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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA
PPG – PSICOBIOLOGIA
FERNANDO ROBERTO FERREIRA SILVA
EFEITOS DOS ESTEROIDES ANABÓLICOS ANDROGÊNICOS SOBRE
FUNÇÕES COGNITIVAS DE RATOS
Natal – RN
2013
FERNANDO ROBERTO FERREIRA SILVA
EFEITOS DOS ESTEROIDES ANABÓLICOS ANDROGÊNICOS SOBRE
FUNÇÕES COGNITIVAS DE RATOS
Tese apresentada à Universidade Federal do Rio Grande do Norte como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Psicobiologia.Orientadora: Dra. Regina Helena da Silva
Natal – RN
2013
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Dedico esse trabalho aos meus pais que
sempre trabalharam muito para que
pudesse ter uma vida mais amena que a
deles.
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AGRADECIMENTOS
Certa vez ouvi de um colega que o momento de escrever os
agradecimentos havia sido um dos mais difíceis do trabalho e, sinceramente, só
quando se está nessa situação é que se entende realmente o que essa frase
representa. Apesar da redação da tese de doutorado ser um produto “individual”,
todo seu conteúdo é fruto de um trabalho coletivo da equipe de laboratório, apoio de
amigos e familiares e sem esse suporte, com certeza, esse momento não se
concretizaria. Consciente de que é impossível listar todos que de uma forma ou de
outra me acrescentaram conhecimentos e experiências essenciais a realização
desse trabalho, me coloco nessa difícil posição e irei tentar fazê-lo a partir de agora.
Inicialmente, preciso registrar meu enorme agradecimento a professora
Dra. Regina Helena da Silva, minha orientadora, que desde o primeiro e-mail que a
enviei sempre se mostrou de braços abertos, receptiva e que, ao longo desse
processo, revelou-se para mim como um exemplo de profissional, sempre
inteligente, criativa e, principalmente, ética na condução de sua profissão. Além
disso, como disse em uma homenagem no dia dos professores que fiz ano passado,
ela é uma inspiração para todos que com ela trabalham e convivem. Nesse
momento, também estendo meu agradecimento a professora Dra. Alessandra Mussi
Ribeiro, que com sua paixão e dedicação, foi fundamental na execução desse
trabalho bem como para minha formação.
A todos os colegas do Laboratório de Estudos da Memória (LEME) que de
alguma forma contribuíram para a execução desse trabalho, meu muito obrigado.
Em especial, externo meu profundo agradecimento a Aline, Paulinha, Ezequiel,
Priscila, Jéssica, Wanessa e André que de forma mais direta contribuíram para que
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este trabalho fosse realizado. Cabe também destacar o meu sincero agradecimento
a Alicia Cabral, dentre outros motivos, pela enorme paciência que ela teve comigo
nessa fase final, pelos conselhos, pelas palavras de apoio: muito obrigado!
As professoras Edda Lisboa Leite, Eliza Xavier e Dilma Ferreira, obrigado
pelo apoio, pelas orientações, conselhos e pelo carinho que sempre demonstraram
por mim. Serei sempre grato.
Aos meus grandes e velhos amigos da ETFRN, meu profundo
agradecimento pela torcida, pelo apoio nessa e em outras jornadas ao longo da
minha vida. Vocês sabem que são especiais para mim. Grande abraço e obrigado
pela amizade sincera e verdadeira.
Aos meus amigos biólogos (e os agregados), em especial: Lula, Pedro,
Kuka, Denis, Rafael, Ramona, Recy, Aretha, Lorena, Jaísa, Matheus, Danile. Mesmo
distantes da maioria de vocês, sei que sempre torceram e continuam torcendo por
mim. Muito obrigado!
A minha grande amiga e madrinha Sdena, muito obrigado pelo bom
humor constante e pela amizade. Sinto sua falta.
A minha grande amiga e madrinha Celina, você é irmãzinha que não tive.
É muito bom saber que posso contar com você. Obrigado por sempre estar presente
nos momentos mais importantes da minha vida.
Aos meus amigos, vizinhos e padrinhos, Felippe e Sângela. Obrigado
pela amizade, parceria e cumplicidade. Obrigado por tudo.
As minhas amigas Thasia, Marília e Yuly, muito obrigado pela torcida e
apoio incondicional.
Aos meus amigos ueceanos, obrigado pela compreensão, paciência e
apoio nos momentos que estive ausente.
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Agradeço também aos professores e funcionários da pós-graduação em
Psicobiologia da UFRN pelo apoio e pela estrutura para que esse trabalho fosse
desenvolvido, em especial aos professores Jeferson de Souza Cavalcante e Maria
Bernadete Cordeiro de Sousa por terem colaborado no momento do meu exame de
qualificação; e agradecer mais uma vez a professora Bernadete por ter se posto
disponível para participar de minha banca.
Agradeço também aos professores Geison de Souza Izídio (UFSC), Paula
Matias Soares (UECE) e Vanessa de Paula Soares Rachetti (UFRN) por terem
aceitado o convite para participar de minha banca. Meu muito obrigado!
Por fim, e não poderia ser diferente, agradeço a minha esposa, Fernanda,
por ter compreendido e entendido as minhas ausências, meu mau humor e por ter
apoiado e colaborado em tudo que foi possível. Você é o que de mais importante
existe em minha vida. Amo você!!!
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SUMÁRIO
1 APRESENTAÇÃO.................................................................................... 14
2 INTRODUÇÃO.......................................................................................... 20
2.1 HORMÔNIOS ESTEROIDES........................................................ 20
2.2 ESTERÓIDES ANABÓLICOS ANDROGÊNICOS (EAA).............. 27
2.2.1 Principais características e efeitos..................................... 27
2.2.2 Efeitos sobre o aprendizado e a memória......................... 34
3 OBJETIVO GERAL.................................................................................. 37
3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS......................................................... 37
4 ARTIGO 1 – The anabolic androgenic steroid testosterone propionate decreases recognition memory in adult male rats……………… 38
5 ARTIGO 2 – Effects of anabolic androgenic steroid testosterone propionate on memory, anxiety and motor behavior in rats tested in plus-maze discriminative avoidance task…………………………………………... 61
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS…...…………………………………………….. 86
REFERÊNCIAS………………………………………………………………..... 87
ANEXO – Relatório do Projeto de Ações Acadêmicas Associadas / Edital PROGRAD/PROPESQ/PROEX nº 01/2011................................................ 96
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LISTA DE FIGURAS
Figura 01: Esquema representando a biossíntese dos principais hormônios esteróides sexuais: progesterona, estradiol e testosterona.......................................................................... 21
Figura 02: Exemplos de esteroides anabolizantes das três classes: Propionato de testosterona (classe I), Estanozolol (classe III) e Nandrolona (classe II). 29
Figure 03: Efeitos da administração aguda (A, C e E) e crônica (B, D e F) de 10mg/kg de propionato de testosterona (PT) ou óleo de gergelim (Veículo, VEH) sobre a tarefa de reconhecimento de objetos novos. (A, B) Distância percorrida; (C, D) Percentual de tempo gasto na tarefa deexploração do objeto novo; (E, F) Tempo de exploração do objeto novo comparado ao objeto familiar. 50
Figura 04: Efeitos da administração de 10mg/kg de propionato de testosterona (PT) ou óleo de gergelim (Veículo, VEH) durante 42 dias na relação peso testicular/peso do corpo………...... 51
Figura 05: Efeitos da administração de 10mg/kg de propionato de testosterona (PT) ou óleo de gergelim (Veículo, VEH) durante 42 dias na atividade motora na tarefa de esquiva discriminativa. (A) Sessão Treino; (B) Sessão Teste………. 72
Figura 06: Efeitos da administração de 10mg/kg de propionato de testosterona (PT) ou óleo de gergelim (Veículo, VEH) durante 42 dias na tarefa de esquiva discriminativa.Percentual de tempo gasto no braço fechado aversivo (%TAV) na sessão Treino (A) e Teste (B)........................................................... 73
Figura 07: Efeitos da administração de 10mg/kg de propionato de testosterona (PT) ou óleo de gergelim (Veículo, VEH) durante 42 dias na tarefa de esquiva discriminativa.Percentual de tempo gasto nos braços abertos (%TO) na sessão Treino (A) e Teste (B)...................................................................... 74
Figura 08: Efeitos de uma injeção única de 10mg/kg de propionato de testosterona (PT) ou óleo de gergelim (Veículo, VEH) na atividade motora na tarefa de esquiva discriminativa. (A) Sessão Treino; (B) Sessão Teste......................................... 75
Figura 09: Efeitos de uma injeção única de 10mg/kg de propionato de testosterona (PT) ou óleo de gergelim (Veículo, VEH) na tarefa de esquiva discriminativa. Percentual de tempo gasto no braço fechado aversivo (%TAV) na sessão Treino 76
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(A) e Teste (B)......................................................................
Figura 10: Efeitos de uma injeção única de 10mg/kg de propionato de testosterona (PT) ou óleo de gergelim (Veículo, VEH) na tarefa de esquiva discriminativa. Percentual de tempo gasto nos braços abertos (%TO) na sessão Treino (A) e Teste (B)............................................................................... 77
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LISTA DE TABELAS
Tabela 01: Efeitos da administração de 10 mg/kg de propionato de testosterona (PT) ou óleo de gergelim (Veículo, VEH) na tarefa de alternação espontânea.......................................... 52
Tabela 02: Efeitos do propionato de testosterona (PT) em diferentes parâmetros bioquímicos do soro de ratos............................. 52
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ABREVIATURAS
5-HT1A subtipo do receptor de serotonina 5-HT (5-hydroxytryptamine)AAS Anabolic Androgenic SteroidsARN Ácido ribonucleicoCA1 região CA1 do hipocampoCA3 região CA3 do hipocampoCAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível SuperiorCEUA Comissão de Ética no Uso de Animais CNPQ Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e TecnológicoDHT 5-α-dihidrotestosterona EAA Esteroides Anabólicos AndrogênicosER Receptor de EstrógenoERH Elementos de resposta ao hormônioFAPERN Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado do Rio Grande do NorteFSH Hormônio folículo estimulanteGDX Gonadectomized- cirurgia para retirada das gônadas.GnRH Hormônio liberador de gonadotrofinaHDL Lipoproteína de alta densidade Hsp90 Proteína de choque térmicoLH Hormônio luteinizantemg miligramamg/kg miligramas por quilogramamg/kg/dia miligrama por quilograma por diamRNA messenger ribonucleic acid- RNA mensageiroNCAA National Collegiate Athletic Associationnmol/L nanomol por litroNOR novel obect recognitionPM-DAT Plus-maze discriminative avoidance taskPROPESQ Pró-reitoria de PesquisaPT Propionato de TestosteronaRA receptor androgênico RE receptor estrogênico SA alternação espontâneaSHBG Proteína ligante do hormônio sexual SNC Sistema Nervoso CentralTGP Transaminase glutâmica pirúvicaTP testosterone propionateUFRN Universidade Federal do Rio Grande do NorteVEH Vehicle
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RESUMO
A utilização e a busca por substâncias que aumentem a masculinidade, a força e a potência sexual não é recente. Com o tempo, essa busca auxiliou no direcionamento de pesquisas na área, levando a descoberta do principal hormônio masculino – a testosterona em meados da década de 30. A partir desse momento, inúmeros compostos foram sintetizados com o intuito de mimetizar os efeitos deste hormônio, aos quais hoje chamamos genericamente de Esteroides Anabólicos Androgênicos (EAA). A princípio, esses EAA foram sendo produzidos com propósitos terapêuticos. No entanto, iniciou-se o uso crescente desses compostos com outras finalidades, principalmente para a melhoria de desempenho em atletas. Além disso, estudos recentes têm demonstrado que os EAA estão sendo cada vez mais utilizados por não atletas, por indivíduos que não são atletas, mas, buscam um corpo esteticamente perfeito. Paralelamente, o crescente abuso dos EAA com finalidades não clínicas pode promover uma série de alterações fisiológicas nocivas, tais como problemas cardíacos, hepáticos, respiratórios e também psicológicos como alterações de humor, nos níveis de ansiedade e na agressividade. A exposição a doses suprafisiológicas de EAA está associada com alterações comportamentais, contudo, pouco se sabe sobre os efeitos dos EAAs sobre as funções cognitivas. Neste trabalho, mimetizamos o abuso de EAA em humanos através da administração intramuscular de uma dose suprafisiológica de propionato de testosterona (PT), em ratos, com o objetivo de investigar os efeitos desse tratamento sobre diferentes aspectos das funções cognitivas, especialmente aprendizado, memória e ansiedade. Ratos Wistar machos adultos foram submetidos aos testes de alternação espontânea, reconhecimento de objetos e esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado. O grupo controle recebeu injeções intramusculares de óleo vegetal (veículo); e o grupo testosterona recebeu injeções de PT (10 mg/kg, i.m.). As injeções foram administradas por 40 dias, com intervalos de 48 horas (tratamento crônico) ou em uma única injeção (tratamento agudo). Além das avaliações comportamentais, foram realizadas análises bioquímicas como indicadores dos efeitos endócrinos do tratamento. Nossos resultados mostram que o tratamento crônico com uma dose suprafisiológica de PT acarretou prejuízos na memória de reconhecimento de objetos novos e na evocação da tarefa da esquiva discriminativa. A memória espacial operacional (avaliada pelo teste de alternação espontânea) não foi afetada bem como não observamos alterações nos níveis de ansiedade. Em relação aos parâmetros bioquímicos avaliados, o tratamento crônico elevou os níveis séricos da transaminase glutâmica pirúvica (TGP), um indicador da presença de lesões hepáticas e pancreáticas (assim como as observadas após o uso crônico dessas substâncias em humanos). Por outro lado, o tratamento agudo com PT não promoveu alteração significativa em nenhum dos parâmetros avaliados, quando comparados ao grupo controle. Em síntese, podemos concluir que o tratamento crônico com uma dose suprafisiológica de testosterona produz déficits de memória de reconhecimento de objetos bem como prejuízos na memória na tarefa da esquiva discriminativa em ratos machos adultos.
