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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA PPG – PSICOBIOLOGIA FERNANDO ROBERTO FERREIRA SILVA EFEITOS DOS ESTEROIDES ANABÓLICOS ANDROGÊNICOS SOBRE FUNÇÕES COGNITIVAS DE RATOS Natal – RN 2013

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA

PPG – PSICOBIOLOGIA

FERNANDO ROBERTO FERREIRA SILVA

EFEITOS DOS ESTEROIDES ANABÓLICOS ANDROGÊNICOS SOBRE

FUNÇÕES COGNITIVAS DE RATOS

Natal – RN

2013

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FERNANDO ROBERTO FERREIRA SILVA

EFEITOS DOS ESTEROIDES ANABÓLICOS ANDROGÊNICOS SOBRE

FUNÇÕES COGNITIVAS DE RATOS

Tese apresentada à Universidade Federal do Rio Grande do Norte como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Psicobiologia.Orientadora: Dra. Regina Helena da Silva

Natal – RN

2013

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Dedico esse trabalho aos meus pais que

sempre trabalharam muito para que

pudesse ter uma vida mais amena que a

deles.

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AGRADECIMENTOS

Certa vez ouvi de um colega que o momento de escrever os

agradecimentos havia sido um dos mais difíceis do trabalho e, sinceramente, só

quando se está nessa situação é que se entende realmente o que essa frase

representa. Apesar da redação da tese de doutorado ser um produto “individual”,

todo seu conteúdo é fruto de um trabalho coletivo da equipe de laboratório, apoio de

amigos e familiares e sem esse suporte, com certeza, esse momento não se

concretizaria. Consciente de que é impossível listar todos que de uma forma ou de

outra me acrescentaram conhecimentos e experiências essenciais a realização

desse trabalho, me coloco nessa difícil posição e irei tentar fazê-lo a partir de agora.

Inicialmente, preciso registrar meu enorme agradecimento a professora

Dra. Regina Helena da Silva, minha orientadora, que desde o primeiro e-mail que a

enviei sempre se mostrou de braços abertos, receptiva e que, ao longo desse

processo, revelou-se para mim como um exemplo de profissional, sempre

inteligente, criativa e, principalmente, ética na condução de sua profissão. Além

disso, como disse em uma homenagem no dia dos professores que fiz ano passado,

ela é uma inspiração para todos que com ela trabalham e convivem. Nesse

momento, também estendo meu agradecimento a professora Dra. Alessandra Mussi

Ribeiro, que com sua paixão e dedicação, foi fundamental na execução desse

trabalho bem como para minha formação.

A todos os colegas do Laboratório de Estudos da Memória (LEME) que de

alguma forma contribuíram para a execução desse trabalho, meu muito obrigado.

Em especial, externo meu profundo agradecimento a Aline, Paulinha, Ezequiel,

Priscila, Jéssica, Wanessa e André que de forma mais direta contribuíram para que

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este trabalho fosse realizado. Cabe também destacar o meu sincero agradecimento

a Alicia Cabral, dentre outros motivos, pela enorme paciência que ela teve comigo

nessa fase final, pelos conselhos, pelas palavras de apoio: muito obrigado!

As professoras Edda Lisboa Leite, Eliza Xavier e Dilma Ferreira, obrigado

pelo apoio, pelas orientações, conselhos e pelo carinho que sempre demonstraram

por mim. Serei sempre grato.

Aos meus grandes e velhos amigos da ETFRN, meu profundo

agradecimento pela torcida, pelo apoio nessa e em outras jornadas ao longo da

minha vida. Vocês sabem que são especiais para mim. Grande abraço e obrigado

pela amizade sincera e verdadeira.

Aos meus amigos biólogos (e os agregados), em especial: Lula, Pedro,

Kuka, Denis, Rafael, Ramona, Recy, Aretha, Lorena, Jaísa, Matheus, Danile. Mesmo

distantes da maioria de vocês, sei que sempre torceram e continuam torcendo por

mim. Muito obrigado!

A minha grande amiga e madrinha Sdena, muito obrigado pelo bom

humor constante e pela amizade. Sinto sua falta.

A minha grande amiga e madrinha Celina, você é irmãzinha que não tive.

É muito bom saber que posso contar com você. Obrigado por sempre estar presente

nos momentos mais importantes da minha vida.

Aos meus amigos, vizinhos e padrinhos, Felippe e Sângela. Obrigado

pela amizade, parceria e cumplicidade. Obrigado por tudo.

As minhas amigas Thasia, Marília e Yuly, muito obrigado pela torcida e

apoio incondicional.

Aos meus amigos ueceanos, obrigado pela compreensão, paciência e

apoio nos momentos que estive ausente.

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Agradeço também aos professores e funcionários da pós-graduação em

Psicobiologia da UFRN pelo apoio e pela estrutura para que esse trabalho fosse

desenvolvido, em especial aos professores Jeferson de Souza Cavalcante e Maria

Bernadete Cordeiro de Sousa por terem colaborado no momento do meu exame de

qualificação; e agradecer mais uma vez a professora Bernadete por ter se posto

disponível para participar de minha banca.

Agradeço também aos professores Geison de Souza Izídio (UFSC), Paula

Matias Soares (UECE) e Vanessa de Paula Soares Rachetti (UFRN) por terem

aceitado o convite para participar de minha banca. Meu muito obrigado!

Por fim, e não poderia ser diferente, agradeço a minha esposa, Fernanda,

por ter compreendido e entendido as minhas ausências, meu mau humor e por ter

apoiado e colaborado em tudo que foi possível. Você é o que de mais importante

existe em minha vida. Amo você!!!

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SUMÁRIO

1 APRESENTAÇÃO.................................................................................... 14

2 INTRODUÇÃO.......................................................................................... 20

2.1 HORMÔNIOS ESTEROIDES........................................................ 20

2.2 ESTERÓIDES ANABÓLICOS ANDROGÊNICOS (EAA).............. 27

2.2.1 Principais características e efeitos..................................... 27

2.2.2 Efeitos sobre o aprendizado e a memória......................... 34

3 OBJETIVO GERAL.................................................................................. 37

3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS......................................................... 37

4 ARTIGO 1 – The anabolic androgenic steroid testosterone propionate decreases recognition memory in adult male rats……………… 38

5 ARTIGO 2 – Effects of anabolic androgenic steroid testosterone propionate on memory, anxiety and motor behavior in rats tested in plus-maze discriminative avoidance task…………………………………………... 61

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS…...…………………………………………….. 86

REFERÊNCIAS………………………………………………………………..... 87

ANEXO – Relatório do Projeto de Ações Acadêmicas Associadas / Edital PROGRAD/PROPESQ/PROEX nº 01/2011................................................ 96

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LISTA DE FIGURAS

Figura 01: Esquema representando a biossíntese dos principais hormônios esteróides sexuais: progesterona, estradiol e testosterona.......................................................................... 21

Figura 02: Exemplos de esteroides anabolizantes das três classes: Propionato de testosterona (classe I), Estanozolol (classe III) e Nandrolona (classe II). 29

Figure 03: Efeitos da administração aguda (A, C e E) e crônica (B, D e F) de 10mg/kg de propionato de testosterona (PT) ou óleo de gergelim (Veículo, VEH) sobre a tarefa de reconhecimento de objetos novos. (A, B) Distância percorrida; (C, D) Percentual de tempo gasto na tarefa deexploração do objeto novo; (E, F) Tempo de exploração do objeto novo comparado ao objeto familiar. 50

Figura 04: Efeitos da administração de 10mg/kg de propionato de testosterona (PT) ou óleo de gergelim (Veículo, VEH) durante 42 dias na relação peso testicular/peso do corpo………...... 51

Figura 05: Efeitos da administração de 10mg/kg de propionato de testosterona (PT) ou óleo de gergelim (Veículo, VEH) durante 42 dias na atividade motora na tarefa de esquiva discriminativa. (A) Sessão Treino; (B) Sessão Teste………. 72

Figura 06: Efeitos da administração de 10mg/kg de propionato de testosterona (PT) ou óleo de gergelim (Veículo, VEH) durante 42 dias na tarefa de esquiva discriminativa.Percentual de tempo gasto no braço fechado aversivo (%TAV) na sessão Treino (A) e Teste (B)........................................................... 73

Figura 07: Efeitos da administração de 10mg/kg de propionato de testosterona (PT) ou óleo de gergelim (Veículo, VEH) durante 42 dias na tarefa de esquiva discriminativa.Percentual de tempo gasto nos braços abertos (%TO) na sessão Treino (A) e Teste (B)...................................................................... 74

Figura 08: Efeitos de uma injeção única de 10mg/kg de propionato de testosterona (PT) ou óleo de gergelim (Veículo, VEH) na atividade motora na tarefa de esquiva discriminativa. (A) Sessão Treino; (B) Sessão Teste......................................... 75

Figura 09: Efeitos de uma injeção única de 10mg/kg de propionato de testosterona (PT) ou óleo de gergelim (Veículo, VEH) na tarefa de esquiva discriminativa. Percentual de tempo gasto no braço fechado aversivo (%TAV) na sessão Treino 76

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(A) e Teste (B)......................................................................

Figura 10: Efeitos de uma injeção única de 10mg/kg de propionato de testosterona (PT) ou óleo de gergelim (Veículo, VEH) na tarefa de esquiva discriminativa. Percentual de tempo gasto nos braços abertos (%TO) na sessão Treino (A) e Teste (B)............................................................................... 77

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LISTA DE TABELAS

Tabela 01: Efeitos da administração de 10 mg/kg de propionato de testosterona (PT) ou óleo de gergelim (Veículo, VEH) na tarefa de alternação espontânea.......................................... 52

Tabela 02: Efeitos do propionato de testosterona (PT) em diferentes parâmetros bioquímicos do soro de ratos............................. 52

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ABREVIATURAS

5-HT1A subtipo do receptor de serotonina 5-HT (5-hydroxytryptamine)AAS Anabolic Androgenic SteroidsARN Ácido ribonucleicoCA1 região CA1 do hipocampoCA3 região CA3 do hipocampoCAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível SuperiorCEUA Comissão de Ética no Uso de Animais CNPQ Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e TecnológicoDHT 5-α-dihidrotestosterona EAA Esteroides Anabólicos AndrogênicosER Receptor de EstrógenoERH Elementos de resposta ao hormônioFAPERN Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado do Rio Grande do NorteFSH Hormônio folículo estimulanteGDX Gonadectomized- cirurgia para retirada das gônadas.GnRH Hormônio liberador de gonadotrofinaHDL Lipoproteína de alta densidade Hsp90 Proteína de choque térmicoLH Hormônio luteinizantemg miligramamg/kg miligramas por quilogramamg/kg/dia miligrama por quilograma por diamRNA messenger ribonucleic acid- RNA mensageiroNCAA National Collegiate Athletic Associationnmol/L nanomol por litroNOR novel obect recognitionPM-DAT Plus-maze discriminative avoidance taskPROPESQ Pró-reitoria de PesquisaPT Propionato de TestosteronaRA receptor androgênico RE receptor estrogênico SA alternação espontâneaSHBG Proteína ligante do hormônio sexual SNC Sistema Nervoso CentralTGP Transaminase glutâmica pirúvicaTP testosterone propionateUFRN Universidade Federal do Rio Grande do NorteVEH Vehicle

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RESUMO

A utilização e a busca por substâncias que aumentem a masculinidade, a força e a potência sexual não é recente. Com o tempo, essa busca auxiliou no direcionamento de pesquisas na área, levando a descoberta do principal hormônio masculino – a testosterona em meados da década de 30. A partir desse momento, inúmeros compostos foram sintetizados com o intuito de mimetizar os efeitos deste hormônio, aos quais hoje chamamos genericamente de Esteroides Anabólicos Androgênicos (EAA). A princípio, esses EAA foram sendo produzidos com propósitos terapêuticos. No entanto, iniciou-se o uso crescente desses compostos com outras finalidades, principalmente para a melhoria de desempenho em atletas. Além disso, estudos recentes têm demonstrado que os EAA estão sendo cada vez mais utilizados por não atletas, por indivíduos que não são atletas, mas, buscam um corpo esteticamente perfeito. Paralelamente, o crescente abuso dos EAA com finalidades não clínicas pode promover uma série de alterações fisiológicas nocivas, tais como problemas cardíacos, hepáticos, respiratórios e também psicológicos como alterações de humor, nos níveis de ansiedade e na agressividade. A exposição a doses suprafisiológicas de EAA está associada com alterações comportamentais, contudo, pouco se sabe sobre os efeitos dos EAAs sobre as funções cognitivas. Neste trabalho, mimetizamos o abuso de EAA em humanos através da administração intramuscular de uma dose suprafisiológica de propionato de testosterona (PT), em ratos, com o objetivo de investigar os efeitos desse tratamento sobre diferentes aspectos das funções cognitivas, especialmente aprendizado, memória e ansiedade. Ratos Wistar machos adultos foram submetidos aos testes de alternação espontânea, reconhecimento de objetos e esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado. O grupo controle recebeu injeções intramusculares de óleo vegetal (veículo); e o grupo testosterona recebeu injeções de PT (10 mg/kg, i.m.). As injeções foram administradas por 40 dias, com intervalos de 48 horas (tratamento crônico) ou em uma única injeção (tratamento agudo). Além das avaliações comportamentais, foram realizadas análises bioquímicas como indicadores dos efeitos endócrinos do tratamento. Nossos resultados mostram que o tratamento crônico com uma dose suprafisiológica de PT acarretou prejuízos na memória de reconhecimento de objetos novos e na evocação da tarefa da esquiva discriminativa. A memória espacial operacional (avaliada pelo teste de alternação espontânea) não foi afetada bem como não observamos alterações nos níveis de ansiedade. Em relação aos parâmetros bioquímicos avaliados, o tratamento crônico elevou os níveis séricos da transaminase glutâmica pirúvica (TGP), um indicador da presença de lesões hepáticas e pancreáticas (assim como as observadas após o uso crônico dessas substâncias em humanos). Por outro lado, o tratamento agudo com PT não promoveu alteração significativa em nenhum dos parâmetros avaliados, quando comparados ao grupo controle. Em síntese, podemos concluir que o tratamento crônico com uma dose suprafisiológica de testosterona produz déficits de memória de reconhecimento de objetos bem como prejuízos na memória na tarefa da esquiva discriminativa em ratos machos adultos.

