UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO

BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS

AÇÃO DO METABÓLITO 5-HIDROXI-2-HIDROXIMETIL-GAMA-PIRONA

SOBRE O FUNGO FILAMENTOSO Curvularia pallescens.

JORGE AUGUSTO LEÃO PEREIRA

Belém-Pará 2013

JORGE AUGUSTO LEÃO PEREIRA

AÇÃO DO METABÓLITO 5-HIDROXI-2-HIDROXIMETIL-GAMA-PIRONA

SOBRE O FUNGO FILAMENTOSO Curvularia pallescens.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e

Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da

Universidade Federal do Pará como requisito parcial

para a obtenção do grau de Mestre em Biologia de

Agentes Infecciosos e Parasitários.

Orientadora: Profª. Dra. Edilene Oliveira da Silva

Belém-Pará 2013

1

JORGE AUGUSTO LEÃO PEREIRA

AÇÃO DO METABÓLITO 5-HIDROXI-2-HIDROXIMETIL-GAMA-PIRONA

SOBRE O FUNGO FILAMENTOSO Curvularia pallescens.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes

Infecciosos e Parasitários, do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do

Pará, como requisito para a obtenção do grau de Mestre em Biologia de Agentes Infecciosos e

Parasitários.

Orientador: Profa. Dra. Edilene Oliveira da Silva

Laboratório de Protozoologia, ICB-UFPA

Banca Examinadora: Profa. Dra. Silvia Helena Marques da Silva

Laboratório de Bacteriologia e Micologia, SABMI-IEC

Prof. Dr. Jorge Pereira da Silva

Laboratório de Imunologia Clínica, ICS-UFPA

Prof. Dr. Moysés dos Santos Miranda

Laboratório de Fertilização Animal, ICB-UFPA

Profa. Dra. Jeannie Nascimento dos Santos (Suplente)

Laboratório de Biologia Celular e Helmintologia, ICB-UFPA

Belém, 22 de Abril de 2013

2

A Deus pela força e inspiração.

À minha filha Adrielly pelo privilégio de tê-la como filha.

À minha família pelo apoio e dedicação.

3

“Quanto mais aumenta nosso conhecimento,

mais evidente fica nossa ignorância”.

(John F. Kennedy)

4

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus, pelo dom da vida.

À minha mãe, Lucília Rosa Leão Pereira, pelo amor silencioso e paciente. Ao meu pai,

Boanerges Viana Pereira, referência em sabedoria e perpiscácia. Aos meus irmãos, que de

forma velada, estão sempre na torcida pela realização dos meus sonhos.

À minha filha Adrielly pela compreensão nas minhas ausências necessárias.

À Profª. Drª. Edilene O. Silva, pela oportunidade, orientação, acolhimento, incentivo a

pesquisa, dedicação no desenvolvimento deste trabalho e aos ensinamentos proporcionados.

Ao Profº. Dr. Alberdan Silva Santos do Laboratório de Planejamento e

Desenvolvimento de Novos Fármacos, por ceder o HMP biotecnológico e a infra estrutura do

laboratório de microbiologia onde grande parte deste trabalho foi realizado. Agradeço

também a Márcia e Marcela pelo apoio dispensado durante os experimentos.

À Fernanda pela ajuda no processamento das amostras, pelo ensinamento das técnicas

e por aturar minhas chatices.

À Ana Paula, pela ajuda providencial, auxílio na obtenção das imagens, dicas,

ensinamentos e conselhos que direcionaram este trabalho nos momentos mais difíceis.

Ao Luis Henrique pela ajuda na obtenção e processamento das imagens no

microscópio confocal e citometria.

Ao Davi Oliveira pela ajuda nos resumos em inglês e dicas de quem já tem

experiência de caminhada.

Ao Bruno Martins pela ajuda no espectrofotômetro, gráficos e pelas risadas no

decorrer desses anos.

Amandinhaaa, valeu pelos protocolos quase sempre corretos e pelos artigos sobre

“Lipid droplets”.

Alô Raquel! Ainda bem que você jogou minhas lâminas com poli-L-lisina, elas não

iam funcionar mesmo. “Hoje vou me fazer um agrado”.

Ao Rodrigo Furtado obrigado por guiar-nos na viagem do Rio de Janeiro.