Palavras-chave: anabolizantes; propionato de testosterona; memória de reconhecimento; esquiva discriminativa.
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ABSTRACT
The use and the demand for substances that enhance masculinity, strength and sexual power are not novel. Over the years, this search has assisted the research directions in this area, leading to the discovery of the primary male sex hormone –testosterone in 1935. Since then, numerous testosterone analogue compounds were synthesized, which are generically called Anabolic Androgenic Steroids (AAS). The AAS were produced for therapeutic purposes, but an increase in the use of these compounds for other purposes occurred over time. Initially they were used mainly to improve performance in athletes. However, recent studies have shown that the use of AAS by non-athletes with aesthetical purposes have been increasing as well. Theabuse of AAS with non-clinical purposes can promote a number of physiological alterations, such as heart, liver, respiratory and psychological problems such as changes in mood, levels of anxiety and aggression. Exposure to supraphysiological doses of AAS is associated with behavioral changes, however, little is known about the effects of AAS on cognitive functions. In this work, we aimed to mimic the AAS abuse in humans with intramuscular administration of a supraphysiological dose of testosterone propionate (TP) in rats. We investigated the effects of this treatment on different aspects of cognitive function, specifically learning, memory and anxiety. Adult male Wistar rats were tested in the spontaneous alternation, novel object recognition and plus-maze discriminative avoidance tasks. The control group received intramuscular injections of vegetable oil (vehicle), and the TP group received injections of TP (10 mg/kg, i.m.). The injections were administered for 40 days, with intervals of 48 hours (chronic treatment) or in a single injection (acute treatment). In addition to the behavioral assessments, we performed biochemical analyzes as indicators of the endocrine effects of the treatment. Our results show that chronic treatment with a supraphysiological dose of TP caused memory impairments in the novel object recognition and the discriminative avoidance tasks.The spatial working memory (evaluated by spontaneous alternation task) was not affected. Also, we did not observe changes in anxiety levels. Regarding the biochemical parameters, chronic treatment increased serum levels of glutamic-pyruvic transaminase, an indicator of hepatic and pancreatic lesions (as those observed after chronic use of these substances in humans). On the other hand, acute treatment with PT did not promote significant changes in any of these parameters when compared to the control group. In summary, we conclude that chronic treatment with a supraphysiological dose of testosterone propionate produces memory deficits in novel object recognition and retrieval of the discriminative avoidance task in adult male rats.
Keywords: anabolic steroids; testosterone propionate; recognition memory; discriminative avoidance task.
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1 APRESENTAÇÃO
A busca do ser humano pela fonte de força, coragem e para obtenção de
algum tipo de vantagem física é muito antiga. Há relatos que, na Antiguidade, os
órgãos sexuais e suas secreções eram utilizados como afrodisíacos e para o
tratamento da impotência, com a crença de que assim aumentariam a força e
coragem do homem. Do mesmo modo, há séculos se tem o conhecimento de que a
castração masculina resulta em perda da virilidade e de certas características como
a voz grave e o aparecimento de pelos. A Igreja Católica, por exemplo, praticava a
castração para preservar as vozes delicadas de meninos cantores (Catlin & Hatton
1990, Millar 1996).
Em meados do século XIX, o pesquisador alemão Arnold Berthold
realizou um experimento no qual observou a diminuição do tamanho da crista e
perda da função sexual após a retirada dos testículos de galos jovens; e observou
também que o reimplante dos testículos revertia essas alterações. Esses resultados
sugeriram que os testículos seriam responsáveis pela síntese de alguma substância
responsável por regular o desenvolvimento e a manutenção das características
masculinas. Corroborando esses achados, no fim desse mesmo século, o fisiologista
francês Charles Eduard Brown-Séquard experimentou uma terapia de
rejuvenescimento, administrando em si mesmo, injeções de um extrato líquido
derivado de testículos de cães e porcos da índia. Como resultado, relatou um
aumento da sua energia intelectual, força física e retardo no envelhecimento. Após o
relato de Brown-Séquard, o interesse dos pesquisadores em estudar essa
substância estimulou muitas pesquisas até aproximadamente 1930. No entanto, nos
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dias de hoje, seus resultados têm sido atribuídos ao efeito placebo (Hoberman &
Yesalis 1995).
No início da década de 1930, Charles Kochakian, um dos mais
importantes cientistas na pesquisa hormonal, sendo considerado o pai dos
esteroides anabólicos androgênicos (EAA) demonstrou que o hormônio extraído da
urina de machos estimulava a retenção de nitrogênio no organismo de cães
castrados. Essa maior retenção é um indicativo da utilização de proteínas para fins
de hipertrofia muscular, estabelecendo, assim a propriedade anabólica da
testosterona. Assim com os estudos de Kochakian, muitos outros surgiram, o que
tornou o tema muito popular fazendo com que a indústria farmacêutica buscasse o
isolamento desse composto testicular (Ghaphery 1995).
Em 1931, Adolf Frederick Butenandt descreveu o isolamento do
androsterona, hormônio análogo a testosterona que foi sintetizado, em 1934, por
Leopold Ruzicka. Apesar da descoberta desse composto, notava-se que os
testículos produziam outro composto ainda mais importante. As pesquisas
prosseguiram até que em 1935, na Holanda, o grupo de pesquisa do Ernst Laqueur
isolou a testosterona. Ainda em 1935, os grupos de pesquisa do Butenandt e do
Ruzicka descobriram, em pesquisas independentes, como realizar a síntese de
testosterona sintética e enviaram os respectivos artigos para publicação com apenas
uma semana de diferença, o que lhes renderam a atribuição para o Prêmio Nobel de
Química em 1939 (Hoberman & Yesalis 1995).
A 2ª Guerra Mundial foi o momento histórico onde houve um primeiro uso
maciço dos EAA, quando foram incorporados como material de suplemento das
tropas americanas e foram utilizados no tratamento dos sobreviventes em condições
debilitantes, em casos de traumatismo, queimaduras, depressão e visando a
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recuperação pós-cirúrgica. Simultaneamente, cientistas alemães produziram uma
série de EAA que foram utilizados pelo exército alemão com dois objetivos:
recuperar os níveis de nitrogênio em prisioneiros que teriam sido obrigados a ficar
dias sem se alimentar; e aumentar a agressividade dos soldados alemães. Um artigo
publicado após o declínio da antiga República Democrática da Alemanha (Alemanha
Oriental), em 1990, descreveu um programa secreto do governo que estimulava o
uso de drogas, principalmente os EAA, para o uso bélico dessas substâncias bem
como para proporcionar aumento no desempenho esportivo (Hoberman & Yesalis
1995, Ghaphery 1995, Gallaway 1997).
No campo esportivo, a década de 50 foi marcada pelo uso de EAA por
atletas russos e europeus em competições de levantamento de peso, fato que
converge para o primeiro relato do uso de EAA em competições esportivas:
campeonato mundial de levantamento de peso em 1954 em Viena/Áustria. O
domínio russo nessa competição despertou o interesse de cientistas americanos que
culminou, em 1956, na criação da metandrostenolona (Dianabol®), surgiu daí o
esteroide oral mais popular entre os levantadores de peso e o mundo desportivo
mudou para sempre (Wade 1972).
Nas Olimpíadas de Tóquio (1964), estes compostos foram largamente
utilizados em diversas modalidades; na Cidade do México (1968) há os primeiros
relatos de uso de EAA entre atletas alemãs; em 1972, nas Olímpiadas de Munique a
Alemanha esteve junto dos Estados Unidos e da União Soviética no ranking de
medalhas (De Rose & Nóbrega 1999). Na década de 80, foi relatado que um em
cada cinco atletas da primeira divisão da NCAA (National Collegiate Athletic
Association) já tinha utilizado anabolizantes em algum momento de sua carreira
(Dezelsky et al. 1989).
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O mais famoso caso de uso de EAA foi o do corredor canadense Ben
Johnson, medalha de ouro nas Olimpíadas de Seul (1988) nos 100m rasos, cujo
exame apresentou metabólitos do anabolizante estanozolol o que culminou na
devolução da medalha olímpica (Yoshida et al. 1994). O uso não controlado dessas
substâncias foi aumentando até que em 1990 os Estados Unidos aprovou a Lei
Federal de Controle de Anabólicos, que tornou crime tanto a posse quanto a
distribuição de anabolizantes para fins não médicos (DuRant et al. 1993). No Brasil,
a posse e distribuição não são caracterizadas como crime, no entanto, a lei nº
9.965/00 (BRASIL 2000) restringe a utilização desses compostos por humanos, com
a retenção de receita médica emitida por médico ou dentista. A não observância
desse requisito enquadra-se como infração sanitária, estando o infrator sujeito a
processos e penalidades previstas na lei nº 6.437/77 (BRASIL 1977).
Nas últimas décadas o uso não terapêutico de EAA tem se elevado em
todo o mundo, e não apenas entre os atletas de alto rendimento, o que tem gerado
uma enorme preocupação em relação ao abuso desses compostos dentro e fora dos
esportes. Isso devido a esta classe de compostos aliarem melhora no desempenho
esportivo com a exaltação ao corpo perfeito, estimulado, sobretudo, pelos meios de
comunicação em massa.
Um estudo epidemiológico mostrou que pode haver mais de 1,5 milhão de
pessoas que abusam de hormônios anabolizantes dentro de academias nos Estados
Unidos, com finalidade de melhora não só do desempenho atlético, mas também de
melhora na imagem corporal (Kanayama et al. 2001). No Brasil não temos muitos
estudos acerca do perfil do usuário dessas substâncias, mas acredita-se que o
consumidor preferencial está na faixa etária dos 18 a 34 anos e seja do sexo
masculino.
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Nas últimas décadas, a utilização de hormônios esteroides para
finalidades não terapêuticas vem se tornando algo corriqueiro entre adolescentes,
jovens e atletas brasileiros. Essa prática acarreta uma série de danos fisiológicos e
psicológicos aos usuários, fato que vem despertando a atenção de muitos
pesquisadores para o tema. Vários desses efeitos prejudiciais à saúde já são bem
estudados e conhecidos, contudo os estudos sobre os efeitos sobre o SNC ainda
são incipientes, principalmente em relação aos efeitos sobre a aprendizagem e a
memória.
Estudos de suplementação hormonal utilizando doses fisiológicas ou
moderadamente suprafisiológicas de EAA demonstram que esses compostos foram
capazes de promover alterações cognitivas em ratos, com diferentes resultados
dependendo da dose, da duração do tratamento e do teste utilizado. Mostram
também que outras alterações comportamentais podem ocorrer com o uso de EAA,
e tais alterações podem comprometer aspectos cognitivos indiretamente. Porém, em
sua maioria, estes estudos não abordam os efeitos causados com a utilização dos
EAA em regime de abuso, que é caracterizado pela cronicidade da administração
associada com as doses suprafisiológicas.
Assim, considerando que o estudo acerca desses compostos é um tema
bastante relevante na pesquisa científica brasileira, que a literatura sobre o assunto
é escassa e em certos aspectos até contraditória, este estudo foi desenhado na
tentativa de investigar a ação de hormônios anabolizantes sobre a aprendizagem e
memória de roedores, com avaliação concomitante de outros aspectos
comportamentais como os níveis de ansiedade e a atividade motora.
Paralelamente, ao longo do desenvolvimento deste trabalho experimental,
me deparei com a escassez de informações acerca do abuso de EAA no Brasil, bem
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como o baixo acesso a informações sobre esses compostos por adolescentes (um
crescente público alvo do abuso de EAA). Esses fatos me motivaram a realizar o
projeto intitulado “Esteroide anabolizante: da Universidade à Escola”, em resposta a
um edital de ações acadêmicas associadas promovido pela UFRN. Embora não faça
parte do trabalho experimental da tese, acrescentei, a título informativo, os principais
resultados dessa iniciativa (ANEXO 1) por considerar parte importante na minha
formação bem como o trabalho de extensão ser um retorno para a sociedade.
20
2 INTRODUÇÃO
2.1 HORMÔNIOS ESTEROIDES
Hormônio pode ser definido como uma substância química secretada em
pequenas quantidades na circulação sanguínea produzindo uma resposta fisiológica
nos tecidos-alvos. Os hormônios são divididos, quimicamente, em aminas, proteínas,
peptídeos e esteroides (Costanzo 1999). Os hormônios esteroides são produzidos,
principalmente, pelas gônadas (ovários e testículos), pelo córtex da suprarrenal e
pela placenta. Entretanto, alguns esteroides são sintetizados no sistema nervoso
central e periférico, tais como a pregnenolona, a desidroepiandrosterona (DHEA) e
seus ésteres sulfatados, sendo chamados, portanto, de neuroesteroides (Baulieu
1998). A síntese dos hormônios esteroides ocorre a partir do colesterol sendo este
obtido da dieta ou por síntese endógena no fígado e no intestino delgado. A síntese
endógena ocorre no citoplasma e no retículo endoplasmático e todos os carbonos da
molécula do colesterol são provenientes da acetil-CoA. A distinção dos tipos de
esteroides ocorre com a incorporação ou não de um ou mais átomos de carbono ao
núcleo básico (quatro anéis hidratados compostos por dezessete átomos de
carbono) e sua classificação se dá de acordo com os radicais ligados ao carbono 17
(C17) (Voet & Voet 2006, para revisão ver Janowski 2006).