Palavras-chave: anabolizantes; propionato de testosterona; memória de reconhecimento; esquiva discriminativa.

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ABSTRACT

The use and the demand for substances that enhance masculinity, strength and sexual power are not novel. Over the years, this search has assisted the research directions in this area, leading to the discovery of the primary male sex hormone –testosterone in 1935. Since then, numerous testosterone analogue compounds were synthesized, which are generically called Anabolic Androgenic Steroids (AAS). The AAS were produced for therapeutic purposes, but an increase in the use of these compounds for other purposes occurred over time. Initially they were used mainly to improve performance in athletes. However, recent studies have shown that the use of AAS by non-athletes with aesthetical purposes have been increasing as well. Theabuse of AAS with non-clinical purposes can promote a number of physiological alterations, such as heart, liver, respiratory and psychological problems such as changes in mood, levels of anxiety and aggression. Exposure to supraphysiological doses of AAS is associated with behavioral changes, however, little is known about the effects of AAS on cognitive functions. In this work, we aimed to mimic the AAS abuse in humans with intramuscular administration of a supraphysiological dose of testosterone propionate (TP) in rats. We investigated the effects of this treatment on different aspects of cognitive function, specifically learning, memory and anxiety. Adult male Wistar rats were tested in the spontaneous alternation, novel object recognition and plus-maze discriminative avoidance tasks. The control group received intramuscular injections of vegetable oil (vehicle), and the TP group received injections of TP (10 mg/kg, i.m.). The injections were administered for 40 days, with intervals of 48 hours (chronic treatment) or in a single injection (acute treatment). In addition to the behavioral assessments, we performed biochemical analyzes as indicators of the endocrine effects of the treatment. Our results show that chronic treatment with a supraphysiological dose of TP caused memory impairments in the novel object recognition and the discriminative avoidance tasks.The spatial working memory (evaluated by spontaneous alternation task) was not affected. Also, we did not observe changes in anxiety levels. Regarding the biochemical parameters, chronic treatment increased serum levels of glutamic-pyruvic transaminase, an indicator of hepatic and pancreatic lesions (as those observed after chronic use of these substances in humans). On the other hand, acute treatment with PT did not promote significant changes in any of these parameters when compared to the control group. In summary, we conclude that chronic treatment with a supraphysiological dose of testosterone propionate produces memory deficits in novel object recognition and retrieval of the discriminative avoidance task in adult male rats.

Keywords: anabolic steroids; testosterone propionate; recognition memory; discriminative avoidance task.

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1 APRESENTAÇÃO

A busca do ser humano pela fonte de força, coragem e para obtenção de

algum tipo de vantagem física é muito antiga. Há relatos que, na Antiguidade, os

órgãos sexuais e suas secreções eram utilizados como afrodisíacos e para o

tratamento da impotência, com a crença de que assim aumentariam a força e

coragem do homem. Do mesmo modo, há séculos se tem o conhecimento de que a

castração masculina resulta em perda da virilidade e de certas características como

a voz grave e o aparecimento de pelos. A Igreja Católica, por exemplo, praticava a

castração para preservar as vozes delicadas de meninos cantores (Catlin & Hatton

1990, Millar 1996).

Em meados do século XIX, o pesquisador alemão Arnold Berthold

realizou um experimento no qual observou a diminuição do tamanho da crista e

perda da função sexual após a retirada dos testículos de galos jovens; e observou

também que o reimplante dos testículos revertia essas alterações. Esses resultados

sugeriram que os testículos seriam responsáveis pela síntese de alguma substância

responsável por regular o desenvolvimento e a manutenção das características

masculinas. Corroborando esses achados, no fim desse mesmo século, o fisiologista

francês Charles Eduard Brown-Séquard experimentou uma terapia de

rejuvenescimento, administrando em si mesmo, injeções de um extrato líquido

derivado de testículos de cães e porcos da índia. Como resultado, relatou um

aumento da sua energia intelectual, força física e retardo no envelhecimento. Após o

relato de Brown-Séquard, o interesse dos pesquisadores em estudar essa

substância estimulou muitas pesquisas até aproximadamente 1930. No entanto, nos

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dias de hoje, seus resultados têm sido atribuídos ao efeito placebo (Hoberman &

Yesalis 1995).

No início da década de 1930, Charles Kochakian, um dos mais

importantes cientistas na pesquisa hormonal, sendo considerado o pai dos

esteroides anabólicos androgênicos (EAA) demonstrou que o hormônio extraído da

urina de machos estimulava a retenção de nitrogênio no organismo de cães

castrados. Essa maior retenção é um indicativo da utilização de proteínas para fins

de hipertrofia muscular, estabelecendo, assim a propriedade anabólica da

testosterona. Assim com os estudos de Kochakian, muitos outros surgiram, o que

tornou o tema muito popular fazendo com que a indústria farmacêutica buscasse o

isolamento desse composto testicular (Ghaphery 1995).

Em 1931, Adolf Frederick Butenandt descreveu o isolamento do

androsterona, hormônio análogo a testosterona que foi sintetizado, em 1934, por

Leopold Ruzicka. Apesar da descoberta desse composto, notava-se que os

testículos produziam outro composto ainda mais importante. As pesquisas

prosseguiram até que em 1935, na Holanda, o grupo de pesquisa do Ernst Laqueur

isolou a testosterona. Ainda em 1935, os grupos de pesquisa do Butenandt e do

Ruzicka descobriram, em pesquisas independentes, como realizar a síntese de

testosterona sintética e enviaram os respectivos artigos para publicação com apenas

uma semana de diferença, o que lhes renderam a atribuição para o Prêmio Nobel de

Química em 1939 (Hoberman & Yesalis 1995).

A 2ª Guerra Mundial foi o momento histórico onde houve um primeiro uso

maciço dos EAA, quando foram incorporados como material de suplemento das

tropas americanas e foram utilizados no tratamento dos sobreviventes em condições

debilitantes, em casos de traumatismo, queimaduras, depressão e visando a

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recuperação pós-cirúrgica. Simultaneamente, cientistas alemães produziram uma

série de EAA que foram utilizados pelo exército alemão com dois objetivos:

recuperar os níveis de nitrogênio em prisioneiros que teriam sido obrigados a ficar

dias sem se alimentar; e aumentar a agressividade dos soldados alemães. Um artigo

publicado após o declínio da antiga República Democrática da Alemanha (Alemanha

Oriental), em 1990, descreveu um programa secreto do governo que estimulava o

uso de drogas, principalmente os EAA, para o uso bélico dessas substâncias bem

como para proporcionar aumento no desempenho esportivo (Hoberman & Yesalis

1995, Ghaphery 1995, Gallaway 1997).

No campo esportivo, a década de 50 foi marcada pelo uso de EAA por

atletas russos e europeus em competições de levantamento de peso, fato que

converge para o primeiro relato do uso de EAA em competições esportivas:

campeonato mundial de levantamento de peso em 1954 em Viena/Áustria. O

domínio russo nessa competição despertou o interesse de cientistas americanos que

culminou, em 1956, na criação da metandrostenolona (Dianabol®), surgiu daí o

esteroide oral mais popular entre os levantadores de peso e o mundo desportivo

mudou para sempre (Wade 1972).

Nas Olimpíadas de Tóquio (1964), estes compostos foram largamente

utilizados em diversas modalidades; na Cidade do México (1968) há os primeiros

relatos de uso de EAA entre atletas alemãs; em 1972, nas Olímpiadas de Munique a

Alemanha esteve junto dos Estados Unidos e da União Soviética no ranking de

medalhas (De Rose & Nóbrega 1999). Na década de 80, foi relatado que um em

cada cinco atletas da primeira divisão da NCAA (National Collegiate Athletic

Association) já tinha utilizado anabolizantes em algum momento de sua carreira

(Dezelsky et al. 1989).

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O mais famoso caso de uso de EAA foi o do corredor canadense Ben

Johnson, medalha de ouro nas Olimpíadas de Seul (1988) nos 100m rasos, cujo

exame apresentou metabólitos do anabolizante estanozolol o que culminou na

devolução da medalha olímpica (Yoshida et al. 1994). O uso não controlado dessas

substâncias foi aumentando até que em 1990 os Estados Unidos aprovou a Lei

Federal de Controle de Anabólicos, que tornou crime tanto a posse quanto a

distribuição de anabolizantes para fins não médicos (DuRant et al. 1993). No Brasil,

a posse e distribuição não são caracterizadas como crime, no entanto, a lei nº

9.965/00 (BRASIL 2000) restringe a utilização desses compostos por humanos, com

a retenção de receita médica emitida por médico ou dentista. A não observância

desse requisito enquadra-se como infração sanitária, estando o infrator sujeito a

processos e penalidades previstas na lei nº 6.437/77 (BRASIL 1977).

Nas últimas décadas o uso não terapêutico de EAA tem se elevado em

todo o mundo, e não apenas entre os atletas de alto rendimento, o que tem gerado

uma enorme preocupação em relação ao abuso desses compostos dentro e fora dos

esportes. Isso devido a esta classe de compostos aliarem melhora no desempenho

esportivo com a exaltação ao corpo perfeito, estimulado, sobretudo, pelos meios de

comunicação em massa.

Um estudo epidemiológico mostrou que pode haver mais de 1,5 milhão de

pessoas que abusam de hormônios anabolizantes dentro de academias nos Estados

Unidos, com finalidade de melhora não só do desempenho atlético, mas também de

melhora na imagem corporal (Kanayama et al. 2001). No Brasil não temos muitos

estudos acerca do perfil do usuário dessas substâncias, mas acredita-se que o

consumidor preferencial está na faixa etária dos 18 a 34 anos e seja do sexo

masculino.

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Nas últimas décadas, a utilização de hormônios esteroides para

finalidades não terapêuticas vem se tornando algo corriqueiro entre adolescentes,

jovens e atletas brasileiros. Essa prática acarreta uma série de danos fisiológicos e

psicológicos aos usuários, fato que vem despertando a atenção de muitos

pesquisadores para o tema. Vários desses efeitos prejudiciais à saúde já são bem

estudados e conhecidos, contudo os estudos sobre os efeitos sobre o SNC ainda

são incipientes, principalmente em relação aos efeitos sobre a aprendizagem e a

memória.

Estudos de suplementação hormonal utilizando doses fisiológicas ou

moderadamente suprafisiológicas de EAA demonstram que esses compostos foram

capazes de promover alterações cognitivas em ratos, com diferentes resultados

dependendo da dose, da duração do tratamento e do teste utilizado. Mostram

também que outras alterações comportamentais podem ocorrer com o uso de EAA,

e tais alterações podem comprometer aspectos cognitivos indiretamente. Porém, em

sua maioria, estes estudos não abordam os efeitos causados com a utilização dos

EAA em regime de abuso, que é caracterizado pela cronicidade da administração

associada com as doses suprafisiológicas.

Assim, considerando que o estudo acerca desses compostos é um tema

bastante relevante na pesquisa científica brasileira, que a literatura sobre o assunto

é escassa e em certos aspectos até contraditória, este estudo foi desenhado na

tentativa de investigar a ação de hormônios anabolizantes sobre a aprendizagem e

memória de roedores, com avaliação concomitante de outros aspectos

comportamentais como os níveis de ansiedade e a atividade motora.

Paralelamente, ao longo do desenvolvimento deste trabalho experimental,

me deparei com a escassez de informações acerca do abuso de EAA no Brasil, bem

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como o baixo acesso a informações sobre esses compostos por adolescentes (um

crescente público alvo do abuso de EAA). Esses fatos me motivaram a realizar o

projeto intitulado “Esteroide anabolizante: da Universidade à Escola”, em resposta a

um edital de ações acadêmicas associadas promovido pela UFRN. Embora não faça

parte do trabalho experimental da tese, acrescentei, a título informativo, os principais

resultados dessa iniciativa (ANEXO 1) por considerar parte importante na minha

formação bem como o trabalho de extensão ser um retorno para a sociedade.

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2 INTRODUÇÃO

2.1 HORMÔNIOS ESTEROIDES

Hormônio pode ser definido como uma substância química secretada em

pequenas quantidades na circulação sanguínea produzindo uma resposta fisiológica

nos tecidos-alvos. Os hormônios são divididos, quimicamente, em aminas, proteínas,

peptídeos e esteroides (Costanzo 1999). Os hormônios esteroides são produzidos,

principalmente, pelas gônadas (ovários e testículos), pelo córtex da suprarrenal e

pela placenta. Entretanto, alguns esteroides são sintetizados no sistema nervoso

central e periférico, tais como a pregnenolona, a desidroepiandrosterona (DHEA) e

seus ésteres sulfatados, sendo chamados, portanto, de neuroesteroides (Baulieu

1998). A síntese dos hormônios esteroides ocorre a partir do colesterol sendo este

obtido da dieta ou por síntese endógena no fígado e no intestino delgado. A síntese

endógena ocorre no citoplasma e no retículo endoplasmático e todos os carbonos da

molécula do colesterol são provenientes da acetil-CoA. A distinção dos tipos de

esteroides ocorre com a incorporação ou não de um ou mais átomos de carbono ao

núcleo básico (quatro anéis hidratados compostos por dezessete átomos de

carbono) e sua classificação se dá de acordo com os radicais ligados ao carbono 17

(C17) (Voet & Voet 2006, para revisão ver Janowski 2006).

