universidade federal do rio grande do norte centro … · 2019-01-30 · costumo dizer que eu tenho...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

NILMARA DE OLIVEIRA ALVES

OS EFEITOS DAS QUEIMADAS NA AMAZÔNIA EM NIVEL CELULAR E MOLECULAR

NATAL-RN

2014

NILMARA DE OLIVEIRA ALVES

OS EFEITOS DAS QUEIMADAS NA AMAZÔNIA EM NIVEL CELULAR E MOLECULAR

Tese apresentada ao Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para o título de doutora em Bioquímica.

Orientador(a): Silvia R. B. de Medeiros Co-orientador(a): Pérola C. Vasconcellos

NATAL – RN 2014

Alves, Nilmara de Oliveira. Os efeitos das queimadas na Amazônia em nível celular e molecular /Nilmara de Oliveira Alves. - Natal, 2014. 137f: il.

Coorientadora: profa Dra. Pérola C. Vasconcellos. Orientadora: Profa. Dra. Silvia R. B. de Medeiros. Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte.Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica.

1. Amazônia - Tese. 2. Genotoxicidade - Tese. 3. Queima debiomassa - Amazônia - Tese. I. Medeiros, Sílvia R. B. II. UniversidadeFederal do Rio Grande do Norte. III. Vasconcellos, Pérola C. IV. Título.

RN/UF/BSE01 CDU 630*43(811.3)

Catalogação da Publicação na FonteUniversidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho ao meu marido Joel e à minha filha Luana que juntos foram os grandes alicerces desta caminhada;

Aos meus pais, Rafael e Maria Francisca, pela confiança e

companheirismo;

Aos professores que acreditaram e permitiram a realização deste trabalho: Silvia Batistuzzo, Pérola Vasconcellos, Sandra Hacon e

Carlos Menck.

AGRADECIMENTOS

Este trabalho é um resultado de dedicação e comprometimento, é a concretização de um sonho, que um dia não parecia estar ao meu alcance... Isaac Newton disse uma frase que resume a realidade desta conquista:

“Se eu conseguir ver mais que outros, foi porque estava em cima do ombro de gigantes...”

Muitos foram os gigantes que eu encontrei nesta caminhada e eu gostaria de agradecer especialmente algumas pessoas que acreditaram no meu trabalho e que me deram subsídios para chegar até aqui.

Joel a você dedico esta tese de doutorado e o meu coração. Sou abençoada por ter você em minha vida, por você me proporcionar o sentido pleno da felicidade. Além da admiração que tenho por todas as suas conquistas profissionais, eu admiro a pessoa que você é...Obrigada pelos ensinamentos diários, pela compreensão, pelos conselhos, por permitir a realização deste sonho.

Minha linda Luana, obrigada por você existir...Com você eu aprendo todos os dias. Descobri que é na simplicidade dos momentos que o amor verdadeiro se expressa na forma mais sublime: com o seu olhar doce, com o seu sorriso, com o seu jeito carinhoso dizendo “mamãe, eu cuido de você!”...Por você eu segui adiante e venci limites que eu não imagina ser possível. Você é tudo para mim!

Meus queridos pais, se hoje eu consegui realizar este sonho foi porque vocês sonharam junto comigo. Hoje eu posso compreender todo o esforço e o sacrifício para conseguir educar um filho. Obrigada por me darem uma estrutura sólida para que eu sempre pudesse ter a liberdade de escolha, mas acima de tudo por terem me ensinado que com honestidade, respeito e simplicidade tudo é possível.

Rafinha, Sil, Hayden e minha princesa Bia é com muito carinho que eu agradeço a confiança e admiração. Vocês também contribuíram para este crescimento profissional.

Agradeço também à minha nova família Ferreira e Brito que me receberam de braços abertos. É muito bom saber que eu posso contar com vocês. Iara e Priscila, obrigada pelo suporte que vocês me deram nesta caminhada. Cícero e Tetê vocês também contribuíram nesta nova conquista.

Silvia Batistuzzo, obrigada por ter aceito orientar a menina piauiense. Muitos professores não acreditaram que eu seria capaz de aprender e fazer o melhor. Você pensou diferente e me deu a oportunidade de buscar este sonho e voar. Após estes 6 anos de qualificação acadêmica, eu sigo o caminho da pesquisa com mais

maturidade e com a contínua busca do saber. Com certeza, isso não seria possível sem a convivência e a troca de experiências. Espero ter contribuído um pouco para o laboratório assim como eu aprendi com o seu grupo.

Vivi, eu sou eternamente agradecida por você ter sido minha orientadora de iniciação científica. Mais do que isso, nós somos grandes amigas. Com você eu aprendi o que significa uma pesquisa científica e foi possível acreditar neste sonho. Ao mesmo tempo, com você eu vivi momentos únicos e por muitas vezes você foi a amiga confidente, de bons conselhos e que sempre me passou muita segurança. Palavras nunca serão suficiente para expressar todo o carinho e respeito que eu tenho por você. Tenho certeza que iremos trabalhar juntas por muitas e muitas vezes...

Ao longo desta jornada eu tive a oportunidade de trabalhar com grandes pesquisadores e eu vi na convivência diária o segredo do sucesso: a simplicidade.

Pérola, o meu agradecimento é eterno. Costumo dizer que eu tenho algumas “mães” na pesquisa científica e você é uma delas. Nos momentos em que eu mais precisei você estava ao meu lado. Obrigada pela co-orientação e pela grande amizade que construímos. Você é especial!

Sandra Hacon, você também faz parte do grupo das minhas “mães” científicas. O seu incentivo e a sua confiança foram essenciais para a realização deste trabalho. Sem o seu apoio nada disso teria sido possível. Aqui registro o imenso carinho, admiração e respeito não somente pela pesquisadora que és, mas também pela pessoa maravilhosa que eu tive a oportunidade de conhecer. É um privilégio trabalhar com você e certamente iremos continuar trilhando uma longa parceria.

Menck, quando eu pedi a você a oportunidade de realizar os meus experimentos no seu laboratório era um momento de muitas mudanças na minha vida pessoal e profissional. O medo de receber um “não” me afligiu por vários dias, mas eu fui presenteada com o seu e-mail dizendo: “...certamente o laboratório está aberto para recebê-la...é como coração de mãe...sempre cabe mais um!” Naquele momento eu já percebi que você era especial! Eu não tenho palavras suficientes para agradecer pela oportunidade de conviver no seu laboratório e de fazer parte do seu grupo. Obrigada pelo voto de confiança e por contribuir na realização deste sonho!

Paulo Artaxo, obrigada pelo suporte contínuo e por acreditar no potencial deste trabalho. O seu apoio fez toda a diferença!

Agradeço também aos meus amigos que fazem e que já fizeram parte do laboratório de Mutagênese Ambiental da UFRN em especial ao Marcos Felipe, Milena, Déborah, Bia, Fábio, Joana, Jana, Richelly, Aline, Natália, Caio, Mayara, Thiago e Anuska.

Aos amigos do departamento de Bioquímica da UFRN, em especial a Cinthia Telles e a Jailma.

Aos companheiros do laboratório de Química Atmosférica da USP, em especial a Sofia.

Ao grupo do laboratório de Reparo do DNA que deixaram eu fazer parte dessa família: Clarissa, Letícia, Veri, Annabel, Camila, Alessandra, Alexandre, Marinalva, Maria Helena, Satoru, Luciana, Natália, Rosa, Janu, Juliana, Ligia, Francisco, Leo, Huma e Lívia. Cada um de vocês me ajudaram de alguma forma. Muito obrigada por tudo!

Ao laboratório de Poluição Atmosférica no Instituto de Física da USP.

Aos amigos da CETESB, em especial a Déborah Roubiceck, Flávia, Isabel e Célia.

Aos grandes amigos que mesmo com a distância nós estamos sempre juntos: Clênya, Andrea, Mara, Kelly Pansard, Paula Verônica, Alessandra e Márcia.

Aos meus queridos familiares piauienses que me admiram e que acreditam no meu sucesso.

Ao Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq) pelo suporte financeiro e pela divulgação do meu trabalho no programa Popularização da Ciência.

“A humildade exprime, uma das raras certezas de que estou certo:

a de que ninguém é superior a ninguém”. (Paulo Freire)

RESUMO

A Amazônia representa mais da metade das florestas tropicais

remanescentes no planeta e compreende a maior biodiversidade do mundo, correspondendo aproximadamente a 60% do território brasileiro. Entretanto, o desmatamento e as queimadas que ocorrem na região têm causado sérios prejuízos para a população que está sendo exposta. Diante desta situação, o objetivo do presente estudo foi avaliar os compostos químicos orgânicos presentes no extrato orgânico do MP menor que 10 µm (MP10) oriundo da queima da floresta Amazônica assim como os efeitos celulares e moleculares por eles causados em células de origem pulmonar. Com relação à composição química, a análise dos n-alcanos mostrou um predomínio da influência antrópica no período de queimadas intensas na região. Além disso, neste mesmo período, observou-se um aumento dos monossacarídeos marcadores da queima de biomassa. Também foram identificados os Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPA) e os seus derivados nas amostras coletadas na Amazônia. Os dados das concentrações dos HPA permitiram calcular o BaP-equivalente e observou-se que o dibenzo(a)antraceno contribui com 83% para o potencial risco carcinogênico de exposição às queimadas. Já para o potencial risco mutagênico, o benzo(a)pireno é o HPA que apresenta uma maior contribuição nesta análise. Pode-se destacar que o reteno foi o HPA mais abundante. Este composto foi genotóxico, além de causar morte por necrose nas células do pulmão humano. Nas análises biológicas, os dados mostraram que o material orgânico extraído é capaz de causar alterações genéticas tanto em células vegetais como em células do pulmão humano. Estes danos levaram a uma parada na fase G1 no ciclo das células expostas, aumentando a expressão das proteínas p53 e p21. Além disso, o MP

causou morte celular por apoptose, aumentando a marcação da histona -H2AX. Com resultados bem evidentes, o MP inalável também causou morte por necrose nas células do pulmão humano. Diante destes resultados, é importante enfatizar a redução e um melhor controle da queima de biomassa na região Amazônica. Afinal, como descrito recentemente pela Organização Mundial de Saúde, pode-se afirmar que a redução da poluição do ar poderá salvar milhões de vidas.

Palavras-chave: Amazônia, MP10, queima de biomassa, genotoxicidade, morte

celular e células do pulmão humano.

ABSTRACT

The Amazon holds over half of the planet's remaining tropical forests and comprises the largest biodiversity in the world, accounting for approximately 60 % of the Brazilian territory. However, deforestation fires in the region causes serious problems to exposed human. The aim of this study was to evaluate the chemical compounds as well as the cellular and molecular effects after exposure to organic material extracted from particulate matter less than 10 µm (PM10) in the Amazon region. As for the chemical composition, n-alkanes analysis showed a prevalence of anthropogenic influence during the fires in the region. In addition, there was a predominance of monosaccharides from biomass burning markers. Also, the Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAH) and their derivatives have also been identified in samples collected in the Amazon. By using the PAH concentrations was possible to calculate the BaP-equivalent and it was found that the dibenz(a) anthracene contributes with 83% to potential carcinogenic risk. As for the potential mutagenic risk, the benzo (a) pyrene is the HPA that has a major contribution in this analysis. It may be noted that the retene was the most abundant PAH. This compound was genotoxic and cause death by necrosis in the human lung cells. In biological tests, the data showed that organic PM10 is capable of causing genetic damage in both plant cells and in human lung cells. This damage cause an arrest in the G1 phase of the cell cycle exposed, increasing the expression of p53 and p21.

Additionally, the PM10 caused cell death by apoptosis, increasing the foci of histone -H2AX. Given these results, it is important to emphasize the reduction and better control of biomass burning in the Amazon region thus improving the quality of health of the population being exposed. As clearly stated recently by the World Health Organization, the reduction of air pollution could save millions of lives annually.

Key-words: Amazon, PM10, biomass burning, genotoxicity, cell death and human lung cells.

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1: DISTRIBUIÇÃO DO MATERIAL PARTICULADO NAS VIAS AÉREAS COM RELAÇÃO AO

SEU TAMANHO AERODINÂMICO. FIGURA ADAPTADA DE NEMMAR ET AL. (2013). ....... 24

FIGURA 2: ESTRUTURA DOS COMPOSTOS PROVENIENTES DA PIRÓLISE DA CELULOSE. FIGURA

ADAPTADA DE SAARNIO (2013). .......................................................................... 28

FIGURA 3: REPRESENTAÇÃO DA ESTRUTURA DE UM ALCANO COM 13 CARBONOS

(TRIDECANO) E DOS ALCANOS ISOPRENÓIDES: PRISTANO E FITANO. ........................... 30 FIGURA 4: HIDROCARBONETOS POLICÍCLICOS AROMÁTICOS CONSIDERADOS PRIORITÁRIOS

NO MONITORAMENTO AMBIENTAL DE POLUENTES ORGÂNICOS PELA ENVIRONMENTAL

PROTECTION AGENCY (EPA). FIGURA ORIGINAL DE DE OLIVEIRA ALVES (2010). . 32

FIGURA 5: VISÃO GERAL DAS POSSÍVEIS ETAPAS PARA A FORMAÇÃO DE NEOPLASMA

OCASIONADO PELOS HIDROCARBONETOS POLICÍCLICOS AROMÁTICOS (HPA). FIGURA

ADAPTADA DE US-EPA (2010). ............................................................................. 34

FIGURA 6: REPRESENTAÇÃO DA ESTRUTURA DE DOIS HIDROCARBONETOS POLICÍCLICOS

AROMÁTICOS (HPA) OXIGENADOS E NITROGENADOS. .............................................. 35

FIGURA 7: BIOMARCADORES DE EXPOSIÇÃO E OS EFEITOS DA POLUIÇÃO. ADAPTADO DE

DEMETRIOU ET AL. (2012). ................................................................................ 38

FIGURA 8: POSSÍVEIS MECANISMOS DE FORMAÇÃO DO MICRONÚCLEO (MN) E DAS PONTES

NUCLEOPLASMÁTICAS (PN). A) MN RESULTANTE POR ANEUGÊNESE. B) MN

RESULTANTE POR CLASTOGÊNESE E PN. C) PN FORMADO POR CROMOSSOMOS

DICÊNTRICOS RESULTANTES DA FUSÃO DOS TELÔMEROS. OS PONTOS AMARELOS

REPRESENTAM SONDAS QUE HIBRIDIZAM PARA A REGIÃO CENTROMÉRICA DOS

CROMOSSOMOS E OS PONTOS AZUIS REPRESENTAM AS SONDAS QUE HIBRIDIZAM COM

AS SEQUÊNCIAS TELOMÉRICAS NOS CROMOSSOMOS. FIGURA ADAPTADA DE FENECH

ET AL. (2011). ...................................................................................................... 43

FIGURA 9: RESPOSTAS DE DANOS AO DNA (RDD) E O PAPEL DA -H2AX. ....................... 46

FIGURA 10: REGULAÇÃO DOS PONTOS DE CHECAGEM PELA SINALIZAÇÃO DE RESPOSTAS DE

DANO AO DNA (RDD). .......................................................................................... 48

FIGURA 11: MORTE CELULAR POR APOPTOSE E NECROSE. FIGURA ADAPTADA DE KONO ET

AL. (2008)............................................................................................................ 51

FIGURA 12: MAPA DESTACANDO O MUNICÍPIO DE ALTA FLORESTA, NO ESTADO DO MATO

GROSSO, REGIÃO DO ARCO DO DESMATAMENTO DA AMAZÔNIA BRASILEIRA. .............. 55

FIGURA 13: ESQUEMA DA MONTAGEM DO AMOSTRADOR ACOPLADO COM O INLET PARA A

COLETA DE MP10, UTILIZANDO FILTROS TEFLON. EM PARALELO, O ESQUEMA DA

MONTAGEM DO AMOSTRADOR DE PARTICULADO FINO E GROSSO (AFG) ACOPLADO COM

INLET, UTILIZANDO FILTROS DE POLICARBONATO. FIGURA ORIGINAL DE DE OLIVEIRA

ALVES (2010). ................................................................................................... 57

FIGURA 14: ESQUEMA DAS ANÁLISES QUÍMICAS E BIOLÓGICAS REALIZADAS COM O MATERIAL

ORGÂNICO EXTRAÍDO DO MP10 ATMOSFÉRICO. ........................................................ 59

FIGURA 15: IMAGENS QUE ILUSTRAM OS PARÂMETROS QUE FORAM ANALISADOS NO TESTE

CBMN APÓS A EXPOSIÇÃO DO MATERIAL PARTICULADO ORGÂNICO DE ALTA FLORESTA

UTILIZANDO AS CÉLULAS A549. (A) CÉLULA BINUCLEADA SEM MICRONÚCLEO, (B) CÉLULA BINUCLEADA COM MICRONÚCLEO, (C) PONTE NUCLEOPLASMÁTICA E (D) BROTO

NUCLEAR. ............................................................................................................. 62

FIGURA 16: MAPA DO BRASIL INDICANDO A REGIÃO AMAZÔNICA (EM VERDE) E UMA VISÃO

DETALHADA DA CIDADE DE PORTO VELHO E DO LOCAL DE AMOSTRAGEM. FIGURA

ADAPTADA DE BRITO ET AL. (2014). ...................................................................... 65

FIGURA 17: AMOSTRADOR DE ALTO VOLUME – HIVOL. A: IMAGEM DO HIVOL COM A CABEÇA

DE SEPARAÇÃO ANDERSEN. B: FILTRO DE QUARTZO NÃO AMOSTRADO NO HIVOL. C: HIVOL SENDO PROGRAMADO PARA O FUNCIONAMENTO. D: FILTRO DE QUARTZO APÓS A

AMOSTRAGEM. ...................................................................................................... 66

FIGURA 18: IMAGEM DA BALANÇA ESPECÍFICA PARA OS FILTROS DE QUARTZO NO

LABORATÓRIO DE POLUIÇÃO ATMOSFÉRICA DA CETESB. ........................................ 67

FIGURA 19: APARATO DE SOXHLET UTILIZADO PARA EXTRAÇÃO DOS FILTROS COLETADOS. 68

FIGURA 20: ESQUEMA DAS ANÁLISES QUÍMICAS UTILIZANDO O MP10 COLETADO EM PORTO

VELHO, REGIÃO DA AMAZÔNIA BRASILEIRA.............................................................. 69

FIGURA 21: ANÁLISES CELULARES E MOLECULARES UTILIZANDO O MP10 COLETADO EM

PORTO VELHO, REGIÃO DA AMAZÔNIA BRASILEIRA. ................................................. 69

FIGURA 22: ANÁLISE DO MATERIAL PARTICULADO E BLACK CARBON ORIUNDOS DA QUEIMA

DE BIOMASSA EM ALTA FLORESTA. ......................................................................... 78

FIGURA 23: DISTRIBUIÇÃO DO ÍNDICE DE WAX NORMAL ALKANES (WNA) OBTIDO ATRAVÉS

DAS CONCENTRAÇÕES DOS N-ALCANOS IDENTIFICADOS EM ALTA FLORESTA. ............. 81

FIGURA 24: ANÁLISE DA PRESENÇA DE MICRONÚCLEO EM CÉLULAS BINUCLEADAS APÓS A

EXPOSIÇÃO AO MATERIAL ORGÂNICO EXTRAÍDO DO MP10 ATMOSFÉRICO. CN -

CONTROLE NEGATIVO SOMENTE COM DMEM; CD - CONTROLE NEGATIVO COM DMSO

0,1%; CP - CONTROLE POSITIVO: MISTURA DE HPA (10 NG/ML).* P<0,05 E *** P

<0,001 ESTATISTICAMENTE SIGNIFICATIVOS EM RELAÇÃO AO CONTROLE NEGATIVO DE

ACORDO COM O TESTE DE DUNNETT. ...................................................................... 84

FIGURA 25:DIAGRAMA BOX PLOT PARA A DISTRIBUIÇÃO DOS VALORES DA MÉDIA DE

MICRONÚCLEO OBTIDA PELO TESTE TRAD-MCN. O LIMITE SUPERIOR DA CAIXA INDICA O

PERCENTIL DE 75% DOS DADOS E O LIMITE INFERIOR DA CAIXA INDICA O PERCENTIL DE

25%. OS EXTREMOS DO GRÁFICO INDICAM OS VALORES MÍNIMO E MÁXIMO. A LINHA DA

CAIXA INDICA O VALOR DA MEDIANA DOS DADOS E OS CÍRCULOS CORRESPONDEM AOS

VALORES DA MÉDIA. CONTROLE NEGATIVO (NC) - DMSO 1% E CONTROLE POSITIVO

(CP) - 0,2% DE FORMALDEÍDO.**P <0,01 ESTATISTICAMENTE SIGNIFICANTES EM

RELAÇÃO AO CN DE ACORDO COM O TESTE DE DUNNETT. ........................................ 85

FIGURA 26: ANÁLISE COMPARATIVA DOS TESTES DE MICRONÚCLEO EM CÉLULAS

PULMONARES (TESTE CBMN) E EM CÉLULAS VEGETAIS (TRAD-MCN).*** P <0,001

ESTATISTICAMENTE SIGNIFICATIVOS ENTRE OS PERÍODOS DE AMOSTRAGEM DE ACORDO

COM O TESTE DE TUKEY. ....................................................................................... 86

FIGURA 27: VALORES MÁXIMOS, MÉDIOS E MÍNIMOS DOS FOCOS DE QUEIMADAS OBTIDOS

DURANTE O PERÍODO DE JANEIRO/1998 A JULHO/2014. FIGURA ADAPTADA DE INPE, 2014. .................................................................................................................. 86

FIGURA 28: CONCENTRAÇÕES DE MP10 E FOCOS DE QUEIMADAS OBTIDOS POR SATÉLITE

NO PERÍODO DE AMOSTRAGEM EM PORTO VELHO...................................87

FIGURA 29: CONCENTRAÇÃO MÉDIA E DESVIO PADRÃO DOS HIDROCARBONETOS

POLICÍCLICOS AROMÁTICOS ANALISADOS NAS AMOSTRAS DE PORTO VELHO.............. 88

FIGURA 30: HIDROCARBONETOS POLICÍCLICOS AROMÁTICOS OXIGENADOS IDENTIFICADOS

EM PORTO VELHO, REGIÃO DA AMAZÔNIA BRASILEIRA. ............................................ 91

FIGURA 31: IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DOS MONOSSACARÍDEOS MARCADORES DA

QUEIMA DE BIOMASSA NAS AMOSTRAS COLETADAS EM PORTO VELHO. ...................... 92

FIGURA 32: CONTRIBUIÇÃO DO LEVOGLUCOSANO NO MP10 COLETADO EM PORTO VELHO. . 92

FIGURA 33: SENSIBILIDADE DAS CÉLULAS A549 APÓS A EXPOSIÇÃO AO MATERIAL ORGÂNICO

DO MP10 ATMOSFÉRICO EM CONCENTRAÇÕES E TEMPOS DIFERENTES. CD: CONTROLE

DMSO (0,1%); HPA: MISTURA DOS HIDROCARBONETOS POLICÍCLICOS AROMÁTICOS

(30 NG/ML); RET: RETENO (30 NG/ML). ** P < 0,01 ESTATISTICAMENTE SIGNIFICANTE

EM RELAÇÃO AO CONTROLE NEGATIVO DE ACORDO COM O TESTE DE DUNNETT. ......... 93

FIGURA 34: DANOS AO DNA CAUSADO PELA EXPOSIÇÃO AO MP10 ORIUNDO DA QUEIMA DE

BIOMASSA NA AMAZÔNIA. CN: CONTROLE NEGATIVO (DMEM); CD: CONTROLE DMSO

(0,1%);HPA: MISTURA DOS HIDROCARBONETOS POLICÍCLICOS AROMÁTICOS (30

NG/ML); RET: RETENO (30 NG/ML). * P<0,05 E ** P<0,01 ESTATISTICAMENTE

SIGNIFICANTE EM RELAÇÃO AO CONTROLE NEGATIVO DE ACORDO COM O TESTE DE

DUNNETT. ............................................................................................................ 94

FIGURA 35: ALTERAÇÕES NO CICLO CELULAR APÓS A EXPOSIÇÃO AO MP10 ATMOSFÉRICO. 95

FIGURA 36: PROTEÍNAS DO CHECKPOINT CELULAR (P53 E P21) FORAM ATIVADAS APÓS A

EXPOSIÇÃO DO MP10 NO PERÍODO DE 24 HORAS.* P<0,05 ESTATISTICAMENTE

SIGNIFICANTE EM RELAÇÃO AO CONTROLE NEGATIVO DE ACORDO COM O TESTE DE

DUNNETT. ............................................................................................................ 96

FIGURA 37: AUMENTO DOS FOCI DE -H2AX APÓS O TRATAMENTO COM O MATERIAL

PARTICULADO. * P<0,05 ESTATISTICAMENTE SIGNIFICANTE EM RELAÇÃO AO CONTROLE

NEGATIVO DE ACORDO COM O TESTE DE DUNNETT. .................................................. 97

FIGURA 38: IMAGENS DO TESTE DE IMUNOFLUORESCÊNCIA PARA A AVALIAÇÃO DA MARCAÇÃO

HISTONA NAS CÉLULAS EXPOSTAS AO MP10. O 4',6-DIAMIDINO-2-

PHENYLINDOLE (DAPI) SE LIGA AO DNA (EM AZUL) E O ANTICORPO -H2AX (EM

VERMELHO). ......................................................................................................... 98

FIGURA 39: MORTE POR APOPTOSE APÓS O TRATAMENTO COM MATERIAL PARTICULADO

ANALISANDO A POPULAÇÃO DE CÉLULAS EM SUB-G1 (72 E 96 HORAS DE EXPOSIÇÃO).99

FIGURA 40: AUMENTO DOS FOCI DE H2AX APÓS 72 HORAS DE EXPOSIÇÃO AO MATERIAL

PARTICULADO. .................................................................................................... 100

FIGURA 41: AUMENTO NA DUPLA MARCAÇÃO DA -H2AX E CASPASE-3 APÓS O TRATAMENTO

COM O MATERIAL PARTICULADO POR 72 HORAS. .................................................... 101

FIGURA 42: IMAGENS DO TESTE PARA DETECÇÃO MORFOLÓGICA POR MICROSCOPIA DE

FLUORESCÊNCIA. A) CÉLULA NORMAL; B) APOPTOSE INICIAL; C) APOPTOSE TARDIA E

D) NECROSE. ..................................................................................................... 102

FIGURA 43: MATERIAL PARTICULADO EMITIDO PELAS QUEIMADAS NA REGIÃO AMAZÔNICA

CAUSA MORTE CELULAR POR APOPTOSE E NECROSE. ............................................. 103

FIGURA 44: MEDIANA DA DISTRIBUIÇÃO DO TAMANHO DOS AEROSSÓIS MEDIDOS EM PORTO

VELHO NO PERÍODO DE QUEIMADAS. OS CÍRCULOS REPRESENTAM OS VALORES MÉDIOS

E AS BARRAS REPRESENTAM PERCENTIS 10 E 90. FIGURA ADAPTADA DE ARTAXO ET

AL. (2013).......................................................................................................... 108

FIGURA 45: MODELO DE AÇÃO DO MATERIAL PARTICULADO ORIUNDO DE QUEIMA DE

BIOMASSA EM CÉLULAS DO PULMÃO HUMANO......................................................... 118

LISTA DE QUADRO

QUADRO 1: COMPARAÇÃO ENTRE AS CONCENTRAÇÕES DO MATERIAL PARTICULADO

INALÁVEL PARA DIFERENTES PAÍSES. ADAPTADO DE NEMMAR ET AL. (2013). .......... 25

LISTA DE TABELAS

TABELA 1: ALCANOS E HIDROCARBONETOS POLICÍCLICOS AROMÁTICOS (HPA) ENCONTRADOS EM ALTA FLORESTA. ....................................................................... 80