Na figura a seguir (Figura 01) tem-se a principal rota metabólica para a
síntese da testosterona. A biossíntese da testosterona pode ser resumida em 04
etapas: (1) inicia-se com a molécula do colesterol que tem sua cadeia lateral clivada
pela enzima colesterol demolase para originar a pregnenolona; (2) esta, por sua vez,
pode ser metabolizada pelas enzimas 3-β-hidroxiesteroide desidrogenase e ∆4,5-
21
isomerase originando a progesterona; (3) a progesterona, após uma sequência de
três reações (17 α-hidroxilase, 17-20 desmolase e 17-β-HSD), transforma-se em
testosterona; e, por fim, (4) a testosterona formada pode ser convertida em estradiol
pela ação da enzima aromatase.
Fonte: Adaptado de Marques (2003).
Figura 1. Esquema representando a biossíntese dos principais hormônios esteroides sexuais: progesterona, estradiol e testosterona.
Os hormônios esteroides nos mamíferos são classificados em cinco
categorias: glicocorticoides, mineralocorticoides, estrogênios, progestogênios e
androgênios (De Matos 2008). As três últimas categorias compreendem os
chamados hormônios sexuais ou gonadais. Os estrogênios e progestogênios são os
22
chamados “hormônios femininos”, que são principalmente sintetizados e liberados
pelos ovários, atuando durante o ciclo menstrual, na manutenção da gravidez e no
desenvolvimento das características sexuais secundárias femininas (aparecimento
de mamas, aumento do tecido adiposo, dentre outras). Já a categoria dos
androgênios, ou “hormônios masculinos”, tem como seu principal representante a
testosterona que é liberada principalmente pelos testículos e desempenha papel
importante no comportamento reprodutivo masculino, na agressão e no
desenvolvimento das características sexuais masculinas (aumento de massa
muscular, modificação no timbre da voz, surgimento de pelos, dentre outras) (Lee &
McEwen 2001, Galea et al. 2006). Além da testosterona destacam-se três outras
formas principais de androgênios circulantes: diidrotestosterona (DHT),
androstenediona e desidroepiandrosterona (DHEA) (Handa, Price 2000).
Os esteroides androgênicos atuam como fatores de transcrição sendo
transportados na corrente sanguínea por moléculas carreadoras para os tecidos
alvos. São moléculas lipofílicas, que atravessam facilmente a membrana plasmática
(Stoffel-Wagner 2001). Na célula-alvo, a sua ação pode ser genômica ou não
genômica. Em sua ação genômica, atuam sobre receptores intracelulares
citosólicos, que se encontram estabilizados pelas proteínas do choque térmico
nomeadas de Hsp90. Uma vez formado o complexo hormônio-receptor, as hsp90 se
desligam do receptor e o complexo se desloca para o núcleo. No núcleo, o complexo
se liga ao DNA nuclear em uma região específica denominada elementos de
resposta ao hormônio (ERH). Esta interação promove a transcrição ou a repressão
de certos genes e, portanto induzem ou bloqueiam a produção de proteínas
(Roskoski 1997, Enmark & Gustafsson 1999). Ações genômicas requerem um
período superior a 30 minutos para serem efetivas (geralmente de horas a dias) e
23
são consideradas as ações clássicas dos hormônios esteroides (Aloisi & Bonifazi
2006). Já as ações não-genômicas são mais rápidas (de milissegundos a minutos) e
foram descritas a partir da descoberta de receptores para esses hormônios
localizados na membrana celular. A classificação e definição dessas ações são
ainda bastante deficientes tendo em vista os dados incompletos acerca da base
molecular para explicar tais ações (Wehling 1997). Contudo, as ações não-
genômicas podem ser assim caracterizadas: ações que são rápidas demais para
serem compatíveis com a síntese proteica e de RNA; ações que não são alteradas
na presença de inibidores de síntese proteica e de RNA; ações que ocorrem quando
se utiliza hormônios ligados a moléculas impermeáveis a membrana; e ações que os
hormônios induzem em células com cromatina altamente compactada (Simoncini &
Genazzani 2003). Alguns exemplos são os receptores de membrana acoplados a
canais iônicos ou segundos mensageiros (como a proteína G, quinases ou
nucleotídeos cíclicos) ou interação alostérica dos próprios receptores (Rupprecht &
Holsboer 1999).
Conforme já comentado, a testosterona é o principal hormônio
androgênico, possui 19 carbonos e é sintetizado a partir do colesterol. Em homens
adultos, é o androgênio circulante mais abundante no corpo, sendo principalmente
produzido nas células de Leydig dos testículos. Entretanto, aproximadamente 5% de
sua produção ocorrem nas glândulas adrenais. Um homem adulto produz em média
7mg de testosterona por dia, com níveis circulantes que variam de 10 a 35 nmol/L.
Estes níveis plasmáticos são bem maiores do que os encontrados em mulheres (Wu
1992).
A produção e secreção da testosterona em indivíduos do sexo masculino
são reguladas por um complexo sistema de retroalimentação do eixo hipotálamo-
24
hipófise-gonadal. O hipotálamo sintetiza e secreta o hormônio liberador de
gonadotrofina (GnRH), que por sua vez estimula a produção e liberação do
hormônio luteinizante (LH) e do hormônio folículo estimulante (FSH) da hipófise
anterior (Haymond & Gronowski 2006). O LH atua nas células de Leydig estimulando
a síntese e secreção de testosterona e o FSH atua nas células de Sertoli
estimulando a espermatogênese bem como a produção e secreção do hormônio
inibina (Haymond & Gronowski, 2006). Androgênios circulantes regulam a secreção
de gonadotrofinas através de retroalimentação negativa no hipotálamo e na hipófise
anterior. Por exemplo, se os níveis de testosterona estiverem elevados, há uma
sinalização para o hipotálamo inibir a secreção do LH e FSH. Esta retroalimentação
diminui a produção de testosterona (Haymond & Gronowski, 2006).
Cerca de 40% da testosterona circulante está ligada a uma proteína
plasmática denominada proteína ligante do hormônio sexual (SHBG), 2 a 3% estão
livres e o restante está associado à albumina ou outras proteínas plasmáticas
(Hardman et al. 1996). A testosterona quando firmemente ligada à SHBG não é
biologicamente ativa, restando apenas a testosterona livre ou as fracamente ligadas
disponíveis para ação nos tecidos (Pardridge 1986).
Existem duas vias principais para o metabolismo periférico da
testosterona sendo o fígado o principal sítio para inativação dos androgênios
(Mooradian et al. 1987). A meia-vida da testosterona livre é de cerca de 10-21
minutos sendo inativada no fígado pela conversão em androstenediona e 90% de
seus metabólitos são excretados na urina (Rang, Dale & Ritter 1997). Por esse
motivo, a urina tem sido o principal meio para análise do uso de esteroides em
atletas.
25
A testosterona circulante também é metabolizada irreversivelmente em
tecidos alvos em metabólitos biologicamente mais potentes como a DHT (por meio
da ação da enzima 5-α-redutase) e o estradiol, via aromatase (Haymond &
Gronowski 2006). Aproximadamente 0,3 mg/dia de testosterona são convertidas em
DHT nas células-alvo (Smith et al. 1985). Aproximadamente 85% do estradiol
circulante em machos são provenientes da aromatização da testosterona
(MacDonald et al. 1979).
A testosterona circulante exerce seus efeitos, diretos e indiretos, em
diferentes tecidos do corpo. Ela pode atuar diretamente no rim, músculo cardíaco e
esquelético, bem como nos órgãos reprodutivos, através da ligação com o receptor
androgênico (RA) (Mooradian et al. 1987). Esse hormônio pode exercer seus efeitos
indiretos em tecidos periféricos pela ação de um de seus metabólitos ativos. Por
exemplo, a DHT pode atuar na pele, folículos pilosos e na próstata (Haymond &
Gronowski 2006, Mooradian et al. 1987). Embora a testosterona e a DHT liguem-se
aos mesmos receptores androgênicos, a DHT liga-se com maior afinidade do que a
testosterona (Mooradian et al. 1987).
A aromatização periférica da testosterona em estradiol pode ocorrer no
tecido adiposo, tecido ósseo e em diferentes regiões do cérebro, de maneira que a
testosterona pode exercer seus efeitos também indiretamente, através dos
receptores estrogênicos (RE) (MacLusky et al. 1985). Desta forma, evidencia-se que
a testosterona, por si só, é um hormônio importante desempenhando uma série de
funções, mas também atua como pró-hormônio circulante para diversos outros
tecidos específicos que possuem as enzimas conversoras (5α-redutase e
aromatase) (Wu 1997).
26
Receptores androgênicos e estrogênicos são amplamente distribuídos no
cérebro. A aromatização da testosterona em estrógeno ocorre em diferentes regiões
do cérebro como na amígdala, hipocampo e hipotálamo (McEwen 1980, Janowski
2006). Assim, os receptores para hormônios esteroides são encontrados em
diversas regiões do cérebro: amígdala, hipocampo, córtex cerebral, medula espinhal,
cerebelo (Merchenthaler et al. 2004, Mitra et al. 2003, Ozawa 2005). Além dessa
ampla distribuição no SNC, os receptores para hormônios esteroides são
encontrados por todo o corpo como pele, musculo esquelético, órgãos reprodutivos,
fígado, coração e rins.
Os efeitos desses hormônios variariam de acordo com o tipo de receptor
presente, bem como o tipo de enzima encontrada em cada célula-alvo. Estudos
recentes relataram que os hormônios gonadais regulam a neurogênese não apenas
durante o desenvolvimento, mas, também na vida adulta. Por exemplo, Galea (2008)
verificou que os hormônios gonadais podem modular a neurogênese no hipocampo
em roedores adultos machos e fêmeas diferentemente. Este processo de
neurogênese foi também observado na amígdala e em outras regiões cerebrais
(Fowler et al. 2008). Consequentemente, qualquer evento que altere os níveis
fisiológicos dos hormônios esteroides no organismo pode provocar prejuízos em
funções cerebrais e de desenvolvimento.
27
2.2 ESTEROIDES ANABÓLICOS ANDROGÊNICOS (EAA)
2.2.1 Principais características e efeitos
Os esteroides anabólicos androgênicos (EAA) são hormônios esteroides
da classe dos hormônios sexuais masculinos, os quais possuem dois efeitos
principais sobre o corpo: efeitos androgênicos e efeitos anabólicos. Os efeitos
androgênicos referem-se às características sexuais masculinas (incluindo o trato
genital, as características sexuais secundárias, a espermatogênese e a fertilidade)
(Handelsman 2001). Já os efeitos anabólicos estão relacionados ao crescimento e
manutenção dos músculos do corpo, na massa e densidade óssea bem como na
produção de hemácias, uma vez que aumentam os níveis de eritropoietina (Shahidi,
2001, Basaria et al. 2001). Contudo, estas substâncias possuem também ações
biológicas que não são nem androgênicas nem anabólicas, tais como as sobre o
SNC.
Por causa do metabolismo hepático de primeira passagem, a testosterona
propriamente dita quando administrada via oral é rapidamente degradada no fígado
e os níveis plasmáticos permanecem baixos, não estando fisiologicamente ativa
(Bagatell & Bremner 1996, Wilson 1988). Dessa forma, várias tentativas foram
realizadas para se encontrar um esteroide com atividade prolongada (Shahidi 2001),
por exemplo, diminuindo a taxa de absorção e evitando a degradação rápida no
organismo (Wu 1992). No entanto, a testosterona pode ser alquilada na posição 17-
hidroxi, dando origem aos andrógenos que são mais resistentes ao metabolismo
hepático. Muitos destes compostos são suficientemente resistentes à degradação,
podendo ser administrados por via oral, e formam a base para muitos esquemas
28
utilizados pelos atletas e construtores do corpo. Em geral, estes androgênios são
mais fracos do que os ésteres de testosterona ou a própria testosterona, e podem
causar disfunção hepática, complicações e efeitos colaterais. As pesquisas também
foram desenvolvidas no sentido de se encontrar compostos sintéticos com
propriedades anabólicas maiores do que as androgênicas, contudo, atualmente
ainda não foram desenvolvidos esteroides puramente anabólicos (Wilson 1988).
Classicamente, os esteroides anabólicos incluem a testosterona e seus
derivados (Thein et al. 1995, Ferrera et al. 1997). Entretanto, alguns autores
descrevem também os derivados sintéticos da testosterona como esteroides
anabolizantes (Hoberman & Yesalis 1995, Goldberg et al. 2000) pois eles
apresentam atividade anabólica (promoção do crescimento) superior à atividade
androgênica (masculinização) (Lukas 1996). Já estão descritos mais de 1.000
derivados sintéticos da testosterona. Aproximadamente 60 tipos de EAA são
comercializados, os quais variam em estrutura, metabolismo e, portanto, nos efeitos
fisiológicos gerados (Basaria et al. 2001). Existem três classes principais destes
compostos de acordo com o tipo de modificação na estrutura da testosterona (Figura
02). A classe I (ou A), cujos compostos são primariamente injetáveis, engloba os
compostos com esterificação do grupo 17-β-hidroxila da testosterona com vários
ácidos carboxílicos, com consequente aumento das propriedades androgênicas,
aumento da solubilidade lipídica da molécula prolongando o tempo de ação na
circulação. Tem como principal representante o propionato de testosterona (Basaria
et al. 2001, Wilson 1996). A classe II (ou B) é também formada por compostos
injetáveis e compreende ésteres chamados de derivados 19-nor-testosterona,
compostos que apresenta uma substituição de um hidrogênio por um grupo metil no
carbono 19 com consequente aumento da meia-vida da classe, maior afinidade
29
pelos receptores androgênicos e uma menor pelos receptores estrogênicos. Tem
como principal exemplo o decanoato de nandrolona (Shahidi 2001). Por fim, a classe
III (ou C) é formada por compostos alquilados no carbono 17-α, fato que retarda o
metabolismo hepático, fazendo com que eles sejam ativos também por
administração oral. Diferentemente das outras duas classes, nenhum dos esteroides
17α- alquilados é convertido em di-hidrotestosterona (DHT) ou 17β-estradiol, embora
outros metabólitos possam ser formados (Winters 1990). Dessa forma, cada EAA
possui uma estrutura única semelhante à testosterona e funciona como um
hormônio esteroide no corpo. Todavia, cada EAA possui diferentes efeitos sobre o
organismo dependendo, além da estrutura, da via de administração, dosagem,
frequência e duração do uso.