Na figura a seguir (Figura 01) tem-se a principal rota metabólica para a

síntese da testosterona. A biossíntese da testosterona pode ser resumida em 04

etapas: (1) inicia-se com a molécula do colesterol que tem sua cadeia lateral clivada

pela enzima colesterol demolase para originar a pregnenolona; (2) esta, por sua vez,

pode ser metabolizada pelas enzimas 3-β-hidroxiesteroide desidrogenase e ∆4,5-

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isomerase originando a progesterona; (3) a progesterona, após uma sequência de

três reações (17 α-hidroxilase, 17-20 desmolase e 17-β-HSD), transforma-se em

testosterona; e, por fim, (4) a testosterona formada pode ser convertida em estradiol

pela ação da enzima aromatase.

Fonte: Adaptado de Marques (2003).

Figura 1. Esquema representando a biossíntese dos principais hormônios esteroides sexuais: progesterona, estradiol e testosterona.

Os hormônios esteroides nos mamíferos são classificados em cinco

categorias: glicocorticoides, mineralocorticoides, estrogênios, progestogênios e

androgênios (De Matos 2008). As três últimas categorias compreendem os

chamados hormônios sexuais ou gonadais. Os estrogênios e progestogênios são os

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chamados “hormônios femininos”, que são principalmente sintetizados e liberados

pelos ovários, atuando durante o ciclo menstrual, na manutenção da gravidez e no

desenvolvimento das características sexuais secundárias femininas (aparecimento

de mamas, aumento do tecido adiposo, dentre outras). Já a categoria dos

androgênios, ou “hormônios masculinos”, tem como seu principal representante a

testosterona que é liberada principalmente pelos testículos e desempenha papel

importante no comportamento reprodutivo masculino, na agressão e no

desenvolvimento das características sexuais masculinas (aumento de massa

muscular, modificação no timbre da voz, surgimento de pelos, dentre outras) (Lee &

McEwen 2001, Galea et al. 2006). Além da testosterona destacam-se três outras

formas principais de androgênios circulantes: diidrotestosterona (DHT),

androstenediona e desidroepiandrosterona (DHEA) (Handa, Price 2000).

Os esteroides androgênicos atuam como fatores de transcrição sendo

transportados na corrente sanguínea por moléculas carreadoras para os tecidos

alvos. São moléculas lipofílicas, que atravessam facilmente a membrana plasmática

(Stoffel-Wagner 2001). Na célula-alvo, a sua ação pode ser genômica ou não

genômica. Em sua ação genômica, atuam sobre receptores intracelulares

citosólicos, que se encontram estabilizados pelas proteínas do choque térmico

nomeadas de Hsp90. Uma vez formado o complexo hormônio-receptor, as hsp90 se

desligam do receptor e o complexo se desloca para o núcleo. No núcleo, o complexo

se liga ao DNA nuclear em uma região específica denominada elementos de

resposta ao hormônio (ERH). Esta interação promove a transcrição ou a repressão

de certos genes e, portanto induzem ou bloqueiam a produção de proteínas

(Roskoski 1997, Enmark & Gustafsson 1999). Ações genômicas requerem um

período superior a 30 minutos para serem efetivas (geralmente de horas a dias) e

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são consideradas as ações clássicas dos hormônios esteroides (Aloisi & Bonifazi

2006). Já as ações não-genômicas são mais rápidas (de milissegundos a minutos) e

foram descritas a partir da descoberta de receptores para esses hormônios

localizados na membrana celular. A classificação e definição dessas ações são

ainda bastante deficientes tendo em vista os dados incompletos acerca da base

molecular para explicar tais ações (Wehling 1997). Contudo, as ações não-

genômicas podem ser assim caracterizadas: ações que são rápidas demais para

serem compatíveis com a síntese proteica e de RNA; ações que não são alteradas

na presença de inibidores de síntese proteica e de RNA; ações que ocorrem quando

se utiliza hormônios ligados a moléculas impermeáveis a membrana; e ações que os

hormônios induzem em células com cromatina altamente compactada (Simoncini &

Genazzani 2003). Alguns exemplos são os receptores de membrana acoplados a

canais iônicos ou segundos mensageiros (como a proteína G, quinases ou

nucleotídeos cíclicos) ou interação alostérica dos próprios receptores (Rupprecht &

Holsboer 1999).

Conforme já comentado, a testosterona é o principal hormônio

androgênico, possui 19 carbonos e é sintetizado a partir do colesterol. Em homens

adultos, é o androgênio circulante mais abundante no corpo, sendo principalmente

produzido nas células de Leydig dos testículos. Entretanto, aproximadamente 5% de

sua produção ocorrem nas glândulas adrenais. Um homem adulto produz em média

7mg de testosterona por dia, com níveis circulantes que variam de 10 a 35 nmol/L.

Estes níveis plasmáticos são bem maiores do que os encontrados em mulheres (Wu

1992).

A produção e secreção da testosterona em indivíduos do sexo masculino

são reguladas por um complexo sistema de retroalimentação do eixo hipotálamo-

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hipófise-gonadal. O hipotálamo sintetiza e secreta o hormônio liberador de

gonadotrofina (GnRH), que por sua vez estimula a produção e liberação do

hormônio luteinizante (LH) e do hormônio folículo estimulante (FSH) da hipófise

anterior (Haymond & Gronowski 2006). O LH atua nas células de Leydig estimulando

a síntese e secreção de testosterona e o FSH atua nas células de Sertoli

estimulando a espermatogênese bem como a produção e secreção do hormônio

inibina (Haymond & Gronowski, 2006). Androgênios circulantes regulam a secreção

de gonadotrofinas através de retroalimentação negativa no hipotálamo e na hipófise

anterior. Por exemplo, se os níveis de testosterona estiverem elevados, há uma

sinalização para o hipotálamo inibir a secreção do LH e FSH. Esta retroalimentação

diminui a produção de testosterona (Haymond & Gronowski, 2006).

Cerca de 40% da testosterona circulante está ligada a uma proteína

plasmática denominada proteína ligante do hormônio sexual (SHBG), 2 a 3% estão

livres e o restante está associado à albumina ou outras proteínas plasmáticas

(Hardman et al. 1996). A testosterona quando firmemente ligada à SHBG não é

biologicamente ativa, restando apenas a testosterona livre ou as fracamente ligadas

disponíveis para ação nos tecidos (Pardridge 1986).

Existem duas vias principais para o metabolismo periférico da

testosterona sendo o fígado o principal sítio para inativação dos androgênios

(Mooradian et al. 1987). A meia-vida da testosterona livre é de cerca de 10-21

minutos sendo inativada no fígado pela conversão em androstenediona e 90% de

seus metabólitos são excretados na urina (Rang, Dale & Ritter 1997). Por esse

motivo, a urina tem sido o principal meio para análise do uso de esteroides em

atletas.

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A testosterona circulante também é metabolizada irreversivelmente em

tecidos alvos em metabólitos biologicamente mais potentes como a DHT (por meio

da ação da enzima 5-α-redutase) e o estradiol, via aromatase (Haymond &

Gronowski 2006). Aproximadamente 0,3 mg/dia de testosterona são convertidas em

DHT nas células-alvo (Smith et al. 1985). Aproximadamente 85% do estradiol

circulante em machos são provenientes da aromatização da testosterona

(MacDonald et al. 1979).

A testosterona circulante exerce seus efeitos, diretos e indiretos, em

diferentes tecidos do corpo. Ela pode atuar diretamente no rim, músculo cardíaco e

esquelético, bem como nos órgãos reprodutivos, através da ligação com o receptor

androgênico (RA) (Mooradian et al. 1987). Esse hormônio pode exercer seus efeitos

indiretos em tecidos periféricos pela ação de um de seus metabólitos ativos. Por

exemplo, a DHT pode atuar na pele, folículos pilosos e na próstata (Haymond &

Gronowski 2006, Mooradian et al. 1987). Embora a testosterona e a DHT liguem-se

aos mesmos receptores androgênicos, a DHT liga-se com maior afinidade do que a

testosterona (Mooradian et al. 1987).

A aromatização periférica da testosterona em estradiol pode ocorrer no

tecido adiposo, tecido ósseo e em diferentes regiões do cérebro, de maneira que a

testosterona pode exercer seus efeitos também indiretamente, através dos

receptores estrogênicos (RE) (MacLusky et al. 1985). Desta forma, evidencia-se que

a testosterona, por si só, é um hormônio importante desempenhando uma série de

funções, mas também atua como pró-hormônio circulante para diversos outros

tecidos específicos que possuem as enzimas conversoras (5α-redutase e

aromatase) (Wu 1997).

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Receptores androgênicos e estrogênicos são amplamente distribuídos no

cérebro. A aromatização da testosterona em estrógeno ocorre em diferentes regiões

do cérebro como na amígdala, hipocampo e hipotálamo (McEwen 1980, Janowski

2006). Assim, os receptores para hormônios esteroides são encontrados em

diversas regiões do cérebro: amígdala, hipocampo, córtex cerebral, medula espinhal,

cerebelo (Merchenthaler et al. 2004, Mitra et al. 2003, Ozawa 2005). Além dessa

ampla distribuição no SNC, os receptores para hormônios esteroides são

encontrados por todo o corpo como pele, musculo esquelético, órgãos reprodutivos,

fígado, coração e rins.

Os efeitos desses hormônios variariam de acordo com o tipo de receptor

presente, bem como o tipo de enzima encontrada em cada célula-alvo. Estudos

recentes relataram que os hormônios gonadais regulam a neurogênese não apenas

durante o desenvolvimento, mas, também na vida adulta. Por exemplo, Galea (2008)

verificou que os hormônios gonadais podem modular a neurogênese no hipocampo

em roedores adultos machos e fêmeas diferentemente. Este processo de

neurogênese foi também observado na amígdala e em outras regiões cerebrais

(Fowler et al. 2008). Consequentemente, qualquer evento que altere os níveis

fisiológicos dos hormônios esteroides no organismo pode provocar prejuízos em

funções cerebrais e de desenvolvimento.

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2.2 ESTEROIDES ANABÓLICOS ANDROGÊNICOS (EAA)

2.2.1 Principais características e efeitos

Os esteroides anabólicos androgênicos (EAA) são hormônios esteroides

da classe dos hormônios sexuais masculinos, os quais possuem dois efeitos

principais sobre o corpo: efeitos androgênicos e efeitos anabólicos. Os efeitos

androgênicos referem-se às características sexuais masculinas (incluindo o trato

genital, as características sexuais secundárias, a espermatogênese e a fertilidade)

(Handelsman 2001). Já os efeitos anabólicos estão relacionados ao crescimento e

manutenção dos músculos do corpo, na massa e densidade óssea bem como na

produção de hemácias, uma vez que aumentam os níveis de eritropoietina (Shahidi,

2001, Basaria et al. 2001). Contudo, estas substâncias possuem também ações

biológicas que não são nem androgênicas nem anabólicas, tais como as sobre o

SNC.

Por causa do metabolismo hepático de primeira passagem, a testosterona

propriamente dita quando administrada via oral é rapidamente degradada no fígado

e os níveis plasmáticos permanecem baixos, não estando fisiologicamente ativa

(Bagatell & Bremner 1996, Wilson 1988). Dessa forma, várias tentativas foram

realizadas para se encontrar um esteroide com atividade prolongada (Shahidi 2001),

por exemplo, diminuindo a taxa de absorção e evitando a degradação rápida no

organismo (Wu 1992). No entanto, a testosterona pode ser alquilada na posição 17-

hidroxi, dando origem aos andrógenos que são mais resistentes ao metabolismo

hepático. Muitos destes compostos são suficientemente resistentes à degradação,

podendo ser administrados por via oral, e formam a base para muitos esquemas

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utilizados pelos atletas e construtores do corpo. Em geral, estes androgênios são

mais fracos do que os ésteres de testosterona ou a própria testosterona, e podem

causar disfunção hepática, complicações e efeitos colaterais. As pesquisas também

foram desenvolvidas no sentido de se encontrar compostos sintéticos com

propriedades anabólicas maiores do que as androgênicas, contudo, atualmente

ainda não foram desenvolvidos esteroides puramente anabólicos (Wilson 1988).

Classicamente, os esteroides anabólicos incluem a testosterona e seus

derivados (Thein et al. 1995, Ferrera et al. 1997). Entretanto, alguns autores

descrevem também os derivados sintéticos da testosterona como esteroides

anabolizantes (Hoberman & Yesalis 1995, Goldberg et al. 2000) pois eles

apresentam atividade anabólica (promoção do crescimento) superior à atividade

androgênica (masculinização) (Lukas 1996). Já estão descritos mais de 1.000

derivados sintéticos da testosterona. Aproximadamente 60 tipos de EAA são

comercializados, os quais variam em estrutura, metabolismo e, portanto, nos efeitos

fisiológicos gerados (Basaria et al. 2001). Existem três classes principais destes

compostos de acordo com o tipo de modificação na estrutura da testosterona (Figura

02). A classe I (ou A), cujos compostos são primariamente injetáveis, engloba os

compostos com esterificação do grupo 17-β-hidroxila da testosterona com vários

ácidos carboxílicos, com consequente aumento das propriedades androgênicas,

aumento da solubilidade lipídica da molécula prolongando o tempo de ação na

circulação. Tem como principal representante o propionato de testosterona (Basaria

et al. 2001, Wilson 1996). A classe II (ou B) é também formada por compostos

injetáveis e compreende ésteres chamados de derivados 19-nor-testosterona,

compostos que apresenta uma substituição de um hidrogênio por um grupo metil no

carbono 19 com consequente aumento da meia-vida da classe, maior afinidade

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pelos receptores androgênicos e uma menor pelos receptores estrogênicos. Tem

como principal exemplo o decanoato de nandrolona (Shahidi 2001). Por fim, a classe

III (ou C) é formada por compostos alquilados no carbono 17-α, fato que retarda o

metabolismo hepático, fazendo com que eles sejam ativos também por

administração oral. Diferentemente das outras duas classes, nenhum dos esteroides

17α- alquilados é convertido em di-hidrotestosterona (DHT) ou 17β-estradiol, embora

outros metabólitos possam ser formados (Winters 1990). Dessa forma, cada EAA

possui uma estrutura única semelhante à testosterona e funciona como um

hormônio esteroide no corpo. Todavia, cada EAA possui diferentes efeitos sobre o

organismo dependendo, além da estrutura, da via de administração, dosagem,

frequência e duração do uso.