TABELA 2: VALORES DAS RAZÕES DIAGNÓSTICAS ENTRE HIDROCARBONETOS POLICÍCLICOS

AROMÁTICOS (HPA) OBTIDOS NA LITERATURA E NAS AMOSTRAS COLETADAS EM ALTA

FLORESTA. ........................................................................................................... 82

TABELA 3: VIABILIDADE DAS CÉLULAS A549 APÓS O TRATAMENTO COM O MATERIAL

ORGÂNICO EXTRAÍDO DO MP10 ATMOSFÉRICO. ........................................................ 83

TABELA 4: BAP-EQUIVALENTE CARCINOGÊNICO (BAP-TEQ) E MUTAGÊNICO (BAP-MEQ) PARA A EXPOSIÇÃO AOS HIDROCARBONETOS POLICÍCLICOS AROMÁTICOS (HPA) ORIUNDOS DAS QUEIMADAS NA REGIÃO AMAZÔNICA. ................................................ 90

LISTA DE ABREVIATURAS / SIGLAS

A549 Linhagem de células do pulmão humano Ac Acenafteno Ace Acenaftileno AFG Amostrador fino e grosso ANOVA Análise de Variância Ant Antraceno APHEIS Air Pollution and Health – A European Information System BaA Benzo(a)antraceno BaP Benzo(a)pireno BbF Benzo(b)fluoranteno BC Black carbono BeP Benzo(e)pireno BkF Benzo(k)fluoranteno BN Broto Nuclear Bper Benzo(g,h,i)perileno BSA Bovine Serum Albumin C Carbono CBMN Cytokinesis-block micronucleus CG Cromatografia gasosa Cm Carbono máximo CETESB Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental CN Controle negativo CO Monóxido de carbono CONAMA Conselho Nacional do Meio Ambiente CP Controle negativo Cri Criseno DAF Diacetato de fluoresceína DAR Doenças do Aparelho Respiratório DBA Dibenzo(a)antraceno DCM Diclorometano DIC Detector de ionização de chama DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium DMSO Dimetilsulfóxido DNA Ácido desoxirribonucleico DPOC Doença pulmonar obstrutiva crônica EM Espectrometria de massa EPA Environmental Protection Agency EROs Espécies Reativas de Oxigênio EUA Estados Unidos Fe Fenantreno Fl Fluoreno Fluo Fluoranteno G0 Estado quiescente das células no ciclo celular G1 Gap 1 G2 Gap 2 H Hidrogênio Hivol Amostrador de alto volume

HPA Hidrocarboneto Policíclico Aromático IARC International Agency for Research on Cancer IDN Índice de divisão nuclear InP Indeno (1,2,3,-cd)pireno INPE Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais IPC Índice Preferencial de Carbono M Mitose MAA Média Aritmética Anual MGA Média Geométrica Anual MN Micronúcleo MT Mato Grosso MTT 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide MP Material Particulado MP0,1 Material Particulado menor que 0,1 µm MP2,5 Material Particulado menor que 2,5 µm MP10 Material Particulado menor que 10 µm N Naftaleno nitro-HPA HPA nitrados NOx Óxido de nitrogênio O3 Ozônio oxi-HPA HPA oxigenados OMS Organização Mundial de Saúde PBS Tampão fosfato salino Pi Pireno PN Ponte Nucleoplasmática PTS RDD

Partículas Totais em Suspensão Resposta de Dano ao DNA

RH Recombinação Homóloga S Síntese SO2 Dióxido de enxofre SPSS Statistical Package for the Social Sciences Trad-MCN Micronúcleo em Tradescantia pallida eu União Européia XTT 2,3-Bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide WNA Wax Normal Alkane

SUMÁRIO

1) Introdução .............................................................................................. 20

1.1) Poluição Atmosférica ...................................................................... 20

1.2) Região Amazônica .......................................................................... 21

1.3) Material Particulado (MP) ................................................................ 23

1.3.1) Composição química do MP........................................................ 26

1.4) Impactos das emissões do material particulado na saúde humana 36

1.4.1) Mecanismos de ação do material particulado ............................. 39

2) Objetivos ................................................................................................ 53

2.1) Objetivo Geral ................................................................................. 53

2.2) Objetivos Específicos ...................................................................... 53

3) Material e Métodos ................................................................................ 54

3.1) Metodologia para a pesquisa realizada em Alta Floresta ................ 54

3.1.1) Caracterização da área de estudo .............................................. 54

3.1.2) Coleta do MP10 ............................................................................ 56

3.1.3) Análise gravimétrica .................................................................... 57

3.1.4) Análise do Black Carbon (BC) ..................................................... 57

3.1.5) Extração do material orgânico do MP10 ....................................... 58

3.1.6) Fracionamento das amostras e análises químicas...................... 59

3.1.7) Análises biológicas ...................................................................... 60

3.1.8) Análise estatística ....................................................................... 64

3.2) Metodologia para a pesquisa realizada em Porto Velho ................. 64

3.2.1) Caracterização da área de estudo .............................................. 64

3.2.2) Coleta do MP10 ............................................................................ 66

3.2.3) Extração do material orgânico do MP10 ....................................... 67

3.2.4) Análise dos Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos ................. 70

3.2.5) Análise dos monossacarídeos..................................................... 71

3.2.6) Cultura celular e teste de viabilidade ........................................... 72

3.2.7) Ensaio de cometa alcalino .......................................................... 73

3.2.8) Deteção da fragmentação do DNA e ciclo celular por citometria de fluxo 74

3.2.9) Detecção da -H2AX e caspase-3 por citometria de fluxo .......... 74

3.2.10) Extração de proteínas e Western Blot ....................................... 75

3.2.11) Ensaio de fluorescência para a detecção de apoptose e necrose................................................................................................................76

3.2.12) Análise estatística ..................................................................... 77

4) Resultados ............................................................................................. 78

4.1) Resultados da pesquisa realizada em Alta Floresta ....................... 78

4.1.1) Dados do Material Particulado (MP) e Black Carbon (BC) .......... 78

4.1.2) Análise química ........................................................................... 79

4.1.3) Testes biológicos ......................................................................... 83

4.2) Resultados da pesquisa realizada em Porto Velho ......................... 86

4.2.1) Dados do MP10 ............................................................................ 86

4.2.2) Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPA) e os seus derivados 88

4.2.3) Monossacarídeos marcadores da queima de biomassa ............. 91

4.2.4) Viabilidade celular ....................................................................... 93

4.2.5) Danos no DNA das células expostas ao material particulado ..... 94

4.2.6) Alterações no ciclo celular e ativação de checkpoints após a exposição ao material particulado ...................................................................... 95

4.2.7) Sinalização em resposta aos danos ao DNA .............................. 96

4.2.8) Análise dos tipos de morte celular em resposta ao dano no DNA 98

5) Discussão ............................................................................................ 104

5.1) Pesquisa realizada em Alta Floresta ............................................. 104

5.2) Pesquisa realizada em Porto Velho .............................................. 107

6) Considerações Gerais ......................................................................... 115

7) Conclusões .......................................................................................... 120

8) Referências.......................................................................................... 121

Introdução 20

Nilmara de Oliveira Alves Tese de doutorado - UFRN

1) Introdução

1.1) Poluição Atmosférica

A poluição atmosférica é um importante fator de risco ambiental no mundo,

principalmente para os grupos mais vulneráveis (crianças e idosos). Dentre os

possíveis contaminantes ambientais, a poluição do ar é aquela com maior alcance,

com capacidade de transportar partículas sem limites geográficos precisos

(FERREIRA, 2009). Dada a extensa variedade de fontes e processos que definem e

transformam a própria composição da poluição atmosférica, a compreensão de seu

impacto na saúde se torna um tópico de estudo desafiante.

Pode-se definir a poluição do ar como uma situação em que as substâncias

estão presentes em concentrações acima dos níveis normais do ambiente,

produzindo um efeito negativo nos seres humanos, animais, vegetais e materiais

(SEINFELD; WILEY, 2006).

Os poluentes atmosféricos podem ser emitidos por diferentes tipos de fontes.

As fontes de poluentes atmosféricos podem ser classificadas como naturais ou

antrópicas. Dentre as fontes naturais pode-se destacar: vulcão, maresia, evaporação

da vegetação, decomposição de matéria orgânica e incêndios. Por outro lado,

problemas graves de alterações do meio podem acontecer pela ação do homem,

tais como: a atividade industrial, o tráfego motorizado, a queima de biomassa e

outros (SEINFELD; WILEY, 2006).

Nos grandes centros urbanos, os veículos automotores estão entre as

principais fontes emissoras dos aerossóis e gases para a atmosfera. Soma-se a

isto, o crescimento das indústrias, a ressuspensão do solo e formação de aerossóis

secundários, que afetam de diversas formas a saúde humana e o ambiente

(CASTANHO; ARTAXO; F, 2001; CRIPPA et al., 2013).

Em contraste com as áreas urbanas, a Amazônia possui uma das regiões

menos impactadas por ações humanas. Porém, no período de seca, as queimadas

são responsáveis por emissões significativas de partículas de aerossóis para a

atmosfera que podem causar efeitos diretos e indiretos no clima e no funcionamento

do ecossistema amazônico (ARTAXO, 2002). As emissões de partículas finas

decorrentes das queimadas predominam no MP emitido para o ambiente,

Introdução 21


contribuindo de forma significativa para a alteração da composição química da

atmosfera amazônica, com implicações importantes em nível local, regional e global,

com valores que chegam a ultrapassar os limites observados em muitos centros

urbanos (ARTAXO, 2002; ARTAXO et al., 2006; CARMO et al., 2010).

1.2) Região Amazônica

A Amazônia representa mais da metade das florestas tropicais

remanescentes no planeta e compreende a maior biodiversidade do mundo (MALHI

et al., 2008). No Brasil, o bioma amazônico possui cerca de 5,5 milhões de km2, o

que corresponde aproximadamente 60% do território brasileiro (ARTAXO et al.,

2013). A atual área de abrangência da Amazônia Legal corresponde à totalidade dos

estados do Acre, Amapá, Amazonas, Pará, Rondônia (RO), Roraima, Tocantins e

parte dos estados do Mato Grosso (MT) e Maranhão.

A região Amazônica desempenha um papel vital na manutenção da

biodiversidade, na hidrologia e no clima regional. Entretanto, desde meados do

século XX, a bacia Amazônica tem passado por mudanças devido à expansão

agrícola, a exploração da madeira e ao crescimento urbano (RIZZO et al., 2013;

SOARES-FILHO et al., 2006).

Estas atividades humanas podem ter efeitos globais no balanço do carbono,

nas concentrações de gases de efeito estufa, nas partículas de aerossóis e no poder

de oxidação da atmosfera. Estudos recentes mostram que as interações entre o

desmatamento, o fogo e as secas intensas podem potencialmente levar a perdas de

armazenamento do carbono e as mudanças nos padrões de precipitações regionais,

aumentando a inflamabilidade da floresta (DAVIDSON et al., 2012).

As partículas de aerossóis de origem natural na Amazônia, encontradas nas

regiões da bacia onde a influência de atividades antrópicas é pequena, são uma

mistura de emissões naturais da floresta, poeira do solo e transporte de partículas

de aerossóis marinho. Estas partículas em regiões de floresta não impactadas são

emitidas diretamente sob a forma de grãos de pólen, bactérias, fragmento de folhas,

excrementos e fragmentos de insetos, além de processos de conversão gás-

partícula (ARTAXO et al., 1994, 1998). Além disso, uma contribuição importante de

Introdução 22


partículas provenientes de fora da bacia amazônica é através do transporte de

poeira do Saara (ARTAXO et al., 1998; FORMENTI et al., 2001).

Em condições naturais, as partículas o número de partículas finas inalável na

Amazônia é de cerca de 200 a 300 partículas/cm3 (MARTIN et al., 2010b). No

entanto, durante a estação seca, as condições atmosféricas mudam devido às

emissões de partículas em larga escala resultantes da queima de biomassa em

várias regiões da Amazônia. Neste cenário, o número de partículas aumenta

evidentemente, com cerca de 15.000 a 30.000 partículas/cm3 (ARTAXO, 2002).

Na Amazônia, a ocorrência do fogo é principalmente de origem antrópica.

Devido às altas taxas de precipitações, a ocorrência de incêndios naturais são

eventos raros na região (BOWMAN et al., 2011). No período da seca, grandes áreas

de florestas naturais são convertidas em pastagem e a principal ferramenta utilizada

por fazendeiros para remover a biomassa é o fogo. Também, as queimadas são

praticadas para fins diversos na agropecuária, nos desmatamentos para a retirada

da madeira e no preparo do corte manual em plantações de cana-de-açúcar

(ARTAXO et al., 2013; FUZZI et al., 2007).

É importante destacar que as duas mais severas secas na Amazônia no

último século ocorreu nos anos de 2005 e 2010. Apesar do maior número de

incêndios em 2010, houve um menor número de queima de florestas quando

comparado com o ano de 2005 na região. Tal evento está associado com a

diminuição do desmatamento florestal detectados de acordo com o Projeto PRODES

– Monitoramento da Floresta Amazônica Brasileira por Satélite. Estes incêndios

ocorridos em 2010 estão associados com um grande número de queima de savanas

(TEN HOEVE et al., 2012).

Assim, uma grande quantidade de poluentes gerados pelas queimadas cobre

todo o arco do desmatamento da Amazônia. A pluma da fumaça se estende por

milhões de quilômetros, cobrindo uma grande parte da Amazônia e da América do

Sul, com significativos efeitos na saúde da população (ANDREAE, 1993). Os

aerossóis da queima de biomassa podem se deslocar por grandes distâncias e

influenciar áreas distantes das regiões de origem (ANDREAE et al., 2001). Logo, a

exposição humana às queimadas não necessariamente ocorre no local onde o foco

da queima está presente.

Introdução 23


Os efeitos dos aerossóis emitidos pela queima de biomassa para a saúde

humana são significantes no arco de desmatamento da Amazônia Brasileira

(CARMO; ALVES; HACON, 2013; DE FARIAS et al., 2010; DE OLIVEIRA et al.,

2012; ROSA et al., 2008). Apesar de anos de estudos científicos sobre os impactos

dos poluentes atmosféricos e a atenção da mídia em relação aos desmatamentos e

incêndios florestais, acidentais ou intencionais, os potenciais efeitos à saúde das

populações tem sido pouco estudado pela comunidade científica no Brasil

(GONÇALVES, 2010).

Tal fato provavelmente acontece devido aos problemas de infraestrutura no

local, tais como deficiências nos serviços de saúde locais e dificuldades no

monitoramento de indicadores de exposição em uma região de proporções

continentais e dificuldade de acesso a muitas áreas (CARMO; ALVES; HACON,

2013).

Dentre os diversos poluentes emitidos pela queima de biomassa destaca-se o

MP, pois estas partículas podem alcançar as vias respiratórias inferiores, com

importantes efeitos na saúde (DONALDSON et al., 2001a; POPE, 2000).

Recentemente, a International Agency for Research on Cancer (IARC), vinculado

com a Organização Mundial de Saúde (OMS) classificou a poluição atmosférica

como carcinogênicos para os humanos, colocando o MP como compostos

carcinogênicos do Grupo 1, principalmente pelas ocorrências de tumores nos

pulmões e na bexiga (IARC, 2013).

1.3) Material Particulado (MP)

O tamanho e a composição do MP dependem das fontes de emissão e dos

processos físico-químicos que ocorrem na atmosfera. O tamanho das partículas é,

em geral, expresso em relação ao seu tamanho aerodinâmico. As partículas

superiores a 10 µm, normalmente ficam depositadas nas cavidades oral e nasal. As

partículas inaláveis são aquelas com diâmetro aerodinâmico igual ou inferior a 10

µm (MP10). Estas partículas são dividas em grupos: as partículas grossas, com

diâmetro aerodinâmico entre 2,5 e 10 m; as partículas finas, com diâmetro

aerodinâmico menor que 2,5 m (MP2,5) e as partículas ultrafinas, com diâmetro

Introdução 24


aerodinâmico menor que 0,1m (MP0,1) (CORMIER et al., 2006; NEMMAR et al.,

2013) (Figura 1).

Figura 1: Distribuição do material particulado nas vias aéreas com relação ao seu tamanho aerodinâmico. Figura adaptada de NEMMAR et al. (2013).

Ao nível internacional as medidas de controle emissões do MP inalável

baseou-se no fato de que estas partículas podem alcançar as vias respiratórias

inferiores, atingindo os alvéolos pulmonares e causando efeitos negativos na saúde

(DONALDSON et al., 2001a; POPE, 2000). Em função disso, a OMS recomenda que

a concentração média do MP10 e MP2,5, em amostras ambientais de 24 horas, não

ultrapasse 50 e 25 µg.m-3, respectivamente.

No Brasil, os padrões de qualidade do ar são estabelecidos pelo Conselho

Nacional de Meio Ambiente (CONAMA) e não houve atualizações desde que foram

estabelecidos em 1990. Embora o tamanho das partículas presentes no MP seja

conhecido como determinante para a magnitude do agravo à saúde, no Brasil a

legislação vigente não tem nenhum parâmetro para as concentrações do MP2,5.

Introdução 25


No Quadro 1 pode-se observar os padrões diários e anuais de qualidade do

ar para o MP10 e MP2,5 em diferentes países. A OMS recomenda que a

concentração média de MP10, em amostras de 24 horas, não ultrapasse o limite de

50 µg.m-3, valor três vezes menor do que o previsto pela legislação brasileira.

Quadro 1: Comparação entre as concentrações do material particulado inalável para diferentes países. Adaptado de NEMMAR et al. (2013).

Origem

MP10 (µg.m-3)

MP2,5 (µg.m-3)

Anual Diária Anual Diária

OMS 20 50 10 25 União Europeia 40 50 25 - Estados Unidos 50 150 12 35 Califórnia 20 50 15 65 Japão 100 12 65 México 50 120 15 65 África do Sul 60 180 15 65 Índia (população sensível/residencial/industrial)

50/60/120 - - -

China (Classes I,II e III) 40/100/150 50/150/250 - 35 Brasil 50 150 - - OMS: Organização Mundial de Saúde

As lacunas normativas constatadas, aliadas aos problemas institucionais,

técnicos e econômicos, têm levado a insuficiência do monitoramento da qualidade

do ar no Brasil. Em um recente levantamento feito pelo Instituto Nacional de Energia

e Meio Ambiente no Brasil, constatou-se que apenas doze Estados da Federação

têm algum tipo de monitoramento de qualidade do ar. Todavia, a maior parte dessas

redes enfrentam dificuldades de manutenção, com muitas séries de dados não

representativas e lacunas temporais importantes de operação (SANTANA et al.,

2012).

Ainda dentro desse contexto, no Brasil, país onde aproximadamente 60% do

território correspondem ao bioma amazônico, não há nenhuma legislação de

qualidade do ar estabelecida para as emissões de queima de biomassa. Apesar dos

desafios, não se pode esquecer que na região amazônica, com circunstâncias

geográficas e ambientais distintas do restante do país brasileiro, aliadas a um

processo histórico de ocupação do território, o uso do fogo expõe a cada ano, uma

Introdução 26


grande parcela da população tornando-as vulneráveis aos seus efeitos

(GONÇALVES, 2010).

Estudos mostram que a exposição aos extratos obtidos no MP atmosférico,

inclusive a níveis abaixo do que é permitido pela OMS, são capazes de causar

diversos efeitos na saúde, tais como: aumento da resposta pró-inflamatória

(HUTTUNEN et al., 2012); danos ao DNA (CORONAS et al., 2009; DE OLIVEIRA

ALVES et al., 2011); estresse oxidativo e apoptose (MARTIN et al., 2010a).

Nesse sentido, destaca-se a pesquisa publicada por BALLESTER e

colaboradores (2008) realizada em 26 cidades europeias através dos dados obtidos

pelo grupo APHEIS (Air Pollution and Health – A European Information System)

demonstrou que a estimativa de redução nos níveis de MP2,5 anuais está associado

com a redução na taxa de mortalidade entre as pessoas com 30 anos de idade.

A habilidade do corpo em se proteger das partículas inaladas e a

susceptibilidade individual aos aerossóis estão ligados tanto ao tamanho quanto à

composição química das partículas (BONETTA et al., 2009; DONALDSON et al.,

2001b; KELLY; FUSSELL, 2012). Portanto, é importante buscar a identificação dos

compostos presentes nos aerossóis de uma determinada fonte de emissão.

1.3.1) Composição química do MP

Uma fração significativa do aerossol no ambiente é de origem antrópica.

Dentre os compostos químicos conhecidos no MP podem-se destacar: sulfato,

amónio, nitrato de sódio, cloreto, metais traços, material carbonáceo, elementos da

crosta terrestre e água (SEINFELD; WILEY, 2006).

A fração carbonácea dos aerossóis consiste tanto do carbono elementar

como do carbono orgânico. O carbono elementar, também chamado de Black

Carbon, é emitido diretamente na atmosfera, produzido principalmente pela queima

incompleta de combustíveis e biomassa. A presença significativa dessas partículas

que absorvem a radiação contribui para a redução da visibilidade e são

responsáveis por efeitos adversos para a saúde humana, tais como: problemas

respiratórios e cardiovasculares (SEINFELD; WILEY, 2006; ZANOBETTI;

SCHWARTZ, 2006).

Introdução 27


A composição do carbono orgânico do MP é bastante complexa. Uma

grande variedade de compostos orgânicos já foram identificados no MP inalável

oriundo da queima de biomassa, tais como: n-alcanos , n-alcenos, n-alcanóis, n-

alcanais, ácidos alcanóicos, ácidos alcenóicos, ácidos alcanodióicos, metil-

alcanoatos, etil-alcanoatos, metil-alcenoatos, guaiacol, guaiacol substituídos,

seringóis, seringóis substituídos, outros benzenos e fenóis substituídos, dímeros e

lignanas, hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPA), HPA alquilados, HPA

oxigenados (oxi-HPA), HPA nitrogenados (nitro-HPA), levoglucosano, manosano,

monometil-inositol, cumarinas, flavonóides, furanos, ácidos resínicos, diterpenóides,

fitosteróides, triterpenóides e outros (FINE; CASS; SIMONEIT, 2001, 2004).

Dentre os compostos orgânicos citados acima, serão destacadas informações

sobre o levoglucosano e os seus estereoisômeros; os n-alcanos; os HPA e os seus

derivados.