Fonte: Extraído de Cunha (2004).
Figura 2. Exemplos de esteroides anabolizantes das três classes: Propionato de testosterona (classe I), Estanozolol (classe III) e Nandrolona (classe II).
Os EAA são utilizados em diversos tratamentos na clínica, em
quantidades controladas. O principal deles é no hipogonadismo masculino através
da manutenção dos níveis séricos de testosterona dentro de níveis fisiológicos
normais (Conway et al. 2000). Considerando a ação destes compostos no balanço
do nitrogênio e síntese proteica no sistema muscular, essas drogas têm importante
papel no tratamento da sarcopenia associada ao câncer, de queimaduras graves,
30
doenças pulmonares e insuficiência renal (Basaria et al. 2001, Shahidi 2001).
Também são frequentemente utilizados para combater a perda muscular em
pacientes com Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS), nos quais alguns
estudos têm demonstrado aumento do humor, da libido e energia associada ao
ganho de massa muscular (Basaria et al. 2001, Bhasin et al. 2000, Rabkin et al.
2000).
A principal diferença entre o uso médico e o abuso dos EAA está na dose
e no esquema de administração (tratamento). Usualmente, o uso médico dos EAA
está relacionado à reposição dos níveis fisiológicos (ex. de 6 a 10 mg/dia no
hipogonadismo) e com intervalos regulares de uso (Wilson et al. 1996). Já na
condição de abuso os regimes de administração são diferentes (geralmente,
utilizando compostos orais e injetáveis) e quase sempre acompanhados de um
aumento progressivo da dose (de 40 a 100 vezes a dose fisiológica) (Rogol &
Yesalis 1992, Yesalis et al. 1997, Brower 2002). A dosagem utilizada depende das
características e necessidades particulares de cada usuário. Por exemplo,
corredores de maratona ou nadadores de longa distância utilizam-se dos esteroides
em níveis pouco acima dos níveis fisiológicos apenas objetivando manter o
desempenho intenso durante toda a prova e também suportar as sessões de treino
pré-competição. Já atletas de força como fisiculturistas e levantadores de peso
utilizam elevadas doses (10 a 100 vezes os níveis fisiológicos) de esteroides devido
à necessidade de ganho de massa muscular para levantar o máximo de peso
possível (Yesalis 2000, Brower 2002). No entanto, a dose real utilizada é geralmente
desconhecida já que os usuários os adquirem do mercado negro ou utilizam
produtos veterinários (Brower 2002, Gruber & Pope 2000).
31
Estudos têm descrito que a forma com que os EAA são utilizados
geralmente segue três metodologias: a primeira, conhecida como “ciclo”, está
relacionada a qualquer período de utilização recorrente que varia de 4 a 18
semanas; a segunda, denominada “pirâmide” começa com pequenas doses que
aumentam progressivamente até o ápice e após esta dosagem máxima ocorre uma
redução até a dose mais baixa; a terceira forma de abuso é conhecida como
“stacking” (uso alternado de esteroides de acordo com a toxicidade) e compreende a
utilização de vários esteroides ao mesmo tempo (em média, cinco tipos diferentes)
(Wu 1997, Catlin 2001). O uso do sistema “stacking” permitiria a maximização da
ligação dos receptores e ativação de múltiplos sítios de receptores de esteroides.
Além desses esquemas de administração, os EAA são comumente utilizados em
conjunto com outras drogas com o intuito de aumentar o efeito anabólico e diminuir
os efeitos colaterais, tais como diuréticos (para diminuir a retenção de líquidos) e
gonadotrofina coriônica humana (para evitar a atrofia testicular). Por fim, é
importante ressaltar que tudo isso também é combinado com dietas específicas
incluindo suplementos (creatina, aminoácidos, vitaminas) e também com exercícios
físicos intensos (Brower 2002, Evans 2004).
Neste contexto, há um enorme interesse no estudo dos efeitos desses
compostos tanto em relação ao abuso quanto ao uso clínico. Os efeitos colaterais do
abuso dos EAA vão desde o aparecimento de acne, retenção de líquido, redução
dos níveis de lipoproteína de alta densidade (HDL) e apneia do sono até efeitos mais
graves ou mesmo letal como falência hepática e algumas formas de cânceres (Stone
1993, Suttmann et al. 1995). Estes efeitos podem ser temporários, rápidos,
persistirem ao longo do tratamento com EAA ou até mesmo permanecerem após o
término do tratamento (Blue & Lombardo 1999). Os efeitos adversos podem ser
32
divididos em quatro áreas principais: hepáticos, cardíacos, endócrino-reprodutivos e
psicológico-comportamentais. Os efeitos colaterais do uso dos EAA irão depender
do sexo e idade do indivíduo, do composto utilizado e da dose e duração do
tratamento (Wu 1997).
Os efeitos psicológicos do uso de EAA ainda são menos estudados do
que os efeitos fisiológicos. Geralmente, trata-se de estudos de caso com doses
muito menores do que as utilizadas em abuso. Além disso, questões éticas impedem
a execução de estudos controlados onde se administre doses altas de EAA em
voluntários saudáveis.
Em contraste com esses efeitos sutis encontrados tanto na clínica quanto
em estudos de laboratório, outros estudos têm encontrado frequentemente
alterações psicológicas significativas em indivíduos que recebem doses
suprafisiológicas de EAA (Trenton & Currier 2005). Diversos estudos de caso
sugerem que EAA podem produzir uma variedade de distúrbios comportamentais e
psicológicos como, por exemplo, o aumento da agressividade, psicose, tentativa de
suicídio e desenvolvimento de dependência a drogas (Brower et al. 1989, Hall et al.
2005, Papazisis et al. 2007, Thiblin et al. 1999, Trenton & Currier 2005).
O efeito psiquiátrico mais citado na literatura é o aumento da
agressividade em indivíduos que usam EAA em doses elevadas (Basaria et al.
2001). Mesmo fisiologicamente, acredita-se que a testosterona seja um importante
determinante da agressão. Por exemplo, modelos animais fornecem fortes
evidências que os níveis séricos de testosterona medeiam os comportamentos de
dominância e agressividade em ratos machos adultos (Bahrke et al. 1990). Além
disso, a exposição à testosterona exógena aumenta a agressividade em roedores
(Farrell & McGinnis 2003, Melloni et al. 1997). Ricci e colaboradores (2006)
33
demonstraram que hamsters tratados com um coquetel de esteroides por 30 dias
apresentaram um aumento da agressividade acompanhado por uma redução na
quantidade de receptores 5HT1A no hipotálamo anterior, sendo que um agonista do
receptor 5HT1A reverteu o quadro agressivo.
Embora existam resultados conflitantes na literatura, existem dados
suficientes e convincentes para sugerir que os EAA podem produzir distúrbios
psicológicos e comportamentais dose dependentes, em indivíduos que abusam de
EAA (Pope & Katz 2003).
Corrigan (1996) divide os efeitos psicológicos promovidos por estas
substâncias em três grupos: a) efeitos imediatos relacionados à mudança de humor
e euforia, com possível melhora da confiança, energia e autoestima, além do
aumento da motivação e do entusiasmo. Há também diminuição da fadiga, insônia,
irritação, raiva, agitação e habilidade para treinar com dor; b) efeitos de altas doses
por longo período, principalmente perda da inibição e alterações de humor; c)
evolução dos efeitos de agressividade para comportamentos violentos, hostis e
antissociais, podendo ocorrer ataques de fúria que vão desde o abuso infantil até os
suicídios e assassinatos. Dessa forma, há crescente interesse em estudos que
procurem elucidar as consequências fisiológicas e psicológicas do uso continuado
dos esteroides anabolizantes no ser humano.
2.2.2 Efeitos sobre o aprendizado e a memória
Apesar das evidências que a administração exógena de hormônios
esteroides promove prejuízos cognitivos, estudos sobre os efeitos dos EAA sobre o
aprendizado e a memória são escassos. Em humanos, alguns estudos têm
34
investigado os efeitos cognitivos da suplementação com testosterona em homens
idosos saudáveis. Por exemplo, após injeções intramusculares de 100 a 150 mg de
testosterona, observou-se melhorias na habilidade espacial (Cherrier et al. 2001,
Janowsky et al. 1994), memórias viso-espacial (Cherrier et al. 2001, Cherrier et al.
2005) e operacional viso-espacial (Janowsky et al. 2000) sugerindo que os
hormônios esteroides sejam capazes de modular aspectos cognitivos em homens
idosos saudáveis. Ainda é incerto se essas melhorias encontradas na cognição se
devem ao aumento nos níveis de testosterona ou de estrógeno.
No entanto, Cherrier e colaboradores (2005) sugerem que as melhorias
na memória verbal dependem da aromatização da testosterona em estrógeno, ao
passo que as melhorias na memória espacial independem da aromatização. Outros
trabalhos sugerem melhoras no desempenho cognitivo quando, por exemplo,
homens com hipogonadismo demonstram pior desempenho cognitivo quando
comparados a homens saudáveis sendo que esses déficits foram reduzidos com a
suplementação de testosterona (Sternbach 1998, Lund et al. 1999, Tan 2001).
Aliado a esses indícios em humanos, a verificação, em ratos, de uma alta
densidade de RA em regiões cerebrais importantes para o aprendizado e memória,
como o hipocampo, sugere que pode haver uma relação importante entre
andrógenos e essas funções cognitivas (Kerr et al. 1995). Na maioria dos
mamíferos, o hipocampo tem um papel bem documentado no aprendizado e na
memória (Bannerman et al. 2002, Martinez et al. 2002). No hipocampo de ratos, RA
estão particularmente concentrados nas células piramidais em CA1 (Clancy et al.
1992, McAbee & DonCarlos 1998). Andrógenos podem também aumentar a
excitabilidade neural no hipocampo de ratos machos (MacLusky et al. 2006, Smith et
al. 2002) e aumentar a densidade de espinhos dendríticos nas regiões CA1 e CA3
35
no hipocampo dorsal (Isgor & Sengelaub 2003). Acredita-se também que os
andrógenos modulem alguns comportamentos que são mediados pelo hipocampo
como os observados no labirinto aquático, na esquiva inibitória e no labirinto em Y
(Isgor & Sengelaub 2003, Frye & Seliga 2001, Kritzer et al. 2001).
Por outro lado, estudos mostram que a administração de testosterona em
ratos pode prejudicar o desempenho dos mesmos no labirinto aquático (Goudsmit et
al. 1990, Naghdi et al. 2003, Moradpour et al. 2006) e na esquiva inibitória (Naghdi &
Asadollahi 2004). Harooni e colaboradores (2008) observaram que a administração
de testosterona na região CA1 do hipocampo pode prejudicar a aquisição,
consolidação e evocação de memórias em uma tarefa de esquiva passiva.
Entretanto, eles também observaram que a total depleção (gonadectomia) não
afetou nenhum desses processos na mesma tarefa.
Como se pode observar, os resultados dos efeitos dos andrógenos sobre
a memória e o aprendizado são ainda muito incipientes. Quadro que se agrava ainda
mais quando se objetiva analisar os efeitos dos EAA administrados cronicamente em
doses suprafisiológicas. De fato, mesmo com o aumento significativo no uso dessas
substâncias, ainda há uma carência de pesquisas que investiguem os efeitos
cognitivos do abuso desses compostos fazendo com que evidências de correlações
tanto positivas quanto negativas sejam sugeridas (Goudsmit et al. 1990, Gouchie &
Kimura 1991, Burkitt et al. 2007). Dentre as poucas pesquisas realizadas com esse
fim, demonstrou-se que o uso de um coquetel de esteroides (5mg/kg/dia)
administrado de 4 a 12 semanas em ratos não foi capaz de afetar a memória
espacial nem a plasticidade hipocampal (Clark et al. 1995, Smith et al., 1996). Por
outro lado, foram observados déficits na memória após a administração de 15
mg/kg/dia de decanoato de nandrolona em ratos na tarefa de memória social olfativa
36
(Kouvelas et al. 2008) e na tarefa do labirinto aquático de Morris (Magnusson et al.
2009).
Alguns estudos mostram que a ansiedade seria um passo necessário na
formação da memória (Mathews 1990, Silva & Frussa-Filho 2000) tornando-se,
assim, um aspecto importante para a compreensão dos processos de aprendizado e
memória. Ainda, além dos efeitos psicológicos em humanos descritos anteriormente,
estudos têm demonstrado que hormônios androgênicos podem modificar o
comportamento de roedores no labirinto em cruz elevado, um modelo clássico de
avaliação da ansiedade. Por exemplo, Bitran e colaboradores (1993) indicaram uma
resposta ansiolítica, em ratos, após seis dias de exposição com propionato de
testosterona; por outro lado, nesse mesmo estudo ratos expostos a 14 dias de
tratamento não diferiram dos controles. Aikey e colaboradores (2002) também
demonstraram uma resposta ansiolítica com o aumento da exploração dos braços
abertos 30 minutos após a administração de uma dose única de testosterona ou de
seu derivado androsterona. Em oposição a esses resultados, a administração
crônica de decanoato de nandrolona produziu efeito ansiogênico em ratos machos
(Minkin 1993). Por outro lado, a administração de 7mg/kg/dia de metil testosterona
por 17 dias não alterou os níveis de exploração dos braços abertos no labirinto em
cruz elevado (Rojas-Ortiz et al. 2006).