Fonte: Extraído de Cunha (2004).

Figura 2. Exemplos de esteroides anabolizantes das três classes: Propionato de testosterona (classe I), Estanozolol (classe III) e Nandrolona (classe II).

Os EAA são utilizados em diversos tratamentos na clínica, em

quantidades controladas. O principal deles é no hipogonadismo masculino através

da manutenção dos níveis séricos de testosterona dentro de níveis fisiológicos

normais (Conway et al. 2000). Considerando a ação destes compostos no balanço

do nitrogênio e síntese proteica no sistema muscular, essas drogas têm importante

papel no tratamento da sarcopenia associada ao câncer, de queimaduras graves,

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doenças pulmonares e insuficiência renal (Basaria et al. 2001, Shahidi 2001).

Também são frequentemente utilizados para combater a perda muscular em

pacientes com Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS), nos quais alguns

estudos têm demonstrado aumento do humor, da libido e energia associada ao

ganho de massa muscular (Basaria et al. 2001, Bhasin et al. 2000, Rabkin et al.

2000).

A principal diferença entre o uso médico e o abuso dos EAA está na dose

e no esquema de administração (tratamento). Usualmente, o uso médico dos EAA

está relacionado à reposição dos níveis fisiológicos (ex. de 6 a 10 mg/dia no

hipogonadismo) e com intervalos regulares de uso (Wilson et al. 1996). Já na

condição de abuso os regimes de administração são diferentes (geralmente,

utilizando compostos orais e injetáveis) e quase sempre acompanhados de um

aumento progressivo da dose (de 40 a 100 vezes a dose fisiológica) (Rogol &

Yesalis 1992, Yesalis et al. 1997, Brower 2002). A dosagem utilizada depende das

características e necessidades particulares de cada usuário. Por exemplo,

corredores de maratona ou nadadores de longa distância utilizam-se dos esteroides

em níveis pouco acima dos níveis fisiológicos apenas objetivando manter o

desempenho intenso durante toda a prova e também suportar as sessões de treino

pré-competição. Já atletas de força como fisiculturistas e levantadores de peso

utilizam elevadas doses (10 a 100 vezes os níveis fisiológicos) de esteroides devido

à necessidade de ganho de massa muscular para levantar o máximo de peso

possível (Yesalis 2000, Brower 2002). No entanto, a dose real utilizada é geralmente

desconhecida já que os usuários os adquirem do mercado negro ou utilizam

produtos veterinários (Brower 2002, Gruber & Pope 2000).

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Estudos têm descrito que a forma com que os EAA são utilizados

geralmente segue três metodologias: a primeira, conhecida como “ciclo”, está

relacionada a qualquer período de utilização recorrente que varia de 4 a 18

semanas; a segunda, denominada “pirâmide” começa com pequenas doses que

aumentam progressivamente até o ápice e após esta dosagem máxima ocorre uma

redução até a dose mais baixa; a terceira forma de abuso é conhecida como

“stacking” (uso alternado de esteroides de acordo com a toxicidade) e compreende a

utilização de vários esteroides ao mesmo tempo (em média, cinco tipos diferentes)

(Wu 1997, Catlin 2001). O uso do sistema “stacking” permitiria a maximização da

ligação dos receptores e ativação de múltiplos sítios de receptores de esteroides.

Além desses esquemas de administração, os EAA são comumente utilizados em

conjunto com outras drogas com o intuito de aumentar o efeito anabólico e diminuir

os efeitos colaterais, tais como diuréticos (para diminuir a retenção de líquidos) e

gonadotrofina coriônica humana (para evitar a atrofia testicular). Por fim, é

importante ressaltar que tudo isso também é combinado com dietas específicas

incluindo suplementos (creatina, aminoácidos, vitaminas) e também com exercícios

físicos intensos (Brower 2002, Evans 2004).

Neste contexto, há um enorme interesse no estudo dos efeitos desses

compostos tanto em relação ao abuso quanto ao uso clínico. Os efeitos colaterais do

abuso dos EAA vão desde o aparecimento de acne, retenção de líquido, redução

dos níveis de lipoproteína de alta densidade (HDL) e apneia do sono até efeitos mais

graves ou mesmo letal como falência hepática e algumas formas de cânceres (Stone

1993, Suttmann et al. 1995). Estes efeitos podem ser temporários, rápidos,

persistirem ao longo do tratamento com EAA ou até mesmo permanecerem após o

término do tratamento (Blue & Lombardo 1999). Os efeitos adversos podem ser

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divididos em quatro áreas principais: hepáticos, cardíacos, endócrino-reprodutivos e

psicológico-comportamentais. Os efeitos colaterais do uso dos EAA irão depender

do sexo e idade do indivíduo, do composto utilizado e da dose e duração do

tratamento (Wu 1997).

Os efeitos psicológicos do uso de EAA ainda são menos estudados do

que os efeitos fisiológicos. Geralmente, trata-se de estudos de caso com doses

muito menores do que as utilizadas em abuso. Além disso, questões éticas impedem

a execução de estudos controlados onde se administre doses altas de EAA em

voluntários saudáveis.

Em contraste com esses efeitos sutis encontrados tanto na clínica quanto

em estudos de laboratório, outros estudos têm encontrado frequentemente

alterações psicológicas significativas em indivíduos que recebem doses

suprafisiológicas de EAA (Trenton & Currier 2005). Diversos estudos de caso

sugerem que EAA podem produzir uma variedade de distúrbios comportamentais e

psicológicos como, por exemplo, o aumento da agressividade, psicose, tentativa de

suicídio e desenvolvimento de dependência a drogas (Brower et al. 1989, Hall et al.

2005, Papazisis et al. 2007, Thiblin et al. 1999, Trenton & Currier 2005).

O efeito psiquiátrico mais citado na literatura é o aumento da

agressividade em indivíduos que usam EAA em doses elevadas (Basaria et al.

2001). Mesmo fisiologicamente, acredita-se que a testosterona seja um importante

determinante da agressão. Por exemplo, modelos animais fornecem fortes

evidências que os níveis séricos de testosterona medeiam os comportamentos de

dominância e agressividade em ratos machos adultos (Bahrke et al. 1990). Além

disso, a exposição à testosterona exógena aumenta a agressividade em roedores

(Farrell & McGinnis 2003, Melloni et al. 1997). Ricci e colaboradores (2006)

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demonstraram que hamsters tratados com um coquetel de esteroides por 30 dias

apresentaram um aumento da agressividade acompanhado por uma redução na

quantidade de receptores 5HT1A no hipotálamo anterior, sendo que um agonista do

receptor 5HT1A reverteu o quadro agressivo.

Embora existam resultados conflitantes na literatura, existem dados

suficientes e convincentes para sugerir que os EAA podem produzir distúrbios

psicológicos e comportamentais dose dependentes, em indivíduos que abusam de

EAA (Pope & Katz 2003).

Corrigan (1996) divide os efeitos psicológicos promovidos por estas

substâncias em três grupos: a) efeitos imediatos relacionados à mudança de humor

e euforia, com possível melhora da confiança, energia e autoestima, além do

aumento da motivação e do entusiasmo. Há também diminuição da fadiga, insônia,

irritação, raiva, agitação e habilidade para treinar com dor; b) efeitos de altas doses

por longo período, principalmente perda da inibição e alterações de humor; c)

evolução dos efeitos de agressividade para comportamentos violentos, hostis e

antissociais, podendo ocorrer ataques de fúria que vão desde o abuso infantil até os

suicídios e assassinatos. Dessa forma, há crescente interesse em estudos que

procurem elucidar as consequências fisiológicas e psicológicas do uso continuado

dos esteroides anabolizantes no ser humano.

2.2.2 Efeitos sobre o aprendizado e a memória

Apesar das evidências que a administração exógena de hormônios

esteroides promove prejuízos cognitivos, estudos sobre os efeitos dos EAA sobre o

aprendizado e a memória são escassos. Em humanos, alguns estudos têm

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investigado os efeitos cognitivos da suplementação com testosterona em homens

idosos saudáveis. Por exemplo, após injeções intramusculares de 100 a 150 mg de

testosterona, observou-se melhorias na habilidade espacial (Cherrier et al. 2001,

Janowsky et al. 1994), memórias viso-espacial (Cherrier et al. 2001, Cherrier et al.

2005) e operacional viso-espacial (Janowsky et al. 2000) sugerindo que os

hormônios esteroides sejam capazes de modular aspectos cognitivos em homens

idosos saudáveis. Ainda é incerto se essas melhorias encontradas na cognição se

devem ao aumento nos níveis de testosterona ou de estrógeno.

No entanto, Cherrier e colaboradores (2005) sugerem que as melhorias

na memória verbal dependem da aromatização da testosterona em estrógeno, ao

passo que as melhorias na memória espacial independem da aromatização. Outros

trabalhos sugerem melhoras no desempenho cognitivo quando, por exemplo,

homens com hipogonadismo demonstram pior desempenho cognitivo quando

comparados a homens saudáveis sendo que esses déficits foram reduzidos com a

suplementação de testosterona (Sternbach 1998, Lund et al. 1999, Tan 2001).

Aliado a esses indícios em humanos, a verificação, em ratos, de uma alta

densidade de RA em regiões cerebrais importantes para o aprendizado e memória,

como o hipocampo, sugere que pode haver uma relação importante entre

andrógenos e essas funções cognitivas (Kerr et al. 1995). Na maioria dos

mamíferos, o hipocampo tem um papel bem documentado no aprendizado e na

memória (Bannerman et al. 2002, Martinez et al. 2002). No hipocampo de ratos, RA

estão particularmente concentrados nas células piramidais em CA1 (Clancy et al.

1992, McAbee & DonCarlos 1998). Andrógenos podem também aumentar a

excitabilidade neural no hipocampo de ratos machos (MacLusky et al. 2006, Smith et

al. 2002) e aumentar a densidade de espinhos dendríticos nas regiões CA1 e CA3

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no hipocampo dorsal (Isgor & Sengelaub 2003). Acredita-se também que os

andrógenos modulem alguns comportamentos que são mediados pelo hipocampo

como os observados no labirinto aquático, na esquiva inibitória e no labirinto em Y

(Isgor & Sengelaub 2003, Frye & Seliga 2001, Kritzer et al. 2001).

Por outro lado, estudos mostram que a administração de testosterona em

ratos pode prejudicar o desempenho dos mesmos no labirinto aquático (Goudsmit et

al. 1990, Naghdi et al. 2003, Moradpour et al. 2006) e na esquiva inibitória (Naghdi &

Asadollahi 2004). Harooni e colaboradores (2008) observaram que a administração

de testosterona na região CA1 do hipocampo pode prejudicar a aquisição,

consolidação e evocação de memórias em uma tarefa de esquiva passiva.

Entretanto, eles também observaram que a total depleção (gonadectomia) não

afetou nenhum desses processos na mesma tarefa.

Como se pode observar, os resultados dos efeitos dos andrógenos sobre

a memória e o aprendizado são ainda muito incipientes. Quadro que se agrava ainda

mais quando se objetiva analisar os efeitos dos EAA administrados cronicamente em

doses suprafisiológicas. De fato, mesmo com o aumento significativo no uso dessas

substâncias, ainda há uma carência de pesquisas que investiguem os efeitos

cognitivos do abuso desses compostos fazendo com que evidências de correlações

tanto positivas quanto negativas sejam sugeridas (Goudsmit et al. 1990, Gouchie &

Kimura 1991, Burkitt et al. 2007). Dentre as poucas pesquisas realizadas com esse

fim, demonstrou-se que o uso de um coquetel de esteroides (5mg/kg/dia)

administrado de 4 a 12 semanas em ratos não foi capaz de afetar a memória

espacial nem a plasticidade hipocampal (Clark et al. 1995, Smith et al., 1996). Por

outro lado, foram observados déficits na memória após a administração de 15

mg/kg/dia de decanoato de nandrolona em ratos na tarefa de memória social olfativa

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(Kouvelas et al. 2008) e na tarefa do labirinto aquático de Morris (Magnusson et al.

2009).