1.3.1.1) Monossacarídeos traçadores de queima de biomassa

O levoglucosano (1,6-anidro-β-D-glucopiranose), o manosano (1,6-anidro-β-

D-manopiranose) e o galactosano (1,6-anidro-β-D-galactopiranose) são bons

marcadores moleculares para a queima de biomassa, pois são derivados da pirólise

da celulose (composto presente em todos os tipos de madeira) e da hemicelulose

em altas temperaturas (acima de 300ºC), não sendo produzido por outros processos

de degradação (SIMONEIT et al., 1999) (Figura 2).

O levoglucosano é emitido em grande escala e é bastante estável na

atmosfera, facilitando a sua detecção a distâncias consideráveis da fonte de

emissão (GIANNONI et al., 2012). O percentual de levoglucosano formado com

relação à concentração total de componentes analisados na fumaça, proveniente da

queima controlada de espécies representativas da vegetação da floresta amazônica,

variou de 10 a 92% para gimnospermas, de 20 a 100% para angiospermas e de 22 a

100% para gramíneas (SIMONEIT et al., 1999). Esses autores também observaram

que a eficiência na formação do levoglucosano depende da intensidade da chama,

da aeração, da duração e temperatura do fogo e do tipo de vegetação queimada.

Introdução 28


Figura 2: Estrutura dos compostos provenientes da pirólise da celulose. Figura adaptada de SAARNIO (2013).

Na Amazônia, na pesquisa realizada por SCHKOLNIK; RUDICH (2006), as

concentrações de levoglucosano no MP2,5 variaram de 0,08 a 5,9 μg.m-3 durante a

estação seca, caindo abaixo do limite de detecção durante a estação chuvosa,

quando há menor número de focos de incêndio. Este composto também foi

encontrado nas frações finas das partículas, indicando ser um produto primário de

combustão.

Na Áustria, pesquisadores investigaram a contribuição da queima de

biomassa nos aerossóis durante um ano (CASEIRO et al., 2009). Os autores deste

estudo observaram que a presença do levoglucosano é predominante na área

residencial, sendo a queima da madeira o principal contribuinte para o MP orgânico.

Esse resultado pode ser explicado pelo uso intenso de lareiras no inverno.

Em Pequim (China), os pesquisadores buscaram compreender a relação

entre o levoglucosano e outros marcadores de queima de biomassa, como por

exemplo, o potássio e o manosano. A comparação mostrou que com a razão entre o

Introdução 29


levoglucosano e o potássio é possível distinguir as emissões da queima de resíduos

de colheita e madeira enquanto que com o estudo da razão entre levoglucosano,

manosano e galactosano, pode-se diferenciar o tipo de queima de madeira. Em

suma, com esta análise, é possível distinguir os diferentes tipos de queima de

biomassa e as suas origens (CHENG et al., 2013).

1.3.1.2) Hidrocarbonetos alifáticos

Os hidrocarbonetos alifáticos correspondem a uma ampla classe de

compostos orgânicos na qual uma das características é a baixa polaridade destas

moléculas. A esta classe pertencem os alcanos, ciclo-alcanos, alcenos, ciclo-

alcenos, alcinos, terpenos, hopanos, esteranos e outros compostos (ALVES, 2005).

Em particular, os n-alcanos são hidrocarbonetos alifáticos saturados, de

cadeia aberta não ramificada, que podem ser emitidos por fontes biogênicas ou

antrópicas. Na Figura 3 está representado a estrutura de um alcano com 13

carbonos.

Os n-alcanos são quimicamente estáveis, pois sua distribuição, reatividade e

volatilidade são relativamente baixas. Estas características favorecem o estudo

destes compostos como importantes traçadores no monitoramento do transporte

atmosférico e da origem da partícula (OMAR et al., 2007).

Estes hidrocarbonetos alifáticos apresentam perfis de distribuição peculiares.

Os compostos com forte predominância dos homólogos ímpares e alto índice

preferencial de carbono representam n-alcanos típicos de emissões biogênicas. Por

outro lado, os compostos derivados de combustíveis fósseis ou queima de biomassa

mostram um perfil onde não existe predominância de homólogos ímpares ou pares

(MAGALHÃES, 2005).

Destaca-se também os alcanos isoprenóides: pristano e fitano (Figura 3), que

são hidrocarbonetos alifáticos de cadeia ramificada com estrutura molecular comum

derivada do isopreno. O pristano e o fitano são produzidos a partir da degradação do

fitol, que é um álcool abundante na natureza constituinte da clorofila-a (ANDREOU;

RAPSOMANIKIS, 2009; MAGALHÃES, 2005).

Introdução 30


Figura 3: Representação da estrutura de um alcano com 13 carbonos (tridecano) e dos alcanos isoprenóides: pristano e fitano.

O Índice Preferencial de Carbono (IPC) é um parâmetro diagnóstico que

representa uma relação de proporcionalidade entre os compostos com o número par

de carbonos e os compostos com o número ímpar de carbonos (Equação 1).

Calcula-se o IPC com o intuito de prever se os n-alcanos são de origem biogênica

ou antropogênica. Os valores de IPC iguais ou menores à unidade mostram o

predomínio das emissões antropogênicas (ALVES, 2008; OMAR et al., 2007)

IPC = ∑ Concentração dos homólogos de carbono ímpares (1)

∑ Concentração dos homólogos de carbono pares

O Carbono máximo (Cm) representa o n-alcano com a maior concentração na

série homóloga e fornece uma importante indicação da contribuição biogênica ou

antrópica. Com a identificação do Cm é possível especificar na série dos n-alcanos

as assinaturas biogênicas (Cm igual ou maior que a C27), petrogênicas (Cm menor

que C23) e mistas (C23 > Cm < C26) (ALVES, 2008).

Além disso, com o estudo dos n-alcanos também é possível avaliar a

contribuição relativa das emissões biogênicas através do índice Wax Normal Alkane

(WNA), que pode ser estimado para os compostos individualmente de acordo com a

equação 2. Os valores negativos devem ser substituídos por zero (LADJI et al.,

2009):

Introdução 31


WNA (*Cn) = Cn – 0,5 x (Cn-1 + Cn +1) (2)

*Cn = concentração do n-alcano de acordo com o número de carbonos

Na pesquisa realizada em duas áreas urbanas na Algéria, LADJI e

colaboradores (2009) fizeram a análise de mais de 90 compostos orgânicos. Dentre

os compostos estudados, a análise dos n-alcanos mostrou um predomínio da

influência antrópica. O estudo também mostrou que com a análise do índice WNA,

as cêras de plantas contribuem com poucas emissões de n-alcanos para a

atmosfera, predominando as emissões de veículos automotores.

No estudo feito na região central da Amazônia, observou-se que na análise

dos hidrocarbonetos alifáticos há um predomínio das emissões biogênicas. Na

distribuição da série dos n-alcanos do C16 ao C35 , o Cm foi o C29. Os autores

concluíram que há uma forte contribuição de n-alcanos oriundos das cêras das

plantas na região Amazônica (SIMONEIT; CARDOSO; ROBINSON, 1990).

1.3.1.3) Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPA) e os seus

derivados

Os HPA são um grupo de compostos orgânicos que contêm apenas carbono

(C) e hidrogênio (H) em sua estrutura e são constituídos por dois ou mais anéis

aromáticos. Eles são considerados como poluentes orgânicos persistentes e são

formados principalmente por processos de combustão incompleta tais como: a

combustão da queima de biomassa, emissões veiculares, industriais e outros

(KATSOYIANNIS; SWEETMAN; JONES, 2011; SIMONEIT, 2002).

Para a United States Environmental Protection Agency (US-EPA), os 16 HPA

considerados importantes no monitoramento ambiental de poluentes orgânicos

prioritários são: Naftaleno (N), Acenaftileno (Ace), Acenaftaleno (Ac), Fluoreno (Fl),

Fenantreno (Fe), Fluoranteno (Fluo), Antraceno (Ant), Criseno (Cri), Pireno (Pir),

Benzo(a)antraceno (BaA), Benzo(a)pireno (BaP), Benzo(b)fluoranteno (BbF),

Benzo(k)fluoranteno (BkF), Dibenzo(a,h)antraceno (DBA); Benzo(g,h,i)perileno

(BPer) e Indeno (1,2,3,-cd)pireno (InP) (Figura 4).

Introdução 32


Figura 4: Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos considerados prioritários no monitoramento ambiental de poluentes orgânicos pela Environmental Protection Agency (EPA). Figura original de DE OLIVEIRA ALVES (2010).

Dentro deste contexto, ressalta-se que o Reteno (Ret) é um HPA bastante

utilizado como marcador para a queima de biomassa, sendo encontrado no MP

atmosférico. Porém, este composto não está incluso na classificação dos HPA

prioritários de acordo com a US-EPA.

Uma das principais preocupações com relação a presença dos HPA na

atmosfera está relacionada com o seu potencial de exposição e os diversos efeitos

na saúde humana, pois alguns destes compostos têm sido caracterizados como

carcinogênicos, mutagênicos e teratogênicos (BOSTRÖM et al., 2002; CALLÉN;

LÓPEZ; MASTRAL, 2012; OKONA-MENSAH et al., 2005).

A US-EPA (2001) classificou sete HPA (BaP, BaA, Cri, BbF, BkF, DBA, InP)

como prováveis cancerígenos para os seres humanos (Grupo 2B) . Estes mesmos

sete HPA também foram classificados pela IARC, onde o BaP e BaA são

considerados como prováveis agentes carcinógenos para os seres humanos (Grupo

2A) enquanto que os outros HPA foram classificados como possivelmente

carcinogênicos para os seres humanos (Grupo 2B) (IARC, 2010).

Introdução 33


Embora o conhecimento da concentração do poluente seja importante para

indicar os riscos de exposição à saúde humana, ainda não foi definido a

concentração aceitável no ambiente para a maioria dos HPA. Entretanto, alguns

países monitoram as concentrações do BaP.

De acordo com o Expert Panel on Air Quality Standards (EPAQS, 1999), o

padrão de qualidade do ar para o BaP no Reino Unido é de 0,25 ng.m-3. Esta

concentração foi adotada com um objetivo estratégico para a melhoria da qualidade

do ar a ser alcançado até o dia 21 de dezembro de 2010 na Inglaterra, Escócia e

País de Gales. Na Europa, a DIRECTIVE OF THE EUROPEAN 2004/107/EC (2004)

estabeleceu para o BaP um valor igual a 1,0 ng.m-3 na concentração média do MP10.

Várias abordagens têm sido desenvolvidas para obter uma avaliação mais

precisa do potencial risco de exposição a uma mistura complexa de HAP utilizando

fatores de equivalência tóxica baseados no BaP. Um deles é o fator de equivalência

carcinogênico (TEF - carcinogenic equivalency factors) (CALLÉN et al., 2012;

COLLINS et al., 1998; JUNG et al., 2010). Além disso, a mutagenicidade de HPA

individuais relativo ao BaP também tem sido avaliado usando o fator de equivalência

mutagênico (MEF - mutagenic equivalency factor) proposto por DURANT et al.

(1996,1999).

Os valores de TEF e MEF combinados com as concentrações dos HPA

atmosféricos têm sido utilizado para calcular os equivalentes carcinogênicos (TEQ)

e os equivalentes mutagênicos (MEQ) em amostras ambientais. Dessa forma, além

do risco de exposição do BaP, é possível calcular o risco de exposição para outros

HPA que também causam danos à saúde (CALLÉN et al., 2012; JUNG et al., 2010).

A Figura 5 mostra uma visão geral dos principais eventos propostos para o

aparecimento de neoplasmas causados pela exposição aos HPA.

Introdução 34


Figura 5: Visão geral das possíveis etapas para a formação de neoplasma ocasionado pelos Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPA). Figura adaptada de US-EPA (2010).

Além dos impactos na saúde causados pelos HPA, estes compostos podem

sofrer reações na atmosfera, tais como: foto-oxidação, nitração, sulfonação e outros.

Quando isso acontece, estes produtos formados podem ser mais tóxicos que os

seus precursores (MARINO; CECINATO; SISKOS, 2000).

Nesse contexto, duas classes de derivados dos HPA vêm sendo bem

estudadas: os HPA nitrados (nitro-HPA) e os HPA oxigenados (oxi-HPA). Os nitro-

HPA são compostos que contém um ou mais dois grupos nitro (NO2) ligados à

molécula de um HPA enquanto que os oxi-HPA são compostos que contém átomos

de oxigênio ligados à molécula do HPA precursor (SIMONICH; MOTORYKIN;

JARIYASOPIT, 2011). Na Figura 6 estão alguns exemplos de nitro e oxi-HPA.

Introdução 35


Figura 6: Representação da estrutura de dois Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPA) oxigenados e nitrogenados.

Os nitro e oxi-HPA podem ser emitidos diretamente pela combustão

incompleta de combustíveis fósseis, queima de biomassa, processos industriais,

incineradores entre outros. Adicionalmente, os derivados dos HPA também podem

ser formados na atmosfera pelas reações com outros compostos presentes no ar,

por exemplo: O3, NOx, SO2, N2O5, radicais OH na presença de luz (KARAVALAKIS

et al., 2011; RINGUET et al., 2012).

Em um estudo realizado em três cidades do estado de São Paulo foram

identificadas concentrações de HPA e dos seus derivados. As amostras coletadas

em Piracicaba e Araraquara tiveram níveis mais altos de oxi-HPA quando

comparadas com os resultados das amostras coletadas na cidade de São Paulo

(FRANCO, 2006). O trabalho relata que este dado deve estar associado à queima

da cana-de-açúcar que ocorrem nas cidades de Piracicaba e Araraquara.

Corroborando com este dado, na literatura, já foi relatado que a queima de biomassa

aumenta a capacidade oxidante da atmosfera, aumentando os níveis de ozônio e

consequentemente, os níveis de oxi-HPA podem ser mais elevados (LAZUTIN et al.,

1996; MI et al., 1998).

Introdução 36


No trabalho publicado por SIENRA (2006) foram identificados oxi-HPA na

atmosfera de Santiago, no Chile. Os resultados mostram que a concentração de

compostos mutagênicos e carcinogênicos foi bem maior quando comparada com

outras cidades, indicando que a população da cidade está exposta a uma grande

quantidade de compostos tóxicos presentes na atmosfera.

De fato, tanto os HPA como os seus derivados, apresentam uma grande

importância pelo seu potencial mutagênico e/ou carcinogênicos já identificados

(KAMEDA, 2011). Esta é uma das principais razões para preocupações acerca dos

níveis destes compostos na atmosfera.

1.4) Impactos das emissões do material particulado na saúde humana

Novos dados publicados pela OMS estimam que, em 2012, cerca de 7

milhões de pessoas morreram como resultado da exposição à poluição do ar, sendo

responsável por uma em cada oito mortes no mundo. Esta publicação confirma que

a poluição atmosférica é hoje o maior risco mundial de saúde ambiental (WHO,

2014).

São várias as consequências na saúde da exposição humana aos poluentes

atmosféricos, tais como: câncer; diminuição da função pulmonar; aumento das

doenças cardiovasculares; alergias; asma; efeitos adversos na reprodução e no

nascimento (INSTITUTE HEALTH EFFECTS, 2010). Estudos estimam que a fração

do MP sozinho causa um excesso de 3,1 milhões de morte no mundo como

resultado das doenças cardiopulmonares e câncer de pulmão em adultos e

infecções respiratórias agudas em crianças (LIM et al., 2012).

Em outubro de 2013, 24 especialistas de 11 países reuniram-se na IARC

(Lyon, França) para avaliar o efeito carcinógeno da poluição atmosférica em áreas

externas. Esta avaliação foi a última de uma série de estudos que começou a

especificar os produtos de combustão e fontes da poluição do ar, concluindo que o

MP é o grande responsável na ocorrência de câncer de pulmão e bexiga (LOOMES

et al., 2013).

Os resultados referentes a carcinogenicidade ocasionada pela exposição aos

poluentes atmosféricos, especificamente ao MP, são bem consistentes em estudos

epidemiológicos (KREWSKI et al., 2009; RAASCHOU-NIELSEN et al., 2013) e nas

Introdução 37


pesquisas com animais em laboratório (EPSTEIN; FUJII; ASAHINA, 1979; REYMÃO

et al., 1997). Além disso, é importante ressaltar que o aumento do risco de câncer do

pulmão também foi observado em áreas urbanas em que as concentrações de MP2,5

estavam abaixo dos níveis permitidos pelas legislações vigentes (RAASCHOU-

NIELSEN et al., 2013).

Além do câncer de pulmão, a exposição crônica ao MP2,5 é um fator de risco

nos casos de mortalidade por doenças cardiopulmonares (ENOMOTO; TIERNEY;

NOZAKI, 2008). Até mesmo se a inalação de MP2,5 ocorrer durante alguns minutos

ou horas, existe a probabilidade de infarto agudo do miocárdio, isquemia cardíaca,

arritmias, insuficiência cardíaca e morte súbita (BROOK, 2008). Em destaque, cita-

se o trabalho realizado por RIVERO et al. (2005), que ao expor ratos wistar ao MP2,5

da cidade de São Paulo durante 60 minutos, os autores observaram a diminuição da

variabilidade da frequência cardíaca nos animais.

Ainda há pesquisas que mostram que a poluição do ar está interferindo

negativamente no processo reprodutivo (SRAM, 1999). Estudos toxicológicos

mostram que os HPA e os metais pesados, também encontrados no MP atmosférico,

são ovotóxicos e disruptores endócrinos potenciais, que interferem com a função

ovariana, produzindo a depleção dos folículos, interrupção do crescimento folicular e

falência ovariana precoce (BORMAN et al., 2000; MILLER et al., 2004).

Dentro deste contexto, VERAS et al. (2008) demonstrou que os aerossóis

gerados por tráfego urbano pode alterar a morfologia funcional da placenta em

camundongos expostos. Outros trabalhos deste mesmo grupo de pesquisa relatam

que a exposição ao MP inalável urbano afeta negativamente funções e estágios do

processo reprodutivo (VERAS et al., 2009, 2010).

Na Malásia, MOTT et al. (2005) investigou os efeitos da exposição humana à

fumaça dos incêndios florestais ocorridos no sudeste asiático no ano de 1997. As

análises de séries temporais mostram um aumento no número de internações

respiratórias relacionadas com o incêndio, principalmente os de doença pulmonar

obstrutiva crônica e asma.

Introdução 38


Ainda que a associação entre as concentrações do MP inalável e os seus

efeitos sobre a saúde humana tenha sido objeto de estudos de inúmeros grupos de

pesquisas, permanece em aberto a questão referente aos mecanismos biológicos

envolvidos na gênese de algumas doenças humanas ligadas à poluição atmosférica

(DEMARINI, 2013; DEMETRIOU et al., 2012).

Nesse sentido, as medições de marcadores biológicos de dose e efeito pode

melhorar a investigação dos efeitos na saúde de várias tipos de exposições,

incluindo a poluição do ar. Dessa forma, é possível fazer uma melhor avaliação da

exposição, contribuindo para a compreensão dos mecanismos assim como pode

fornecer avanços nos estudos biológicos e na investigação da susceptibilidade

individual (VINEIS; HUSGAFVEL-PURSIAINEN, 2005).

Na revisão sobre biomarcadores de exposição à poluição do ar e a sua

relação com o câncer de pulmão, DEMETRIOU e colaboradores (2012) relatam que

os biomarcadores podem refletir cada etapa em uma via causal da doença após à

exposição. Na Figura 7 são mostrados os marcadores biológicos e os seus

caminhos para o câncer.

Figura 7: Biomarcadores de exposição e os efeitos da poluição. Adaptado de DEMETRIOU et al. (2012).

Ressalta-se que na patogênese do câncer de pulmão, para o mecanismo

central são considerados os danos ao DNA e o estresse oxidativo assim como a

resposta inflamatória após a exposição aos poluentes. Tais eventos podem causar

danos cromossômicos e mutações. Estas mudanças junto com a regulação gênica

alterada, pode levar a perda do controle do ciclo celular e a instabilidade genômica

(DEMETRIOU et al., 2012; VINEIS; HUSGAFVEL-PURSIAINEN, 2005).

Introdução 39


1.4.1) Mecanismos de ação do material particulado

De fato, a poluição atmosférica é um sério risco para a saúde humana e dos

ecossistemas que estão expostos. A população que mora em regiões contaminadas

por poluentes aéreos sofrem uma exposição crônica, já que inalam cerca de 10.000

a 20.000 litros de ar por dia. Isso significa que mesmo em concentrações baixas, as

toxinas presentes nos aerossóis pode representar um risco para a saúde

(SCARPATO et al., 1993).

Logo, é importante conhecer os mecanismos nos quais as partículas inaladas

podem ocasionar as doenças respiratórias, inclusive a ocorrência do câncer de

pulmão. Os grandes desafios dos estudos relacionados aos mecanismos de ação

dos aerossóis são: i) identificar os compostos responsáveis pelos diversos efeitos da

poluição atmosférica na saúde e ii) desvendar como estas partículas se comportam

no organismo humano. São inúmeras variáveis que podem influenciar a ocorrência

de agravos à saúde (DEMETRIOU et al., 2012; KELLY; FUSSELL, 2012; VINEIS;

HUSGAFVEL-PURSIAINEN, 2005). Porém, o primeiro passo é compreender como

estas partículas se comportam em nível celular e molecular.

Sabendo que os resultados de carcinogenicidade em humanos e animais são

fortemente suportados por evidências de danos no material genético (BONASSI et

al., 2008; DEMARINI, 2013; LOOMES et al., 2013), são de extrema importância a

utilização de biomarcadores genotóxicos e mutagênicos no estudo dos efeitos

ocasionados pela exposição ao MP.

Na busca da identificação dos riscos impostos ao ambiente por

contaminantes, vários bioensaios têm sido realizados para avaliar os principais

efeitos associados ao material genético (ZEIGER, 2010), tais como: mutações

gênicas (substituições de base, deleções e inserções) e mutações cromossômicas

(clastogenicidade – alterações cromossômicas estruturais e aneuploidia – alterações

cromossômicas numéricas).

Para a análise genotóxica, destaca-se o teste cometa. É um ensaio específico

para a detecção de quebras de fita do DNA (SPEIT; HARTMANN, 2005). No Brasil,

pesquisadores investigaram os efeitos genotóxicos causados pelo extrato de HPA

provenientes da atmosfera urbana da região metropolitana de Porto Alegre utilizando

o teste cometa. Os resultados mostraram que a investigação dos danos ao DNA nas

Introdução 40


células de fibroblastos do pulmão causadas pelo extrato orgânico das partículas

aéreas permitiu avaliar os efeitos genotóxicos dos HPA associados com a

sazonalidade da região (TEIXEIRA et al., 2012).

Para avaliar a atividade mutagênica associada ao MP inalável destaca-se o

teste de Ames, que utiliza linhagens específicas de Salmonella typhimurium

(MARVIN; HEWITT, 2007). Trabalhos investigando o efeito dos extratos orgânicos

de MP10 obtiveram valores mais significativos na linhagem de Salmonella que são

sensíveis aos compostos orgânicos (YG1041), sugerindo que os nitro e oxi HPA

exerceram um papel fundamental na atividade mutagênica dessas amostras

(UMBUZEIRO et al., 2008a, 2008b).

Utilizando o teste para detecção de mutação e recombinação em células

somáticas de Drosophila melanogaster (SMART), DIHL et al. (2008) analisaram os

extratos orgânicos de partículas do MP10 e das partículas totais em suspensão. O

maior efeito detectado neste estudo foi o aumento da frequência de recombinação

homóloga (RH), enfatizando os riscos que podem estar correlacionados com a

poluição do ar (DIHL, 2008). Vale destacar que a RH é um evento associado a

diferentes etapas do processo de tumorigênese (BISHOP; SCHIESTL, 2003).

O teste de micronúcleo (MN) tem sido uma excelente ferramenta para avaliar

os efeitos mutagênicos de origem cromossômica (FENECH, 1997, 2002). O MN é

uma pequena massa nuclear delimitada por membrana e separada do núcleo

principal, sendo formado durante a telófase. Eles aparecem apenas em células que

completaram a divisão nuclear e são originados de fragmentos de cromossomos ou

cromossomos inteiros que se atrasam durante a migração cromossômica que ocorre

na anáfase. Desse modo, os MN representam perda da cromatina em consequência

do dano cromossômico estrutural ou dano no aparelho mitótico (FENECH et al.,

2011; HOLLAND et al., 2008).

A análise da qualidade do ar através da utilização de vegetais e do uso de

linhagens celulares como bioindicadores têm contribuído para o monitoramento

ambiental de diferentes locais e consequentemente para um prognóstico de risco à

saúde da população exposta (CRISPIM et al., 2012; POMA et al., 2006; SAVÓIA et

al., 2009). Desse modo, o teste de micronúcleo em Tradescantia (Trad-MCN) e o

teste de micronúcleo com bloqueio da citocinese (CBMN) têm sido amplamente

utilizado devido a sua alta sensibilidade a compostos genotóxicos.