37
3 OBJETIVO GERAL
O objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos de um esteroide
anabólico androgênico (PT) sobre diferentes aspectos das funções cognitivas e
ansiedade em ratos após tratamento agudo e crônico.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1) Avaliar os efeitos do tratamento agudo e crônico com PT no desempenho
de ratos na tarefa de reconhecimento de objetos;
2) Avaliar os efeitos do tratamento agudo e crônico com PT sobre a memória
operacional de ratos submetidos à tarefa da alternação espontânea;
3) Avaliar os efeitos do tratamento agudo e crônico com PT sobre a memória
aversiva e quadro de ansiedade de ratos, a partir da avaliação do
desempenho na esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado.
A seguir apresentamos os dados da presente tese subdivididos em
dois artigos, sendo que o Artigo 1 contempla os objetivos específicos 1 e 2; e o
Artigo 2 contempla o objetivo específico 3. Destaca-se que o Artigo 1 já está
aceito para publicação (Current Psychopharmacology, 2013, Volume 2, No. 2) e o
Artigo 2 está em preparação.
38
4 ARTIGO 1
The anabolic androgenic steroid testosterone propionate decreases
recognition memory in adult male rats
Fernando Roberto Ferreira Silva, Alicia Cabral, Ana Paula Nascimento Lima,
Aline Lima Dierschnabel, Ezequiel Batista do Nascimento, Priscila Tavares
Macedo, Geison Souza Izídio, Alessandra Mussi Ribeiro, Regina Helena Silva*
Memory Studies Laboratory, Physiology Department. Federal University of Rio
Grande do Norte, Natal, Brazil
*Corresponding author: Departamento de Fisiologia - Centro de Biociências -UFRN,Av. Salgado Filho, s/n – Caixa Postal 1511CEP 59078-970 – Natal/RN, BrazilFax: +55 84 32119206.E-mail address: [email protected] (R.H. Silva).
Keywords: androgens, AAS supraphysiological dose, behaviour effects, cognitive
deficit, long-term AAS treatment, acute AAS treatment, spatial working memory
39
Abstract
Although there are therapeutic applications of the Anabolic Androgenic Steroids
(AAS), the predominant use implies the illicit self-administration by athletes and
adolescents. In this respect, AAS abuse is associated with untoward effects on
brain and behavior. Exposure to supraphysiological doses of AAS leads to
changes in anxiety and aggression, but their effects on cognitive functions are
poorly understood. We investigated the effects of the AAS testosterone propionate
(TP), acutely or chronically administered in supraphysiological doses, on memory
in rats. Experiment I – The rats were treated once with vehicle (n = 5) or TP (n =
5). Behavioral experiments were performed 60 minutes after the single injection.
Experiment II – Adult male Wistar rats received repeated daily administration of
vehicle (Control Group, n = 6) or TP (10 mg/kg, n = 7) for 40 days. Behavioral
experiments started 24 hours after the last injection, and included the evaluation
of spatial working memory and recognition memory. After behavioral procedures,
the animals were euthanized, the blood was collected for biochemical analyses
and testicles were removed and weighted. Regarding the behavioral assessment,
rats chronically treated with TP presented decreased time exploring the novel
object when compared to control group. Rats that were treated acutely showed no
significant difference compared with control. Acute or chronic treatments with TP
were not effective in promoting changes in spatial working memory. Additionally,
chronic treatment with TP induced significantly increases in biochemistry marker
the enzyme glutamate pyruvate transaminase (SGPT) and a reduction in testicular
weight as compared with control. Even though not interfering with spatial working
memory performance, AAS abuse could induce deficit on recognition memory.
40
Introduction
The original therapeutic use of the synthetic analogues of testosterone,
the anabolic androgenic steroids (AAS), was the enhancement of anabolic
potency [1]. However, it is known that AAS (in supraphysiological doses) have a
high prevalence of misuse by athletes and adolescents, aiming to improve
performance or body image [2, 3, 4]. Some consequences of the chronic steroid
misuse that have been described are coronary heart disease, increased blood
pressure, and liver dysfunction [5]. These adverse effects vary in intensity
depending on age, sex, type of AAS, dosage and duration of use [6, 7, 8]. Besides
the development of drug dependence, adverse effects of AASs in the neural
function and behavior have been reported, such as aggressive behavior,
psychosis and even suicide attempts [9, 10, 11, 12]. In addition, a few reports
have shown cognitive impairments [13].
Considering that gonadal hormones play a role in mechanisms related
to cognitive function [14, 15], it is expected that AASs exert actions on learning
and memory processes. Indeed, studies have shown high density of androgen
receptors in brain areas related to these processes [16, 17], as well as of the role
of sexual hormones in learning and memory [18]. The studies on this issue were
mainly conducted with acute testosterone, administered intra-hippocampally, and
have shown that this hormone impairs the performance of rats in spatial water
maze [19, 20] and inhibitory avoidance tasks [21, 22]. Other studies have shown
impaired performance in different kinds of memory tasks in gonadectomized
(GDX) male rodents, which were restored after testosterone administration [23,
24].
41
On the other hand, there are few studies focusing on the effects of
long-term treatment with testosterone or synthetic analogues, which would be of
interest considering the pattern of abuse of these substances. Moreover, these
studies have shown controversial results, Kouvelas et al. [25] showed impaired
performance in an olfactory social memory task in rats treated with nandrolone
decanoate. Conversely, other studies did not report any alteration in the
acquisition or extinction of a lever-pressing task [26] or performance in the water
maze task [27] of the rats treated with same drug.
The mechanism underlying the potential cognitive effects of AAS is not
understood. It has been demonstrated that the AAS nandrolone, given chronically,
modify the glutamatergic [28], GABAergic [29], dopaminergic and serotonergic
[30, 31] systems. From another standpoint, beneficial effects of prolonged
testosterone treatment on neuronal function have also been reported [32],
although this neuronal effect did not result in behavioral improvement in
senescent rats [33].
In this context, the wide-spread use of AAS during lifetime is an
important concern. In addition to the physiological damage that has been
extensively described, evidence suggests that there are also cognitive
impairments. However, as mentioned, the results in animal studies are not
unequivocal. In order to extend the knowledge about the cognitive effects of
prolonged treatment with AAS, we investigated the effects of chronic testosterone
propionate (TP) at a supraphysiological dose in rats. We hypothesized that the
effects of AAS would extend to different aspects of memory function other than
those previously investigated. The animals were tested in the spontaneous
alternation task (to evaluate spatial working memory), and the novel object
42
recognition (NOR) task. After the behavioral tests, animals were euthanized and
testicular weight and biochemical analyses were obtained. Additionally, behavioral
testing in the same paradigms after acute treatment was conducted for
comparison.
Materials and Methods
Subjects and general procedures
Three-month-old male Wistar rats (300–350g) were used. Animals
were housed individually in plastic cages (30x19x13cm, length x width x high),
under conditions of acoustic isolation and controlled airflow and temperature (25 ±
1º C), with a 12h light/12 h dark cycle (lights on at 06:30). Food and water were
available ad libitum. All procedures were approved by the local ethics committee.
All efforts were made to minimize animal pain, suffering or discomfort.
Treatment
Animals in the control group were injected with sesame oil (Vehicle –
VEH) and those in the treated group were injected with 10 mg/kg testosterone
propionate (TP - Androgenol®, Herpate Calier, Brazil) diluted in vegetable oil. The
injections were administered intramuscularly, and the target hind limbs were
alternated. The dose of 1 mg/kg is sufficient to restore endocrine function and
reproductive behaviors in gonadectomized male rats [34]. Thus, the dosage of 10
mg/kg used in this experiment can be considered supraphysiological, and was
43
combined with a long-term treatment of 40 days (20 injections) to simulate abuse
conditions. The health condition of the animals during the treatment with TP was
considered adequate: no deaths occurred during the treatment and no wounds
were observed in the injection sites. Additionally, repeated oil injection did not
seem to interfere with animals’ general behavior (as suggested by absence of
effect in the locomotion - Table 1). Moreover, no changes were observed in the
weight of the rats throughout the treatment (data not shown).
Experimental design
The animals were handled daily for 10 min during seven days before
the beginning of the experimental procedures. Afterwards, the rats were randomly
assigned to one of the groups: Control or PT-treated.
Experiment I – Effects of acute administration of testosterone
Each animal received a single intramuscular injections of sesame oil
(VEH; n = 5) or injections of 10 mg/kg testosterone propionate (TP; n = 5). This
day was considered day 1-I.
On day 1-I, sixty minutes after the single administration, rats were
individually placed in this central space in a plus-maze to spontaneous alternation
task.
On day 2-I (24h after the single injections), rats were exposed to the
open field for habituation for 10 min. After 24h and 48h (on days 3-I and 4-I), the
44
training and test sessions of the novel object recognition task were performed as
described above, respectively.
Experiment II – Effects of chronic administration of testosterone
Rats received intramuscular injections of sesame oil (VEH; n = 6) or 10
mg/kg testosterone propionate (TP; n = 7) every other day for 40 days (20
injections). The first injection day of the Experiment II, was considered day 1-II.
On day 39, rats were individually submitted to the spontaneous alternation task.
On day 40-II (24h after the last injection), rats were submitted to the
habituation session for the object recognition task, and the training session was
conducted on day 41-II. The test session was conducted 24h later (on Day 42-II).
Behavioral tasks
Recognition memory - Novel object recognition (NOR) task
Each animal was placed in the central region of an open field arena
(diameter = 1.0 m) and were given 10 min of free exploration to habituate (without
any objects). After 24h, in a 5-min training session, the animals were placed in the
field with two identical objects (objects A1 and A2), diametrically positioned in
opposite sides of the field and fixed on the floor. In the test session, conducted
24h later, a novel object (B) replaced one of the previous objects (A) and the rats
were allowed to explore them for 5 minutes. The objects used were approximately
the same size and had different colors and shapes. Exploratory behavior
45
(touching with the nose and/or forepaws, sniffing or biting each object) was
recorded. The exploration ratio [time spent exploring the novel object B / (time
exploring familiar object A + time exploring the novel object B)] was calculated for
each animal. The maze and the objects were cleaned thoroughly after each
session with a 5% ethanol solution. All behavioral tests were held between 09:00
a.m. and 11:30 a.m.
Spatial working memory - Spontaneous alternation (SA) task
The apparatus used was a wooden plus-maze placed 50cm elevated
from the floor, with four enclosed arms (47cm×16cm×34cm) extending from a
central platform (16cm×16cm). The animals were individually placed in this central
space with access to all arms and allowed free exploration for 10 min. The
behavior of the animals was recorded by a video camera positioned above the
maze and analyzed by video-tracking software (Any-maze, Stoelting, USA). The
four arms were designated A, B, C and D, and the amount and sequence of
entries in the arms were registered. An entry was defined by the crossing of the
four paws through the entrance of the arm. An alternation was computed when the
animal explored the 4 individual arms consecutively, in any order, without
repeating an arm choice. Percentage of alternation was calculated by number of
registered alternations /number of possible alternations. General locomotor
activity was evaluated by the total number of entries and the distance travelled.
46
Biochemical analysis
On day 42-II, after the test session of NOR task, blood samples (5 ml)
were collected into heparinized tubes after rapid decapitation. Centrifugation
(1000 rpm at 4ºC for 10 min) separated serum from blood. The serum obtained
was used to estimate the levels of glutamate oxaloacetate transaminase (SGOT),
glutamate pyruvate transaminase (SGPT) [35] and bilirubin [36]. The increase in
the levels of liver enzymes is frequent among steroid users [37].
Gonadal weight
After decapitation, testicles were dissected and weighted. For data
analysis, testicular weight was normalized considering the total body weight.
Ethical statement
The authors declare that all experiments reported in this article
received formal approval of the local ethical committee (CEUA-UFRN, protocol
024/2009), and followed the law for the use of animals in scientific research
(Brazilian law number 11.794). Moreover, the study was conducted in compliance
with the standards set forth in the eighth edition of Guide for the Care and Use of
Laboratory Animals published by the National Academy of Sciences, Washington,
D.C). All efforts were made to keep the number of animals used to a minimum, as
well as pain, suffering or discomfort.
47
Statistical Analyses
The independent samples t test was used to analyze differences
between the groups VEH or TP. In the novel object recognition task, within-subject
comparisons for percentage of time to explore old x new objects were conducted
with paired-samples t tests. Data are displayed as mean ± standard error (S.E.M),
and p < 0.05 was considered to reflect significant differences. The SPSS 18 for
Windows software was used to perform the statistical analysis.
Results
Experiment I – Effects of acute TP treatment
Novel object recognition task
No changes in locomotor activity were found in the habituation session
[t(8) = 0.377, p = 0.716 (Fig. 1A). In the test session, there was no effect of
treatment on new object exploration ratio [t(8) = 0.439, p = 0.672 (Fig. 1C). Both
groups showed augmented exploration of the new object compared to old object
[Control group, t(4) = 4.624, p = 0.010] and TP treated group [t(4) = 3.967, p =
0.017] (Fig. 1E).