À Paula Frade exemplo de sensibilidade a flor da pele e a maior bandida que eu já

conheci principalmente após passar no mestrado.

À Josineide Pantoja tenho uma inveja branca de estares no Doutorado.

À Caroline Martins pela companhia nos momentos descontraídos no laboratório.

5

À Lienne Silveira pela dedicação integral nos últimos meses. Por ter suportado meu

estresse exacerbado nos momentos difíceis. Sua companhia e ajuda foram fundamentais para

conclusão deste trabalho. Foi bom te conhecer e conviver com você.

Ao Aprígio Nunes pelo exemplo de perseverança. Vamos sair mais vezes pra você

pagar a conta.

Ao Heider pela obtenção análise de microscopia eletrônica de transmissão.

Aos novos alunos do laboratório de protozoologia, Evelen, Ingrid e Sandro pelo

convívio e momentos descontraídos.

À CAPES e INBEB pelo suporte financeiro.

Ao Laboratório de Biologia Estrutural da Universidade Federal Pará.

Ao Instituto Evandro Chagas e Museu Emílio Goeldi pelo uso dos equipamentos para

obtenção das imagens.

Enfim, Agradeço a todos que de alguma maneira contribuíram para a realização deste

trabalho.

6

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS ......... 8

LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS ......... 10

RESUMO . 11

ABSTRACT ........................................................................................................................... 12

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 13

1.1 CARACTERÍSTICAS GERAIS DOS FUNGOS ............................................................. 14

1.2 ESPÉCIECurvulariapallescens .......................................................................................... 16

1.3 MELANINA FÚNGICA .................................................................................................... 17

1.4CORPÚSCULOS LIPÍDICOS ............................................................................................ 19

1.4.1 Biogênese dos Corpúsculos Lipídicos ......................................................................... 20

1.4.2 Função dos Corpúsculos Lipídicos .............................................................................. 21

1.5DROGAS ANTIFÚNGICAS .............................................................................................. 22

1.6 METABÓLITO 5-HIDROXI-2-HIDROXIMETIL-GAMA-PIRONA (HMP) ................ 23

2. JUSTIFICATIVA ............................................................................................................... 25

3. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 26

3.1 OBJETIVO GERAL .......................................................................................................... 26

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................ 26

4. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................... 27

4.1 OBTENÇÃO DO METABÓLITO HMP ......................................................................... 27

4.2 OBTENÇÃO,CULTIVO E MANUTENÇÃO DE Curvulariapallescens ......................... 27

4.3 DILUIÇÃO DO METABÓLITO HMP ............................................................................ 28

4.4ANÁLISE MICROSCÓPICA ............................................................................................. 28

4.4.1 Microscopia Óptica de campo claro (MOCC) ........................................................... 28

4.4.2 Microscopia Eletrônica Varredura (MEV) ................................................................ 28

4.4.3 Microscopia Eletrônica Transmissão (MET) ............................................................. 29

4.5 TESTE DE VIABILIDADE CELULAR EM HIFAS TRATADAS COM HMP USANDO

O FUN-1 .................................................................................................................................. 29

4.5.1 Análise por microscopia óptica de fluorescência ...................................................... 29

4.6 ANÁLISE CITOQUÍMICA PARA DETECÇÃO DE LIPÍDIOS .................................... 30

7

4.6.1Marcação de corpúsculos lipídicos pela coloraçãosudanblack B .............................. 30

4.6.2Detecção de corpúsculos lipídicos pelo marcador fluorescente BODIPY®

............... 30

4.6.3 Detecção de corpúsculos lipídicos pelo método ósmio-imidazol ............................... 31

5.RESULTADOS ................................................................................................................... 32

5.1ANÁLISE DAS CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS ........................................... 32

5.2 ANÁLISE MORFOLÓGICA POR MICROSCOPIA ÓPTICA DE CAMPO CLARO .... 33

5.3 ANÁLISE MORFOLÓGICA POR MICROSCOPIA

ELETRÔNICAVARREDURA(MEV) .................................................................................... 36

5.4 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO (MET) ...................................... 41

5.5 ANÁLISE CITOQUÍMICA DAS VESÍCULAS DE Curvulariapallescens .................... 46

5.5.1 Sudanblack B ................................................................................................................ 46

5.5.2 Bodipy ............................................................................................................................ 49

5.5.3Ósmio-imidazol ............................................................................................................... 54