Introdução 41


1.4.1.1) Teste de micronúcleo em Tradescantia (Trad-MCN)

O teste Trad-MCN tem sido bastante utilizado nos estudos de avaliação

genotóxica, podendo ser realizado com as inflorescências da Tradescantia pallida ou

dos clones de Tradescantia (BNL- 4430 e KU-20) (DE SOUZA LIMA; DE SOUZA;

DOMINGOS, 2009; ISIDORI et al., 2003; KLUMPP et al., 2004; SUYAMA et al.,

2002).

Este ensaio pode ser avaliado por dois sistemas experimentais: (i) in situ,

através da exposição aos agentes presentes na atmosfera, onde o efeito verificado é

proveniente de uma mistura complexa do ar e (ii) ex situ, através da exposição

direta do material que será avaliado, em hidroponia. O Trad-MCN mostrou-se

sensível a poluentes atmosféricos com experimentos tanto in situ(DE OLIVEIRA

GALVÃO et al., 2014; GUIMARÃES et al., 2000; ISIDORI et al., 2003) como no

sistema ex situ (CARVALHO-OLIVEIRA et al., 2005; DE OLIVEIRA ALVES et al.,

2011).

Pesquisadores analisaram a qualidade atmosférica de Córdoba – Argentina e

observou-se que houve uma correlação dose-resposta entre a frequência de MN e

os níveis das partículas totais em suspensão utilizando o Trad-MCN (CARRERAS;

PIGNATA; SALDIVA, 2006). O teste também foi sensível para detectar riscos

genotóxicos na cidade de Santo André no estado de São Paulo, onde os autores

indicaram os fatores climáticos (umidade relativa do ar, temperaturas e índices

pluviométricos) como condições relevantes na formação de MN (SAVÓIA et al.,

2009).

Em sistema hidropônico, foram analisados diferentes períodos de

recuperação da planta para os extratos com o poluente ozônio e concluíram que os

efeitos genotóxicos e mutagênicos para este composto podem ser observados entre

48 e 72 horas após a exposição (DE SOUZA LIMA; DE SOUZA; DOMINGOS, 2009).

Além disso, outro trabalho usando o sistema ex situ para o Trad-MCN, mostrou que

a fração solúvel inorgânica do MP10 coletado em São Paulo também é mutagênico

(BATALHA et al., 1999).

Na Amazônia, destaca-se a pesquisa realizada por SISENANDO et al. (2011),

onde os autores demonstraram através do Trad-MCN in situ que os poluentes

oriundos da queima de biomassa podem induzir danos genéticos. Além deste

trabalho, com o intuito de ampliar a pesquisa na região Amazônica e identificar os

Introdução 42


compostos químicos envolvidos nestes danos, o MP orgânico foi avaliado através do

Trad-MCN ex situ e os resultados mostraram que esse extrato tem um grande

potencial mutagênico. Nas amostras coletadas, foram detectados compostos

orgânicos mutagênicos e carcinogênicos que podem estar influenciado nos danos

genéticos encontrados (DE OLIVEIRA ALVES et al., 2011).

De forma interessante, MARIANI e colaboradores (2009) demonstraram que o

Trad-MCN pode ser utilizado na avaliação dos riscos à saúde humana impostos

pelos poluentes atmosféricos. No caso, os autores fizeram uma associação entre a

frequência de MN em Tradescantia pallida e os dados de mortalidade causados por

doenças cardiovasculares e câncer.

1.4.1.2) Teste de micronúcleo com o bloqueio da citocinese (CBMN)

O teste CBMN baseia-se no uso da citocalasina B, que é um agente inibidor

da polimerização da proteína actina necessária para a formação do anel de

microfilamentos que induz a contração do citoplasma e clivagem da célula em duas

células-filhas (citocinese). O emprego da citocalasina B resulta em um acúmulo de

células binucleadas, facilitando a identificação de alguns marcadores de danos

genéticos. Além do MN, podem-se destacar outros marcadores de danos ao DNA,

tais como: pontes nucleoplasmáticas (PN) e broto nuclear (BN) (FENECH, 1997;

FENECH et al., 2011).

As PN originam-se durante a anáfase, quando os centrômeros de

cromossomos dicêntricos são puxados para os pólos opostos da célula durante a

mitose. Na ausência da ruptura da ponte na anáfase, a membrana nuclear

eventualmente rodeia o núcleo da célula-filha junto com a ponte e então, a PN é

formada. É importante destacar que essas PN são quebradas durante a citocinese,

mas podem ser acumuladas em células bloqueadas, portanto, esta é uma das

importâncias do teste CBMN (FENECH et al., 2003, 2011).

O BN é caracterizado por ter a mesma morfologia do MN, com a exceção de

que eles estão ligados ao núcleo por uma haste estreita ou larga de material

nucleoplasmático, dependendo do estágio do processo de brotação. Um dos

mecanismos propostos de formação do BN é que eles são decorrentes da

eliminação de DNA amplificado (FENECH et al., 2003, 2011).

Introdução 43


Na Figura 8 pode-se observar alguns dos diferentes mecanismos de formação

do MN e de PN. O MN pode ser formado pela perda de um cromossomo inteiro

(Figura 8A) ou por quebra cromossômica (Figura 8B). Com relação às PN, elas

podem ser originadas pela formação de cromossomos dicêntricos resultantes por

quebras cromossômicas por um erro no reparo (Figura 8B) ou pela fusão da região

telomérica dos cromossomos (Figura 8C). Para distinguir estes eventos, uma opção

é utilizar sondas específicas para o centrômero e para o telômero dos cromossomos.

Figura 8: Possíveis mecanismos de formação do micronúcleo (MN) e das pontes nucleoplasmáticas (PN). A) MN resultante por aneugênese. B) MN resultante por clastogênese e PN. C) PN formado por cromossomos dicêntricos resultantes da fusão dos telômeros. Os pontos amarelos representam sondas que hibridizam para a região centromérica dos cromossomos e os pontos azuis representam as sondas que hibridizam com as sequências teloméricas nos cromossomos. Figura adaptada de FENECH et al. (2011).

A estreita relação entre o câncer de pulmão e compostos mutagênicos e/ou

carcinogênicos, associados ao fato de que a maioria das genotoxinas do MP são

inaladas atingindo regiões inferiores do trato respiratório, justifica os trabalhos

envolvidos na caracterização dos efeitos genotóxicos. Logo, vários pesquisadores

têm utilizado o teste CBMN para avaliar a genotoxicidade e mutagenicidade das

Introdução 44


partículas finas dos aerossóis de diferentes fontes de emissões (OH et al., 2011;

TANG et al., 2012).

No estudo sobre os efeitos genotóxicos ocasionado pela exposição

ocupacional oriundo das emissões veiculares foi realizado entre os policiais que

trabalham no trânsito na China. Além do questionário sobre os efeitos dos poluentes

atmosféricos na saúde, os pesquisadores realizaram o teste CBMN com linfócitos

para analisar os danos ao DNA. Os resultados mostraram um aumento na

frequência de MN quando comparado com o grupo controle, confirmando que a

poluição atmosférica urbana causa mutações no material genético (ZHAO et al.,

1998).

Destaca-se também o trabalho realizado por Oh e colaboradores (2011) que

mostraram que o material orgânico extraído do MP2,5 induz estresse oxidativo e

danos genotóxicos em linhagem de células do epitélio bronquial humano. Através do

teste CBMN, os autores observaram os efeitos genotóxicos em frações contendo

hidrocarbonetos alifáticos, HP, alqui-HPA, nitro-HPA, cetonas e quinonas.

1.4.1.3) Respostas a Danos no DNA (RDD)

A todo o momento, o genoma humano é constantemente exposto a diferentes

tipos de danos causados por fontes exógenas (radiações ultravioleta, MP e outros

compostos genotóxicos) e por subprodutos de processos endógenos (espécies

reativas de oxigênio durante a respiração e outros) (LOPEZ-CONTRERAS;

FERNANDEZ-CAPETILLO, 2012).

A quantidade de lesões que os seres humanos enfrentam é enorme, com

estimativas sugerindo que cada uma das 1013 células tem que lidar com cerca de

10.000 lesões por dia (LINDAHL; BARNES, 2000). A sinalização das respostas a

danos no DNA (RDD) é específica para o tipo de dano. A maioria das lesões são

devidamente resolvidas por mecanismos especializados. Porém, uma resposta

deficiente aos danos no DNA, em particular, a quebra de dupla fita do DNA,

ocasiona uma séria ameaça para a saúde humana (JACKSON; BARTEK, 2009).

Para este tipo de dano, um marcador sensível que tem sido bastante utilizado

é a ocorrência da fosforilação da histona tipo H2AX na serina 139 em mamíferos

(ser-129 em S. cerevisiae), denominada -H2AX (BONNER et al., 2008; GARCIA-

CANTON; ANADÓN; MEREDITH, 2012).

Introdução 45


Embora o papel exato ainda seja controverso, considera-se que a sinalização

da forma fosforilada da histona H2AX pode estar envolvida no recrutamento de

vários fatores de reparação do DNA ao redor da lesão, tais como o complexo MRN e

as proteínas BRCA1 e RAD51(CANN; DELLAIRE, 2011). Dessa forma, a proteína -

H2AX tem sido considerada uma das principais proteínas sinalizadoras envolvida na

RDD, desempenhando um papel importante no seu reparo e mantendo a integridade

do genoma (VALDIGLESIAS et al., 2013).

Em pesquisa realizada na Itália foram coletadas partículas finas e ultrafinas

do MP atmosférico em diferentes estações do ano em Milão. Para investigar se

essas partículas causam quebras de dupla fita no DNA em co-cultura de células de

pulmão e monócitos, os autores analisaram a quantidade de foci de -H2AX por

citometria de fluxo, mostrando um aumento significado deste marcador nas amostras

coletadas no inverno (LONGHIN et al., 2013b).

Estudos mostraram que a fumaça do cigarro convencional gera um aumento

na formação de -H2AX em linhagem de células pulmonares de mamífero. O

processo não é dependente do ciclo celular, indicando a indução direta de quebras

de dupla fita no DNA pelos compostos presentes no cigarro (ALBINO; HUANG,

2004; TANAKA et al., 2007). Em concordância com o trabalho citado, a pesquisa

feita por TOYOOKA, IBUKI (2009) mostrou que a fumaça do cigarro induz um

aumento na formação de -H2AX em células do pulmão (A549) associando este

evento com a quebra de dupla fita no DNA.

Além de ser um marcador de quebra de dupla fita no DNA, o aumento da

formação da -H2AX pode ocorrer em resposta a outros danos, como por exemplo:

parada do ciclo celular, reparo do DNA e apoptose. Em particular a morte celular,

ROGAKOU et al. (2000) sugerem que durante a apoptose, devido a fragmentação

do DNA, pode ocorrer a formação de -H2AX. Diante de tal resultado, os autores

acreditam que o reparo do DNA e a apoptose podem partilhar passos iniciais

comuns relacionados com a cromatina.

Na Figura 9 estão sendo mostrados as vias da RDD. Em destaque está o

papel da -H2AX na sinalização de danos genotóxicos.

Introdução 46


Figura 9: Respostas de danos ao DNA (RDD) e o papel da -H2AX. Figura adaptada de SULLI; DI MICCO; D’ADDA DI FAGAGNA (2012).

Sabe-se que a ocorrência de danos genotóxicos, incluindo aqueles

ocasionados pela exposição ao MP, podem alterar a regulação do ciclo celular

(DEMETRIOU et al., 2012). A ativação das vias da RDD são determinadas por

várias quinases que consequentemente fosforilam e ativam diferentes proteínas que

coordenam a parada do ciclo celular e as vias de reparo para preservar a integridade

genômica (SULLI; DI MICCO; D’ADDA DI FAGAGNA, 2012). A retomada da

progressão do ciclo celular ocorre somente quando o dano no DNA for removido por

completo. Alternativamente, em casos de danos no DNA grave, a RDD pode induzir

a morte por apoptose em alguns tipos celulares (HALAZONETIS; GORGOULIS;

BARTEK, 2008).

Introdução 47


Ainda neste contexto, a sinalização da RDD pode induzir uma parada no ciclo

celular permanente, denominada senescência celular, que é causada pelo acúmulo

de lesões ao DNA não reparadas que fortemente persistem sinalizando RDD ou

induzem a apoptose (FUMAGALLI et al., 2012).

Além disso, existem os pontos de checagem (ou checkpoints) que funcionam

como pontos de controle de qualidade. Caso haja dano ao material genético, ativa-

se uma cascata de sinais para bloquear a progressão do ciclo naquela célula,

colocando em funcionamento a maquinaria de reparo do material genético e/ou

acionando a apoptose por meio de sensores, sinalizadores e efetores específicos.

Esses pontos também são responsáveis por permitir a finalização correta dos

passos de uma fase precedente, regulando a transição para a fase seguinte

(VERMEULEN; VAN BOCKSTAELE; BERNEMAN, 2003).

As transições através das diferentes fases do ciclo celular são fortemente

regulados pela atividade de quinases dependentes de ciclina (CDK). As CDK são

ativadas por ciclinas e inibida pelos inibidores de CDK (CKIs) ou inibidores de

tirosina fosfolarilada. A ativação da RDD pode limitar a atividade das CDK e, assim,

prevenir a progressão do ciclo celular para a fase seguinte (G1 / S e G2 / M)

(ABRAHAM, 2001).

No processo de ciclo celular destaca-se a proteína p53. Ela é parte dos

mecanismos de pontos de checagem da célula. Quando ocorrem lesões no DNA, ela

interage com o ciclo celular na tentativa de identificar eventuais erros e permitir que

estes sejam reparados. É um fator de transcrição que bloqueia o ciclo celular e

impede a progressão para a fase S ou promove a morte celular. Entre seus efetores

está a p21, capaz de inibir as CDK (cyclin-depent kinase) responsáveis pela entrada

na fase S. A produção aumentada de p21 vai bloquear a atividade de quinase do

complexo ciclina/CDK; este, por sua vez, não irá fosforilar pRb, que não vai liberar o

fator E2F e o ciclo vai parar. Esta interrupção no ciclo tem por finalidade permitir que

o dano no DNA seja corrigido para que a célula continue sua divisão, ou então que a

célula seja encaminhada a apoptose, caso o dano seja deletério e não sujeito a

correções (BATCHELOR; LOEWER; LAHAV, 2009). A Figura 10 resume a regulação

dos pontos de checagem a partir da RDD.

Introdução 48


Figura 10: Regulação dos pontos de checagem pela sinalização de respostas de dano ao DNA (RDD). Figura original de LOPEZ-CONTRERAS & FERNANDEZ-CAPETILLO (2012).

Estudos in vitro têm demonstrado que o MP atmosférico pode inibir o

crescimento das células, reduzindo a proliferação e/ou podem provocar a morte das

células (DENG et al., 2007; GUALTIERI et al., 2011; POMA et al., 2006). A redução

da proliferação têm sido associada com a parada em várias fases do ciclo celular

(DENG et al., 2007; GUALTIERI et al., 2011; JALAVA et al., 2007).

No estudo realizado em Dunquerque, na França, os pesquisadores

investigaram a ocorrência de anormalidades moleculares na ativação da via de

sinalização do gene TP53-RB após a exposição ao MP2,5 utilizando como modelo a

linhagem de células do pulmão humano (células L132). Os experimentos in vitro

mostraram que a exposição ao MP atmosférico urbano, em curto prazo, alteraram a

expressão gênica e a concentração de proteínas de vários pontos de controle do

ciclo celular (p53, p21, ciclina D1, CDK, BCL2 e outros) da via de sinalização do

gene TP53-RB, causando tanto a proliferação celular quanto a morte por apoptose

(ABBAS et al., 2010).

Também com o intuito de investigar os mecanismos de ação do MP

atmosférico urbano de Milão, na Itália, os pesquisadores exploraram as alterações

no ciclo celular induzidas pelo MP2,5 utilizando a linhagem celular do epitélio

humano (BEAS-2B). Os dados mostram claramente que a exposição a estas

Introdução 49


partículas causaram uma parada no ciclo celular na fase G2. O aumento das células

em G2 foi seguido por uma parada temporária no ponto de transição entre a

metáfase e anáfase. Este evento foi associado com a presença de graves

aberrações no fuso mitótico (LONGHIN et al., 2013a).

1.4.1.4) Morte celular por apoptose e necrose

A morte celular por apoptose é uma das etapas de sinalização da RDD.

Entretanto, há também outros tipos de morte celular não apoptóticas, como a

necrose, autofagia, mitose catastrófica e senescência (SARASTE; PULKKI, 2000).

Alterações na coordenação desses tipos de morte celular podem contribuir no

processo de tumorigênese (GRIVICICH; REGNER; ROCHA, 2007). Dentro deste

contexto, pode-se destacar o processo de apoptose e necrose.

A apoptose ou morte celular programada é um evento essencial para a

manutenção do desenvolvimento dos seres vivos, sendo importante para eliminar

células defeituosas ou que não são mais necessárias ao organismo. As células em

apoptose caracterizam-se pelo estrangulamento da membrana sem perda de

integridade, condensação da cromatina, fragmentação do DNA, diminuição do

volume celular e formação de vesículas com membranas (corpos apoptóticos) sem

desintegração das organelas, exposição de moléculas sinalizadoras como

fosfatidilserinas (MEIER; FINCH; EVAN, 2000; SARASTE; PULKKI, 2000).

A apoptose pode ser ativada por vias normais ou por diferentes estímulos. A sua

ativação por compostos químicos pode ocorrer por duas vias: extrínseca e

intrínseca. A primeira inicia-se fora da célula, onde a proteína ligante Fas-L se liga

no receptor membro da família de receptores TNF (FAS) na superfície da célula,

desencadeando a ativação, primeiramente, das caspases 8 e 10 seguida das

caspases 3, 6 e 7. A outra via, ocorre dentro da célula e acontece quando as células

estão em estresse, podendo ser sinalizadas por proteínas pró-apoptóticas da família

Bcl-2 (bid, bax e bak), induzidas por espécies reativas de oxigênio(ERO) e por

cátions divalentes. Logo, a apoptose é uma forma energeticamente ativa de morte

celular, que acontece de maneira ordenada e que difere nos aspectos morfológicos,

bioquímicos e moleculares da necrose (MEIER; FINCH; EVAN, 2000; SARASTE;

PULKKI, 2000).

Introdução 50


A necrose é um tipo de morte na qual as células sofrem um insulto que resulta

no aumento do volume celular, agregação da cromatina, desorganização do

citoplasma, perda da integridade da membrana plasmática e consequentemente a

ruptura celular. Durante a necrose, o conteúdo celular é liberado, causando dano às

células vizinhas e uma reação inflamatória no local. A desregulação desse processo

pode causar várias doenças, incluindo neoplasias, doenças autoimunes e desordens

degenerativas(CUMMINGS; SCHNELLMANN, 2004; SARASTE; PULKKI, 2000).

Estudos prévios demonstram que o B(a)P e alguns ciclopentano-HPA

presentes no MP causam toxicidade na linhagem celular de hepatoma de ratos

(Hepa1c1c7), resultando em um aumento de apoptose dependente das

concentrações utilizadas (SOLHAUG et al., 2004).

Recentemente, um grupo de pesquisadores chineses analisaram a

citotoxicidade de algumas quinonas presente no MP atmosférico utilizando a

linhagem celular do pulmão humano (A549). Com os resultados obtidos, os autores

sugerem que a 1,2-naftoquinona pode causar morte celular por apoptose ou necrose

(SHANG et al., 2014).

Destaca-se também que partículas emitidas por diesel e nitro-HPA já foram

relatados como agentes causadores de apoptose em linhagem de hepatocarcinoma

celular(LANDVIK et al., 2007).

Na Figura 11 estão destacadas as diferenças morfológicas entre apoptose e

necrose.

Introdução 51


Figura 11: Morte celular por apoptose e necrose. Figura adaptada de KONO et al. (2008).

1.4.1.5) Mecanismo de ação do material particulado emitido pela

queima de biomassa

A classificação do MP como agente carcinogênico para humanos pela IARC

coloca em questão a identificação dos compostos individuais presentes no MP e o

potencial carcinogênico de cada componente bem como a investigação das

possíveis vias que podem contribuir para o risco do processo de carcinogênese

(HAMRA et al., 2014).

Introdução 52


Apesar dos desafios, alguns pesquisadores buscam o conhecimento dos

mecanismos responsáveis pela ação do MP atmosférico urbano (BUDINGER et al.,

2011; DEMARINI, 2013; DONALDSON et al., 2001b). Entretanto, não há muitos

estudos voltados para as emissões provenientes da queima de biomassa.

Em particular, na Amazônia, os efeitos na saúde humana ocasionados pelo

MP emitido pela queima de biomassa é significante no arco do desmatamento da

região (CARMO; ALVES; HACON, 2013; DE OLIVEIRA et al., 2012; IGNOTTI et al.,

2010; ROSA et al., 2008). Porém, são poucos os estudos que investigam os efeitos

genotóxicos ocasionados pelas queimadas (DE OLIVEIRA ALVES et al., 2011;

SISENANDO et al., 2011, 2012) e até o momento, não há publicações voltadas para

o estudo dos mecanismos de ação do MP.

Logo, isto justifica o interesse do presente trabalho em avaliar os efeitos do

material orgânico extraído (MOE) em nível celular e molecular utilizando como

sistema teste as células do pulmão humano.

Objetivos 53


2) Objetivos

2.1) Objetivo Geral

Analisar os compostos químicos orgânicos assim como os efeitos celulares e

moleculares do MP oriundos da queima de biomassa na região Amazônica.

2.2) Objetivos Específicos

- Analisar a composição química do MP oriundo da queima de biomassa na

Amazônia;

- Analisar a citotoxicidade celular com concentrações e tempo de exposição

diferentes utilizando a linhagem de células do pulmão humano (A549);

- Avaliar a genotoxicidade do MOE do MP10 atmosférico utilizando as células

A549;

- Avaliar a mutagenicidade do MOE através do teste de micronúcleo tanto em

células vegetais como em células do pulmão humano (A549);

- Analisar o ciclo celular após a exposição do MOE utilizando a técnica por

citometria de fluxo;

- Avaliar a expressão das proteínas p53 e p21 por Western Blot;

- Quantificar a formação de foci da -H2AX nas células expostas ao MOE por

citometria de fluxo;

- Identificar os tipos de morte celular (apoptose e necrose) nas células

pulmonares após a exposição ao MOE;

- Apresentar um modelo referencial da exposição ao MOE e os seus efeitos

em nível celular e molecular.

Material e Métodos 54


3) Material e Métodos

Neste estudo foram selecionados duas áreas diferentes do arco de

desmatamento da região Amazônica para estudar tanto a composição química como

os efeitos celulares e moleculares causados pelo MP emitidos pelas queimadas.

Para facilitar a compreensão, a descrição da metodologia será dividida de acordo

com o local da pesquisa.

3.1) Metodologia para a pesquisa realizada em Alta Floresta (MT)

Os resultados desta pesquisa foram publicados na revista Environmental

Research (DE OLIVEIRA ALVES et al., 2014).

3.1.1) Caracterização da área de estudo

O município de Alta Floresta está localizado no extremo norte do estado do

Mato Grosso e está a 830 Km² da capital do Estado, Cuiabá (latitude 14º37’10’’ ao

sul e longitude 57º29’09’’ ao oeste). O território apresenta uma área de 9.310,27 km2

(Figura 12). Com relação ao relevo, participa do Planalto Apiacás-Sucurundi e da

Depressão Interplanáltica Amazônia Meridional. No quadro florístico destacam-se a

Floresta ombrófila aberta e densa, a Floresta estacional e o Cerrado (IBGE, 2014). O

município encontra-se no trajeto de dispersão dos poluentes gerados pela prática da

queima de biomassa conhecida como “arco do desmatamento” com intensas

queimadas no período de seca na Amazônia.



Figura 12: Mapa destacando o município de Alta Floresta, no estado do Mato Grosso, região do arco do desmatamento da Amazônia Brasileira.

O clima é típico da região Amazônica brasileira, quente, úmido e tropical.

Possui ciclos bem definidos de seca e chuva: estação da chuva compreendida entre

novembro a abril; e a estação de intensa seca entre julho a outubro. Os meses de

maio e junho correspondem a um período intermediário, caracterizado pela redução

das chuvas e início da seca.

Este município foi selecionado para este estudo devido à prática de

desmatamentos para o preparo da terra e extensão das áreas de pastagens assim

como pela exploração da madeira, resultando no aumento da queima de biomassa.

De acordo com o Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais (INPE), entre os estados

que compõe o arco do desmatamento na Amazônia brasileira, o MT teve a maior

concentração de focos de calor e de área desmatada nos últimos anos (DUBREUIL

et al., 2012).



3.1.2) Coleta do MP10

As coletas em Alta Floresta ocorreram em dois períodos, um de queima de

biomassa intensa (Agosto a Outubro/2008) e outro de queima de biomassa

moderada (Novembro/2008 a Janeiro/2009), conforme o protocolo descrito em DE

OLIVEIRA ALVES et al. (2011). Para a coleta do MP10 utilizou-se filtros do tipo teflon.

Nestes filtros foram determinadas as concentrações do MP10 e dos níveis de BC.