Alguns estudos mostram que a ansiedade seria um passo necessário na

formação da memória (Mathews 1990, Silva & Frussa-Filho 2000) tornando-se,

assim, um aspecto importante para a compreensão dos processos de aprendizado e

memória. Ainda, além dos efeitos psicológicos em humanos descritos anteriormente,

estudos têm demonstrado que hormônios androgênicos podem modificar o

comportamento de roedores no labirinto em cruz elevado, um modelo clássico de

avaliação da ansiedade. Por exemplo, Bitran e colaboradores (1993) indicaram uma

resposta ansiolítica, em ratos, após seis dias de exposição com propionato de

testosterona; por outro lado, nesse mesmo estudo ratos expostos a 14 dias de

tratamento não diferiram dos controles. Aikey e colaboradores (2002) também

demonstraram uma resposta ansiolítica com o aumento da exploração dos braços

abertos 30 minutos após a administração de uma dose única de testosterona ou de

seu derivado androsterona. Em oposição a esses resultados, a administração

crônica de decanoato de nandrolona produziu efeito ansiogênico em ratos machos

(Minkin 1993). Por outro lado, a administração de 7mg/kg/dia de metil testosterona

por 17 dias não alterou os níveis de exploração dos braços abertos no labirinto em

cruz elevado (Rojas-Ortiz et al. 2006).

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37

3 OBJETIVO GERAL

O objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos de um esteroide

anabólico androgênico (PT) sobre diferentes aspectos das funções cognitivas e

ansiedade em ratos após tratamento agudo e crônico.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1) Avaliar os efeitos do tratamento agudo e crônico com PT no desempenho

de ratos na tarefa de reconhecimento de objetos;

2) Avaliar os efeitos do tratamento agudo e crônico com PT sobre a memória

operacional de ratos submetidos à tarefa da alternação espontânea;

3) Avaliar os efeitos do tratamento agudo e crônico com PT sobre a memória

aversiva e quadro de ansiedade de ratos, a partir da avaliação do

desempenho na esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado.

A seguir apresentamos os dados da presente tese subdivididos em

dois artigos, sendo que o Artigo 1 contempla os objetivos específicos 1 e 2; e o

Artigo 2 contempla o objetivo específico 3. Destaca-se que o Artigo 1 já está

aceito para publicação (Current Psychopharmacology, 2013, Volume 2, No. 2) e o

Artigo 2 está em preparação.

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38

4 ARTIGO 1

The anabolic androgenic steroid testosterone propionate decreases

recognition memory in adult male rats

Fernando Roberto Ferreira Silva, Alicia Cabral, Ana Paula Nascimento Lima,

Aline Lima Dierschnabel, Ezequiel Batista do Nascimento, Priscila Tavares

Macedo, Geison Souza Izídio, Alessandra Mussi Ribeiro, Regina Helena Silva*

Memory Studies Laboratory, Physiology Department. Federal University of Rio

Grande do Norte, Natal, Brazil

*Corresponding author: Departamento de Fisiologia - Centro de Biociências -UFRN,Av. Salgado Filho, s/n – Caixa Postal 1511CEP 59078-970 – Natal/RN, BrazilFax: +55 84 32119206.E-mail address: [email protected] (R.H. Silva).

Keywords: androgens, AAS supraphysiological dose, behaviour effects, cognitive

deficit, long-term AAS treatment, acute AAS treatment, spatial working memory

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Abstract

Although there are therapeutic applications of the Anabolic Androgenic Steroids

(AAS), the predominant use implies the illicit self-administration by athletes and

adolescents. In this respect, AAS abuse is associated with untoward effects on

brain and behavior. Exposure to supraphysiological doses of AAS leads to

changes in anxiety and aggression, but their effects on cognitive functions are

poorly understood. We investigated the effects of the AAS testosterone propionate

(TP), acutely or chronically administered in supraphysiological doses, on memory

in rats. Experiment I – The rats were treated once with vehicle (n = 5) or TP (n =

5). Behavioral experiments were performed 60 minutes after the single injection.

Experiment II – Adult male Wistar rats received repeated daily administration of

vehicle (Control Group, n = 6) or TP (10 mg/kg, n = 7) for 40 days. Behavioral

experiments started 24 hours after the last injection, and included the evaluation

of spatial working memory and recognition memory. After behavioral procedures,

the animals were euthanized, the blood was collected for biochemical analyses

and testicles were removed and weighted. Regarding the behavioral assessment,

rats chronically treated with TP presented decreased time exploring the novel

object when compared to control group. Rats that were treated acutely showed no

significant difference compared with control. Acute or chronic treatments with TP

were not effective in promoting changes in spatial working memory. Additionally,

chronic treatment with TP induced significantly increases in biochemistry marker

the enzyme glutamate pyruvate transaminase (SGPT) and a reduction in testicular

weight as compared with control. Even though not interfering with spatial working

memory performance, AAS abuse could induce deficit on recognition memory.

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40

Introduction

The original therapeutic use of the synthetic analogues of testosterone,

the anabolic androgenic steroids (AAS), was the enhancement of anabolic

potency [1]. However, it is known that AAS (in supraphysiological doses) have a

high prevalence of misuse by athletes and adolescents, aiming to improve

performance or body image [2, 3, 4]. Some consequences of the chronic steroid

misuse that have been described are coronary heart disease, increased blood

pressure, and liver dysfunction [5]. These adverse effects vary in intensity

depending on age, sex, type of AAS, dosage and duration of use [6, 7, 8]. Besides

the development of drug dependence, adverse effects of AASs in the neural

function and behavior have been reported, such as aggressive behavior,

psychosis and even suicide attempts [9, 10, 11, 12]. In addition, a few reports

have shown cognitive impairments [13].

Considering that gonadal hormones play a role in mechanisms related

to cognitive function [14, 15], it is expected that AASs exert actions on learning

and memory processes. Indeed, studies have shown high density of androgen

receptors in brain areas related to these processes [16, 17], as well as of the role

of sexual hormones in learning and memory [18]. The studies on this issue were

mainly conducted with acute testosterone, administered intra-hippocampally, and

have shown that this hormone impairs the performance of rats in spatial water

maze [19, 20] and inhibitory avoidance tasks [21, 22]. Other studies have shown

impaired performance in different kinds of memory tasks in gonadectomized

(GDX) male rodents, which were restored after testosterone administration [23,

24].

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On the other hand, there are few studies focusing on the effects of

long-term treatment with testosterone or synthetic analogues, which would be of

interest considering the pattern of abuse of these substances. Moreover, these

studies have shown controversial results, Kouvelas et al. [25] showed impaired

performance in an olfactory social memory task in rats treated with nandrolone

decanoate. Conversely, other studies did not report any alteration in the

acquisition or extinction of a lever-pressing task [26] or performance in the water

maze task [27] of the rats treated with same drug.

The mechanism underlying the potential cognitive effects of AAS is not

understood. It has been demonstrated that the AAS nandrolone, given chronically,

modify the glutamatergic [28], GABAergic [29], dopaminergic and serotonergic

[30, 31] systems. From another standpoint, beneficial effects of prolonged

testosterone treatment on neuronal function have also been reported [32],

although this neuronal effect did not result in behavioral improvement in

senescent rats [33].

In this context, the wide-spread use of AAS during lifetime is an

important concern. In addition to the physiological damage that has been

extensively described, evidence suggests that there are also cognitive

impairments. However, as mentioned, the results in animal studies are not

unequivocal. In order to extend the knowledge about the cognitive effects of

prolonged treatment with AAS, we investigated the effects of chronic testosterone

propionate (TP) at a supraphysiological dose in rats. We hypothesized that the

effects of AAS would extend to different aspects of memory function other than

those previously investigated. The animals were tested in the spontaneous

alternation task (to evaluate spatial working memory), and the novel object

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recognition (NOR) task. After the behavioral tests, animals were euthanized and

testicular weight and biochemical analyses were obtained. Additionally, behavioral

testing in the same paradigms after acute treatment was conducted for

comparison.

Materials and Methods

Subjects and general procedures

Three-month-old male Wistar rats (300–350g) were used. Animals

were housed individually in plastic cages (30x19x13cm, length x width x high),

under conditions of acoustic isolation and controlled airflow and temperature (25 ±

1º C), with a 12h light/12 h dark cycle (lights on at 06:30). Food and water were

available ad libitum. All procedures were approved by the local ethics committee.

All efforts were made to minimize animal pain, suffering or discomfort.

Treatment

Animals in the control group were injected with sesame oil (Vehicle –

VEH) and those in the treated group were injected with 10 mg/kg testosterone

propionate (TP - Androgenol®, Herpate Calier, Brazil) diluted in vegetable oil. The

injections were administered intramuscularly, and the target hind limbs were

alternated. The dose of 1 mg/kg is sufficient to restore endocrine function and

reproductive behaviors in gonadectomized male rats [34]. Thus, the dosage of 10

mg/kg used in this experiment can be considered supraphysiological, and was

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combined with a long-term treatment of 40 days (20 injections) to simulate abuse

conditions. The health condition of the animals during the treatment with TP was

considered adequate: no deaths occurred during the treatment and no wounds

were observed in the injection sites. Additionally, repeated oil injection did not

seem to interfere with animals’ general behavior (as suggested by absence of

effect in the locomotion - Table 1). Moreover, no changes were observed in the

weight of the rats throughout the treatment (data not shown).

Experimental design

The animals were handled daily for 10 min during seven days before

the beginning of the experimental procedures. Afterwards, the rats were randomly

assigned to one of the groups: Control or PT-treated.

Experiment I – Effects of acute administration of testosterone

Each animal received a single intramuscular injections of sesame oil

(VEH; n = 5) or injections of 10 mg/kg testosterone propionate (TP; n = 5). This

day was considered day 1-I.

On day 1-I, sixty minutes after the single administration, rats were

individually placed in this central space in a plus-maze to spontaneous alternation

task.

On day 2-I (24h after the single injections), rats were exposed to the

open field for habituation for 10 min. After 24h and 48h (on days 3-I and 4-I), the

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training and test sessions of the novel object recognition task were performed as

described above, respectively.

Experiment II – Effects of chronic administration of testosterone

Rats received intramuscular injections of sesame oil (VEH; n = 6) or 10

mg/kg testosterone propionate (TP; n = 7) every other day for 40 days (20

injections). The first injection day of the Experiment II, was considered day 1-II.

On day 39, rats were individually submitted to the spontaneous alternation task.

On day 40-II (24h after the last injection), rats were submitted to the

habituation session for the object recognition task, and the training session was

conducted on day 41-II. The test session was conducted 24h later (on Day 42-II).

Behavioral tasks

Recognition memory - Novel object recognition (NOR) task

Each animal was placed in the central region of an open field arena

(diameter = 1.0 m) and were given 10 min of free exploration to habituate (without

any objects). After 24h, in a 5-min training session, the animals were placed in the

field with two identical objects (objects A1 and A2), diametrically positioned in

opposite sides of the field and fixed on the floor. In the test session, conducted

24h later, a novel object (B) replaced one of the previous objects (A) and the rats

were allowed to explore them for 5 minutes. The objects used were approximately

the same size and had different colors and shapes. Exploratory behavior

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(touching with the nose and/or forepaws, sniffing or biting each object) was

recorded. The exploration ratio [time spent exploring the novel object B / (time

exploring familiar object A + time exploring the novel object B)] was calculated for

each animal. The maze and the objects were cleaned thoroughly after each

session with a 5% ethanol solution. All behavioral tests were held between 09:00

a.m. and 11:30 a.m.

Spatial working memory - Spontaneous alternation (SA) task

The apparatus used was a wooden plus-maze placed 50cm elevated

from the floor, with four enclosed arms (47cm×16cm×34cm) extending from a

central platform (16cm×16cm). The animals were individually placed in this central

space with access to all arms and allowed free exploration for 10 min. The

behavior of the animals was recorded by a video camera positioned above the

maze and analyzed by video-tracking software (Any-maze, Stoelting, USA). The

four arms were designated A, B, C and D, and the amount and sequence of

entries in the arms were registered. An entry was defined by the crossing of the

four paws through the entrance of the arm. An alternation was computed when the

animal explored the 4 individual arms consecutively, in any order, without

repeating an arm choice. Percentage of alternation was calculated by number of

registered alternations /number of possible alternations. General locomotor

activity was evaluated by the total number of entries and the distance travelled.

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Biochemical analysis

On day 42-II, after the test session of NOR task, blood samples (5 ml)

were collected into heparinized tubes after rapid decapitation. Centrifugation

(1000 rpm at 4ºC for 10 min) separated serum from blood. The serum obtained

was used to estimate the levels of glutamate oxaloacetate transaminase (SGOT),

glutamate pyruvate transaminase (SGPT) [35] and bilirubin [36]. The increase in

the levels of liver enzymes is frequent among steroid users [37].

Gonadal weight

After decapitation, testicles were dissected and weighted. For data

analysis, testicular weight was normalized considering the total body weight.

Ethical statement

The authors declare that all experiments reported in this article

received formal approval of the local ethical committee (CEUA-UFRN, protocol

024/2009), and followed the law for the use of animals in scientific research

(Brazilian law number 11.794). Moreover, the study was conducted in compliance

with the standards set forth in the eighth edition of Guide for the Care and Use of

Laboratory Animals published by the National Academy of Sciences, Washington,

D.C). All efforts were made to keep the number of animals used to a minimum, as

well as pain, suffering or discomfort.

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Statistical Analyses

The independent samples t test was used to analyze differences

between the groups VEH or TP. In the novel object recognition task, within-subject

comparisons for percentage of time to explore old x new objects were conducted

with paired-samples t tests. Data are displayed as mean ± standard error (S.E.M),

and p < 0.05 was considered to reflect significant differences. The SPSS 18 for

Windows software was used to perform the statistical analysis.

Results

Experiment I – Effects of acute TP treatment

Novel object recognition task

No changes in locomotor activity were found in the habituation session

[t(8) = 0.377, p = 0.716 (Fig. 1A). In the test session, there was no effect of

treatment on new object exploration ratio [t(8) = 0.439, p = 0.672 (Fig. 1C). Both

groups showed augmented exploration of the new object compared to old object

[Control group, t(4) = 4.624, p = 0.010] and TP treated group [t(4) = 3.967, p =

0.017] (Fig. 1E).