48
Spontaneous alternation task
No significant differences were found on spontaneous alternation
performances [t(7) = 1.367, p = 0.214], number of arm entries [t(7) = 0.206, p =
0.842] and distance travelled [t(7) = 0.076, p = 0.941] between control and
experimental groups (Table 1).
Experiment II – Effects of chronic TP treatment
Novel object recognition task
No changes in locomotor activity were observed in the habituation
session [t(11) = 0.719, p = 0.487] (Fig. 1B). Rats treated with 10 mg/kg TP
presented significantly decreased exploration of the new object compared to VEH
in the test session [t(7) = 3.869, p = 0.006 (Fig. 2B). In addition, the exploration of
the new object by the VEH (but not TP) group was greater than the exploration of
the old object [t(7) = 4.22, p = 0.024 (Fig. 2C). In this task, the data of four animals
(two VEH and two TP) were removed from the analysis due to absence of object
exploration in the training session.
Spontaneous alternation task
No significant differences were found on spontaneous alternation
performances [t(11) = 1.019, p = 0.33], number of arm entries [t(11) = 0.302, p =
49
0.76] and distance travelled [t(11) = 0.859, p = 0.41] between control and
experimental groups (Table 1).
Endocrine effects
The protocol of TP treatment used in the present study showed
significant effects in testicular weight. Indeed, when compared to VEH, this
administration reduced relative testicular weight in relation the total body weight
[t(11) = 4.33, p = 0.001 (Fig. 2). The administration of TP also caused significant
increase in marker enzyme SGPT compared with the control group [t(11) = 2.715,
p = 0.02] (Table 2). However, no significant differences were detected in levels of
SGPO and serum bilirubin.
50
ACUTE CHRONICA B
C D
E F
Figure 1. Effects of acute (A, C and E) and chronic administration (B, D, and F) of 10 mg/kg of
testosterone propionate (TP) or vehicle (oil sesame - VEH) in rats submitted on novel object
recognition task. Data are expressed as the mean ± S.E.M. (A, B) Distance travelled; (C, E) Ratio
of the exploration of the new object, *p < 0.05 compared to VEH (Independent samples t-test); (E,
F) Exploration time of new object compared to familiar object, *p < 0.05 compared to familiar
object exploration (paired-samples t-test).
51
Figure 2. Effects of the administration of 10 mg/kg of testosterone propionate (TP) or vehicle
(sesame oil - VEH) for 42 days on testicular weight in rats. *p < 0.05 compared to vehicle
(Independent samples t-test).
52
Table 1. Effects of 10 mg/kg of testosterone propionate (TP) or sesame oil, vehicle (VEH) in rats submitted on spontaneous alternation task.
Values are expressed as mean S.E.M. (Independent samples t-test).
Table 2. Effects of testosterone propionate (TP) on different biochemical parameters in the serum of rats.
ParameterTreatment
VEH TP
SGPT (U/ml) 49.00 ± 4.42 84.29 ± 11.38*
SGOT (U/ml) 137.83 ± 13.87 121.00 ± 18.50
Bilirubin (mg/dl)
Total 0.45 ± 0.25 0.49 ± 0.22
Direct 0.31 ± 0.20 0.36 ± 0.22
SGPT, glutamate pyruvate transaminase in the serum; SGOT, glutamate oxaloacetate transminase in the serum. Values are expressed as mean ± S.E.M. (*p < 0.05 compared to vehicle; samples t test).
Parameters Treatment
VEH TP
Acute administration Alternations (%) 34.46 ± 7.29 47.70 ± 6.41 Total number of entries in the arms 24.75 ± 2.65 25.60 ± 2.99 Distance travelled (m) 23.34 ± 2.54 22.87 ± 2.34
Chronic administration
Alternations (%) 44.73 ± 4.15 37.41 ± 2.13 Total number of entries in the arms 33.00 ± 3.01 34.83 ± 4.77 Distance travelled (m) 38.16 ± 4.12 33.15 ± 4.83
53
Discussion
As mentioned, the AAS are used aiming improvements on performance
and body image, usually through the illicit self-administration that is associated
with untoward effects on brain and behavior. Moreover the AAS has become a
widespread drug abuse problem [1, 2, 38]. Thereby, due to the involvement of
steroid hormones with cognitive functions, the prolonged use may promote
impairment in these processes. In this context, aiming to investigate the effects of
continuous exposure to supraphysiological levels of androgen steroids, chronically
and acutely testosterone propionate (TP)-treated rats were tested in two different
memory tasks.
Regarding the effects of TP on the performance of rats in the
spontaneous alternation (SA) task (Experiment I and II) (Table 1), these findings
corroborate studies in which spatial working memory was not altered after
administration of a high dose of one of the three AAS compounds (17α-
methyltestosterone, testosterone cypionate or methandrostenolone) [39]. The
spontaneous alternation behavior comprises the tendency for rodents and other
animals to alternate their nonreinforced choices of arms in a maze at successive
opportunities [40]. This task has been used as a simple test of spatial working
memory. Thus, the absence of effect observed in rats treated with TP (acute or
chronically administered) is possibly because this task is not complex enough to
verify the effects of treatment.
From another standpoint, some findings indicated acute
intrahippocampal injections of testosterone have benefits for memory performance
in rats [22]. In agreement, a correlation between spatial impairment and
54
testosterone loss in aged mice was demonstrated, and treatment with exogenous
testosterone counteracted this impairment [41, 42]. Further, there is evidence of
an organizational action of these hormones in the development of neuronal
circuitries related to cognitive function. Indeed, a study showed that testosterone
enhances learning and memory in rats when given at critical periods of
development [41]. In summary, studies with testosterone (or its derivatives) and
spatial working memory in animals have shown controversial results.
In the case of the present study, the absence of effects of TP in SA
task in the results obtained cannot be attributed to motor alterations, since the
treatment did not cause changes in motor functions when compared to rats
treated with untreated in both the SA and NOR tasks (Table 1). Our data on
locomotor activity corroborate previous studies that demonstrated lack of motor
alterations in gonadally-intact rodents after chronic exposure to AAS [43, 44, 45].
We also investigated the effects of AAS in the novel object recognition
(NOR) paradigm. The chronic treatment with TP 10 mg/kg was able to cause a
deficit in the index of recognition of novel object when compared to the control
group (Fig. 1D). Few previous investigations focused the effects of AAS chronic
treatment on recognition memory. For example, recognition of a juvenile in a
social recognition task was decreased by chronic administration of nandrolone
decanoate (15mg/kg), although this treatment did not impair the acquisition of the
information [25]. In line with this result, nandrolone decanoate also delayed the
extinction learning in rats tested in an aversively-motivated task (passive
avoidance) [46]. On the other hand, Aubele and coworkers [47] found a deficit in a
spontaneous object recognition task (performed with a 1.5 h delay) after
55
gonadectomy in adult male rats, providing evidence of a modulatory role of these
hormones in recognition memory processes.
It is relevant to mention that different mechanisms could be related to
the modulatory role of endogenous hormones as opposed to the effects of
supraphysiological doses of androgens on the cognitive function. Indeed, there is
an improvement of cognitive function when low doses of androgens are
administered, while higher doses can cause cognitive impairments [33]. In line
with this reasoning, in studies using the Morris Water Maze showed that
testosterone and flutamide impaired de performance of rats after infusions in the
CA1 hippocampal subregion [19, 48]. Interestingly, this pattern of bidirectional
results has also been found to the effects of estrogens administration in
ovariectomized female rats [49].
The mechanisms behind a specific impairment in recognition memory
(reported here), or in the complex effects for cognitive function in general, remain
unclear. There is evidence of modulation of several neurotransmission systems by
steroid hormones and/or their active metabolites. Regarding the effects related to
memory processes, an action via the cholinergic transmission has been indicated
[50]. In addition, the chronic treatment with nandrolone interferes with the
glutamatergic transmission [28]. Moreover, GABA-, dopamine- or serotonin-
mediated neurotransmissions can also be modulated by AAS [51, 52, 53]. Further
investigation on the mechanisms related to memory impairment of object
recognition due to AAS is needed.
Regarding physical (non-behavioral) effects, AAS compounds usually
produce typical marked effects like reduction in testicles’ weights [5]. In this study,
testicular weight of animals receiving TP was reduced compared to the control
56
group (Fig. 2). The alterations in the gonadal weight are likely due to the well-
established actions of AAS compounds on the negative feedback loop
(hypothalamic-pituitary-gonadal axis) which results in changes in endogenous
testosterone production [54]. Also, increased levels of enzyme GPT, which often
indicates liver damage possibly caused by high doses of TP. The spectrum of
hepatic injury is ample. Elevated levels of alkaline phosphatase, as well as
elevation of liver transaminases are perhaps the more frequently described
abnormalities [55, 56]. Some studies have also demonstrated evidence for
enhanced blood aminotransferase activities after AAS use in bodybuilders [56].
Thus, besides the behavioral cognitive effects, these biochemical and weight
analysis overall confirmed the effectiveness of the protocol used in the present
study in inducing typical consequences of AAS abuse.
Conclusion
In conclusion, data reported here extents the studies showing that
AASs affects the cognitive functions in rats. Specifically, we have demonstrated
that chronic administration of TP resulted in significant reductions of performance
in novel object recognition task. Further research is needed to determinate the
extent to which high levels of androgens may influence different aspects of
cognitive functions, as well as the mechanisms underlying these effects.
57
Acknowledgments
The authors would like to thank Edda Lisboa Leite for biochemical
analysis. This work was supported by fellowships from CNPQ, CAPES, FAPERN
and PROPESQ/UFRN.
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61
5 ARTIGO 2
Effects of anabolic androgenic steroid testosterone propionate on memory,
anxiety and motor behavior in rats tested in the plus-maze discriminative
avoidance task
Fernando Roberto Ferreira Silva, Alicia Cabral, Ana Paula Nascimento Lima,
Aline Lima Dierschnabel, Ezequiel Batista do Nascimento, Priscila Tavares
Macedo, Geison Souza Izídio, Alessandra Mussi Ribeiro, Regina Helena Silva*
Memory Studies Laboratory, Physiology Department. Federal University of Rio
Grande do Norte, Natal, Brazil
* Corresponding author: Departamento de Fisiologia - Centro de Biociências -
UFRN, Av. Salgado Filho, s/n – Caixa Postal 1511, CEP 59078-970 – Natal/RN,
Brazil. Fax: +55 84 32119206.
E-mail address: [email protected] (R.H. Silva).
Keywords: long-term anabolic androgenic steroids treatment; acute anabolic
androgenic steroids treatment; behaviour effects; cognitive deficit.
62
Abstract
Anabolic Androgenic Steroids abuse is associated with untoward effects on body,
brain and behavior. Exposure to supraphysiological doses of AAS provokes some
unwanted physical side effects such as coronary heart disease, increased blood
pressure, liver dysfunction, but particularly alterations in anxiety, aggression, and
in other cognitive functions. We investigated the effects of acute or chronic
treatment of a supraphysiological dose of the AAS testosterone propionate (TP)
on memory and anxiety in rats. Experiment I – Adult male Wistar rats received
repeated daily administration of vehicle (Control Group, n=7) or TP (10.0 mg/kg;
n=8) for 40 days. Behavioral experiments started 24 hours after the last injection.
Experiment II – Rats were treated once with vehicle (n=5) or TP (10.0 mg/kg,
n=5). Behavioral experiments were performed 60 minutes after the single
injection. The apparatus employed in this work (Plus-maze discriminative
avoidance task / PM-DAT) is a modified elevated plus-maze. This task has been
validated for the simultaneous assessment of learning/memory and anxiety-like
behavior, being the measurements used to evaluate these parameters the
discrimination between both enclosed arms (aversive and non-aversive) and
open-arm exploration (time spent in the open arms of the apparatus), respectively.
Compared to controls, rats chronically treated with TP spend more time in
aversive enclosed arm (%TAV) in the test session suggesting worse retrieval of
the task by animals treated with TP. In the training session, rats that were
chronically treated showed no significant difference compared with control. Rats
that were acutely treated showed no significant difference compared with control
63
in both sessions. Although not interfering with anxiety-like behavior, AAS abuse
induced memory deficits in the PM-DAT.
64
Introduction
Because of the usually illegal character of their use, the side effects
associated with Anabolic Androgenic Steroids (AAS) abuse are difficult to describe
with great precision (Hall, Hall 2005). Nevertheless some unwanted physical side
effects such as coronary heart disease, increased blood pressure, and liver
dysfunction (Bonetti et al. 2008; McAllister, Collins 2006) are well known. Besides
these physical impairments, adverse effects of AASs on the central nervous system,
including clear psychiatric effects, have also been reported. Indeed, hyperactivity,
aggression, psychosis, euphoria, suicide attempts, and the development of drug
dependence (Papazisis et al. 2007; Trenton, Currier 2005) have been reported,
particularly in individuals submitted to excessive doses of these compounds.
These male sexual hormones, associated with both estrogen (ER) and
androgen receptors (AR) have an important role in several brain regions, including
cognitive processing sites [amygdala, hippocampus, cerebral cortex and cerebellum].
These potential physiological roles of endogen androgens imply consequences of the
treatment with AASs to brain mechanisms related to learning and memory (Ozawa
2005; Merchenthaler et al. 2004; Mitra et al. 2003).
The effects of androgens on memory, learning and anxiety have been the
aim of investigations in animal models. For example, testosterone produces
anxiolytic-like behavior in rodents in several models of anxiety (Gutierrez-Garcia et al.
2009; Fernández-Guasti, Martínez-Mota, 2005; Aikey et al. 2002; Bing et al. 1998).