Estas amostras também foram utilizadas para teste de genotoxicidade e para a

identificação dos alcanos e HPA analisados neste trabalho.

O procedimento de coleta foi realizado através de um amostrador acoplado

com inlet para a coleta das partículas menores que 10 µm. O amostrador é

conectado a uma bomba de vácuo que succiona o ar atmosférico e a tubulação

passa por um medidor de fluxo que fornece o volume total do ar amostrado em

tempo real. Para isto, os equipamentos foram calibrados com um padrão e os

volumes amostrados corrigidos. Além disso, o circuito elétrico possui um horímetro

que fornece o tempo de amostragem, integrando em horas (DE OLIVEIRA ALVES,

2010).

Em paralelo, através de um outro método, o MP10 foi coletado através de um

sistema conhecido como amostrador fino e grosso (AFG) que separa as partículas

em duas frações: uma fina, definida por partículas menores que 2,5 µm e uma

grossa, definida por partículas com diâmetro entre 2,5 e 10 µm. Os filtros utilizados

nesta amostragem são de policarbonato.

É importante destacar que para ambos os métodos de coleta, os filtros

passaram por procedimentos de pesagem, foram montados no suporte do

amostrador e embalados com papel alumínio antes e depois da coleta. Após a

amostragem, os filtros foram levados para o laboratório de Física Atmosférica na

USP para a análise gravimétrica.

Na Figura 13 estão representados os dois tipos de coletas realizadas neste

estudo.



Figura 13: Esquema da montagem do amostrador acoplado com o inlet para a coleta de MP10, utilizando filtros teflon. Em paralelo, o esquema da montagem do amostrador de particulado fino e grosso (AFG) acoplado com inlet, utilizando filtros de policarbonato. Figura original de DE OLIVEIRA ALVES (2010).

3.1.3) Análise gravimétrica

O procedimento para a análise gravimétrica foi de acordo com o protocolo

seguido por DE OLIVEIRA ALVES (2010). A massa dos filtros dos tipos teflon e

policarbonato foram medidos antes e depois da amostragem. A partir da diferença

da análise gravimétrica foi possível determinar a massa do MP. Os filtros foram

pesados em uma balança microanalítica eletrônica de precisão nominal 1μg da

marca Mettler no Instituto de Física da Universidade de São Paulo.

Além disso, a massa do MP obtida foi subtraída da massa adquirida nos filtros

brancos. Estes filtros (não amostrados) foram submetidos ao mesmo processo dos

outros filtros que foram levados para a área de estudo, servindo como controle para

eliminar qualquer ganho de massa devido à absorção de água ou contaminação no

transporte e manuseio dos filtros.

3.1.4) Análise do Black Carbon (BC)

Para determinar a concentração do BC foi utilizada a análise de refletância no

Instituto de Física da USP. A técnica consiste na alta absorção de luz na região

visível, utilizando um refletômetro, Smoke Stain Refletometer, Diffusion System,

modelo M43D. Logo, o filtro coletado foi apoiado em um suporte e iluminado por

uma lâmpada de tungstênio. A luz refletida é então detectada por um foto sensor.



Quanto menor a intensidade da luz refletida, maior é a quantidade de BC presente

na amostra (DE OLIVEIRA ALVES, 2010; MAENHAUT et al., 2002).

3.1.5) Extração do material orgânico do MP10

Para a extração do material orgânico do MP10 foram utilizados apenas os

filtros do tipo teflon. O protocolo escolhido foi o estabelecido por DE OLIVEIRA

ALVES et al. (2011). O material orgânico foi extraído por ultrasonicação utilizando

diclorometano na proporção de 1 ml do solvente para 1 mg do material coletado.

Cada filtro foi sonicado 3 vezes por 10 minutos e em seguida foi feito um pool para a

obtenção das amostras mensais. O volume do material orgânico extraído (MOE) foi

reduzido para 5 ml usando o rotavapor a vácuo e em seguida, a amostra foi seca

com nitrogênio puro. Uma vez que a concentração do MOE foi determinada, as

amostras foram estocadas à -20ºC, conforme sugerido por SATO et al. (1995).

Uma parte do MOE foi dissolvido em n-hexano para o fracionamento. A outra

parte foi dissolvida em dimetilsulfóxido (DMSO) e utilizado nas análises biológicas. É

importante destacar que para as duas análises, os filtros brancos, usados como

controle negativo, foram utilizados e passaram pelos mesmos procedimentos de

extração dos outros filtros coletados.

Na Figura 14 está representado um esquema das análises químicas e

biológicas realizadas com o MOE.



Figura 14: Esquema das análises químicas e biológicas realizadas com o material orgânico extraído do MP10 atmosférico.

3.1.6) Fracionamento das amostras e análises químicas

Para o fracionamento das amostras, cerca de 30 mg do MOE foi utilizado para

a análise. Os extratos foram separados por cromatografia líquida em gel de sílica. A

coluna utilizada (30 x 0.7 cm) tinha 1,5 g de gel de sílica (GOGOU; APOSTOLAKI;

STEPHANOU, 1998). Ressalta-se que para estas análises foi feito um pool dos

extratos orgânicos, pois a quantidade de massa nas amostras individuais não eram

suficientes para a detecção dos compostos.



Neste trabalho, foram analisados os alcanos e os HPA. Para a coleta dos

alcanos foram utilizados 15 mL de n-hexano (fração 1) e para a coleta dos HPA

foram utilizados 15 mL de tolueno: n-hexano (5,6 : 9,4) (fração 2). Após a passagem

dos eluentes, cada fração foi reduzida para 2 ml no rotavapor com vácuo. Em

seguida, as amostras foram transferidas para um frasco, foram secas com nitrogênio

puro e estocadas a – 20ºC (GOGOU; APOSTOLAKI; STEPHANOU, 1998).

A exatidão do método foi avaliada através do teste de recuperação. A faixa

de recuperação para os n-alcanos foi de 71% a 95% e para os HPA foi de 81% a

100%.

Os compostos foram identificados e quantificados usando um cromatógrafo a

gás equipado com detector de ionização de chama (CG-DIC). O volume das

amostras injetadas foi igual a 1 µl. As temperaturas utilizadas no detector e injetor

foram respectivamente 320ºC e 300ºC. A identificação destes compostos foi

realizada por comparação com o tempo de retenção dos padrões e a quantificação

foi feita usando o método do padrão externo (VASCONCELLOS et al., 2011). Essa

análise foi realizada no laboratório de Química Atmosférica no Instituto de Química

da USP.

3.1.7) Análises biológicas

3.1.7.1) Cultura celular

A linhagem de células do pulmão humano tumoral (A549) foi selecionada para

este estudo. As células foram cultivadas em meio Dulbecco's Modified Eagle's

Medium (DMEM) High Glucose (LGC Biotecnologia). O meio foi suplementado com

10 % de soro fetal bovino (Cultilab, Brasil) e 1% de solução de

antibiótico/antimicótico (0.1 mg/mL penicilina, 0.1 mg/mL estreptomicina e 0.25

mg/mL fungizona) (Life Technologies, EUA).

A cultura foi mantida a 37ºC em atmosfera úmida com 5% de CO2. Após

atingirem aproximadamente 80% de confluência, as células em cultura foram soltas

da superfície através da tripsinização (10%) e em seguida, centrifugadas durante 5

min a 1500 rpm. O precipitado das células foi ressuspendido com solução salina de

tampão fosfato (PBS). A suspensão das células A549 foi ajustada para uma

concentração apropriada de acordo com o protocolo detalhado para os ensaios

citotóxicos e para o teste CBMN.



3.1.7.2) Ensaio de citotoxicidade

A citotoxicidade celular foi avaliada pelo ensaio que mede a habilidade das

células vivas de reduzirem 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium

bromide (MTT) a sais de formazana, de cor violeta, após o tratamento. Este ensaio é

conhecido como teste MTT (MOSMANN, 1983).

As células A549 foram cultivadas em placas de 96 poços, a 8 x103

células/poço e cultivado com DMEM contendo 10% de soro fetal bovino até a

aderência e crescimento das células (24 h). Depois, as células foram tratadas, em

diferentes concentrações (0,1 mg/L; 0,5 mg/L e 1,0 mg/L) do MOE tanto do período

de intensa como o de moderada queima de biomassa por 24 horas.

O teste MTT foi realizado em triplicata e a absorbância foi medida a 570 nm

no leitor de microplacas ELISA. Para cada tratamento, foi utilizado um controle

positivo (mistura de HPA (padrão) = 10 ng/ml) e um controle negativo (células

tratadas com o extrato dos filtros brancos). A viabilidade celular, em cada

tratamento, foi calculada a partir da fórmula matemática abaixo (fórmula 4):

Células mortas (%) = Absorbância do Teste – Absorbância do CN* x 100 (4)

Absorbância do CN*

*CN = Controle Negativo

3.1.7.3) Teste de micronúcleo com o bloqueio da citocinese (CBMN)

Para investigar o efeito genotóxico in vitro, foram utilizadas as células A549.

Este ensaio foi realizado utilizando a técnica padrão proposto por FENECH (2002)

com algumas modificações.

As células foram plaqueadas em placas de 6 poços, a 1,5 x105 células/poço

por 24 horas. Em seguida, as células foram expostas a diferentes concentrações

(0,1 mg.L-1; 0,5 mg.L-1 e 1,0 mg.L-1) do MOE do período de queima de biomassa

intensa e moderada. Após 24 horas, o material exposto foi retirado e acrescentou-se

o meio de cultura com citocalasina B (Sigma) na concentração de 5 µg.mL-1, com o

objetivo de observar o acúmulo de células binucleadas. Depois, retirou-se o meio de

cultura e acrescentou-se 2 ml de tripsina por 5 minutos (37ºC). Em seguida,



adicionou-se o meio de cultura para inativar a ação da tripsina. Uma vez que as

células foram ressuspendidas, elas foram transferidas para os tubos de 15 mL

previamente identificados. As células A549 foram centrifugadas a 1500 rpm por 5

minutos. Por último, foram fixadas com metanol e ácido acético (3:1) e então,

homogeneizadas. Cerca de 50 a 100 µl do material foram pingados em uma lâmina

previamente lavada e para a análise, onde as células foram coradas com Giemsa

(10%).

Os MN foram contados em 3.000 células binucleadas por tratamento. Outras

alterações nucleares também foram observadas, tais como as PN e o BN utilizando

um microscópio óptico comum com a objetiva de 40x (Figura 15). Destaca-se que

foram utilizados dois controles negativos (somente meio de cultura e DMEM +

DMSO 0,1%) e um controle positivo (mistura de HPA totais).

Figura 15: Imagens que ilustram os parâmetros que foram analisados no teste CBMN após a exposição do material orgânico extraído (MOE) de Alta Floresta utilizando as células A549. (A) Célula binucleada sem micronúcleo, (B) Célula binucleada com micronúcleo, (C) ponte nucleoplasmática e (D) broto nuclear.



Além da avaliação da genotoxicidade, o teste CBMN permite avaliar a

citotoxicidade através do índice de divisão nuclear (IDN). O IDN foi determinado

usando a seguinte fórmula (5):

IDN = ( M1 + 2M2 + 3M3 + 4M4 ) / N (5),

onde M1 - M4 representa o número de células com 1 - 4 núcleos e N é o

número total de células de contadas, conforme os procedimentos de FENECH

(1997).

3.1.7.4) Teste de micronúcleo em Tradescantia pallida (Trad-MCN)

Para avaliar os efeitos genotóxicos do MP10 utilizando células vegetais,

optou-se pelo Trad-MCN conforme o trabalho executado por DE OLIVEIRA ALVES

et al. (2011). O protocolo deste teste foi estabelecido por MA (1981).

Assim como no teste CBMN, o MOE foi testado em três concentrações

diferentes (0,1 mg.L-1, 0,5 mg.L-1 e 1,0 mg.L-1) para os períodos de queima de

biomassa intensa e moderada. Ressalta-se que para o Trad-MCN, o extrato foi

dissolvido em DMSO (1%). Também foram realizados testes com o controle negativo

(filtros brancos) e com o controle positivo (formaldeído 0,2%).

Na realização do bioensaio, cerca de 45 talos de Tradescantia pallida

coletados de diferentes vasos previamente estabelecidos e controlados, foram

mantidos em laboratório com solução nutritiva de Hoagland, por 24 horas. Em

seguida, foram transferidos para Beckers contendo a solução teste (controles

negativo e positivo assim como as três concentrações do material orgânico para

cada mês) por 8 horas. Após o período de exposição, os talos foram submetidos a

um processo de recuperação por 24 horas com solução de Hoagland. Depois, os

botões foram fixados em solução de ácido acético e álcool (1:3) por 48 horas e

armazenadas em álcool 100%.

Para a análise, os botões foram dissecados e as anteras maceradas sobre a

lâmina, junto com uma gota do corante Carmin (2%). Somente as lâminas contendo

a fase em tétrade foram consideradas. Foram analisadas 300 tétrades por lâmina

em aumento de 400x, contando-se o número de tétrades normais e de tétrades com

a presença de um ou mais MN. A frequência de MN foi expressa em porcentagem

(número total de MN em 100 tétrades).



3.1.8) Análise estatística

Os cálculos estatísticos foram realizados utilizando Statistical Package for the

Social Sciences (SPSS), versão 15.0 e OriginPro 8, da seguinte forma:

i) Uma análise de variância (ANOVA) dos dados de MP10 e BC foi realizada,

considerando-se a regressão linear simples;

ii) ANOVA one-way foi utilizado em ambos os testes citotóxicos e

genotóxicos;

iii) O teste Dunnett foi utilizado para determinar o nível de significância entre o

grupo controle e o tratado bem como o teste Tukey para as comparações múltiplas.

As diferenças de médias e correlações foram consideradas significativas

quando p <0,05.

3.2) Metodologia para a pesquisa realizada em Porto Velho

3.2.1) Caracterização da área de estudo

O local de amostragem (08º 41’ 24’’ ao sul; 63º 52’ 12’’a oeste) está localizado

em uma área de reserva ecológica a 5 km norte da cidade de Porto Velho, localizada

no estado de Rondônia com 485.000 habitantes. Na maior parte do ano, a direção

do vento é no sentido norte, passando primeiro pelo local de amostragem, seguindo

em direção a cidade de Porto Velho. Dessa forma, os impactos da emissão urbana

são minimizados (BRITO et al., 2014) (Figura 16).

O município de Porto Velho, capital localizada ao norte do estado de

Rondônia, latitude 08º 45’ 43’’ sul e longitude 63º 54’ 14’’ oeste, encontra-se em uma

área de bioma amazônico, à margem direita do rio Madeira, afluente do rio

Amazonas (Figura 16). Situada entre a planície amazônica e o planalto central

brasileiro, apresenta relevo pouco acidentado, sem grandes elevações ou

depressões, com variações que vão de 70 a 500 m (GONÇALVES, 2010).

A região possui ciclos bem definidos de seca e chuva e situa-se no

trajeto de dispersão dos poluentes gerados tanto em países vizinhos quanto na área

do arco do desmatamento que abrange os estados do Maranhão, Tocantins, Mato

Grosso, Rondônia, Amazonas, Pará e Acre. Esta é uma área da região Amazônica



impactada pelas interferências humanas associadas com o uso do solo e pela

queima de biomassa (ARTAXO et al., 2013).

O clima predominante é o tropical chuvoso (úmido e quente), com

períodos bem definidos de chuva (meses de janeiro a março) e o período

mais seco corresponde entre os meses de julho a setembro. Os outros meses são

considerados um períodos de transição (GONÇALVES, 2010).

A variação da temperatura anual em Porto Velho é de 24°C e 26º C, com

temperatura máxima entre 30°C e 34°C e mínima entre 17º C e 23°C. Além da

temperatura, o conhecimento da precipitação pluviométrica são muito importantes

para a produtividade agrícola. A precipitação média anual no município é em torno

de 1.400 a 2.500 mm e mais de 90% desta ocorre na estação chuvosa (SEDAM,

2014).

Figura 16: Mapa do Brasil indicando a região amazônica (em verde) e uma visão detalhada da cidade de Porto Velho e do local de amostragem. Figura adaptada de BRITO et al. (2014).



3.2.2) Coleta do MP10

Na área próxima a cidade de Porto Velho foram coletados 50 amostras de

MP10 no período de julho/2011 a janeiro/2012 utilizando filtros de fibra de quartzo (20

x 25 cm). O tempo de amostragem foi de 48 horas no período de queima de

biomassa intensa e de 72 horas no período de queima de biomassa moderada.

Para esta coleta foi usado um amostrador de alto volume (Hivol) - HVS 3000 –

numa vazão aproximada de 1,13 m3.min-1. A cabeça de separação Andersen é

dotada de um conjunto de boqueiras que aceleram o ar de coleta para dentro de

uma câmara de impactação, onde as partículas maiores que 10 µm ficam retidas em

uma placa com spray de silicone. Logo, o MP10 é conduzido para fora da câmara e é

direcionado para o filtro de coleta, onde ficam retidas as partículas (Figura 17).

Figura 17: Amostrador de alto volume – Hivol. A: Imagem do Hivol com a cabeça de separação Andersen. B: Filtro de quartzo não amostrado no Hivol. C: Hivol sendo programado para o funcionamento. D: Filtro de quartzo após a amostragem.

Os filtros de quartzo, antes da amostragem, foram descontaminados

aquecendo-os a 800ºC por 8 horas. As pesagens dos filtros foram realizadas na

Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental (CETESB) em São Paulo. As

condições de umidade foram controladas entre 30 e 40% e os filtros ficaram 48

horas sendo condicionados na sala de pesagem. A pesagem dos filtros foi feitas



antes e depois da coleta em uma balança específica para os filtros de quartzo (20 x

25 cm) (Figura 18).

Figura 18: Imagem da balança específica para os filtros de quartzo no laboratório de Poluição Atmosférica da CETESB.

Alguns procedimentos são necessários para manusear esse tipo de filtro.

Por exemplo, cada filtro foi embalado individualmente com papel alumínio e em

seguida, foram guardados em saco plástico com fechamento zip lok e armazenado a

4ºC, evitando perdas ou outras reações que possam ocorrer até a extração do

material orgânico. A concentração do MP10 foi determinada conforme o protocole

descrito na seção 3.1.3).

3.2.3) Extração do material orgânico do MP10

Os filtros de fibra de quartzo foram submetidos à extração utilizando o aparato

de Soxhlet com diclorometano por 24 horas (Figura 19).



Figura 19: Aparato de Soxhlet utilizado para extração dos filtros coletados.

Após a extração do MOE, o solvente foi evaporado utilizando rotavapor até 1

mL e em seguida, sob fluxo ameno de nitrogênio líquido. No total, 50 filtros foram

coletados e passaram por esse mesmo procedimento. Uma vez tendo o extrato

obtido, a metade da amostra foi utilizada para as análises químicas e a outra parte

foi utilizada para os estudos biológicos.

Com o intuito de garantir a quantidade exata de massa do material extraído,

um frasco sem amostra contendo apenas 200 µL de DCM foi pesado em uma

balança microanalítica eletrônica de precisão nominal 1μg. Em seguida, no mesmo

frasco utilizado anteriormente, o extrato orgânico extraído foi diluído em 200 µL de

DCM e pesado novamente. A diferença de massa obtida é a quantidade de massa

do MOE. Este procedimento foi realizado para os extratos obtidos de cada filtro,

incluindo os amostrados e os brancos (VALLE-HERNÁNDEZ et al., 2010).

Após a obtenção dos extratos orgânicos do MP10 atmosférico foram realizadas

as análises químicas (Figura 20), além das análises celulares e moleculares (Figura

21).



Figura 20: Esquema das análises químicas utilizando o material orgânico extraído (MOE) coletado em Porto Velho, região da Amazônia Brasileira.

Figura 21: Análises celulares e moleculares utilizando o material orgânico extraído (MOE) coletado em Porto Velho, região da Amazônia Brasileira.



3.2.4) Análise dos Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos

3.2.4.1) Fracionamento das amostras

O MOE foi fracionado conforme o procedimento descrito por WEI et al. (2012),

utilizando diferentes solventes orgânicos para separação das classes dos

compostos.

Na fração 1 utilizou-se 40mL de n-hexano para obtenção dos alcanos. Na

fração 2, para a coleta dos HPA totais, nitro-HPA e oxi-HPA foram utilizados 100 mL

de DCM e n-hexano (1:1).

Neste trabalho serão apresentados apenas os resultados dos HPA e oxi-HPA

nas amostras coletadas, pois a análise dos nitro-HPA está em andamento.

3.2.4.2) Padronização do método analítico

Para a identificação e quantificação destes compostos foi utilizada a

cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (CG-EM) (Agilent

7820A). A coluna utilizada foi de metil-fenil(5%) VF - 5 ms (30 m x 0,250 mm, 0,25

µm de espessura) (Agilent Tecnologies). A análise foi feita pelo modo Scan. Para os

HPA, o programa de temperatura do forno utilizado foi de 80 à 280ºC conforme o

protocolo estabelecido por VASCONCELLOS (1996). A rampa de temperatura

utilizada para os oxi-HPA foi de 60ºC para 200ºC à 20ºC. min-1 e 200ºC para 300ºC

à 5ºC. min-1, conforme o protocolo de KARAVALAKIS et al. (2010) e WEI et al.

(2012).

A determinação da curva analítica dos compostos analisados consistiu no

preparo de soluções padrões: HPA totais (fenantreno (Fe), antraceno (Ant),

fluoranteno (Fluo), pireno (Pi), reteno (Ret), benzo(a)antraceno (BaA), criseno (Cri),

benzo(b)fluoranteno (BbF), benzo(k)fluoranteno (BkF), benzo(e)pireno (BeP),

benzo(a)pireno (BaP), indeno(1,2,3-cd)pireno (InP), dibenzo(a,h)antraceno (DBA) e

benzo(g,h,i)perileno) (BPer) (Sigma). Os oxi-HPA foram: 9-fluorenona, 2-

metilantraquinona, benzo(a)antraceno-7,12-diona e 9,10-antraquinona adquiridos da

Sigma Aldrich. As soluções foram injetadas no CG/MS (Agilent 7820A).



3.2.4.3) Teste de recuperação

O teste de recuperação foi realizado para validar o método analítico

empregado. A recuperação de um analito indica a quantidade de determinada

espécie química recuperada no processo em relação à quantidade real presente na

amostra. Para tanto, foram utilizados filtros de fibra de quartzo não amostrados

(branco), nos quais foi determinado o volume de um padrão de concentração

conhecida. Em seguida, os filtros foram submetidos à extração por Soxhlet e ao

fracionamento. As frações obtidas foram injetadas no CG/EM (Agilent 7820A) e

posteriormente analisadas.

3.2.4.4) Concentrações do BaP equivalente

Neste estudo foram analisados o BaP equivalente carcinogênico (BaP-TEQ) e

para o BaP equivalente mutagênico (BaP-MEQ). Os cálculos foram feitos

multiplicando a concentração de cada HPA com o TEF para o potencial risco

carcinogênico obtido por NISBET & LAGOY (1992) e com o MEF para o potencial

risco mutagênico obtido por DURANT et al. (1996,1999).

O BaP-TEQ (fórmula 3) e o BaP-MEQ (fórmula 4) para a soma dos HPA

foram calculados:

(BaP-TEQ)∑8HPA: [BaA] x 0,1 + [Cri] x 0,01 + [BbF] x 0,1 + [BkF] x 0,1 + [BaP] x

1 + [InP] x 0,1 + [DBA] x 5 + [BPer] x 0,01 (3)

(BaP-MEQ)∑8HPA: [BaA] x 0.082 + [Cri] x 0,017 + [BbF] x 0,25 + [BkF] x 0.11 +

[BaP] x 1 + [InP] x 0,31 + [DBA] x 0,29 + [BPer] x 0,19 (4)

3.2.5) Análise dos monossacarídeos

As análises dos monossacarídeos marcadores de queima de biomassa

(levoglucosano, manosano e galactosano) foram feitas no Finnish Meteorological

Institute, Air Quality Research na Finlândia, com a colaboração do pesquisador Dr.

Risto Hillamo.



Uma parte do filtro de quartzo com o MP10 foi extraído com água deionizada e

os compostos foram identificados pela cromatografia de troca iônica de alta

eficiência combinada com a espectrometria de massa com ionização por

electrospray (HPLC-IE-MS). Todos os procedimentos usados para esta análise estão

descritos em SAARNIO et al. (2010).

3.2.6) Cultura celular e teste de viabilidade

A linhagem A549, derivada de células do pulmão humano, foi utilizada como

bioindicador nas análises celulares e moleculares. A manutenção da cultura celular

seguiu o protocolo já citado na seção 3.1.7.1).

Para analisar a viabilidade das células expostas ao MP10 foi utilizado o teste

2,3-Bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT) (Cell

Proliferation Kit, Roche, Suíça) com as seguintes concentrações do MOE: 50

µg.mL1, 100 µg.mL-1, 200 µg.mL-1 e 400 µg.mL-1, em diferentes tempos de

exposição: 24, 48, 72 e 96 horas. Ressalta-se que a maior concentração do material

orgânico (400 µg.mL-1) equivale a 30 µg.m-3 da concentração do MP10.