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Spontaneous alternation task

No significant differences were found on spontaneous alternation

performances [t(7) = 1.367, p = 0.214], number of arm entries [t(7) = 0.206, p =

0.842] and distance travelled [t(7) = 0.076, p = 0.941] between control and

experimental groups (Table 1).

Experiment II – Effects of chronic TP treatment

Novel object recognition task

No changes in locomotor activity were observed in the habituation

session [t(11) = 0.719, p = 0.487] (Fig. 1B). Rats treated with 10 mg/kg TP

presented significantly decreased exploration of the new object compared to VEH

in the test session [t(7) = 3.869, p = 0.006 (Fig. 2B). In addition, the exploration of

the new object by the VEH (but not TP) group was greater than the exploration of

the old object [t(7) = 4.22, p = 0.024 (Fig. 2C). In this task, the data of four animals

(two VEH and two TP) were removed from the analysis due to absence of object

exploration in the training session.

Spontaneous alternation task

No significant differences were found on spontaneous alternation

performances [t(11) = 1.019, p = 0.33], number of arm entries [t(11) = 0.302, p =

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0.76] and distance travelled [t(11) = 0.859, p = 0.41] between control and

experimental groups (Table 1).

Endocrine effects

The protocol of TP treatment used in the present study showed

significant effects in testicular weight. Indeed, when compared to VEH, this

administration reduced relative testicular weight in relation the total body weight

[t(11) = 4.33, p = 0.001 (Fig. 2). The administration of TP also caused significant

increase in marker enzyme SGPT compared with the control group [t(11) = 2.715,

p = 0.02] (Table 2). However, no significant differences were detected in levels of

SGPO and serum bilirubin.

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ACUTE CHRONICA B

C D

E F

Figure 1. Effects of acute (A, C and E) and chronic administration (B, D, and F) of 10 mg/kg of

testosterone propionate (TP) or vehicle (oil sesame - VEH) in rats submitted on novel object

recognition task. Data are expressed as the mean ± S.E.M. (A, B) Distance travelled; (C, E) Ratio

of the exploration of the new object, *p < 0.05 compared to VEH (Independent samples t-test); (E,

F) Exploration time of new object compared to familiar object, *p < 0.05 compared to familiar

object exploration (paired-samples t-test).

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Figure 2. Effects of the administration of 10 mg/kg of testosterone propionate (TP) or vehicle

(sesame oil - VEH) for 42 days on testicular weight in rats. *p < 0.05 compared to vehicle

(Independent samples t-test).

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Table 1. Effects of 10 mg/kg of testosterone propionate (TP) or sesame oil, vehicle (VEH) in rats submitted on spontaneous alternation task.

Values are expressed as mean S.E.M. (Independent samples t-test).

Table 2. Effects of testosterone propionate (TP) on different biochemical parameters in the serum of rats.

ParameterTreatment

VEH TP

SGPT (U/ml) 49.00 ± 4.42 84.29 ± 11.38*

SGOT (U/ml) 137.83 ± 13.87 121.00 ± 18.50

Bilirubin (mg/dl)

Total 0.45 ± 0.25 0.49 ± 0.22

Direct 0.31 ± 0.20 0.36 ± 0.22

SGPT, glutamate pyruvate transaminase in the serum; SGOT, glutamate oxaloacetate transminase in the serum. Values are expressed as mean ± S.E.M. (*p < 0.05 compared to vehicle; samples t test).

Parameters Treatment

VEH TP

Acute administration Alternations (%) 34.46 ± 7.29 47.70 ± 6.41 Total number of entries in the arms 24.75 ± 2.65 25.60 ± 2.99 Distance travelled (m) 23.34 ± 2.54 22.87 ± 2.34

Chronic administration

Alternations (%) 44.73 ± 4.15 37.41 ± 2.13 Total number of entries in the arms 33.00 ± 3.01 34.83 ± 4.77 Distance travelled (m) 38.16 ± 4.12 33.15 ± 4.83

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Discussion

As mentioned, the AAS are used aiming improvements on performance

and body image, usually through the illicit self-administration that is associated

with untoward effects on brain and behavior. Moreover the AAS has become a

widespread drug abuse problem [1, 2, 38]. Thereby, due to the involvement of

steroid hormones with cognitive functions, the prolonged use may promote

impairment in these processes. In this context, aiming to investigate the effects of

continuous exposure to supraphysiological levels of androgen steroids, chronically

and acutely testosterone propionate (TP)-treated rats were tested in two different

memory tasks.

Regarding the effects of TP on the performance of rats in the

spontaneous alternation (SA) task (Experiment I and II) (Table 1), these findings

corroborate studies in which spatial working memory was not altered after

administration of a high dose of one of the three AAS compounds (17α-

methyltestosterone, testosterone cypionate or methandrostenolone) [39]. The

spontaneous alternation behavior comprises the tendency for rodents and other

animals to alternate their nonreinforced choices of arms in a maze at successive

opportunities [40]. This task has been used as a simple test of spatial working

memory. Thus, the absence of effect observed in rats treated with TP (acute or

chronically administered) is possibly because this task is not complex enough to

verify the effects of treatment.

From another standpoint, some findings indicated acute

intrahippocampal injections of testosterone have benefits for memory performance

in rats [22]. In agreement, a correlation between spatial impairment and

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testosterone loss in aged mice was demonstrated, and treatment with exogenous

testosterone counteracted this impairment [41, 42]. Further, there is evidence of

an organizational action of these hormones in the development of neuronal

circuitries related to cognitive function. Indeed, a study showed that testosterone

enhances learning and memory in rats when given at critical periods of

development [41]. In summary, studies with testosterone (or its derivatives) and

spatial working memory in animals have shown controversial results.

In the case of the present study, the absence of effects of TP in SA

task in the results obtained cannot be attributed to motor alterations, since the

treatment did not cause changes in motor functions when compared to rats

treated with untreated in both the SA and NOR tasks (Table 1). Our data on

locomotor activity corroborate previous studies that demonstrated lack of motor

alterations in gonadally-intact rodents after chronic exposure to AAS [43, 44, 45].

We also investigated the effects of AAS in the novel object recognition

(NOR) paradigm. The chronic treatment with TP 10 mg/kg was able to cause a

deficit in the index of recognition of novel object when compared to the control

group (Fig. 1D). Few previous investigations focused the effects of AAS chronic

treatment on recognition memory. For example, recognition of a juvenile in a

social recognition task was decreased by chronic administration of nandrolone

decanoate (15mg/kg), although this treatment did not impair the acquisition of the

information [25]. In line with this result, nandrolone decanoate also delayed the

extinction learning in rats tested in an aversively-motivated task (passive

avoidance) [46]. On the other hand, Aubele and coworkers [47] found a deficit in a

spontaneous object recognition task (performed with a 1.5 h delay) after

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gonadectomy in adult male rats, providing evidence of a modulatory role of these

hormones in recognition memory processes.

It is relevant to mention that different mechanisms could be related to

the modulatory role of endogenous hormones as opposed to the effects of

supraphysiological doses of androgens on the cognitive function. Indeed, there is

an improvement of cognitive function when low doses of androgens are

administered, while higher doses can cause cognitive impairments [33]. In line

with this reasoning, in studies using the Morris Water Maze showed that

testosterone and flutamide impaired de performance of rats after infusions in the

CA1 hippocampal subregion [19, 48]. Interestingly, this pattern of bidirectional

results has also been found to the effects of estrogens administration in

ovariectomized female rats [49].

The mechanisms behind a specific impairment in recognition memory

(reported here), or in the complex effects for cognitive function in general, remain

unclear. There is evidence of modulation of several neurotransmission systems by

steroid hormones and/or their active metabolites. Regarding the effects related to

memory processes, an action via the cholinergic transmission has been indicated

[50]. In addition, the chronic treatment with nandrolone interferes with the

glutamatergic transmission [28]. Moreover, GABA-, dopamine- or serotonin-

mediated neurotransmissions can also be modulated by AAS [51, 52, 53]. Further

investigation on the mechanisms related to memory impairment of object

recognition due to AAS is needed.

Regarding physical (non-behavioral) effects, AAS compounds usually

produce typical marked effects like reduction in testicles’ weights [5]. In this study,

testicular weight of animals receiving TP was reduced compared to the control

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group (Fig. 2). The alterations in the gonadal weight are likely due to the well-

established actions of AAS compounds on the negative feedback loop

(hypothalamic-pituitary-gonadal axis) which results in changes in endogenous

testosterone production [54]. Also, increased levels of enzyme GPT, which often

indicates liver damage possibly caused by high doses of TP. The spectrum of

hepatic injury is ample. Elevated levels of alkaline phosphatase, as well as

elevation of liver transaminases are perhaps the more frequently described

abnormalities [55, 56]. Some studies have also demonstrated evidence for

enhanced blood aminotransferase activities after AAS use in bodybuilders [56].

Thus, besides the behavioral cognitive effects, these biochemical and weight

analysis overall confirmed the effectiveness of the protocol used in the present

study in inducing typical consequences of AAS abuse.

Conclusion

In conclusion, data reported here extents the studies showing that

AASs affects the cognitive functions in rats. Specifically, we have demonstrated

that chronic administration of TP resulted in significant reductions of performance

in novel object recognition task. Further research is needed to determinate the

extent to which high levels of androgens may influence different aspects of

cognitive functions, as well as the mechanisms underlying these effects.

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57

Acknowledgments

The authors would like to thank Edda Lisboa Leite for biochemical

analysis. This work was supported by fellowships from CNPQ, CAPES, FAPERN

and PROPESQ/UFRN.

References

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5 ARTIGO 2

Effects of anabolic androgenic steroid testosterone propionate on memory,

anxiety and motor behavior in rats tested in the plus-maze discriminative

avoidance task

Fernando Roberto Ferreira Silva, Alicia Cabral, Ana Paula Nascimento Lima,

Aline Lima Dierschnabel, Ezequiel Batista do Nascimento, Priscila Tavares

Macedo, Geison Souza Izídio, Alessandra Mussi Ribeiro, Regina Helena Silva*

Memory Studies Laboratory, Physiology Department. Federal University of Rio

Grande do Norte, Natal, Brazil

* Corresponding author: Departamento de Fisiologia - Centro de Biociências -

UFRN, Av. Salgado Filho, s/n – Caixa Postal 1511, CEP 59078-970 – Natal/RN,

Brazil. Fax: +55 84 32119206.

E-mail address: [email protected] (R.H. Silva).

Keywords: long-term anabolic androgenic steroids treatment; acute anabolic

androgenic steroids treatment; behaviour effects; cognitive deficit.

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Abstract

Anabolic Androgenic Steroids abuse is associated with untoward effects on body,

brain and behavior. Exposure to supraphysiological doses of AAS provokes some

unwanted physical side effects such as coronary heart disease, increased blood

pressure, liver dysfunction, but particularly alterations in anxiety, aggression, and

in other cognitive functions. We investigated the effects of acute or chronic

treatment of a supraphysiological dose of the AAS testosterone propionate (TP)

on memory and anxiety in rats. Experiment I – Adult male Wistar rats received

repeated daily administration of vehicle (Control Group, n=7) or TP (10.0 mg/kg;

n=8) for 40 days. Behavioral experiments started 24 hours after the last injection.

Experiment II – Rats were treated once with vehicle (n=5) or TP (10.0 mg/kg,

n=5). Behavioral experiments were performed 60 minutes after the single

injection. The apparatus employed in this work (Plus-maze discriminative

avoidance task / PM-DAT) is a modified elevated plus-maze. This task has been

validated for the simultaneous assessment of learning/memory and anxiety-like

behavior, being the measurements used to evaluate these parameters the

discrimination between both enclosed arms (aversive and non-aversive) and

open-arm exploration (time spent in the open arms of the apparatus), respectively.

Compared to controls, rats chronically treated with TP spend more time in

aversive enclosed arm (%TAV) in the test session suggesting worse retrieval of

the task by animals treated with TP. In the training session, rats that were

chronically treated showed no significant difference compared with control. Rats

that were acutely treated showed no significant difference compared with control

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in both sessions. Although not interfering with anxiety-like behavior, AAS abuse

induced memory deficits in the PM-DAT.

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Introduction

Because of the usually illegal character of their use, the side effects

associated with Anabolic Androgenic Steroids (AAS) abuse are difficult to describe

with great precision (Hall, Hall 2005). Nevertheless some unwanted physical side

effects such as coronary heart disease, increased blood pressure, and liver

dysfunction (Bonetti et al. 2008; McAllister, Collins 2006) are well known. Besides

these physical impairments, adverse effects of AASs on the central nervous system,

including clear psychiatric effects, have also been reported. Indeed, hyperactivity,

aggression, psychosis, euphoria, suicide attempts, and the development of drug

dependence (Papazisis et al. 2007; Trenton, Currier 2005) have been reported,

particularly in individuals submitted to excessive doses of these compounds.

These male sexual hormones, associated with both estrogen (ER) and

androgen receptors (AR) have an important role in several brain regions, including

cognitive processing sites [amygdala, hippocampus, cerebral cortex and cerebellum].

These potential physiological roles of endogen androgens imply consequences of the

treatment with AASs to brain mechanisms related to learning and memory (Ozawa

2005; Merchenthaler et al. 2004; Mitra et al. 2003).

The effects of androgens on memory, learning and anxiety have been the

aim of investigations in animal models. For example, testosterone produces

anxiolytic-like behavior in rodents in several models of anxiety (Gutierrez-Garcia et al.

2009; Fernández-Guasti, Martínez-Mota, 2005; Aikey et al. 2002; Bing et al. 1998).