6. VIABILIDADE DAS CÉLULAS FÚNGICAS ................................................................ 59

7. DISCUSSÃO ....................................................................................................................... 62

8. CONCLUSÃO ..................................................................................................................... 66

9. REFERÊNCIAS ................................................................................................................. 67

8

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Morfologia básica dos fungos ............................................................................... 14

Figura 2 – Representação esquemática da membrana e parede celular fúngica..................... 15

Figura 3 –Características morfológicas de Curvularia. pallescens ........................................ 16

Figura 4 – Representação esquemática das vias de síntese da melanina fúngica ................... 18

Figura 5 – Representação esquemática da biogênese dos corpúsculos lipídicos ................... 21

Figura 6 –Representação esquemáticados alvos de ação das drogas antifúngicas .................. 22

Figura 7 – Estrutura química do HMP .................................................................................... 23

Figura 8 – Características morfológicas da cultura de Curvularia. pallescens, cultivadas com

diversas concentrações de HMP comercial .............................................................................. 32

Figura 9 – Características morfológicas da cultura de Curvularia. pallescens, cultivadas com

diversas concentrações de HMP biotecnológico ..................................................................... 33

Figura 10 – Microscopia óptica de campo claro deCurvularia. Pallescens, cultivados com

diferentes concentrações de HMP comercial e coradas com lactofenol azul de algodão......... 34

Figura 11 – Microscopia óptica de campo claro deCurvularia. Pallescens, cultivados com

diferentes concentrações de HMP biotecnológico e coradas com lactofenol azul de algodão. 35

Figura 12 – Microscopia eletrônica de varredura de Curvulariapallescenscultivados com

diferentes concentrações de HMP comercial........................................................................... 38

Figura 13 – Microscopia eletrônica de varredura de Curvulariapallescens cultivados com

diferentes concentrações de HMP biotecnológico.................................................................... 40

Figura 14 – Microscopia eletrônica de transmissão de Curvulariapallescens cultivados com

diferentes concentrações de HMP comercial........................................................................... 43

Figura 15 – Microscopia eletrônica de transmissão de Curvulariapallescens cultivados com

diferentes concentrações de HMP biotecnológico................................................................... 45

Figura 16 – Microscopia óptica de campo claro de Curvulariapallescens, cultivados com

diferentes concentrações de HMP comercial e marcado com sudanblack B ......................... 47

Figura 17– Microscopia óptica de campo claro de Curvulariapallescens, cultivados com

diferentes concentrações de HMP biotecnológico e marcado com sudanblack B ................. 48

Figura 18– Microscopia confocal de Curvulariapallescens, cultivados com diferentes

concentrações de HMP comercial e incubados com BODIPY®

.............................................. 51

Figura 19– Microscopia confocal de Curvulariapallescens, cultivados com diferentes

concentrações de HMP biotecnológico e incubados com BODIPY®

...................................... 53

9

Figura 20– Microscopia eletrônica de transmissão pelo método ósmio-imidazol de

Curvulariapallescens, cultivado com diferentes concentrações de HMP comercial ............... 56

Figura 21– Microscopia eletrônica de transmissão pelo método ósmio-imidazol de

Curvulariapallescens, cultivado com diferentes concentrações de HMP biotecnológico 58

Figura 22– Microscopia de fluorescência de Curvulariapallescens, cultivados com diferentes

concentrações de HMP comercial e incubados com FUN-1®

.................................................. 60

Figura 23 – Microscopia de fluorescência de Curvulariapallescens, cultivados com diferentes

concentrações de HMP biotecnológico e incubados com FUN-1®

.......................................... 61

10

LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS

°C – Graus Celsius

CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

µg/mL – Microgramas por mililitros

g – Grama

µL – Microlitros

µm – Micrometros

HMP – 5-hidroxi-2-hidroximetil-gama-pirona

M – Molar

mL – Mililitros

MET – Microscopia Eletrônica de Transmissão

MEV – Microscopia Eletrônica de Varredura

MOCC – Microscopia Óptica de Campo Claro

mg/ mL – Miligramas por mililitros

nm- Nanômetro

RPM – Rotação por minuto

UV – Ultravioleta

DHN – 1,8-di-hidroxinaftaleno

L- DOPA – L-3,4-dihidroxifenilalanina

DMP30 – Dimethylaminomethyl phenol

PHEM – Pipes, Hepes, EGTA e Magnésio

pH – Potencial hidrogeniônico

GPY – Sigla inglesa para glicose peptona e estrato de levedura

11

RESUMO

Os fungos são organismos eucarióticos que desempenham um importante papel na

manutenção da vida no planeta. Existem cerca de noventa mil espécies fúngicas descritas,