Após o término do período de exposição, o meio de cultura foi removido e as

células foram cuidadosamente lavadas com solução salina (PBS). Em seguida, uma

solução do sal XTT em PBS foi adicionada às células, que foram novamente

incubadas na estufa por 90 a 120 minutos 37ºC, 5% de CO2. Após esse período, o

sobrenadante foi transferido para placas de 96 poços.

A leitura da absorbância foi feita no espectrofotômetro (GloMax Multi

Detection System, Promega, EUA). Os valores de absorbância (OD=OD 560nm –

OD 750nm) foram aferidos fazendo a leitura no comprimento de onda de 492 nm,

com a leitura de referência no comprimento de onde de 650 nm. Os resultados foram

expressos em porcentagem relativa ao controle conforme descrito por (QUINET et

al., 2014) QUINET et al. (2014).



3.2.7) Ensaio de cometa alcalino

O ensaio de cometa alcalino é um ensaio de boa sensibilidade para detecção

de danos no DNA. Para a realização deste teste foi utilizado o protocolo adaptado de

SINGH et al. (1988). No ensaio foram utilizadas 105 células em placas de 35 mm

de diâmetro.

As células foram expostas ao MOE nas seguintes concentrações: 50 µg.mL-1,

100 µg.mL-1, 200 µg.mL-1 e 400 µg.mL-1. Como controle positivo foi utilizado uma

mistura de HPA totais (Fe, Ant, Fluo, Pi, BaA, Cri, BbF, BkF, BeP, BaP, InP, BPer e

DBA) na concentração de 30 ng.mL-1. Além disso, foi investigado o efeito do

composto reteno (30 ng/mL), que é um HPA marcador de queima de biomassa. Para

todo o experimento, o tratamento de exposição foi de 24 horas.

Para a coleta, as células foram centrifugadas, ressuspendidas em 20 µl de

PBS e 180 µl de agarose Low-Melting Point 0.5%. Essas células foram

delicadamente plaqueadas em duas lâminas de microscopia previamente recobertas

com uma camada de agarose 1.5%, cobertas com lamínulas e mantidas a 4°C

por no mínimo 10 minutos, para a polimerização da agarose. Após esse

período as lamínulas foram retiradas e as lâminas incubadas por aproximadamente

16 horas a 4°C em solução de lise (2.5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris pH 9.5 –

ajustado com NaOH; na hora da utilização foram acrescentados 1% Triton X-100 e

10% DMSO).

Após a lise, as lâminas foram mantidas por 25 minutos na cuba de

eletroforese (BioRad) para a desnaturação do DNA em tampão de eletroforese

(2mM EDTA, 300 mM NaOH pH > 13) antes da corrida. A eletroforese foi realizada

por 25 minutos a 25 V e 300 mA. Após a eletroforese, as lâminas foram

neutralizadas 3 vezes por 5 minutos com o tampão de neutralização (0.4 M Tris pH

7.5) e fixadas por no mínimo 30 minutos com etanol 100% gelado (estoque à

20°C).

A coloração foi feita com 40 µL da solução de brometo de etídio (20 µg/mL)

imediatamente antes da leitura no microscópio óptico de fluorescência com filtro de

510-560 nm e barreira de 590 nm. Foram visualizados 100 cometas em cada lâmina,

preparada em duplicata, usando o software Komet 6.0. Os resultados foram plotados

pelo momento da cauda (do inglês “Olive tail moment”).



3.2.8) Detecção da fragmentação do DNA e ciclo celular por citometria

de fluxo

Após a exposição das células A549 ao extrato orgânico em diferentes tempos

de tratamento, as células foram coletadas juntamente com o sobrenadante e

centrifugadas a 2000 rpm por 5 minutos. O precipitado foi colocado em tubos de 15

mL e fixado com etanol 70% gelado e armazenado à - 20ºC. Antes da análise, os

tubos foram centrifugados a 2000 rpm por 5 minutos e os sobrenadantes foram

descartados. Depois, as células foram lavadas com 1 mL de PBS e centrifugadas

novamente sob as mesmas condições (BATISTA, 2008).

Em seguida, as células foram marcadas com 200 µL da solução de Propidium

iodide (PI), com a concentração de 50 µg/mL (PI + Triton + RNase A (0,03 mg/mL) +

PBS) e foram mantidas no escuro por pelo menos 30 minutos em temperatura

ambiente. Depois, a solução PI foi desprezada e o precipitado celular foi

ressuspendido em PBS para a leitura da fluorescência no citômetro

Guava EasyCyte Plus System (Guava Technologis, Hayward, CA, EUA) (BATISTA,

2008).

Para a análise da fragmentação do DNA utilizou-se um software (Guava

Express Pro) para a quantificação da população em sub-G1 (considerada como toda

a fluorescência inferior ao pico que corresponde à fase G1 do ciclo celular). Para a

análise do ciclo celular foi utilizado o software ModFit LT (Verity Software House,

Topsham, ME, EUA).

3.2.9) Detecção da -H2AX e caspase-3 por citometria de fluxo

Para a dupla marcação de PI com -H2AX (marcador de danos no

DNA) ou caspase 3 ativada (marcador de morte celular por apoptose), as

células A549 foram coletadas e fixadas com paraformaldeído 1% em PBS por 15

minutos no gelo, antes da fixação com etanol 70%. Após a fixação, as células foram

centrifugadas e lavadas com PBS-T BSA (0,2% Triton X-100, 1% BSA),

centrifugadas novamente e bloqueadas/permeabilizadas por 5 minutos em PBS-T

BSA.



Após o bloqueio as células foram centrifugadas e os precipitados

ressuspendidos em 50 µL de anticorpo primário anti--H2AX (ser-139 mouse mAb,

clone JBW301, Upstate/Millipore) ou anti-caspase 3 ativada conjugado com FITC

(rabbit 559341 BD Pharmingen, EUA) 1:500 em PBS-T BSA, incubados por 1 hora

a temperatura ambiente, sob agitação.

Na marcação para -H2AX, após a incubação as células foram lavadas duas

vezes e incubadas com 50 µL de anticorpo secundário anti-mouse FITC (Sigma),

1:200 em PBS-T BSA por 1 hora a temperatura ambiente, sob agitação

(QUINET et al., 2014). Após a incubação com o anticorpo secundário as células

foram novamente lavadas duas vezes com PBS-T BSA e a marcação com PI

realizada com descrito na seção 3.2.8).

3.2.10) Extração de proteínas e Western Blot

A extração das amostras protéicas foi realizada com tampão RIPA (10 mM

Tris-Cl pH 7.4, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% desoxicolato de

sódio, 0.1% SDS) por amostra, adicionado de coquetel de inibidor de proteases

(Merck Millipore, Alemanha) e PMSF (concentração final: 1 mM) ou benzonase

(Millipore). As amostras foram homogeneizadas com o tampão e incubadas por

20 minutos no gelo. Após a incubação, as amostras foram centrifugadas (16000

g por 20 minutos a 4°C) e os sobrenadantes transferidos para novos tubos,

armazenados a -20°C.

A quantificação das amostras foi feita pelo método colorimétrico de BCA

(Pierce TM BCA Protein Assay Kit, Thermo Scientific, EUA), com leitura a 562

nm após 30 minutos de incubação a 37°C.

Os experimentos de Western Blot foram realizados em géis de SDS-PAGE,

em condições desnaturantes. A concentração dos gel foi de 10% (2.5 ml Tris 1.5

M pH = 8.8, 4 ml Acrilamida/Bisacrilamida 30%, 50 μl SDS 20%, 200 μl APS 10%,

3 μl Temed e 3.3 ml água deionizada). Foram aplicados de 30-50 μg de proteína de

cada amostra, desnaturadas a 95°C por 3 minutos, juntamente com o Tampão de

Amostra 4X (0.065 M Tris pH = 6.8, 10% glicerol, 2% SDS, 2% β-mercaptoetanol,

0.002% azul de bromofenol).



A eletroforese foi realizada sob uma voltagem de 100 V, com Tampão

de Corrida 1X (Tampão de Corrida 10X: 192 mM Glicina, 250 mM Tris, 1% SDS). A

transferência foi realizada em membrana de nitrocelulose (Trans-Blot Transfer

Medium, BioRad, EUA), previamente equilibrada por 3 minutos em Tampão de

Transferência (800-900 mL Tampão de Corrida 1X, 10% - 20% metanol, água

deionizada QSP 1 L) antes da transferência, realizada por 90 minutos a 65 V.

Após a transferência as membranas foram coradas com Ponceau S

(0,1 g Ponceau em 100 mL de ácido acético 10%) e lavadas com água destilada. O

bloqueio foi realizado com TBS 0.1% Tween 20 (TBS 1X: 50 mM Tris-HCl pH

= 7.4, 150 mM NaCl) (TBS-T) acrescido de 5% leite (Molico) por uma hora, sob

agitação, à temperatura ambiente.

As incubações com os anticorpos primários (diluídos na solução de

bloqueio) foram realizadas por aproximadamente 24 horas a 4°C. Foram feitas

3 lavagens de 10 minutos cada com TBS-T, sob agitação. Os anticorpos

secundários foram incubados por uma hora à temperatura ambiente, sob

agitação. As membranas foram novamente lavadas com TBS-T (3 lavagens de

10 minutos cada) e reveladas por 1 minuto com substrato quimioluminescente

para peroxidase (Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate, Millipore). A

visualização foi realizada no aparelho ImageQuant 300 (GE Healthcare, EUA).

Os anticorpos utilizados foram: anti-p53 (mouse mAb to p53, AHO0152,

Life Technologies, diluição 1:500); anti-GAPDH (Mouse pAb to GAPDH, 6C5

SC-32233, Santa Cruz Biotechnology, diluição 1:1000); secundários anti-mouse

IgG (Sigma, diluição 1:1000).

3.2.11) Ensaio de fluorescência para a detecção de apoptose e

necrose

Esse ensaio baseia-se na capacidade diferencial de entrada dos

diferentes corantes (DAF, que cora o citoplasma; Hoechst, um corante supravital

intercalante da dupla-fita; e o PI, que cora somente as células com a membrana já

permeabilizada) fluorescentes de acordo com a permeabilidade das membranas

celulares, o que permite a análise do tipo de morte celular (apoptose ou



necrose) de acordo com a fluorescência dos corantes e da morfologia das

células.

Após o tratamento celular de 72 e 96 horas com as concentrações de MP10

previamente escolhidas, as células A549 foram lavadas com PBS, centrifugadas e

ressuspendidas com 20 µL da solução com os corantes. Em seguida, 10 µL foram

pingados na lâmina, cobertos com a lamínula e imediatamente foram feitas as

análises por microscopia de fluorescência. Para cada tratamento foram analisadas

500 células e houve uma repetição de 3 experimentos independentes. No total,

1.500 células foram analisadas para cada concentração ou composto conforme o

protocolo descrito por BATISTA (2008).

Vale ressaltar que foi utilizado o controle negativo (somente com o meio de

cultura DMEM e DMSO 0,1%) e o controle positivo (mistura de HPA totais: Fe, Ant,

Fluo, Pi, BaA, Cri, BbF, BkF, BeP, BaP, InP, BPer e DBA – 30 ng/mL). O composto

reteno (30 ng/mL) também foi avaliado neste teste.

3.2.12) Análise estatística

Os resultados obtidos foram submetidos à análise estatística realizada com o

auxílio dos programas computacionais: GraphPad Prism versão 5.0, Statistical

Package for Social Sciences (SPSS) versão 15.0 e OriginPro 8. Uma análise de

variância (ANOVA) foi utilizada para os dados obtidos nos testes de viabilidade

celular, genotóxico e morfológico assim como nos resultados obtidos por citometria

de fluxo e por Western Blot. O teste Dunnett foi utilizado para determinar o nível de

significância entre o grupo controle e o tratado bem como o teste Tukey para as

comparações múltiplas. Também foi utilizada a regressão linear para ver a

correlação entre os compostos marcadores de queima de biomassa. A análise foi

significativa com p < 0,05.

Resultados 78


4) Resultados

4.1) Resultados da pesquisa realizada em Alta Floresta

Os resultados da pesquisa realizada em Alta Floresta foram publicados na

revista Environmental Research (DE OLIVEIRA ALVES et al., 2014).

4.1.1) Dados do Material Particulado (MP) e Black Carbon (BC)

Para estudar os efeitos mutagênicos dos aerossóis foram coletadas 51

amostras do MP em Alta Floresta, região da Amazônia Brasileira. Na Figura 22 estão

representadas as concentrações das partículas finas (menores que 2,5 µm) e

grossas (entre 2,5 µm e 10 µm) coletadas pelo sistema AFG utilizando os filtros de

policarbonato. Além disso, foram medidas as concentrações do MP10 e BC coletados

nos filtros Teflon. Ressalta-se que a soma das partículas finas e grossas

correspondem à concentração do MP10.

Figura 22: Distribuição das concentrações do material particulado e Black Carbon em Alta Floresta no período de agosto a dezembro de 2008.

Ao comparar os resultados obtidos pelas duas metodologias utilizadas neste

trabalho observa-se que os dados foram similares. Por exemplo, no período de

queima de biomassa intensa a concentração média do MP10 coletado nos filtros dos

Resultados 79


tipos teflon e policarbonato foram 34 µg.m-3 e 33 µg.m-3, respectivamente. Para o

período de queima de biomassa moderada a concentração média foi de 16 µg.m-3

para as amostras dos filtros do tipo teflon e de 18 µg.m-3 para as amostras dos filtros

de policarbonato. Nota-se que há um predomínio das partículas finas em relação a

partículas grossas em todos os meses amostrados.

As maiores concentrações de MP10 e BC foram encontradas no período de

queima de biomassa intensa (agosto e setembro/2008). A análise da regressão

linear mostra que o MP10 e BC tiveram uma significante correlação (p <0.001 e

R2=0.88).

4.1.2) Análise química

As concentrações dos alcanos e dos HPA identificados nas amostras

coletadas em Alta Floresta estão mostrados na Tabela 1.

Os compostos alifáticos (n-alcanos) identificados e quantificados

compreendem o intervalo de C18 a C34. A soma da concentração total dos n-alcanos

durante os períodos de queima de biomassa intensa e moderada foram de 21,8

ng.m-3 e 103,2 ng.m-3, respectivamente. A concentração mais elevada em ambos os

períodos analisados foram observadas em C29. Os valores do IPC foram de 0,9 e 1,4

nos períodos de queima de biomassa intensa e moderada, respectivamente.

Os alcanos isoprenóides pristano e fitano também foram analisados. A razão

entre estes compostos foram de 1,30 e 1,09 para a intensa e moderada queima,

respectivamente.

Neste estudo, 15 HPA foram identificados e quantificados no extrato orgânico.

O reteno foi o HPA mais abundante para ambos os períodos analisados em Alta

Floresta, representando aproximadamente 43% da concentração total dos HPA. De

acordo com a classificação da IARC, vários compostos mutagênicos foram

identificados, tais como: Fe, Fluo, Pir, B(e)P e BghiP. Além disso, os compostos

BbF, BkF, BaP e InP, que são considerados mutagênicos e carcinogênico, também

foram identificados nos extratos. É importante destacar que o BaP foi identificado

apenas no período de queima de biomassa intensa.

Resultados 80


Tabela 1: Alcanos e Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPA) identificados em Alta Floresta.

Queima de biomassa intensa

Queima de biomassa moderada

n-alcanos (ng.m-3) C18 1,7 1,0 C19 0,9 0,7 C20 1,9 0,9 C21 0,9 0,9 C22 1,0 1,3 C23 0,9 2,6 C24 1,0 3,7 C25 1,4 6,0 C26 1,2 9,0 C27 2,1 11,9 C28 1,4 15,1 C29 2,7 24,2 C30 1,1 14,6 C31 1,3 3,2 C32 0,7 2,4 C33 0,6 4,4 C34 1,0 1,3 Total 21,8 103,2 Pristano (ng.m-3) 1,4 1,2 Fitano (ng.m-3) 1,1 1,1 IPC Cmax

0,9 C29

1,4 C29

HPA (ng.m-3) Naftaleno 0,10 0,10 Acenafteno 0,15 <LD Acenaftileno 0,52 0,40 Fluoreno 0,36 0,18 Antraceno 0,10 <LD Fenantreno 0,10 0,05 Fluoranteno 0,09 0,05 Pireno 0,06 0,04 Reteno 1,50 1,25 Benzo(a)pireno 0,06 <LD Benzo(e)pireno 0,10 0,15 Benzo(g,h,i)perileno 0,09 0,10 Benzo(b)fluoranteno 0,12 0,10 Benzo(K)fluoranteno 0,05 0,22 Indeno(1,2,3,-dc)pireno 0,10 0,11 Total 3,50 2,75 < LD: abaixo do limite de detecção

Resultados 81


A análise de WNA mostra que houve um predomínio das emissões biogênicas

no período de queima moderada na Amazônia (Figura 23).

Figura 23: Distribuição do índice de Wax Normal Alkanes (WNA) obtido através das concentrações dos n-alcanos identificados em Alta Floresta.

Para identificar a origem da emissão dos HPA, foram calculadas as razões

das concentrações entre alguns compostos. As razões selecionadas para a

comparação com outros estudos foram: Fluo/(Fluo + Pir), BFs/BPer, InP/(InP +

BPer), (BPerP/BeP) and BaP/BeP (Tabela 2). O valor das razões obtidas neste

trabalho é similar com outros estudos que têm como principal fonte a queima de

biomassa.

Resultados 82


Tabela 2: Valores das razões diagnósticas entre Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPA) obtidos na literatura e nas amostras coletadas em Alta Floresta.

Razões de

HPA

Queima de biomassa intensa (neste

estudo)


(neste estudo)

Aerossóis de queimadas

Aerossóis

de coníferas

Aerossóis de Túneis

Aerossol urbano

Fluo/(Fluo+Pir) 0,85 0,81 0,25-0,70a

0,51-0,68 b

0,53-0,86c

0,48-0,93d

0,65e

0,56f

0,18-0,88g 0,54

h 0,40-0,85

i

0,65-0,87j

0,13-0,95k

0,40-0,79l

0,64-0,97m

BFs/BPer 1,89 3,28 3,2-12a

2,7-33b

3,5c

5,2-9,5d

3,6 e,f

- 0,79 h -

InP/(BPer+InP)

0,53

0,52

0,15-0,49

a

0,24-0,57b

-

0,31

h

-

BPer/BeP

0,96

0,67

0,87

c,d

-

-

-

BaP/BeP

0,57 <LD - - - 0,40-1,00i

0,40-0,80j

0,40-1,00k

0,40-0,70l

0,50-0,10m

aVicente et al. (2012) – PM2,5

bVicente et al. (2012) – PM10 - PM2,5

cVicente et al. (2011) – PM2,5

dVicente et al. (2012) – PM10 -PM2,5

eAlves et al. (2011) ) – PM2,5

fAlves et al. (2011) – PM10 - PM2,5 gOros and Simoneit (2001)

hOliveira et al. (2011)

iVasconcellos et al. (2011) – Autumn/2003

jVasconcellos et al. (2011) – Winter/2003 kVasconcellos et al. (2011) – Spring/2003

lVasconcellos et al. (2011)-Summer/2003 mVasconcellos et al. (2011) – Autumn/2004

< LD: abaixo do limite de detecção

Resultados 83


4.1.3) Testes biológicos

4.1.3.1) Teste de viabilidade celular

Para estudar o comportamento das células do pulmão humano (A549) em

resposta ao tratamento com o MOE foi realizado o teste MTT para avaliar a

viabilidade das células.

A Tabela 3 mostra que na presença do extrato orgânico, em ambos os

períodos de análise, a viabilidade das células foi reduzida na medida em que houve

o aumento da concentração testada. Entretanto, somente na concentração mais alta

(1,0 mg/L) teve uma diferença significativa em relação ao controle negativo

(**p<0.01).

Ressalta-se que o controle positivo utilizado neste teste foi selecionado com o

objetivo de obter uma concentração para a análise nos testes de genotoxicidade.

Logo, a concentração de 10 ng.mL-1 da mistura de HPA foi ideal para visualizar os

danos genéticos, porém não afetou a viabilidade das células.

Tabela 3: Viabilidade das células A549 após o tratamento com o material orgânico extraído do MP10 atmosférico.

Concentrações (mg.L-1)



MP orgânico usando células A549 (% viabilidade ± Desvio Padrão)

CDa 107,41 ± 0,57 105,87 ± 0,41 0.1 102,07 ± 0,68 102,03 ± 0,51 0.5 87,59 ± 0,59 91,60 ± 0,53 1.0 75,90 ± 0,52** 94,03 ± 0,50 CPb 93,95 ± 0,68 93,17 ± 0,43

a Controle com DMSO 0,1%

b Controle Positivo: 10 ng/mL da mistura de HPA

**p <0.01 Estatisticamente significante quando comparado com o controle negativo (DMEM) de acordo com o teste Dunnett.

4.1.3.2) Testes de micronúcleo

A análise comparativa do potencial genotóxico do MP orgânico coletado em

Alta Floresta foi avaliada em dois sistemas: in vitro, com o teste CBMN e ex situ,

com o teste Trad-MCN.

Resultados 84


Os resultados do teste CBMN são mostrados na Figura 24. O valor do IDN

como um índice de inibição da proliferação celular foi semelhante ao do grupo

controle e variou entre 1,5 e 1,7.

No teste CBMN, para o período de intensa queima de biomassa, observou-se

um aumento significativo na frequência de MN, de um modo dependente da

concentração, quando comparados com o controle negativo (p <0,001). No outro

período analisado, caracterizado pela moderada queima de biomassa, apenas nas

concentrações 0,5 mg/L e 1,0 mg/L do extrato orgânico, foi observado que a

formação de MN aumentou significativamente quando comparada com o controle

negativo. Estes efeitos também foram comparáveis aos danos induzidos pelo

controle positivo (mistura de HPA) (Figura 24).

O tratamento com o extrato orgânico obtido do MP10 de Alta Floresta não

induziu aumento significativo na formação de PN e BN quando foram comparados

com o controle negativo.

Figura 24: Análise da presença de micronúcleo em células binucleadas após a exposição ao material orgânico extraído do MP10 atmosférico. CN - Controle negativo somente com DMEM; CD - Controle negativo com DMSO 0,1%; CP - controle positivo: mistura de HPA (10 ng/mL).* p<0,05 e *** p <0,001 estatisticamente significativos em relação ao controle negativo de acordo com o teste de Dunnett.

O teste Trad-MCN (ex situ) mostra que, no período de queima de biomassa

intensa, houve um aumento significativo na frequência de MN com as concentrações

Resultados 85


testadas. No entanto, durante o período de queima de biomassa moderada, apenas

a concentração mais alta (1,0 mg.L-1) foi significante em relação ao controle negativo

(p <0,001) (Figura 25).

Figura 25:Diagrama Box plot para a distribuição dos valores da média de micronúcleo obtida pelo teste Trad-MCN. O limite superior da caixa indica o percentil de 75% dos dados e o limite inferior da caixa indica o percentil de 25%. Os extremos do gráfico indicam os valores mínimo e máximo. A linha da caixa indica o valor da mediana dos dados e os círculos correspondem aos valores da média. Controle Negativo (NC) - DMSO 1% e controle positivo (CP) - 0,2% de formaldeído.**p <0,01 estatisticamente significantes em relação ao CN de acordo com o teste de Dunnett.

Ao comparar os resultados obtidos pelos dois testes de MN (CBMN e Trad-

MCN) nota-se que ambos os ensaios mostraram que a frequência média de MN no

período de intensa queima de biomassa é maior em relação ao período de

moderada queima de biomassa (p<0.001) (Figura 26).

Resultados 86


Figura 26: Análise comparativa dos testes de micronúcleo em células pulmonares (teste CBMN) e em células vegetais (Trad-MCN).*** p <0,001 estatisticamente significativos entre os períodos de amostragem de acordo com o teste de Tukey.

4.2) Resultados da pesquisa realizada em Porto Velho

4.2.1) Dados do MP10

Através do monitoramento de queimadas e incêndios realizado pelo Instituto

Nacional de Pesquisas Espaciais (INPE, 2014) obteve-se uma série histórica dos

focos de queimadas detectados por satélite no período de janeiro/1998 a julho/2014.

Com esse dados, observa-se um aumento significativo nos focos de queimadas para

os meses de julho a setembro no estado de Rondônia (Figura 27).

Figura 27: Valores máximos, médios e mínimos dos focos de queimadas obtidos durante o período de janeiro/1998 a julho/2014. Figura adaptada de INPE, 2014.

Resultados 87


As concentrações do MP10 obtidas nas 50 amostras coletadas em Porto Velho

no período de Julho/2011 a Março/2012 utilizando um amostrador de alto volume

(Hivol). A concentração média do MP10 nos meses de julho a setembro foi de 28,82

µg.m-3. Em concordância com os focos de queimadas obtidos pelo INPE, esse é o

período onde ocorre uma maior prática de queimadas. Nos meses de outubro/2011

a março/2012, a concentração média do MP10 foi de 13,80 µg.m-3, sendo este um

período chuvoso na região amazônica (Figura 28). Ressalta-se que neste período

específico, devido às políticas públicas implantadas pelo governo federal e estadual,

ocorreu uma redução acentuada das queimadas.

