As referências devem seguir os "Requisitos uniformes para manuscritos submetidos

a Revistas Biomédicas - Vancouver".

Todas as referências devem ser citadas no texto. Eles devem ser ordenados

alfabeticamente pelo sobrenome do autor e numerados em ordem crescente de

acordo. A ordem de citação no texto deve seguir esses números. As abreviaturas dos

títulos das revistas internacionais citadas devem seguir o Index Medicus / MEDLINE.

Comunicações pessoais e dados não publicados sem data de publicação não devem

ser incluídos na lista de referência.

24

Resumos, monografias, dissertações e teses não serão aceitos como referências.

Os nomes de todos os autores devem ser citados até 6 autores;No caso de haver

mais autores, os 6 primeiros autores devem ser citados, seguidos pela expressão ",

et al.", Que deve ser seguida por "período" e não deve ser escrita em itálico. Ex: Uhl,

et al.

No máximo, 30 referências podem ser citadas, exceto para comentários convidados

pelo Editor-em-chefe.

Artigos publicados em revistas

Wenzel A, Fejerskov O. Validade do diagnóstico de lesões de cáries questionáveis

em superfícies oclusais de terceiros molares extraídos. Caries Res. 1992; 26: 188-93.

Trabalhos com mais de 6 autores

Os primeiros 6 autores são citados, seguidos pela expressão ", et al."

Parkin DM, Clayton D, Black RJ, Masuyer E, Friedl HP, Ivanov E, et al. Infância -

leucemia na Europa após Chernobyl: 5 anos de seguimento. Br J Cancer. 1996; 73:

1006-12.