sendo que apenas algumas destas são patógenos de plantas e animais. A espécie Curvularia

pallescens é um fungo endofítico produtor de melanina que ocasionalmente pode causar

algumas infecções humanas. Atualmente, há alguns estudos acerca dos efeitos antifúngicos de

bioprodutos que possuem baixa toxicidade. O 5-hidroxi-2-hidroximetil-γ-pirona (HMP) é um

metabolito secundário sintetizado por algumas espécies de fungos do gênero Aspergillus. O

HMP possui várias aplicações, principalmente como inibidor da tirosinase, enzima que ajuda

na via biossintética para formação da melanina em células de mamíferos e fungo. Este estudo

avaliou a ação deste metabólito sobre o fungo filamentoso C. pallescens cultivado e tratado

com 25, 50, 100 e 200 µg/ml de HMP comercial e obtido por processos biotecnológicos. A

análise morfológica por microscopia óptica de campo claro, microscopia eletrônica de

varredura e microscopia eletrônica de transmissão, mostrou um acúmulo de estruturas

intracitoplasmáticas semelhantes a corpúsculos lipídicos, externalização de vesículas e

desestruturação da parede celular. Análises citoquímica específicas, sudan black B, bodipy e

ósmio-imidazol, para detecção de lipídio definiram que estas vesículas continham lipídio e

que estavam sendo externalizadas provavelmente por causa da desestruturação da parede

celular provocadas pelo tratamento com HMP. Apesar desses danos celulares apresentados, o

teste de viabilidade celular utilizando FUN-1, mostrou que a viabilidade foi alterada somente

em algumas concentrações de HMP. Esses resultados sugerem que o HMP pode apresentar

ação fungistática e promover alterações importantes na morfologia das células de Curvularia

pallescens as quais podem estar relacionadas à diminuição da viabilidade de algumas células.

Assim, novos estudos são necessários para identificar o mecanismo que induzem estas

alterações.

Palavras-chave: HMP; Fungo; Alterações morfológicas; Curvularia pallescens.

12

ABSTRACT

Fungi are eukaryotic organism that have an important role in maintenance of the life

on the planet. There are approximately ninety thousand fungal species described, with only

some of these are pathogens of plant and animals. The species Curvularia pallescens is

a entophytic fungi and producer of melanin that occasionally causes a variety of human

infections. Nowadays, there are some studies about antifungi effects of bioproducts which

have low toxicity. The 5-hydroxy-2-hydroxymethyl-γ-pyrone (HMP) is a secondary

metabolite synthesized by some species of fungi from Aspergillus genera. The HMP has

several applications mainly as tyrosinase inhibitor, enzyme that helps in biosynthetic pathway

for melanin formation in various mammalian and fungi cells. This study evaluated the HMP

effect on the filamentous fungus C. pallescens cultivated and treated with 25, 50, 100 e 200

µg/ml of HMP. The morphological analysis by bright field optical microscopy, scanning

electron microscopy and transmission electron microscopy of treated cells showed

accumulation of many structures intracytoplasmatic like lipid droplets, vesicles

externalization and disruption of the cell wall. Cytochemical analyses specific, sudan black B,

bodipy and osmium-imidazole, to detect lipid defined that vesicles had lipid e was be

externalised probably by disruption of the cell wall caused by treatment with HMP. Despite

the present cellular damage, the viability test using FUN-1, showed that the viability was

altered only in some concentrations of HMP. These results suggested that HMP may have

fungistatic action and promote significant changes in cell morphology of Curvularia

pallescens, that may be related to decreased of viability of few cells. Thus, further studies are

needed to identify the mechanisms that induce these alterations.

Keywords: HMP; Fungal; Morphological alterations; Curvularia pallescens.

13

1. INTRODUÇÃO

Os fungos são seres eucarióticos, heterótrofos que desempenham um papel essencial

para a manutenção da vida no planeta. Constituem um grupo grande e heterogêneo encontrado

virtualmente em todos os ambientes e são importantes recicladores da matéria orgânica.