Na Figura 28 também está destacada a série temporal dos focos de queimadas

identificados por satélite pelo INPE e as concentrações do MP10 para o mesmo

período de amostragem medidos em Porto Velho. Observa-se que existe uma

tendência no aumento das concentrações do MP10 na medida em que ocorre um

aumento dos focos de queima.

Figura 28: Concentrações de MP10 e focos de queimadas obtidos por satélite no período de amostragem em Porto Velho.

Resultados 88


4.2.2) Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPA) e os seus

derivados

Nas 50 amostras coletadas foram analisados os HPA totais e os oxi-HPA. A

precisão do método selecionado foi avaliado através do teste de recuperação. A

faixa de recuperação para os HPA foi de 72 a 99%. Para os oxi-HPA a faixa de

recuperação foi de 70 a 93%. A recuperação para os compostos com maior

volatilidade (acenaftileno e fluoreno) foram abaixo de 60% e, portanto, não foram

analisados neste trabalho.

Os HPA foram identificados e quantificados e observou-se uma diferença

significativa em relação às concentrações de HPA destes compostos no período de

queima intensa e moderada em Porto Velho (Figura 29).

Dos 14 HPA quantificados, o Ret foi o composto mais abundante durante

toda a análiseDe acordo com a IARC, dentre os HPA considerados somente

mutagênicos foram identificados: Fe, Fluo, Pir, BeP e BPer. Além destes compostos,

o BaP, BaA, Cri, BbF, BkF, InP , DBA e BPer são considerados mutagênicos e

carcinogênicos, sendo também encontrados nas amostras em Porto Velho.

Figura 29: Concentração média e desvio padrão dos Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos analisados nas amostras de Porto Velho.

Resultados 89


Para avaliar o potencial risco carcinogênico e mutagênico para a exposição

aos HPA foram calculados o BaP-equivalente (BaP-TEF e BaP-MEF). As

concentrações calculadas para oito HPA considerados mutagênicos e

carcinogênicos e para os compostos individuais são mostrados na Tabela 4.

Ao analisar o BaP-TEF e BaP-MEF para a soma dos oito HPA (BaP, BaA, Cri,

BbF, BkF, InP , DBA e BPer) observa-se que no período de queima de biomassa

intensa o potencial risco carcinogênico e mutagênico é aproximadamente o dobro

quando comparado com o período de queima de biomassa moderada. Além disso,

os HPA que mais contribuíram para os BaP-equivalentes foram o BaP e DBA.

Resultados 90


Tabela 4: BaP-equivalente carcinogênico (BaP-TEQ) e mutagênico (BaP-MEQ) para a exposição aos Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPA) oriundos das queimadas na região Amazônica.

BaP-TEQ (ng.m-3) para a exposição dos HPA oriundos da região Amazônica



TEFa Média ± DPb TEFa Média ± DPb ∑8HPA NA 1,970 ± 0,47 NA 0,840 ± 0,03 Benzo(a)pireno 1,00 0,260 ± 0,18 1,00 0,100 ± 0,10 Benzo(a)antraceno 0,10 0,026 ± 0,21 0,10 0,015 ± 0,18 Criseno 0,01 0,002 ± 0,19 0,01 0,001 ± 0,19 Benzo(b)fluoranteno 0,10 0,014 ± 0,12 0,10 0,007 ± 0,07 Benzo(k)fluoranteno 0,10 0,015 ± 0,15 0,10 0,006 ± 0,06 Indeno(1,2,3-cd)pireno

0,10 0,024 ± 0,30 0,10 0,014 ± 0,18

Dibenzo(a)antraceno 5,00 1,650 ± 0,34 5,00 0,700 ± 0,18 Benzo(g,h,i)perileno 0,01 0,001 ± 0,15 0,01 0,000 ± 0,09 Total de amostras 19 31

BaP-MEQ (ng.m-3) para a exposição dos HPA oriundos da região Amazônica



MEFc Média ± DPb MEFc Média ± DPb ∑8HPA NA 0,530 ±

0,62** NA 0,230 ± 0,12

Benzo(a)pireno 1,000 0,260 ± 0,18 1,000 0,100 ± 0,10 Benzo(a)antraceno 0,082 0,021 ± 0,20 0,082 0,012 ± 0,20 Criseno 0,017 0,004 ± 0,18 0,017 0,002 ± 0,17 Benzo(b)fluoranteno 0,250 0,035 ± 0,13 0,250 0,017 ± 0,07 Benzo(k)fluoranteno 0,110 0,016 ± 0,14 0,110 0,006 ± 0,07 Indeno(1,2,3-cd)pireno

0,310 0,074 ± 0,33 0,310 0,043 ± 0,18

Dibenzo(a)antraceno 0,290 0,095 ± 0,39 0,290 0,040 ± 0,16 Benzo(g,h,i)perileno 0,190 0,030 ± 0,19 0,190 0,015 ± 0,08 Total de amostras 19 31

aTEF:Toxic Equivalente Factors para o potencial risco de câncer relativo ao BaP (NISBET & LAGOY,1992)

bDP:Desvio Padrão

cMEF:Mutagenic Potency Factor para o potencial risco mutagêncio relativo ao BaP (DURANT et al.,

1996,1999).

Para as análises dos oxi-HPA, foram selecionados quatro compostos: 9-

fluorenona, 2-metilantraquinona, benzo(a)antraceno-7,12-diona e 9,10-antraquinona.

Toda a metodologia foi padronizada assim como a identificação e quantificação dos

compostos. O composto 2-metilantraquinona (192,2 pg.m-3) e o 7,12-

benzo(a)antracenoquinona (145,9 pg.m-3) foram os mais abundantes dos oxi-HPA

identificados (Figura 30).

Resultados 91


Figura 30: Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos oxigenados identificados em Porto Velho, região da Amazônia Brasileira.

4.2.3) Monossacarídeos marcadores da queima de biomassa

As concentrações dos compostos: levoglucosano, manosano e galactosano

identificados e quantificados nas amostras de MP10 coletadas em Porto Velho estão

mostrados na Figura 31. Como esperado, a correlação entre estes marcadores foi

muito boa: (levoglucosano e manosano – R2= 0.97; p<0.0001), (levoglucosano e

galactosano – R2= 0.98; p<0.0001) e (manosano e galactosano – R2= 0.93;

p<0.0001). Para algumas amostras, os derivados manosano e galactosano ficaram

abaixo do limite de detecção.

Ao analisar todo o período de amostragem é evidente o aumento do

levoglucosano e dos seus monômeros nos meses de julho a setembro, sendo este o

período onde ocorre a queima de biomassa intensa na região (Figuras 31 e 32).

Ressalta-se que no pico de queimada, a concentração do levoglucosano

corresponde a quase 8% do total do MP10. Este valor representa uma significante

contribuição da queima de biomassa nas partículas inaláveis (Figura 32).

Resultados 92


Figura 31: Identificação e quantificação dos monossacarídeos marcadores da queima de biomassa nas amostras coletadas em Porto Velho.

Figura 32: Contribuição do levoglucosano no MP10 coletado em Porto Velho.

Resultados 93


Após a análise dos compostos marcadores da queima de biomassa foram

selecionadas apenas as amostras do período de queima de biomassa intensa para

avaliar os efeitos celulares e moleculares utilizando as células do pulmão humano.

4.2.4) Viabilidade celular

Os resultados do teste XTT mostraram que não houve perda da viabilidade

das células expostas às concentrações do MOE no período de 24 e 48 horas. A

partir da maior concentração testada (400 µg/mL) no período de 72 horas foi

observada uma diferença significativa em relação ao controle negativo. No período

de 96 horas de exposição, nas concentrações de 200 µg/mL e 400 µg/mL do MOE,

as células foram mais sensíveis ao tratamento e observou-se uma diminuição da

atividade mitocondrial (Figura 33).

Além do tratamento com o meio DMEM, utilizou-se o DMSO (0,1%) como

controle negativo e não teve nenhuma diferença entre eles. Para a mistura de HPA

(30 ng/mL) (controle positivo) e para o HPA reteno (marcador de queima de

biomassa) observou-se a perda de viabilidade das células a partir das 72 horas de

exposição a esses compostos (Figura 33).

Figura 28: Sensibilidade das células A549 após a exposição ao material orgânico extraído em concentrações e tempos diferentes. CD: controle DMSO (0,1%); HPA: mistura dos Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (30 ng/mL); Ret: Reteno (30 ng/mL). ** p < 0,01 Estatisticamente significante em relação ao controle negativo de acordo com o teste de Dunnett.

Resultados 94


4.2.5) Danos no DNA das células expostas ao material particulado

Após a obtenção das concentrações viáveis (não tóxicas) através do teste de

viabilidade celular, realizou-se o ensaio cometa alcalino para verificar se o MOE

causa danos genotóxicos. Após 24 horas de exposição observou-se uma dose

resposta em todas as concentrações testadas, mostrando que as partículas

orgânicas oriundas das queimadas na Amazônia podem gerar danos no DNA

(Figura 34).

Neste mesmo experimento foi utilizada a mistura de HPA (30 ng/mL) como

controle positivo e o seu efeito foi confirmado. Além disso, utilizou-se uma

concentração do composto reteno (30 ng/mL) para avaliar a sua genotoxicidade,

pois são poucos trabalhos que investigam os danos genéticos causados por este

marcador de queima de biomassa. Surpreendentemente, o reteno foi genotóxico,

com alta significância em relação ao controle negativo (p<0,01) (Figura 34).

Figura 34: Danos ao DNA causado pela exposição ao MP10 oriundo da queima de biomassa na Amazônia. CN: controle negativo (DMEM); CD: controle DMSO (0,1%);HPA: mistura dos Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (30 ng/mL); Ret: Reteno (30 ng/mL). * p<0,05 e ** p<0,01 Estatisticamente significante em relação ao controle negativo de acordo com o teste de Dunnett.

Resultados 95


4.2.6) Alterações no ciclo celular e ativação de checkpoints após a

exposição ao material particulado

A marcação do conteúdo do DNA com PI foi utilizado para a análise do ciclo

celular das células do pulmão humano expostas ao extrato orgânico do MP10 emitido

pelas queimadas em Porto Velho. A Figura 35 mostra o perfil do ciclo celular das

células A549 após o tratamento com as partículas orgânicas por 24 horas. Os dados

mostraram que apenas na maior concentração testada (400 µg/mL equivale a 30

µg.m-3) houve uma parada na fase G1.

Figura 35: Alterações no ciclo celular após a exposição ao MP10 atmosférico.

Resultados 96


Tendo em vista que ocorreu uma parada em G1 no período de 24 horas, foi

de interesse analisar a expressão das proteínas p53 e p21 nestas mesmas

condições. Os resultados do Western Blot mostraram que há um aumento na

expressão dessas duas proteínas de checkpoint do ciclo celular com diferença

significativa em relação ao controle negativo (Figura 36).

Figura 36: Proteínas do checkpoint celular (p53 e p21) foram ativadas após ao material orgânico extraído no período de 24 horas.* p<0,05 Estatisticamente significante em relação ao controle negativo de acordo com o teste de Dunnett.

4.2.7) Sinalização em resposta aos danos ao DNA

Sabendo que o MOE é genotóxico e que provoca parada no ciclo celular na

fase G1, investigou-se a ocorrência da sinalização da histona -H2AX.

Após o tratamento com o MOE durante 24 horas de exposição, observou-se

uma tendência no aumento dos foci de -H2AX com diferença significativa (p<0,05)

(Figura 37).

Resultados 97


Figura 37: Aumento dos foci de -H2AX após o tratamento com o material particulado orgânico extraído. * p<0,05 Estatisticamente significante em relação ao controle negativo de acordo com o teste de Dunnett.

Resultados 98


Ressalta-se que também foi realizado o teste de imunofluorescência para a

avaliação da marcação histona H2AX nas células expostas ao MP10. Abaixo estão

algumas imagens obtidas desta análise (Figura 38).

Figura 38: Imagens do teste de imunofluorescência para a avaliação da marcação histona -H2AX nas células expostas ao material orgânico extraído. O 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) se liga ao

DNA (em azul) e o anticorpo -H2AX (em vermelho).

4.2.8) Análise dos tipos de morte celular em resposta ao dano no DNA

A marcação do DNA com PI também serve para o estudo das células em

apoptose, que corresponde às populações de células com quantidade de DNA

menor que o da célula em G1 (sub-G1), o que sugere a ocorrência de fragmentação

do DNA.

Resultados 99


Para o período de 72 e 96 horas de exposição, um aumento na fragmentação

do DNA das células foi observado para a concentração de 400 µg/mL, sendo

significativo em relação ao controle negativo (p<0,01). É interessante ressaltar que

não foi observada uma mudança significativa entre os dois tempos de exposição

analisados (Figura 39).

Figura 39: Morte por apoptose após o tratamento com material particulado orgânico analisando a população de células em sub-G1 (72 e 96 horas de exposição).

Resultados 100


Sabe-se que o aumento dos foci de -H2AX também pode ser resultado da

ocorrência de apoptose. Notou-se que após 72 horas de exposição, na maior

concentração testada do MOE (400 µg/mL equivale a 30 µg.m-3), houve um aumento

na marcação para a histona H2AX bem evidente e significativo tanto com relação

ao controle negativo quanto com relação à concentração de 200 µg/mL (p<0,01)

(Figura 40).

Figura 40: Aumento dos foci de H2AX após 72 horas de exposição ao material particulado.

Com o intuito de investigar se o aumento dos foci de H2AX está associada

com a fragmentação do DNA durante a apoptose após 72 horas de exposição ao

MOE foi feita uma análise com uma dupla marcação da histona H2AX e da

caspase-3. Os dados mostram que à medida que ocorre aumenta os foci de H2AX

ocorre também um aumento na ativação da caspase-3 (Figura 41).

Controle negativo

200 µg/mL

Controle negativo

400 µg/mL

3.41% -H2AX 10.57% -H2AX

**

0

2

4

6

8

10

12

14

CN 200 µg/mL 400 µg/mL

Po

rcen

tag

em

da f

luo

rescên

cia

da

his

ton

a

H2A

X (

%)

Concentrações testadas

**

Resultados 101


Figura 41: Aumento na dupla marcação da -H2AX e caspase-3 após o tratamento com o material particulado orgânico por 72 horas.

Outra forma de avaliar os tipos de morte celular é através da marcação

simultânea com os 3 corantes fluorescentes DAF, PI e Hoechst, pois permite a

determinação do tipo de morte celular de acordo com a morfologia das

células visualizadas no microscópio de fluorescência. Quando uma célula é

normal, apresenta o núcleo azul intacto (Figura 42A). A apoptose inicial é

caracterizada pelo núcleo azul condensado e fragmentado (Figura 42B) enquanto

que na apoptose tardia observa-se o núcleo vermelho condensado e fragmentado

(Figura 42C). Já a célula em necrose, apresenta o núcleo vermelho intacto (Figura

42D).

Controle negativo

400 µg/mL

Controle negativo

400 µg/mL

H2AX Caspase – 3

10e0 10e1 10e2 10e3 10e4Green Fluorescence (GRN-HLog)

10

e4

10

e3

10

e2

10

e1

10

e0

Yell

ow

Flu

ore

sce

nce (

YL

W-H

Lo

g)

M1


10

e4

10

e3

10

e2

10

e1

10

e0

Yell

ow

Flu

ore

sce

nce (

YL

W-H

Lo

g)

Plot4: Gated by : Gate 1


10

e4

10

e3

10

e2

10

e1

10

e0

Yell

ow

Flu

ore

sce

nce (

YL

W-H

Lo

g)

M1


10

e4

10

e3

10

e2

10

e1

10

e0

Yell

ow

Flu

ore

sce

nce (

YL

W-H

Lo

g)

Plot4: Gated by : Gate 1

Controle negativo 400 µg/mL

Resultados 102


Figura 42: Imagens do teste para detecção morfológica por microscopia de fluorescência. A) Célula normal; B) Apoptose inicial; C) Apoptose tardia e D) Necrose.

Após 72 horas de exposição ao MOE, nas concentrações de 200 µg/mL e 400

µg/mL, os dados mostram que há a ocorrência de apoptose inicial (4,4% e 6,8%),

apoptose tardia (5,2% e 10%) e necrose (18,8 e 30,8%), respectivamente (Figura

43A).

Além disso, a mistura de HPA (controle positivo) nesta análise causou tanto a

morte por apoptose quanto por necrose. Já na exposição com o composto reteno,

observou-se apenas morte por necrose com diferença significativa em relação ao

controle (p<0,01) (Figura 43).

Após 96 horas de exposição ao MOE, observa-se que há um aumento visível

para a necrose nas duas concentrações testadas (200 µg/mL e 400 µg/mL). A

mistura de HPA (controle positivo) continua causando morte por apotose e necrose.

Para a exposição com o reteno, há um aumento da morte por apoptose e é evidente

a morte por necrose (Figura 43B).

Resultados 103


A) 72 horas de exposição

B) 96 horas de exposição

Figura 43: Material particulado orgânico emitido pelas queimadas na região Amazônica causa morte celular por apoptose e necrose.

Discussão 104


5) Discussão

5.1) Pesquisa realizada em Alta Floresta

A queima de biomassa que ocorre sistematicamente na região da Amazônia

como parte do processo de desmatamento tem um efeito adverso sobre a saúde

humana e o meio ambiente (DE FARIAS et al., 2010; DE OLIVEIRA ALVES et al.,

2011; SISENANDO et al., 2011, 2012). No entanto, nesta região há poucos estudos

que associam a poluição atmosférica e danos genéticos.

Na avaliação feita por KELLY & FUSSELL (2012), os autores relatam que a

maior lacuna no conhecimento da toxicidade do MP está relacionada com a falta de

conhecimento sobre os componentes presentes nestes aerossóis, bem como sobre

as suas características físicas e químicas. O presente trabalho centrou-se na

composição química e nos danos genéticos do MP inalável e é a primeira pesquisa

que comparou o efeito genotóxico do MOE nos períodos de queima de biomassa

intensa e moderada na região amazônica, utilizando dois ensaios com diferentes

bioindicadores.

Em Alta Floresta as concentrações de MP10 apresentaram grandes diferenças

entre os períodos de intensa e moderada queima de biomassa. Em concordância

com este resultado, imagens de satélite nesta mesma região registraram 182 focos

de incêndio durante o período de intensa queima de biomassa e apenas 5 focos de

incêndio para o período de moderada queima de biomassa (INPE, 2008).

Em Alta Floresta, as concentrações do MP10 foram abaixo do limite

estabelecido pela OMS para 24 horas. Entretanto, os compostos orgânicos

presentes no extrato orgânico causaram danos no material genético de células

vegetais e do pulmão humano. Este resultado é muito importante porque os estudos

realizados por DE OLIVEIRA ALVES et al. (2011) e CORONAS et al. (2009)

sugeriram uma reavaliação dos padrões estabelecidos pelos órgãos ambientais e de

saúde, em termos de composição química e potencial genotóxicos do MP.

Os dados obtidos nesta pesquisa mostraram uma boa correlação entre MP10 e

BC durante todo o período de amostragem. Resultados semelhantes foram

observados em Alta Floresta por MAENHAUT et al. (2002). Além disso, estudos

também mostraram que o BC provavelmente contribui para vários efeitos adversos

para a saúde (CANÇADO et al., 2006; HOEK et al., 2002). Outro estudo mostrou

Discussão 105


que o BC correlaciona com o aumento do risco de hospitalização por infarto do

miocárdio (ZANOBETTI; SCHWARTZ, 2006).

Nas análises do MP de Alta Floresta, observou-se o predomínio da fração fina

nos aerossóis. De acordo com BRÄUNER et al. (2007), o MP pode causar diversos

efeitos incluindo o estresse oxidativo, resultando em dano ao DNA e em outras

macromoléculas.

Na análise química das amostras coletadas foram identificados os n-alcanos

variando do C18 ao C34, bem como os compostos pristano e fitano. A determinação

do Cmax (C29) durante os dois períodos de amostragem mostram que há emissões

biogênicas. É importante salientar que os n-alcanos oriundos da queima de

biomassa são indistinguíveis dos alcanos de cera de plantas no aerossol ambiente

(SIMONEIT et al., 1996). Estes resultados estão de acordo com os dados obtidos

por OROS & SIMONEIT (2001), onde os autores fizeram uma descrição dos

componentes orgânicos em aerossóis proveniente da queima de biomassa em áreas

florestais da Califórnia e Oregon.

Outro parâmetro para avaliar a contribuição biogênica nas análises dos

alcanos é quando o resultado da razão entre pristano / fitano é superior a 1. Este

resultado é evidente durante os dois períodos de amostragem (1,30 e 1,09 para os

períodos de intensa e moderada queima de biomassa, respectivamente).

O valor do IPC encontrado durante o período de intensa queima indica uma

influência antrópica diretamente associada à queima de biomassa (IPC ~ 0,9).

Resultados semelhantes foram encontrados por DE OLIVEIRA ALVES et al. (2011),

em Tangará da Serra (MT) durante o período de queima de biomassa. No entanto,

durante o período de moderada queima, o IPC indicou um predomínio da influência

biogênica nas amostras (IPC ~ 1,4). Além disso, o índice WNA mostra que a

emissão biogênica é maior no período de queima moderada, corroborando com os

resultados do IPC.

Resultados da análise dos HPA indicaram o reteno como o composto mais

abundante em ambos os períodos de amostragem. O reteno é um marcador

conhecido da combustão de madeira(RAMDAHL, 1983). Esse resultado está

corroborando com outros estudos realizados em áreas de incêndios florestais

(ALVES et al., 2011; VICENTE et al., 2012). Compostos classificados como

cancerígenos e mutagênicos pela IARC foram identificados durante os dois períodos

Discussão 106


de amostragem. No entanto, durante o período de queima de biomassa moderada, o

BaP estava abaixo do limite de detecção, o que sugere que outros componentes são

responsáveis pelo efeito genotóxico observado nas concentrações mais elevadas.

Estudos anteriores demonstraram que as concentrações de HPA têm grandes

variações na composição e nas diferentes fontes de emissões. Assim, algumas

relações entre estes compostos são uma ferramenta poderosa para entender a

origem das fontes de emissões (VASCONCELLOS et al., 2011; WANG et al., 2009).

As razões entre os Fluo / (Fluo + Pir), BF/ BPer e InP / ( BPer + InP ) obtidos para

ambos os períodos deste estudo estão de acordo com aqueles relatados na

literatura para diferentes fontes de queima de biomassa (OROS; SIMONEIT, 2001;

VICENTE et al., 2011, 2012).

A razão de diagnóstico para BPer/BeP para as amostras de Alta Floresta

durante a intensa queima foi 0,96 e durante a moderada queima foi 0,67. NIELSEN

et al. (1996) relatam que esses índices têm sido usados para diferenciar entre as

emissões de tráfego ( BPer / BeP ~ 2,02 ) e de não- tráfego ( BPer / BeP ~ 0,80).

A relação BaP/BeP durante o período de intensa queima de biomassa foi de

0,57. No trabalho de VASCONCELLOS et al. (2010) os pesquisadores relataram que

esta razão pode ser um indicador importante para o cálculo do envelhecimento das

partículas. A razão BeP/(BaP+BeP) indica a influência da reatividade da atmosfera

na composição do MP, pois o BeP é mais inerte e BaP é facilmente decomposto

pela luz e por compostos oxidantes (VASCONCELLOS et al., 2011).

Para avaliar o potencial genotóxico de uma amostra é interessante realizar

diferentes testes. Os bioensaios escolhidos para este estudo foram bem sucedidos

na detecção de compostos genotóxicos presentes no ar. Dentre as pesquisas

realizadas na região amazônica, apenas um estudo, conduzido por DE OLIVEIRA

ALVES et al. (2001), usou o Trad- MCN (ex situ) para avaliar os efeitos do extrato

orgânico de queimadas na região.

Além disso, este foi o primeiro trabalho que avaliou o efeito genotóxico do

MOE usando células do pulmão humano (in vitro) na Amazônia. É importante

ressaltar que foram utilizados linhagem de células A549 porque as células

pulmonares é um dos principais alvos quando as toxinas são inaladas. Também,

este sistema de células é uma boa ferramenta para analisar as lesões

Discussão 107


cromossômicas, pois elas são células metabolizadoras capazes de biotransformar

xenobióticos (FOSTER et al., 1998).

O teste CBMN indicou que no período de queima de biomassa moderada, nas

concentrações de 0,5 mg/L e 1,0 mg/L de extrato orgânico, houve um aumento

significativo na formação de MN quando comparado com o controle negativo

enquanto que para o Trad- MCN foi significativo apenas na maior concentração.

Este resultado pode ser explicado pela maior sensibilidade das células in vitro e pela

atividade metabólica da célula A549. Também, alguns compostos mutagênicos

presentes nesta fração podem ter contribuído para este efeito.

Os dados de ambos os testes de MN, para as mesmas concentrações,

mostraram que a frequência de MN do período de queima de biomassa intensa é

maior em relação ao período de queima moderada. Este resultado pode estar

associado à presença do BaP nos extratos do período de intensa queima de

biomassa. Curiosamente, os extratos orgânicos de Tangará da Serra, utilizando

Trad- MCN indicaram resultados semelhantes (DE OLIVEIRA ALVES et al., 2011).