Additionally, acute intra-hippocampal administration of testosterone impairs the
performance of rats in spatial water maze (Moradpour, Naghdi, Fathollahi 2006;
Naghdi, Nafisy, Majlessi 2001) and inhibitory avoidance tasks (Harooni et al. 2008;
65
Naghdi, Asadollahi 2004) showing a clear impairment in memory and learning in
these models. Conversely, studies with animals subjected to gonadectomy have also
indicated male rodents demonstrate impaired performance in the inhibitory
avoidance, radial arm maze, T-maze and social memory tasks, which were restored
after testosterone administration (Frye, Seliga 2001; Vazquez-Pereyra et al. 1995).
However, these studies mainly investigate the effects of acute
testosterone or synthetic analogues administration. Further, the few publications that
focus the effects of long-term chronic treatment have shown controversial results:
high dose administration of nandrolone decanoate daily for 6 weeks impaired
memory in an olfactory social memory task in rats (Kouvelas et al. 2008);
administration of nandrolone decanoate (10 or 50 mg/rat weekly, for 8 weeks) did not
affect the acquisition of lever-pressing behavior nor extinction in gonadally intact and
gonadectomized male Wistar rats (Minkin, Meyer, van Haaren 1993); and the
treatment with an AAS combination (testosterone cypionate, nandrolone decanoate,
plus boldenone undecylenate), methandrostenolone to Long-Evans rats for 10
weeks, had no effects on performance of the animals in a water maze task (Clark,
Mitre, Brinck-Johnsen 1995).
In spite of the mechanisms underlying the potential cognitive effects of
AAS are still unknown, it has been demonstrated that chronic administration of the
AAS nandrolone modify the glutamatergic (Rossbach et al. 2007), GABAergic (Clark
et al. 2006), dopaminergic (Kurling et al. 2005; Kindlundh et al. 2004; Thiblin 1999)
and serotonergic (Kurling et al. 2005; Thiblin 1999) systems. Conversely, beneficial
effects of prolonged testosterone treatment on neuronal function have also been
reported (Goudsmit, Fliers, Swab 1988), although this neuronal effect did not result in
behavioral improvement in senescent rats (Goudsmit, van de Poll, Swab 1990).
66
In order to increase the knowledge about the cognitive effects of abuse-
like AAS treatment, the present study aimed to investigate the influence of acute and
chronic administration of a supraphysiological dose of testosterone propionate (TP)
in memory and anxiety of male rats. Studies with chronic treatment should be
particularly important considering the pattern of use of these substances by human
self-administration (abuse condition).
Materials and Methods
Subjects and general procedures
Three-month-old male Wistar rats (300–350g), obtained from our own
colony were housed individually in plastic cages (30x19x13cm, length x width x high)
under 12:12 dark/light cycle (lights on at 07:00) and conditions of temperature (24 ±
1°C), humidity and luminosity controlled and food and water available throughout the
experiment. Before the beginning of the experimental procedures, all animals were
handled to 10 min once a day, for seven days.
Treatment
The animals were randomly assigned to one of the following groups:
Testosterone group – intramuscular injections of 10 mg/kg testosterone propionate
(TP - Androgenol®, Herpate Calier, Brazil) diluted in vegetable oil; and Control group
– i.m. injections of sesame oil (Vehicle – VEH). Since 1 mg/kg is sufficient to restore
67
endocrine function and reproductive behaviors in gonadectomized male rats [36], the
dosage used in this experiment is considered a supraphysiological dosage.
Behavioral task
Plus-maze discriminative avoidance (PM-DAT) task
The apparatus employed is a modified elevated plus-maze, made of wood,
containing two enclosed arms (50x15x40cm) opposite to two open arms (50x15cm).
A 100W lamp was placed over one of the enclosed arms (aversive enclosed arm).
Light intensity was controlled throughout the behavioral sessions (09 lx). Training and
test sessions were at the same room, wherein each wall in front of the open arms of
PM-DAT had different extra-maze visual cues (door, window, cupboard and
observer) that rats could use to distinguish the location of the different arms of the
maze. Each animal was placed in the central platform, with the head turned to one of
the open arms. During the training session (acquisition), each time the rat entered
with the 4 paws in the aversive enclosed arm, the aversive stimuli (100-W light and
an 80 dB noise produced by a small machine) were turned on. The stimuli were then
turned off when the animal left this arm. After 24 hours, in the test session
(extinction), each animal was again placed in the center of apparatus to free
exploration, without receiving any aversive stimulation. Both sessions last 10
minutes. In all sessions, the animals were previously identified and observed in a
random order and in a blind manner, and after each behavioral session the
apparatus was cleaned with a dry cloth and 5% alcohol solution. The behaviors
assessed were: entries on the open and enclosed arms (total number), time spent in
68
the aversive, non-aversive and open arms. These data were scored during both
sessions. Learning was evaluated by the decrease in percent time spent in the
aversive enclosed arm throughout the training session (time spent in the aversive
enclosed arm/time spent in the both enclosed arms). Memory was evaluated by the
percent time spent in the aversive enclosed arm during the test session (time spent
in aversive enclosed arm/time spent in both enclosed arms). Additionally, the training
session was divided in three blocks: beginning (first 3 min, block I), middle (4–7 min,
block II) and ending (last 3 min, block III). Anxiety-like behavior was evaluated by the
percent time spent in the open arms (time spent in open arms/time spent in both
open arms and enclosed arms) of apparatus. Total number of entries in any of the
arms (an entry was defined as the entry of all four paws into one arm) was used to
evaluate motor activity.
Experimental design
Experiment I – Effects of chronic administration of testosterone
Rats received intramuscular injections of sesame oil (VEH; n=7) or 10
mg/kg testosterone propionate (TP; n=8) every other day for 40 days (20 injections).
The first injection day of the Experiment I, was considered day 1.
On day 40 (24h after the last injection) rats were submitted to the training
session of the PM-DAT task. After 24h (on day 41), rats were exposed to the test
session.
69
Experiment II – Effects of acute administration of testosterone
Each animal received a single intramuscular injections of sesame oil
(VEH; n=5) or injections of 10 mg/kg testosterone propionate (TP; n=5). Sixty
minutes after the single administration, rats were individually placed in this central
space in a modified elevated plus-maze for training session (10 min). Twenty-four
hours after the training session, rats were individually replaced in plus-maze for test
session (10 min).
Ethical statement
The authors declare that all experiments reported in this article received
formal approval of the local ethical committee (CEUA-UFRN, protocol 024/2009), and
were performed in accordance with the law of use of animals in scientific research
(Brazilian law number 11.794). The procedures followed were in accordance with the
standards set forth in the Brazilian Guide for the Care and Use of Laboratory
Animals. All efforts were made to minimize pain, suffering or discomfort, as well as
the number of animals used.
Statistical Analyses
Data are presented as mean ± standard error (S.E.M). Data from
behavioral tests were analyzed using independent Student´s t-test, paired samples t-
70
test or two-way ANOVA, when necessary. SPSS 18 for Windows software was used
to perform the statistical analysis. A value of p<0.05 was considered significant
statistically for all comparisons made.
Results
Experiment I – Effects of chronic TP treatment
The effect of TP in the modified elevated plus-maze was verified after 40
days of systemic exposure. No statistically significant differences were found for
distance travelled (locomotor activity) in training session (t(13)=0.522; p=0.610; Fig.
1A) but the distance travelled by TP group was significantly higher than that present
by control animals (t(13)=2.725; p=0.017; Fig. 1B) in the test session.
In the training session, two-way ANOVA with repeated measures revealed
a time (blocks of session) effect [F(2,26)=5.042; p=0.014)] and treatment effect
[F(1,13)=5.506; p=0.035)] but no time x treatment interaction [F(2,26)=1.428;
p=0.258)] for percent time spent in the aversive enclosed arm, suggesting that
learning of the task was similar for both groups (Fig. 2A). In the test session, two-
tailed t-test for independent samples revealed that TP animals spend more time in
aversive enclosed arm (%TAV) than that presented by the control group
(t(13)=2.306; p=0.038; Fig. 2B), suggesting worse retention of the task by animals
treated with TP.
No differences were found in the percent time spent in open arms (%TO)
in both sessions (Fig. 3A and 3B).
71
Experiment II – Effects of acute TP treatment
No changes in locomotor activity were found in both sessions [training
session – (p=0.357; Fig. 4A) and test session – (p=0.618; Fig. 4B)].
In the training session, two-way ANOVA with repeated measures revealed
a time (blocks of session) effect [F(2,16)=12.007; p=0.001)] but no treatment effect
[F(1,8)=6.745; p=0.554] or time x treatment interaction [F(2,16)=0.682; p=0.520] for
percent time spent in the aversive enclosed arm, suggesting that learning of the task
was similar for both groups (Fig. 5A). In the test session, two-tailed t-test for
independent samples showed no differences in percent time spent in aversive
enclosed arm (%TAV) when comparing the groups (p=0.206; Fig. 5B).
No differences were found in percent time spent in open arms (%TO) in
both sessions [Training session – (p=0.930; Fig. 6A) and Test session – (p=0.695;
Fig. 6B)].
72
Figure 1. Effects of 10 mg/kg of testosterone propionate (TP) or sesame oil, vehicle (VEH) for 42 days on locomotor activity in discriminative avoidance task. Data are expressed as the mean ± S.E.M. (A) Training session; (B) Test session (*p < 0.05 compared to VEH; independent samples t-test).
73
Figure 2. Effects of 10 mg/kg of testosterone propionate (TP) or sesame oil, vehicle (VEH) for 42 days in discriminative avoidance task. Data are expressed as the mean ± S.E.M for percent time spent in the aversive enclosed arm (%TAV) in three blocks of Training session (A) and for the whole Test session (B) (*p < 0.05 compared to VEH; independent samples t-test).
74
Figure 3. Effects of 10 mg/kg of testosterone propionate (TP) or sesame oil, vehicle (VEH) for 42 days in discriminative avoidance task. Data are expressed as the mean ± S.E.M for percent time spent in the open arm (%TO) in (A) Training and (B) Test sessions (*p < 0.05 compared to VEH; independent samples t-test).
75
Figure 4. Effects of a single injection of 10 mg/kg of testosterone propionate (TP) or sesame oil, vehicle (VEH) on locomotor activity in discriminative avoidance task. Data are expressed as the mean ± S.E.M. (A) Training session; (B) Test session (*p < 0.05 compared to VEH; independent samples t-test).
76
Figure 5. Effects of a single injection of 10 mg/kg of testosterone propionate (TP) or sesame oil, vehicle (VEH) in discriminative avoidance task. Data are expressed as the mean ± S.E.M for percent time spent in the aversive enclosed arm (%TAV) in (A) Training and (B) Test sessions (*p < 0.05 compared to VEH; independent samples t-test).
77
Figure 6. Effects of a single injection of 10 mg/kg of testosterone propionate (TP) or sesame oil, vehicle (VEH) in discriminative avoidance task. Data are expressed as the mean ± S.E.M for percent time spent in the open arm (%TO) in (A) Training and (B) Test sessions (*p < 0.05 compared to VEH; independent samples t-test).
78
Discussion
Aiming to investigate the effects of continuous exposure to high doses of
androgen steroids on learning, memory and anxiety, chronically and acutely
testosterone propionate (TP) – treated rats were tested in the plus-maze
discriminative avoidance task (PM-DAT). PM-DAT is a modified version of the
conventional elevated plus-maze, in which an aversive situation is presented in one
of the enclosed arms (aversive arm). This task has been validated for the
simultaneous evaluation of learning/memory and anxiety-like behavior, being the
measurements used to evaluate these parameters the discrimination between both
enclosed arms (aversive and non-aversive) and open-arm exploration (time spent in
the open arms of the apparatus), respectively. Then, rats are conditioned to choose
between two enclosed arms while avoiding the open arms of the apparatus (Ribeiro
et al. 2010; Silva, Frussa-Filho 2000).
The dosage and the duration of treatment used in this study were chosen
based on the amount used to simulate the abuse of AASs by humans (Bronson
1996). As mentioned, although the Anabolic Androgenic Steroids (AAS) were
developed for therapeutic purposes, they are now commonly used for illicit self-
administration at supra-physiological doses to improve performance and body image,
which is associated with untoward effects on brain and behavior. In this context, due
to the involvement of steroid hormones with several cognitive functions, the
prolonged use may promote impairment in these processes (Trenton, Currier 2005).
Previous studies, tested either in an activity chamber or an open-field,
have demonstrated no significant changes in locomotor activity in male rats and mice
following AAS administration (Clark, Henderson 2003). These data are consistent
79
that we observed in three of the four situations tested in this experiment – training in
chronic treatment; and training and test in acute treatment. These findings reinforce
the hypothesis that AAS do not impair general locomotor activity. However, in test
session after chronic treatment, the distance travelled by TP group was higher than
control group. One study (Martinez-Sanchis, Aragon, Salvador 2002) showed
increased locomotor activity caused by AAS; however, in that study rats were treated
with both AAS and cocaine to assess the effects of interactions between these two
agents on activity. Testosterone alone had no effect on activity, although the activity-
promoting effects of cocaine (10 mg/kg) were enhanced by testosterone (2, 6, 10 and
14 mg/kg). The reasons for the discrepancies are not clear, but may relate to the
difference in the apparatus, type of AAS, and time course of AAS administration
(single exposure versus 30 days). Furthermore, the observed increase in locomotor
activity only in test session can also indicate a deficit in the habituation to the
apparatus since these animals showed a deficit in the retrieval. Thus, it would appear
that additional studies are needed to determine the effects of AAS on the locomotor
effects.