Additionally, acute intra-hippocampal administration of testosterone impairs the

performance of rats in spatial water maze (Moradpour, Naghdi, Fathollahi 2006;

Naghdi, Nafisy, Majlessi 2001) and inhibitory avoidance tasks (Harooni et al. 2008;

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Naghdi, Asadollahi 2004) showing a clear impairment in memory and learning in

these models. Conversely, studies with animals subjected to gonadectomy have also

indicated male rodents demonstrate impaired performance in the inhibitory

avoidance, radial arm maze, T-maze and social memory tasks, which were restored

after testosterone administration (Frye, Seliga 2001; Vazquez-Pereyra et al. 1995).

However, these studies mainly investigate the effects of acute

testosterone or synthetic analogues administration. Further, the few publications that

focus the effects of long-term chronic treatment have shown controversial results:

high dose administration of nandrolone decanoate daily for 6 weeks impaired

memory in an olfactory social memory task in rats (Kouvelas et al. 2008);

administration of nandrolone decanoate (10 or 50 mg/rat weekly, for 8 weeks) did not

affect the acquisition of lever-pressing behavior nor extinction in gonadally intact and

gonadectomized male Wistar rats (Minkin, Meyer, van Haaren 1993); and the

treatment with an AAS combination (testosterone cypionate, nandrolone decanoate,

plus boldenone undecylenate), methandrostenolone to Long-Evans rats for 10

weeks, had no effects on performance of the animals in a water maze task (Clark,

Mitre, Brinck-Johnsen 1995).

In spite of the mechanisms underlying the potential cognitive effects of

AAS are still unknown, it has been demonstrated that chronic administration of the

AAS nandrolone modify the glutamatergic (Rossbach et al. 2007), GABAergic (Clark

et al. 2006), dopaminergic (Kurling et al. 2005; Kindlundh et al. 2004; Thiblin 1999)

and serotonergic (Kurling et al. 2005; Thiblin 1999) systems. Conversely, beneficial

effects of prolonged testosterone treatment on neuronal function have also been

reported (Goudsmit, Fliers, Swab 1988), although this neuronal effect did not result in

behavioral improvement in senescent rats (Goudsmit, van de Poll, Swab 1990).

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In order to increase the knowledge about the cognitive effects of abuse-

like AAS treatment, the present study aimed to investigate the influence of acute and

chronic administration of a supraphysiological dose of testosterone propionate (TP)

in memory and anxiety of male rats. Studies with chronic treatment should be

particularly important considering the pattern of use of these substances by human

self-administration (abuse condition).

Materials and Methods

Subjects and general procedures

Three-month-old male Wistar rats (300–350g), obtained from our own

colony were housed individually in plastic cages (30x19x13cm, length x width x high)

under 12:12 dark/light cycle (lights on at 07:00) and conditions of temperature (24 ±

1°C), humidity and luminosity controlled and food and water available throughout the

experiment. Before the beginning of the experimental procedures, all animals were

handled to 10 min once a day, for seven days.

Treatment

The animals were randomly assigned to one of the following groups:

Testosterone group – intramuscular injections of 10 mg/kg testosterone propionate

(TP - Androgenol®, Herpate Calier, Brazil) diluted in vegetable oil; and Control group

– i.m. injections of sesame oil (Vehicle – VEH). Since 1 mg/kg is sufficient to restore

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endocrine function and reproductive behaviors in gonadectomized male rats [36], the

dosage used in this experiment is considered a supraphysiological dosage.

Behavioral task

Plus-maze discriminative avoidance (PM-DAT) task

The apparatus employed is a modified elevated plus-maze, made of wood,

containing two enclosed arms (50x15x40cm) opposite to two open arms (50x15cm).

A 100W lamp was placed over one of the enclosed arms (aversive enclosed arm).

Light intensity was controlled throughout the behavioral sessions (09 lx). Training and

test sessions were at the same room, wherein each wall in front of the open arms of

PM-DAT had different extra-maze visual cues (door, window, cupboard and

observer) that rats could use to distinguish the location of the different arms of the

maze. Each animal was placed in the central platform, with the head turned to one of

the open arms. During the training session (acquisition), each time the rat entered

with the 4 paws in the aversive enclosed arm, the aversive stimuli (100-W light and

an 80 dB noise produced by a small machine) were turned on. The stimuli were then

turned off when the animal left this arm. After 24 hours, in the test session

(extinction), each animal was again placed in the center of apparatus to free

exploration, without receiving any aversive stimulation. Both sessions last 10

minutes. In all sessions, the animals were previously identified and observed in a

random order and in a blind manner, and after each behavioral session the

apparatus was cleaned with a dry cloth and 5% alcohol solution. The behaviors

assessed were: entries on the open and enclosed arms (total number), time spent in

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the aversive, non-aversive and open arms. These data were scored during both

sessions. Learning was evaluated by the decrease in percent time spent in the

aversive enclosed arm throughout the training session (time spent in the aversive

enclosed arm/time spent in the both enclosed arms). Memory was evaluated by the

percent time spent in the aversive enclosed arm during the test session (time spent

in aversive enclosed arm/time spent in both enclosed arms). Additionally, the training

session was divided in three blocks: beginning (first 3 min, block I), middle (4–7 min,

block II) and ending (last 3 min, block III). Anxiety-like behavior was evaluated by the

percent time spent in the open arms (time spent in open arms/time spent in both

open arms and enclosed arms) of apparatus. Total number of entries in any of the

arms (an entry was defined as the entry of all four paws into one arm) was used to

evaluate motor activity.

Experimental design

Experiment I – Effects of chronic administration of testosterone

Rats received intramuscular injections of sesame oil (VEH; n=7) or 10

mg/kg testosterone propionate (TP; n=8) every other day for 40 days (20 injections).

The first injection day of the Experiment I, was considered day 1.

On day 40 (24h after the last injection) rats were submitted to the training

session of the PM-DAT task. After 24h (on day 41), rats were exposed to the test

session.

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Experiment II – Effects of acute administration of testosterone

Each animal received a single intramuscular injections of sesame oil

(VEH; n=5) or injections of 10 mg/kg testosterone propionate (TP; n=5). Sixty

minutes after the single administration, rats were individually placed in this central

space in a modified elevated plus-maze for training session (10 min). Twenty-four

hours after the training session, rats were individually replaced in plus-maze for test

session (10 min).

Ethical statement

The authors declare that all experiments reported in this article received

formal approval of the local ethical committee (CEUA-UFRN, protocol 024/2009), and

were performed in accordance with the law of use of animals in scientific research

(Brazilian law number 11.794). The procedures followed were in accordance with the

standards set forth in the Brazilian Guide for the Care and Use of Laboratory

Animals. All efforts were made to minimize pain, suffering or discomfort, as well as

the number of animals used.

Statistical Analyses

Data are presented as mean ± standard error (S.E.M). Data from

behavioral tests were analyzed using independent Student´s t-test, paired samples t-

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test or two-way ANOVA, when necessary. SPSS 18 for Windows software was used

to perform the statistical analysis. A value of p<0.05 was considered significant

statistically for all comparisons made.

Results

Experiment I – Effects of chronic TP treatment

The effect of TP in the modified elevated plus-maze was verified after 40

days of systemic exposure. No statistically significant differences were found for

distance travelled (locomotor activity) in training session (t(13)=0.522; p=0.610; Fig.

1A) but the distance travelled by TP group was significantly higher than that present

by control animals (t(13)=2.725; p=0.017; Fig. 1B) in the test session.

In the training session, two-way ANOVA with repeated measures revealed

a time (blocks of session) effect [F(2,26)=5.042; p=0.014)] and treatment effect

[F(1,13)=5.506; p=0.035)] but no time x treatment interaction [F(2,26)=1.428;

p=0.258)] for percent time spent in the aversive enclosed arm, suggesting that

learning of the task was similar for both groups (Fig. 2A). In the test session, two-

tailed t-test for independent samples revealed that TP animals spend more time in

aversive enclosed arm (%TAV) than that presented by the control group

(t(13)=2.306; p=0.038; Fig. 2B), suggesting worse retention of the task by animals

treated with TP.

No differences were found in the percent time spent in open arms (%TO)

in both sessions (Fig. 3A and 3B).

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Experiment II – Effects of acute TP treatment

No changes in locomotor activity were found in both sessions [training

session – (p=0.357; Fig. 4A) and test session – (p=0.618; Fig. 4B)].

In the training session, two-way ANOVA with repeated measures revealed

a time (blocks of session) effect [F(2,16)=12.007; p=0.001)] but no treatment effect

[F(1,8)=6.745; p=0.554] or time x treatment interaction [F(2,16)=0.682; p=0.520] for

percent time spent in the aversive enclosed arm, suggesting that learning of the task

was similar for both groups (Fig. 5A). In the test session, two-tailed t-test for

independent samples showed no differences in percent time spent in aversive

enclosed arm (%TAV) when comparing the groups (p=0.206; Fig. 5B).

No differences were found in percent time spent in open arms (%TO) in

both sessions [Training session – (p=0.930; Fig. 6A) and Test session – (p=0.695;

Fig. 6B)].

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Figure 1. Effects of 10 mg/kg of testosterone propionate (TP) or sesame oil, vehicle (VEH) for 42 days on locomotor activity in discriminative avoidance task. Data are expressed as the mean ± S.E.M. (A) Training session; (B) Test session (*p < 0.05 compared to VEH; independent samples t-test).

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Figure 2. Effects of 10 mg/kg of testosterone propionate (TP) or sesame oil, vehicle (VEH) for 42 days in discriminative avoidance task. Data are expressed as the mean ± S.E.M for percent time spent in the aversive enclosed arm (%TAV) in three blocks of Training session (A) and for the whole Test session (B) (*p < 0.05 compared to VEH; independent samples t-test).

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Figure 3. Effects of 10 mg/kg of testosterone propionate (TP) or sesame oil, vehicle (VEH) for 42 days in discriminative avoidance task. Data are expressed as the mean ± S.E.M for percent time spent in the open arm (%TO) in (A) Training and (B) Test sessions (*p < 0.05 compared to VEH; independent samples t-test).

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Figure 4. Effects of a single injection of 10 mg/kg of testosterone propionate (TP) or sesame oil, vehicle (VEH) on locomotor activity in discriminative avoidance task. Data are expressed as the mean ± S.E.M. (A) Training session; (B) Test session (*p < 0.05 compared to VEH; independent samples t-test).

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Figure 5. Effects of a single injection of 10 mg/kg of testosterone propionate (TP) or sesame oil, vehicle (VEH) in discriminative avoidance task. Data are expressed as the mean ± S.E.M for percent time spent in the aversive enclosed arm (%TAV) in (A) Training and (B) Test sessions (*p < 0.05 compared to VEH; independent samples t-test).

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Figure 6. Effects of a single injection of 10 mg/kg of testosterone propionate (TP) or sesame oil, vehicle (VEH) in discriminative avoidance task. Data are expressed as the mean ± S.E.M for percent time spent in the open arm (%TO) in (A) Training and (B) Test sessions (*p < 0.05 compared to VEH; independent samples t-test).

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Discussion

Aiming to investigate the effects of continuous exposure to high doses of

androgen steroids on learning, memory and anxiety, chronically and acutely

testosterone propionate (TP) – treated rats were tested in the plus-maze

discriminative avoidance task (PM-DAT). PM-DAT is a modified version of the

conventional elevated plus-maze, in which an aversive situation is presented in one

of the enclosed arms (aversive arm). This task has been validated for the

simultaneous evaluation of learning/memory and anxiety-like behavior, being the

measurements used to evaluate these parameters the discrimination between both

enclosed arms (aversive and non-aversive) and open-arm exploration (time spent in

the open arms of the apparatus), respectively. Then, rats are conditioned to choose

between two enclosed arms while avoiding the open arms of the apparatus (Ribeiro

et al. 2010; Silva, Frussa-Filho 2000).

The dosage and the duration of treatment used in this study were chosen

based on the amount used to simulate the abuse of AASs by humans (Bronson

1996). As mentioned, although the Anabolic Androgenic Steroids (AAS) were

developed for therapeutic purposes, they are now commonly used for illicit self-

administration at supra-physiological doses to improve performance and body image,

which is associated with untoward effects on brain and behavior. In this context, due

to the involvement of steroid hormones with several cognitive functions, the

prolonged use may promote impairment in these processes (Trenton, Currier 2005).

Previous studies, tested either in an activity chamber or an open-field,

have demonstrated no significant changes in locomotor activity in male rats and mice

following AAS administration (Clark, Henderson 2003). These data are consistent

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that we observed in three of the four situations tested in this experiment – training in

chronic treatment; and training and test in acute treatment. These findings reinforce

the hypothesis that AAS do not impair general locomotor activity. However, in test

session after chronic treatment, the distance travelled by TP group was higher than

control group. One study (Martinez-Sanchis, Aragon, Salvador 2002) showed

increased locomotor activity caused by AAS; however, in that study rats were treated

with both AAS and cocaine to assess the effects of interactions between these two

agents on activity. Testosterone alone had no effect on activity, although the activity-

promoting effects of cocaine (10 mg/kg) were enhanced by testosterone (2, 6, 10 and

14 mg/kg). The reasons for the discrepancies are not clear, but may relate to the

difference in the apparatus, type of AAS, and time course of AAS administration

(single exposure versus 30 days). Furthermore, the observed increase in locomotor

activity only in test session can also indicate a deficit in the habituation to the

apparatus since these animals showed a deficit in the retrieval. Thus, it would appear

that additional studies are needed to determine the effects of AAS on the locomotor

effects.