Este estudo confirmou o efeito genotóxico do MOE tanto em células vegetais quanto

em células do pulmão humano.

5.2) Pesquisa realizada em Porto Velho

Estudos realizados na região Amazônica têm mostrado que a exposição da

população aos poluentes oriundos da queima de biomassa aumentam os riscos de

doenças respiratórias agudas (CARMO; ALVES; HACON, 2013; IGNOTTI et al.,

2010). Sabe-se que a inalação dessas partículas com compostos tóxicos além de

serem fatores de risco determinantes para o acometimento e agravos de infecções

respiratórias e cardiovasculares, há também uma forte correlação entre a poluição

do ar e a mortalidade por câncer de pulmão (FAJERSZTAJN et al., 2013).

De fato, quanto menor for o tamanho aerodinâmico do MP, maiores serão os

efeitos inflamatórios dessas partículas nos pulmões (DONALDSON et al., 2001a).

Baseado nisso, ressalta-se que no trabalho publicado por ARTAXO et al. (2013),

analisando a distribuição do tamanho das partículas dos aerossóis em Porto Velho,

no mesmo local de amostragem deste presente estudo, observa-se que no período

Discussão 108


de seca há um aumento significativo no número de partículas com diâmetro de

aproximadamente 100 nm (Figura 44).

Figura 44: Mediana da distribuição do tamanho dos aerossóis medidos em Porto Velho no período de queimadas. Os círculos representam os valores médios e as barras representam percentis 10 e 90. Figura adaptada de ARTAXO et al. (2013).

O dado acima é de extrema importância, pois as nanopartículas atingem os

alvéolos pulmonares e podem provocar diversos efeitos na saúde (NEMMAR et al.,

2013). A população exposta às queimadas na Amazônia inalam essas partículas e

ainda são desconhecidos os seus mecanismos de ação.

Diante deste fato, esta pesquisa buscou trazer novos conhecimentos sobre os

efeitos do MP emitido pelas queimadas a nível de danos no DNA e de morte celular

usando como modelo as células do pulmão humano, contribuindo assim para um

melhor entendimento dos riscos da exposição ao MP, principalmente para os grupos

mais vulneráveis.

Neste estudo, as concentrações do MP10 não excederam o limite

recomendado pela OMS. Entretanto, é importante ressaltar que somente os dados

das concentrações do MP10 não indicam necessariamente a genotoxicidade destas

partículas, sendo importante a identificação de compostos químicos e a investigação

dos efeitos na saúde em nível celular e molecular (BONETTA et al., 2009; KELLY;

FUSSELL, 2012).

Discussão 109


Sabendo disso, após a coleta do MP10, foram realizadas a identificação e

quantificação de compostos químicos nas amostras coletadas em Porto Velho. Os

dados obtidos na análise dos HPA mostraram a presença de compostos

mutagênicos e carcinogênicos (BaP, BaA, Cri, BbF, BkF, InP , DBA e BPer), sendo

estes compostos encontrados em maiores concentrações no período de queima

intensa na região. Estes dados corroboram com outros trabalhos realizados na

Amazônia que analisaram os HPA no período de seca (DE OLIVEIRA ALVES et al.,

2011, 2014).

O reteno foi o HPA encontrado em maior quantidade nas amostras de Porto

Velho, sendo este um marcador de queima de biomassa (RAMDAHL, 1983). Vale

ressaltar que mesmo no período de queima de biomassa moderada, o reteno

continua sendo o composto emitido em maior quantidade. No trabalho realizado por

SHEN et al. (2012), os autores ressaltam que o reteno pode ser emitido por outros

tipos de queima de biomassa. Logo, o reteno encontrado neste estudo também pode

estar sendo emitido por outras fontes, além das queimadas de florestas que ocorrem

na região. Um trabalho mais detalhado sobre os diferentes tipos de origem dos HPA,

nesta mesma área da Amazônia, está em andamento pela autora deste estudo.

É importante destacar que a análise do BaP-TEF mostrou um potencial risco

carcinogênico para as pessoas expostas aos HPA identificados na queima de

biomassa na Amazônia. O valor obtido para o BaP-TEF no período de queima de

biomassa intensa referente a soma dos oito HPA (BaP, BaA, Cri, BbF, BkF, InP ,

DBA e BPer) foi aproximadamente 4 vezes maior quando comparado com o estudo

feito em residências (oudoor e indoor) na cidade de Nova York por JUNG e

colaboradores (2010).

Com relação ao potencial risco mutagênico referente a exposição aos HPA na

Amazônia, com a análise do BaP-MEQ notou-se uma diferença nas concentrações

do período de queima de biomassa intensa e moderada. De forma interessante, o

BaP-MEF no período de queima de biomassa intensa referente a soma dos oito HPA

(BaP, BaA, Cri, BbF, BkF, InP , DBA e BPer) foi similar aos resultados obtidos no

estudo em residências (oudoor e indoor) na cidade de Nova York (JUNG et al.,

2010).

Além disso, a exposição ao BaP e ao DBA representam um maior risco para o

potencial carcinogênico e mutagênico na Amazônia. No período de queima de

Discussão 110


biomassa intensa, a contribuição do BaP e DBA para o BaP-TEQ foram

aproximadamente 13% e 83%. Entretanto, nas pesquisas realizadas em residências

no Japão e em Nova York o BaP foi o composto que mais contribui para o potencial

risco carcinogênico (JUNG et al., 2010; OHURA et al., 2004).

Por outro lado, no período de queima de biomassa intensa em Porto Velho, o

BaP foi o HPA que mais contribuiu para o BaP-MEQ (aproximadamente 49%)

diferentemente dos dados obtidos no estudo por JUNG et al.(2010), que

identificaram os compostos InP e BPer como os maiores contribuintes para o

potencial risco mutagênico.

Além da análise dos HPA totais foi realizada a análise dos HPA oxigenados

nas amostras coletadas na região de Porto Velho. A identificação destes compostos

é de extrema importância, pois estudos reportam que os oxi-HPA podem ser mais

mutagênicos do que os HPA totais (PEDERSEN et al., 2004; UMBUZEIRO et al.,

2008a).

O benzo(a)antraceno-7,12-diona foi um dos compostos detectados em maior

quantidade dentre os oxi-HPA identificados neste estudo. Este composto junto com

o 9,10-antraquinona foi analisado por KNECHT et al. (2013) com relação a sua

toxicidade utilizando o teste de embrião com Zebrafisher e mostrou ter um papel

significativo no aumento do estresse oxidativo in vivo. Além disso, a exposição ao

benzo(a)antraceno-7,12-diona diminuiu o oxygen consumption rate (OCR), que é

uma medida relacionada a respiração mitocondrial.

O oxi-HPA 2-metilantraquinona foi o composto encontrado em maior

quantidade nas amostras de Porto Velho. SHANG et al. (2014) mostra que a

exposição a este composto aumenta o número de espécies reativas de oxigênio

(EROs) na mesma linhagem de células do pulmão humano (A549) utilizada neste

estudo.

Em referência aos monossacarídeos, a análise dos levoglucosano, manosano

e galactosano mostraram claramente que no período de julho a setembro as

queimadas contribuem de forma significativa nas concentrações dos aerossóis. Este

resultado corrobora com outros trabalhos realizados na Amazônia (GRAHAM, 2002;

MAYOL-BRACERO, 2002) (GRAHAM, 2002; MAYOL-BRACERO, 2002).

Discussão 111


Com as concentrações viáveis para a análise de genotoxicidade, os dados

obtidos através do teste cometa mostram que o material orgânico oriundo da queima

de biomassa é capaz de causar danos no DNA das células do pulmão humano. Os

HPA mutagênicos e carcinogênicos assim como os oxi-HPA encontrados nestas

amostras podem estar influenciando neste resultado. Outros testes que avaliam os

danos genéticos já foram feitos com as amostras de diferentes regiões da Amazônia

e mostram que o MP é genotóxico e mutagênico (DE OLIVEIRA ALVES et al., 2011,

2014). Além disso, trabalhos com poluentes atmosféricos de origem urbana, também

utilizaram o teste cometa e observaram que o MP orgânico causa danos no material

genético com diferentes linhagens de células (BRÄUNER et al., 2007; OH et al.,

2011; TEIXEIRA et al., 2012).

Diferentemente dos HPA homocíclicos que são considerados como poluentes

prioritários pela EPA, o reteno não está incluso na avaliação do risco dentre os HPA.

Além disso, não há muitos trabalhos que associam a exposição deste poluente na

atmosfera à saúde humana. É importante destacar que os dados obtidos no teste

cometa mostrou que o reteno foi capaz de causar danos no DNA nas células do

pulmão humano. Este resultado representa uma alerta para maiores investigações e

reavaliações, pois este composto emitido por queimadas pode potencializar os

efeitos genotóxicos observados neste estudo.

Ressalta-se que o reteno também é encontrado em sedimentos aquáticos. Na

pesquisa realizada por MARIA & CORREIA (2005), os autores demonstram que este

HPA foi genotóxico no estudo com Anguilla anguilla L., aumentando a atividade

hepática destes peixes após a exposição. Outros trabalhos alertam sobre os danos

tóxicos detectados em testes com peixes após a exposição ao reteno (HAWLICZEK

et al., 2012; ILLIARD; UERBACH; ODSON, 1999).

Após as evidências que o material orgânico extraído do MP10 causa danos

genotóxicos, investigou-se se estas partículas eram capazes de causar alterações

no ciclo celular das células expostas. Os resultados mostraram que para a maior

concentração testada ( 400 µg/mL equivale a 30 µg.m-3) houve uma parada no ciclo

celular na fase G1. Associado a este efeito, houve um aumento na expressão das

proteínas p53 e p21. Sabe-se que em resposta a um dano, a p53 induz a expressão

da p21 que interrompe o avanço do ciclo celular na transição da fase G1 para a fase

Discussão 112


S por inibição das quinases dependentes de ciclinas (CDK) (COLLINS; GARRETT,

2005).

De forma similar com os dados obtidos com o MP oriundo da queima de

biomassa na Amazônia, alguns estudos mostram que o MP urbano pode causar

alterações no ciclo das células. Na pesquisa realizada por ZHANG et al. (2007), os

autores observaram que o MP urbano obtido pela US-EPA induziu uma parada no

ciclo celular na fase G1, inibiu a síntese de DNA, bloqueou a proliferação celular e

causou a diminuição das ciclinas E, A, D1 e (CDK)2.

Ainda dentro deste contexo, destaca-se o trabalho realizado por LONGHIN et

al. (2013), onde os pesquisadores mostraram que as células do epitélio bronquial

expostas ao MP2,5 orgânico proveniente da área urbana de Milão causa alterações

no ciclo celular, com parada na fase G2/M.

Em concordância com a parada no ciclo celular, observou-se um aumento na

marcação da histona H2AX fosforilada (-H2AX) na maior concentração testada do

material orgânico (400 µg/mL equivale a 30 µg.m-3) após 24 horas de exposição.

Curiosamente seria interessante avaliar esta marcação em um período menor de

exposição para analisar se nas primeiras horas de exposição ao MP ocorre uma

maior quantidade de foci de -H2AX. De fato, a histona -H2AX é conhecida como

um marcador indicativo da presença de diversos tipos de dano no DNA, servindo

para o recrutamento de proteínas de checagem do ciclo celular, reparo e

apoptose, sendo assim importante na manutenção da integridade do genoma

(LUKAS; LUKAS; BARTEK, 2011).

O aumento da marcação de H2AX também pode estar associada com alguns

HPA encontrados nas amostras coletadas em Porto Velho, pois no trabalho

realizado por AUDEBERT et al. (2012), os pesquisadores utilizaram esta marcação

para estimar a genotoxicidade de alguns HPA. Os resultados destes autores

mostraram que a exposição individual de alguns HPA (BaA, BbF, BcF, BkF, Cri, InP,

DBA, 7,12 – dimetil-benzo(a) antraceno, dibenzo(a,i)pireno e BaP) aumentaram a

indução dos foci de H2AX na linhagem celular HepG2. Interessantemente, a

maioria destes compostos também foram identificados nas amostras de MP10

coletadas na região de Porto Velho.

Discussão 113


Os resultados obtidos neste trabalho relacionados ao ciclo celular e marcação

de -H2AX indicam a presença de danos não reparados após a exposição ao

material orgânico do MP10 atmosférico. Em comparação com alguns estudos que

analisaram os efeitos da fumaça do cigarro em células pulmonares, observa-se

também que houve um aumento nos foci de -H2AX e os autores associam com a

quebra de dupla fita no DNA (JORGENSEN et al., 2010; TANAKA et al., 2007).

Além da análise do ciclo celular, a marcação com o Iodeto de Propídeo (PI),

um intercalante da fita dupla de DNA, permite a detecção da população em

subG1, ou seja, com um conteúdo de DNA menor do que células em fase

G1 (< 2n). Essa fragmentação do DNA ocorre durante o processo de morte celular

por apoptose, que é um processo que envolve a ação regulada de enzimas

catabólicas (proteases e nucleases), e leva a mudanças características na

morfologia nuclear, como a condensação e fragmentação da cromatina, com a

formação de fragmentos de DNA de múltiplos de aproximadamente 200 bp

(KROEMER; DALLAPORTA; RESCHE-RIGON, 1998). Em concordância com os

ensaios de viabilidade celular, os experimentos obtidos por citometria de fluxo

detectaram um aumento na população em sub-G1 nas células do pulmão

humano após 72 e 96 horas de exposição ao MP orgânico.

Ainda no período de 72 horas de exposição ao MP, notou-se um aumento

significativo na marcação de -H2AX. Este resultado pode ser explicado pela

fragmentação do DNA que ocorre durante a apoptose, que aumenta a quantidade de

foci H2AX (ROGAKOU et al., 2000). Assim, a análise bem evidente da associação

da ativação da caspase – 3 com a histona H2AX corroborou esta explicação. Em

acordo com o presente trabalho, ABBAS e colaboradores (2010) demonstraram que

o MP de origem urbana causa proliferação celular e apoptose em células do pulmão.

Uma vez que foi observado que o material orgânico extraído do MP10 causa

apoptose nas células do pulmão, investigou-se também a ocorrência de outros tipos

de morte. Curiosamente, detectou-se que além da morte por apoptose, há uma alta

ocorrência de necrose nas células analisadas. Este dado é bem interessante, pois

estudos mostram que a ocorrência de necrose aumenta a resposta inflamatória

(PROSKURYAKOV; GABAI; KONOPLYANNIKOV, 2002). Logo, tal ocorrência

provavelmente pode ter alguma relação com o aumento de hospitalizações por

doenças respirtórias já identificadas no período de queimadas na Amazônia.

Discussão 114


Destaca-se também que a mistura de HPA utilizada no teste para avaliar os

diferentes tipos de morte celular por microscopia de fluorescência mostrou a

ocorrência tanto de apoptose como de necrose. Além da queima de biomassa, estes

compostos também são encontrados em emissões veiculares, industriais, inclusive

na fumaça do cigarro. No trabalho feito por VAYSSIER et al. (1998), os autores

relatam que a fumaça do cigarro causa morte celular tanto por apoptose como por

necrose em células de mamíferos. Também SOLHAUG et al. (2004) mostraram que

os HPA induzem sinais apoptóticos.

A utilização do teste morfológico para diferenciar a morte por apoptose e

necrose mostrou que o reteno é capaz de causar morte principalmente por necrose

nas células do pulmão humano. Este dado merece atenção, pois além de causar

morte celuar, o reteno também foi considerado genotóxico de acordo com os dados

obtidos nesta pesquisa. Dessa forma, pode-se concluir que a presença do reteno,

que é o composto mais abundante nas análises dos HPA nas amostras coletadas na

região de Porto Velho, pode ser um dos grandes contribuintes para os danos

observados nas células do pulmão humano.

É interessante ressaltar que a concentração de 400 µg/mL utilizada neste

estudo equivale a 30 µg/m3. Este valor está abaixo do limite recomendado pela OMS

(valor diário MP10 = 50 µg/m3). Entretanto, os resultados desta pesquisa mostraram

que ainda assim estas partículas inaláveis causam danos no material genético e

morte celular.

Considerações Gerais 115


6) Considerações Gerais

A Amazônia é o maior bioma do planeta e ocupa mais da metade do território

brasileiro. Com as estações bem definidas, no período de julho a setembro é

observado um aumento na frequência de queimadas na região do arco do

desmatamento, causando sérios problemas para o meio ambiente e para a saúde da

população que está sendo exposta.

Diante desta problemática, investigou-se a composição química e os efeitos

celulares e moleculares do MP emitido pela queima de biomassa na região de Alta

Floresta e de Porto Velho.

Com o estudo realizado em Alta Floresta, pode-se observar através da

análise dos alcanos que há um predomínio da influência antrópica associada com o

aumento de queimadas no período de seca nesta região. Além disso, a análise do

WNA mostrou uma evidente contribuição biogênica nas amostras coletas no período

de queima moderada.

Em Porto Velho, para a análise da contribuição da queima de biomassa

identificou-se os compostos levoglucosano, manosano e galactosano que mostraram

um evidente predomínio da queima de biomassa no período de intensas queimadas

na região. Interessantemente, no pico de queima, o levoglucosano corresponde a

quase 8% do total do MP10 coletado, dado este que significa uma importante

contribuição deste compostto nas partículas inaláveis.

Também foram analisados os HPA nestas duas localidades. A análise da

razão de origem dos HPA mostram que estes compostos têm o predomínio de

emissões oriundas da queima de biomassa. Logo, este resultado contribui nas

evidências do predomínio das emissões de queimadas nesta área de estudo.

Em ambas regiões da Amazônia, o reteno foi o HPA encontrado em maior

quantidade para todo o período de amostragem, sendo este também um marcador

para a queima de biomassa. Este dado incentivou a busca sobre a genotoxicidade

deste composto e posteriormente a sua análise.

Os resultados mostarram que o reteno é capaz de causar danos ao DNA em

células do pulmão humano. Além disso, mostrou que este HPA também causa

claramente morte por necrose nas células estudadas. Este resultado é um

diferencial na pesquisa, pois até o momento não há estudos voltados para a

genotoxicidade e para o tipo de morte celular provocada por este composto em



células pulmonares. Logo, pode-se afirmar que o reteno também está contribuindo

nos danos genéticos causados pela exposição ao MP neste estudo.

Além disso, na análise dos HPA, foram identificados e quantificados

compostos mutagênicos e carcinogênicos nas amostras coletadas em ambas as

regiões selecionadas para o presente estudo. Com a análise individual dos HPA nas

50 amostras coletadas em Porto Velho foi possível calcular o BaP-equivalente para

alguns HPA (BaP, BaA, Cri, BbF, BkF, InP, DBA e BPer) identificados na região

Amazônica. No período de queima de biomassa intensa o DBA foi o composto que

mais contribui para o potencial risco carcinogênico (BaP-TEQ) e o B(a)P foi o HPA

que mais contribuiu para o potencial mutagênico (BaP-MEQ).

De forma interessante, nas amostras coletadas tanto em Alta Floresta como

em Porto Velho, o B(a)P que é um composto conhecido pelo potencial carcinogênico

e mutagênico foi detectado no período de queima intensa nestas áreas da região

Amazônica. Por outro lado, no período de queima moderada em Alta Floresta, este

composto ficou abaixo do limite de detecção.

O resultado acima é interessante, pois nas análises comparativas de

genotoxicidade e mutagenicidade realizadas com as amostras de Alta Floresta, os

testes Trad-MCN e CBMN mostraram que o MP oriundo do período da queima

intensa de biomassa é mutagênico. Nesta mesma região, ao fazer uma análise

comparativa da frequência de micronúcleo do período de queima intensa em relação

ao período de queima moderada, observa-se uma diferença significativa. Logo, o

B(a)P pode estar contribuindo fortemente para a diferença nesta análise

comparativa. É importante destacar que outros compostos mutagênicos que não

foram caracterizados nas amostras de Alta Floresta, tais como os HPA oxigenados e

nitrogenados, também podem estar contribuindo para os danos genéticos

observados nas células estudadas.

Assim como nas amostras coletadas em Alta Floresta, também observou-se

que o MP oriundo do período de queima intensa na região de Porto Velho é

genotóxico. Além dos HPA encontrados nestas amostras, os oxi-HPA também foram

caracterizados e podem estar contribuindo para os danos ao DNA observados nas

células do pulmão humano.



Uma vez sabendo que o MP oriundo das queimadas da região Amazônica é

capaz de causar danos genotóxicos e mutagênicos, buscou-se estudar os

mecanismos de ação destas partículas inaláveis à nivel celular e molecular

utilizando as células do pulmão humano. Para esta investigação, utilizou-se as

amostras coletadas em Porto Velho.

A maior concentração (400 µg/mL) utilizada neste estudo para avaliar os

mecanismos de ação das partículas inaláveis corresponde a concentração de 30

µg.m-3. Este valor é abaixo do limite aceitável para o meio ambiente pelas

legislações nacionais e internacionais, mas corresponde a concentração média do

MP10 encontrada na Amazônia no período de queimadas intensas.

Embora seja uma concentração considerada baixa de acordo com a

legislação da WHO, ao analisar o ciclo celular das células expostas ao MP10

orgânico no período de 24 horas, observou-se que houve uma parada na fase G1.

Em associação com este resultado, notou-se também que um aumento na

expressão das proteínas p53 e p21 que são consideradas pontos de checagem do

ciclo celular.

A ocorrência de danos genotóxicos e mutagênicos ocasionados pela

exposição ao MP alteraram a regulação do ciclo celular. A retomada da progressão

do ciclo celular ocorre somente quando o dano no DNA é removido por completo.

Neste caso, observou-se que as respostas ao dano no DNA induziram a morte por

apoptose nas células do pulmão humano. Neste estudo, a morte celular por

apoptose foi confirmada por diferentes ensaios, tais como a análise da população

em sub G1, o teste morfológico por microscopia de fluorescência e o aumento na

ativação da caspase-3 por citometria de fluxo.

Além da morte por apoptose, observou-se que o material orgânico do MP10 é capaz

de causar morte por necrose. Sabe-se que a morte por necrose possivelmente

aumenta a resposta pró-inflamatória nas células. Este resultado pode estar

associado com a ocorrência de doenças inflamatórias na via respiratória.

Em suma, apesar dos diferentes ensaios utilizados com as amostras de Alta

Floresta e Porto Velho, a fonte predominante é a emissão da queima de biomassa

na região Amazônica e os resultados mostram que o MP orgânico é genotóxico e

mutagênico. Além disso, foi possível pela primeira vez analisar os danos celulares e

moleculares causados pelas partículas emitidas pela queima de biomassa e as



possíveis vias que podem elevar os riscos da indução da tumorigênese no pulmão.

Então, propõe-se o seguinte modelo para a ação do MP emitido pela queima de

bioma (Figura 45).

Figura 45: Modelo de ação do extrato orgânico obtido do MP10 oriundo de queima de biomassa na Amazônia utilizando o sistema em células do pulmão humano.

Com os resultados acima, é possível começar a entender a ação do extrato

orgânico presente no MP10 emitido pela queima de biomassa na região Amazônica.

É importante enfatizar a importância da redução e um melhor controle da queima de

biomassa na região Amazônica. Afinal, como descrito recentemente pela OMS, a

redução da poluição do ar poderá salvar milhões de vidas (WHO, 2014).



Além dos resultados apresentados nesta tese, outros estudos estão sendo

realizados com o extrato orgânico do MP10 emitido pela queima de biomassa na

Amazônia, tais como:

- Análise dos HPA nitrogenados;

- Identificação de fontes ou processos de aerossóis na atmosfera utilizando

modelos receptores na composição química;

- Investigação dos mecanismos de autofagia;

- Análise da ocorrência de mutação gênica utilizando o teste de Ames.

Conclusões 120


7) Conclusões

- O material orgânico extraído (MOE) emitido pela queima de biomassa é

genotóxico e mutagênico;

- O MOE causa alterações no ciclo celular com parada na fase G1,

aumentando a expressão das proteínas p53 e p21;

- O MOE aumenta os foci de H2AX e este evento pode estar associado tanto

com os danos ao DNA como com a fragmentação do DNA durante a apoptose;

- O MOE do MP10 emitido pela queima de biomassa intensa causa morte por

apoptose e por necrose, sendo que esta última pode ser um fator que contribui para

a resposta pró-inflamatória;

- O reteno é genotóxicos e causa causa principalmente morte por necrose nas

células do pulmão humano;

- O dibenzo(a)antraceno contribuiu com 83% para o BaP-TEF∑8HPA, sendo

este o composto com o maior risco para o potencial carcinogênico;

- O benzo(a)pireno é o HPA que mais contribuiu para o potencial risco mutagênico

(BaP-MEF∑8HPA).

Referências 121


8) Referências

ABBAS, I. et al. Occurrence of molecular abnormalities of cell cycle in L132 cells after in vitro short-term exposure to air pollution PM(2.5). Chemico-biological interactions, v. 188, n. 3, p. 558-65, 5 dez. 2010.

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