Our data showed that both treatments – chronic and acute – did not alter
the percent time spent in the open arms in in the plus-maze discriminative avoidance
task in both sessions – training and test, suggesting that AAS treatment had no
effects on anxiety-like behavior (Silva et al. 2013). The number of studies that have
evaluated the effects of AAS on anxiety-like behavior is limited and controversial. The
first study (Bitran, Kellog, Hilvers 1993) that investigated the effects of anabolic
steroids on anxiety revealed that rats treated for 06 days with testosterone
propionate displayed an increase in the exploration of the open arms of the elevated
plus-maze, a sign of reduced anxiety. However, in this same study, the behavior of
80
rats exposed to testosterone propionate for 14 days did not differ from controls.
Further, Wistar rats that received a single injection of testosterone (5 mg/kg) 24-h
before testing on Vogel’s conflict test showed behavior consistent with an antianxiety
action of testosterone. Additionally, the effects for rats treated for 06 days occurred in
the absence of any changes in locomotor activity, suggesting a specific effect of the
treatment on anxiety-like behavior rather than a generalized effect on activity. On the
other hand, chronic exposure to high doses of nandrolone decanoate increased
anxiety-like behavior in adult male rats on the elevated plus-maze (Rocha et al.
2007) and in adult male mice, as assessed in both the open-field and elevated plus-
maze tests (Ambar, Chiavegatto 2009). The diversity of AAS effects on anxiety-like
behaviors in rodents is likely to reflect the interactions of age, sex, type(s) of AAS,
the regimen employed to administer them, type of experimental methodologies and
environmental context. For example, in our work rats were subjected to 40 days of
treatment, which differs from other works cited above. In this context, further studies
are needed to elucidate the AAS’s action on anxiety behavior.
The task used in this study, the PM-DAT, allows the evaluation of learning
of aversive arm avoidance by analyzing behavior throughout the training session
(Silva et al. 2004). In the present study, we found no difference in aversive arm
exploration across the training session between treated groups (both in chronic and
acute treatments), suggesting that all animals learned the task. on the other hand,
during the test session in Experiment I (chronic), we found that TP animals spend
more time in aversive enclosed arm (%TAV) than the animals in the control group
suggesting worse retention of the task by animals treated with TP. These findings are
consistent with previous studies that have shown the disrupting effects of a high dose
of nandrolone decanoate on spatial (Magnusson et al. 2009) and social memory in
81
rats (Kouvelas et al. 2008). However, the effects of AAS on memory in avoidance
tasks are incipient. For example, acute (single injection following training) or chronic
(5 weeks) physiological levels of testosterone administration enhances cognitive
performance on the inhibitory avoidance task in adult male rats (Frye et al. 2010
Edinger, Lee, Frye 2004; Frye, Seliga 2001). Additionally, studies have showed that
a single intracerebral administration of several doses of testosterone caused a dose-
dependent impairment of spatial memory (Naghdi, Oryan, Etemadi 2003; Naghdi,
Nafisy, Majlessi 2001), as well as acquisition, consolidation and retrieval of inhibitory
avoidance memory (Harooni et al. 2008). In a previous study we have demonstrated
that chronic administration of testosterone propionate for 40 days resulted in
significant reductions of performance in the novel object recognition task, suggesting
deficit in recognition memory (Silva et al. 2013).
Similar to the endogenous compounds, studies have shown that high
doses of synthetic androgens (nandrolone: 15 mg/kg), when given in daily
subcutaneous injections for either 6 weeks (Kouvelas et al. 2008) or 14 days
(Magnusson et al. 2009) can also impair cognition. Therefore, as reflected by the
diversity of these results, it seems that the lack of consistency between androgens
effects on avoidance tasks might depend on different experimental paradigms that
might include class of androgens, dose, exposure duration, as well as route of
administration.
The underlying mechanisms that mediate AAS-induced impairments of
learning and memory are not clear. Previous studies have shown that AAS-induced
increases in BDNF, reduction of anxiety, memory impairment, and enhancement of
GABAergic transmission (Penatti, Porter, Henderson 2009; Kouvelas et al. 2008) are
mediated by a direct activation of central androgen receptors. Thus, our data suggest
82
that the mechanisms involved in the AAS-induced cognitive deficits are probably
related to long-term mechanisms, since they occur only after prolonged treatments.
However, more studies are needed in order to elucidate the exact processes affected
by EAAs in the brain. .
Conclusion
In conclusion, data reported here extents the studies showing that chronic
AASs affect the cognitive functions in rats. Chronic or acute administrations of TP
were not sufficient to alter anxiety-like behavior; however, long-term exposure of TP
resulted in significant reductions of performance in plus-maze discriminative
avoidance task. Further research is needed to determinate the extent to which high
levels of androgens may influence different aspects of cognitive functions, as well as
the mechanisms underlying these effects.
Acknowledgments
This work was supported by fellowships from CNPQ, CAPES, FAPERN
and PROPESQ/UFRN.
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6 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Com o objetivo de mimetizar o abuso de esteroides anabólicos
androgênicos (EAA) em humanos, consideramos vários aspectos – dose
suprafisiológica, via de administração e cronicidade. Também, com o intuito de
evidenciar os efeitos do tratamento prolongado com esses esteroides também
investigamos comparativamente, o tratamento agudo. Utilizamos o propionato de
testosterona (PT) em uma dose (10mg/kg), aproximadamente, 10 vezes superior à
dose fisiológica e demonstramos que a administração crônica (40 dias),
intramuscular, desse esteroide é capaz de provocar prejuízos cognitivos. Em uma
tarefa de reconhecimento de objetos, observamos que os animais tratados
cronicamente apresentaram prejuízo no reconhecimento de objetos novos,
sugerindo que esses compostos interfiram na memória de reconhecimento. Já na
tarefa da esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado, apesar de não
observarmos déficits no aprendizado da tarefa, ficou claro que os animais tratados
cronicamente apresentaram déficit na evocação da memória uma vez que obtiveram
performances (permaneceram mais tempo nos braços aversivos) piores do que os
animais do grupo controle. É importante destacar que esses prejuízos encontrados
não foram observados nos animais submetidos ao tratamento agudo, reforçando a
hipótese de que o tratamento prolongado é o responsável pelas alterações.
87
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96
ANEXO – Relatório do Projeto de Ações Acadêmicas Associadas / Edital
PROGRAD/PROPESQ/PROEX nº 01/2011
1. Apresentação:
Os esteróides anabólicos androgênicos (EAA), mais conhecidos com o
nome de anabolizantes, são hormônios esteróides da classe dos hormônios sexuais
masculinos, os quais possuem dois efeitos principais sobre o corpo: efeitos
androgênicos e efeitos anabólicos. Os indivíduos que os utilizam visam
especialmente o ganho de massa muscular seja para aumento de desempenho
atlético ou para melhorar a imagem. Vários estudos apontam que o abuso de
anabolizantes é maior (ou vem crescendo) dentre os adolescentes e jovens. No
entanto, no Brasil ainda há uma escassez de estudos que verifiquem com maior
clareza essa problemática. Aliado a esse cenário de uso crescente soma-se a
facilidade na compra dessas substâncias ilegalmente e a desinformação dos danos
que o uso inadequado pode causar a saúde. Nesse sentido e tendo como temática a
hipótese de que ações educativas previnem ou até mesmo impedem a utilização dos
anabolizantes por jovens e adolescentes, o presente projeto propõe a integração
entre as informações teóricas oriundas do ambiente científico, representado por
professores e alunos de graduação e pós-graduação do Departamento de Fisiologia
da UFRN e as informações práticas obtidas, por meio de questionários, nas Escolas
de Ensino Médio da cidade do Natal/RN, representadas pelas informações
prestadas pelos alunos.
2. Atividades Realizadas
O projeto teve início com a seleção dos alunos que iriam integrar o
projeto. Foram selecionados dois alunos bolsistas e dois alunos voluntários, sendo
97
dois três alunos do curso de Biomedicina da UFRN e um aluno do curso de
Farmácia da UFRN.
Após a pesquisa/revisão bibliográfica, definiu-se o questionário a ser
utilizado (adaptamos um questionário utilizado em um estudo anterior); fez-se um
teste piloto com esse questionário em duas escolas públicas na cidade de
Parnamirim (que não integra o rol de escolas do projeto). Após o teste piloto,
fizeram-se pequenas alterações no questionário até que se chegasse ao
questionário final.
O próximo passo foi definir as Escolas Estaduais que iriam integrar o
projeto. Inicialmente, foram pré-selecionadas 20 Escolas Estaduais. Entramos em
contato1 com todas as Escolas pré-selecionadas e destas 17 foram escolhidas,
levando-se em conta as que tivemos autorização dos gestores, facilidade de acesso,
dentre outros fatores. Das 17 selecionadas quatro estão na Zona Leste, quatro na
Zona Oeste, quatro na Zona Sul e cinco na Zona Norte, como pode ser visto abaixo:
a. Zona Leste: Colégio Estadual Atheneu, Escola Estadual Jeronimo
Gueiros, Escola Estadual Winston Churchill e Instituto Padre
Miguelinho;
b. Zona Oeste: Escola Estadual Jean Mermoz, Escola Estadual Raimundo
Soares, Escola Estadual Felizardo Moura e Escola Estadual Prof.
Francisco Ivo Cavalcanti;
c. Zona Sul: Escola Estadual Governador Walfredo Gurgel, Escola
Estadual Desembargador Floriano Cavalcanti, Escola Estadual
Professor Antônio Pinto de Medeiros e Escola Estadual Ferreira
Itajubá;
1 O primeiro contato era sempre realizado pessoalmente pelo aluno doutorando Fernando Roberto Ferreira Silva.
98
d. Zona Norte: Escola Estadual Myriam Coeli, Escola Estadual Zila
Mamede, Escola Estadual Dom José Adelino Dantas, Escola
Estadual Professor Varela Barca e Escola Estadual Professor Ana
Júlia Mousinho.
O número de questionários foi decidido tendo como base o número de
alunos matriculados por Zona da cidade do Natal2. Desta forma, aplicaríamos
questionários que equivalessem a 10% dos alunos matriculados em cada Zona. No
entanto, devido a diversos contratempos (serão explicados mais adiante) não
conseguimos todos os questionários planejados. A relação do número de
questionários esperado e obtidos é a seguinte:
1. Zona Leste: 851 esperados e 435 obtidos;
2. Zona Oeste: 495 esperados e 372 obtidos;
3. Zona Sul: 546 esperados e 814 obtidos;
4. Zona Norte: 828 esperados e 814 obtidos;
5. Total: 2.720 esperados e 2.159 obtidos.
3. Resultados obtidos:
Como mencionado anteriormente, foram coletados dados de 2.159
questionários. A seguir segue relato sucinto dos dados estatísticos:
a. Com relação à série: 38% do 1º ano, 29,5% do 2º ano e 32,6% do 3º
ano do Ensino Médio;
b. Com relação ao sexo: 43,1% do sexo masculino e 56,9% do sexo
feminino;
2 Censo Escolar 2011.
99
c. 54,2% afirmaram que praticam algum esporte ou se exercitam
regularmente (no mínimo duas vezes por semana);
d. 46,2% afirmaram que nunca frequentaram academia de ginástica e/ou
musculação, enquanto que 31,7% afirmaram que já frequentaram,
mas, no momento não estão frequentando, e 22% frequentam
regularmente;
e. Com relação ao uso do álcool: 72,8% afirmaram que não bebem,
14,2% que bebem raramente, 5,3% ocasionalmente, 7,1% apenas em
festas e nos finais de semana e 0,5% regularmente;
f. Com relação ao uso do cigarro: 97,2% afirmaram que não fumam,
1,2% fuma raramente, 0,3% ocasionalmente, 0,6% em festas e nos
fins de semanas e 0,7% regularmente;
g. 26,3% afirmaram que conhecem o nome de algum anabolizante, sendo
os mais citados: durateston, ADE e Decadurabolin;
h. 45,4% afirmaram que sabem com que finalidade os anabolizantes são
usados;
i. 51,3% afirmaram que conhecem alguém que já usou anabolizante;
j. 21,9% afirmaram que alguém já ofereceu anabolizante;
k. Com relação ao comércio de anabolizantes, apenas 18,3% sabem que
a compra só é permitida com receita médica;
l. 42% afirmaram que conhecem alguns dos efeitos indesejados do uso
de anabolizantes;
m.Apenas 1,2% afirmaram que já usaram anabolizantes, no entanto,
11,2% afirmaram que já pensaram em usar anabolizantes,
principalmente, com fins estéticos.
100
Com relação a aspectos mais qualitativos dos resultados podemos
destacar:
Os contatos com os gestores, professores e alunos das Escolas foram
sempre excelentes, inclusive, em muitas delas, fomos informados que se
tratava do primeiro contato da Escola com algum projeto da UFRN, fato que
por si só reforça a importância de projetos como este;
Com relação a aplicação, em si, dos questionários, considerando que a
participação é voluntária, é importante ressaltar a ampla participação dos
alunos que estavam presentes no dia da aplicação.
4. Considerações Finais:
O projeto nos trouxe enorme satisfação em poder incluir alunos, Escolas
que estão quase sempre fora dos trabalhos realizados na UFRN. Além disso,
consideramos que existe sim uma relação objetiva entre as propostas, pois
propomos que os jovens (alunos do Ensino Médio) estão vulneráveis à utilização de
anabolizantes devido a tudo que envolve esse período da vida: autoafirmação,
preocupação com o corpo, dentre outros fatores. E, mais do que isso, considerando
os resultados obtidos, a temática mostrou-se adequada e ficou evidenciada a
necessidade de se trabalhar com profundidade temas dessa natureza com esse
público haja vista que a não informação ou a informação inadequada pode acarretar
diversos problemas à saúde dos alunos.