Our data showed that both treatments – chronic and acute – did not alter

the percent time spent in the open arms in in the plus-maze discriminative avoidance

task in both sessions – training and test, suggesting that AAS treatment had no

effects on anxiety-like behavior (Silva et al. 2013). The number of studies that have

evaluated the effects of AAS on anxiety-like behavior is limited and controversial. The

first study (Bitran, Kellog, Hilvers 1993) that investigated the effects of anabolic

steroids on anxiety revealed that rats treated for 06 days with testosterone

propionate displayed an increase in the exploration of the open arms of the elevated

plus-maze, a sign of reduced anxiety. However, in this same study, the behavior of

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rats exposed to testosterone propionate for 14 days did not differ from controls.

Further, Wistar rats that received a single injection of testosterone (5 mg/kg) 24-h

before testing on Vogel’s conflict test showed behavior consistent with an antianxiety

action of testosterone. Additionally, the effects for rats treated for 06 days occurred in

the absence of any changes in locomotor activity, suggesting a specific effect of the

treatment on anxiety-like behavior rather than a generalized effect on activity. On the

other hand, chronic exposure to high doses of nandrolone decanoate increased

anxiety-like behavior in adult male rats on the elevated plus-maze (Rocha et al.

2007) and in adult male mice, as assessed in both the open-field and elevated plus-

maze tests (Ambar, Chiavegatto 2009). The diversity of AAS effects on anxiety-like

behaviors in rodents is likely to reflect the interactions of age, sex, type(s) of AAS,

the regimen employed to administer them, type of experimental methodologies and

environmental context. For example, in our work rats were subjected to 40 days of

treatment, which differs from other works cited above. In this context, further studies

are needed to elucidate the AAS’s action on anxiety behavior.

The task used in this study, the PM-DAT, allows the evaluation of learning

of aversive arm avoidance by analyzing behavior throughout the training session

(Silva et al. 2004). In the present study, we found no difference in aversive arm

exploration across the training session between treated groups (both in chronic and

acute treatments), suggesting that all animals learned the task. on the other hand,

during the test session in Experiment I (chronic), we found that TP animals spend

more time in aversive enclosed arm (%TAV) than the animals in the control group

suggesting worse retention of the task by animals treated with TP. These findings are

consistent with previous studies that have shown the disrupting effects of a high dose

of nandrolone decanoate on spatial (Magnusson et al. 2009) and social memory in

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rats (Kouvelas et al. 2008). However, the effects of AAS on memory in avoidance

tasks are incipient. For example, acute (single injection following training) or chronic

(5 weeks) physiological levels of testosterone administration enhances cognitive

performance on the inhibitory avoidance task in adult male rats (Frye et al. 2010

Edinger, Lee, Frye 2004; Frye, Seliga 2001). Additionally, studies have showed that

a single intracerebral administration of several doses of testosterone caused a dose-

dependent impairment of spatial memory (Naghdi, Oryan, Etemadi 2003; Naghdi,

Nafisy, Majlessi 2001), as well as acquisition, consolidation and retrieval of inhibitory

avoidance memory (Harooni et al. 2008). In a previous study we have demonstrated

that chronic administration of testosterone propionate for 40 days resulted in

significant reductions of performance in the novel object recognition task, suggesting

deficit in recognition memory (Silva et al. 2013).

Similar to the endogenous compounds, studies have shown that high

doses of synthetic androgens (nandrolone: 15 mg/kg), when given in daily

subcutaneous injections for either 6 weeks (Kouvelas et al. 2008) or 14 days

(Magnusson et al. 2009) can also impair cognition. Therefore, as reflected by the

diversity of these results, it seems that the lack of consistency between androgens

effects on avoidance tasks might depend on different experimental paradigms that

might include class of androgens, dose, exposure duration, as well as route of

administration.

The underlying mechanisms that mediate AAS-induced impairments of

learning and memory are not clear. Previous studies have shown that AAS-induced

increases in BDNF, reduction of anxiety, memory impairment, and enhancement of

GABAergic transmission (Penatti, Porter, Henderson 2009; Kouvelas et al. 2008) are

mediated by a direct activation of central androgen receptors. Thus, our data suggest

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that the mechanisms involved in the AAS-induced cognitive deficits are probably

related to long-term mechanisms, since they occur only after prolonged treatments.

However, more studies are needed in order to elucidate the exact processes affected

by EAAs in the brain. .

Conclusion

In conclusion, data reported here extents the studies showing that chronic

AASs affect the cognitive functions in rats. Chronic or acute administrations of TP

were not sufficient to alter anxiety-like behavior; however, long-term exposure of TP

resulted in significant reductions of performance in plus-maze discriminative

avoidance task. Further research is needed to determinate the extent to which high

levels of androgens may influence different aspects of cognitive functions, as well as

the mechanisms underlying these effects.

Acknowledgments

This work was supported by fellowships from CNPQ, CAPES, FAPERN

and PROPESQ/UFRN.

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6 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Com o objetivo de mimetizar o abuso de esteroides anabólicos

androgênicos (EAA) em humanos, consideramos vários aspectos – dose

suprafisiológica, via de administração e cronicidade. Também, com o intuito de

evidenciar os efeitos do tratamento prolongado com esses esteroides também

investigamos comparativamente, o tratamento agudo. Utilizamos o propionato de

testosterona (PT) em uma dose (10mg/kg), aproximadamente, 10 vezes superior à

dose fisiológica e demonstramos que a administração crônica (40 dias),

intramuscular, desse esteroide é capaz de provocar prejuízos cognitivos. Em uma

tarefa de reconhecimento de objetos, observamos que os animais tratados

cronicamente apresentaram prejuízo no reconhecimento de objetos novos,

sugerindo que esses compostos interfiram na memória de reconhecimento. Já na

tarefa da esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado, apesar de não

observarmos déficits no aprendizado da tarefa, ficou claro que os animais tratados

cronicamente apresentaram déficit na evocação da memória uma vez que obtiveram

performances (permaneceram mais tempo nos braços aversivos) piores do que os

animais do grupo controle. É importante destacar que esses prejuízos encontrados

não foram observados nos animais submetidos ao tratamento agudo, reforçando a

hipótese de que o tratamento prolongado é o responsável pelas alterações.

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ANEXO – Relatório do Projeto de Ações Acadêmicas Associadas / Edital

PROGRAD/PROPESQ/PROEX nº 01/2011

1. Apresentação:

Os esteróides anabólicos androgênicos (EAA), mais conhecidos com o

nome de anabolizantes, são hormônios esteróides da classe dos hormônios sexuais

masculinos, os quais possuem dois efeitos principais sobre o corpo: efeitos

androgênicos e efeitos anabólicos. Os indivíduos que os utilizam visam

especialmente o ganho de massa muscular seja para aumento de desempenho

atlético ou para melhorar a imagem. Vários estudos apontam que o abuso de

anabolizantes é maior (ou vem crescendo) dentre os adolescentes e jovens. No

entanto, no Brasil ainda há uma escassez de estudos que verifiquem com maior

clareza essa problemática. Aliado a esse cenário de uso crescente soma-se a

facilidade na compra dessas substâncias ilegalmente e a desinformação dos danos

que o uso inadequado pode causar a saúde. Nesse sentido e tendo como temática a

hipótese de que ações educativas previnem ou até mesmo impedem a utilização dos

anabolizantes por jovens e adolescentes, o presente projeto propõe a integração

entre as informações teóricas oriundas do ambiente científico, representado por

professores e alunos de graduação e pós-graduação do Departamento de Fisiologia

da UFRN e as informações práticas obtidas, por meio de questionários, nas Escolas

de Ensino Médio da cidade do Natal/RN, representadas pelas informações

prestadas pelos alunos.

2. Atividades Realizadas

O projeto teve início com a seleção dos alunos que iriam integrar o

projeto. Foram selecionados dois alunos bolsistas e dois alunos voluntários, sendo

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dois três alunos do curso de Biomedicina da UFRN e um aluno do curso de

Farmácia da UFRN.

Após a pesquisa/revisão bibliográfica, definiu-se o questionário a ser

utilizado (adaptamos um questionário utilizado em um estudo anterior); fez-se um

teste piloto com esse questionário em duas escolas públicas na cidade de

Parnamirim (que não integra o rol de escolas do projeto). Após o teste piloto,

fizeram-se pequenas alterações no questionário até que se chegasse ao

questionário final.

O próximo passo foi definir as Escolas Estaduais que iriam integrar o

projeto. Inicialmente, foram pré-selecionadas 20 Escolas Estaduais. Entramos em

contato1 com todas as Escolas pré-selecionadas e destas 17 foram escolhidas,

levando-se em conta as que tivemos autorização dos gestores, facilidade de acesso,

dentre outros fatores. Das 17 selecionadas quatro estão na Zona Leste, quatro na

Zona Oeste, quatro na Zona Sul e cinco na Zona Norte, como pode ser visto abaixo:

a. Zona Leste: Colégio Estadual Atheneu, Escola Estadual Jeronimo

Gueiros, Escola Estadual Winston Churchill e Instituto Padre

Miguelinho;

b. Zona Oeste: Escola Estadual Jean Mermoz, Escola Estadual Raimundo

Soares, Escola Estadual Felizardo Moura e Escola Estadual Prof.

Francisco Ivo Cavalcanti;

c. Zona Sul: Escola Estadual Governador Walfredo Gurgel, Escola

Estadual Desembargador Floriano Cavalcanti, Escola Estadual

Professor Antônio Pinto de Medeiros e Escola Estadual Ferreira

Itajubá;

1 O primeiro contato era sempre realizado pessoalmente pelo aluno doutorando Fernando Roberto Ferreira Silva.

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d. Zona Norte: Escola Estadual Myriam Coeli, Escola Estadual Zila

Mamede, Escola Estadual Dom José Adelino Dantas, Escola

Estadual Professor Varela Barca e Escola Estadual Professor Ana

Júlia Mousinho.

O número de questionários foi decidido tendo como base o número de

alunos matriculados por Zona da cidade do Natal2. Desta forma, aplicaríamos

questionários que equivalessem a 10% dos alunos matriculados em cada Zona. No

entanto, devido a diversos contratempos (serão explicados mais adiante) não

conseguimos todos os questionários planejados. A relação do número de

questionários esperado e obtidos é a seguinte:

1. Zona Leste: 851 esperados e 435 obtidos;

2. Zona Oeste: 495 esperados e 372 obtidos;

3. Zona Sul: 546 esperados e 814 obtidos;

4. Zona Norte: 828 esperados e 814 obtidos;

5. Total: 2.720 esperados e 2.159 obtidos.

3. Resultados obtidos:

Como mencionado anteriormente, foram coletados dados de 2.159

questionários. A seguir segue relato sucinto dos dados estatísticos:

a. Com relação à série: 38% do 1º ano, 29,5% do 2º ano e 32,6% do 3º

ano do Ensino Médio;

b. Com relação ao sexo: 43,1% do sexo masculino e 56,9% do sexo

feminino;

2 Censo Escolar 2011.

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c. 54,2% afirmaram que praticam algum esporte ou se exercitam

regularmente (no mínimo duas vezes por semana);

d. 46,2% afirmaram que nunca frequentaram academia de ginástica e/ou

musculação, enquanto que 31,7% afirmaram que já frequentaram,

mas, no momento não estão frequentando, e 22% frequentam

regularmente;

e. Com relação ao uso do álcool: 72,8% afirmaram que não bebem,

14,2% que bebem raramente, 5,3% ocasionalmente, 7,1% apenas em

festas e nos finais de semana e 0,5% regularmente;

f. Com relação ao uso do cigarro: 97,2% afirmaram que não fumam,

1,2% fuma raramente, 0,3% ocasionalmente, 0,6% em festas e nos

fins de semanas e 0,7% regularmente;

g. 26,3% afirmaram que conhecem o nome de algum anabolizante, sendo

os mais citados: durateston, ADE e Decadurabolin;

h. 45,4% afirmaram que sabem com que finalidade os anabolizantes são

usados;

i. 51,3% afirmaram que conhecem alguém que já usou anabolizante;

j. 21,9% afirmaram que alguém já ofereceu anabolizante;

k. Com relação ao comércio de anabolizantes, apenas 18,3% sabem que

a compra só é permitida com receita médica;

l. 42% afirmaram que conhecem alguns dos efeitos indesejados do uso

de anabolizantes;

m.Apenas 1,2% afirmaram que já usaram anabolizantes, no entanto,

11,2% afirmaram que já pensaram em usar anabolizantes,

principalmente, com fins estéticos.

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Com relação a aspectos mais qualitativos dos resultados podemos

destacar:

Os contatos com os gestores, professores e alunos das Escolas foram

sempre excelentes, inclusive, em muitas delas, fomos informados que se

tratava do primeiro contato da Escola com algum projeto da UFRN, fato que

por si só reforça a importância de projetos como este;

Com relação a aplicação, em si, dos questionários, considerando que a

participação é voluntária, é importante ressaltar a ampla participação dos

alunos que estavam presentes no dia da aplicação.

4. Considerações Finais:

O projeto nos trouxe enorme satisfação em poder incluir alunos, Escolas

que estão quase sempre fora dos trabalhos realizados na UFRN. Além disso,

consideramos que existe sim uma relação objetiva entre as propostas, pois

propomos que os jovens (alunos do Ensino Médio) estão vulneráveis à utilização de

anabolizantes devido a tudo que envolve esse período da vida: autoafirmação,

preocupação com o corpo, dentre outros fatores. E, mais do que isso, considerando

os resultados obtidos, a temática mostrou-se adequada e ficou evidenciada a

necessidade de se trabalhar com profundidade temas dessa natureza com esse

público haja vista que a não informação ou a informação inadequada pode acarretar

diversos problemas à saúde dos alunos.