Podem viver em simbiose com plantas e animais, além de servirem como alimentos para

produção de drogas (Lacaz et al., 2002). Estão envolvidos também em processos

biotecnológicos produzindo enzimas, fármacos, ácidos orgânicos, proteínas heterólogas e

metabólitos como o 5-hidroxi-2-hidroximetil-gama-pirona (Wang et al., 2005; Ferreira et al,

2010).

Apresentam organizações celulares básicas do tipo leveduriforme e hifal (uni ou

multinucleada). São revestidos por uma parede celular que confere resistência aos desafios

ambientais, sendo constituída basicamente de quitina e outros polissacarídeos como glicanas e

mananas, possuindo uma porção fibrilar e outra amorfa, composição que pode variar entre os

filos do reino fungi (Tortora et al., 2005).

Sua nutrição ocorre através da secreção para o ambiente externo de uma grande

variedade de enzimas como hidrolases e peroxidases, além de outros metabólitos secundários.

São capazes de decompor os substratos em moléculas menores para que possam atravessar a

parede e a membrana celular. A reserva energética baseia-se no armazenamento de glicogênio

(Papagianni, 2004).

Estima-se que existam cerca de um milhão e meio de espécies fúngicas, com

aproximadamente noventa mil descritas, sendo algumas destas patógenos de plantas e animais

(Margulis & Schwartz, 2001; Putzke & Putzke, 2004). Em alguns fungos, a patogênese

baseia-se principalmente na produção de glicoproteínas, enzimas e pigmentos (Eisenman et

al., 2009). Uma grande variedade de fungos produz pigmentos com diversas funções com

grande destaque para a melanina, um pigmento escuro, que protege contra dissecação,

temperaturas extremas, osmose, radicais de oxigênio, radiação ionizante e radiação

ultravioleta (Wang & Casadevall, 1994; Bryan et al., 2011; Khajo et al., 2011). Dentre as

espécies produtoras de melanina, destaca-se o fungo Curvularia pallescens, alvo de estudo

neste trabalho.

14

1.1. CARACTERÍSTICAS GERAIS DOS FUNGOS

Os fungos são seres eucarióticos pluricelulares e unicelulares que possuem, na grande

maioria, genoma haplóide. São multinucleados e possuem reprodução sexuada e assexuada.

Não possuem pigmentos fotossintéticos, utilizando fontes energéticas do ambiente onde

vivem para obter compostos orgânicos necessários para seu crescimento e armazenamento de

energia. Os principais compostos armazenados compreendem açucares, alcoóis e lipídios.

Fungos apresentam vida livre, mas podem estabelecer relação mutualística ou parasitária com

outros organismos. Os fungos estão distribuídos em quatro grandes divisões:

Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota e Basidiomycota. Essa divisão baseia-se nas

estruturas esporuladoras originadas sexuadamente (zoósporo, ascósporo e basidiósporos). Os

fungos que não produzem essas estruturas são denominados fungos mitospóricos

(anamórficos) e são colocados em categorias artificiais como a divisão Deuteromycota ou

subdivisão Deuteromycotina constituindo os fungos imperfeitos (Esposito & Azevedo, 2010).

Quanto à morfologia, os fungos apresentam-se sob duas formas principais,

filamentosa ou hifal e leveduriforme. A primeira possui forma tubular, contendo normalmente

um ou mais núcleos. Podem apresentar paredes transversais denominadas septos que em

algumas espécies possuem poros centrais que permitem o fluxo de material citoplasmático

entre os compartimentos. As hifas que não possuem septos são chamadas de cenocíticas. As

leveduras são células arredondadas que se reproduzem por brotamento (Figura 01).

Figura 1: Morfologia básica dos fungos. (A) hifa cenocítica; (B) hifa Septada; (C) levedura.

Fonte: Winn jr et al., 2008 modificado.

15

As duas formas possuem uma membrana celular constituída por uma bicamada fosfolipídica

intimamente associada a uma parede rígida constituída basicamente por quitina e glucanas,

formando um envoltório que confere resistência as condições adversas do ambiente (Figura

02) (Esposito, 2010). Assim como os demais eucariontes, os fungos apresentam, organelas

que de modo geral desempenham papel similar a de animais e plantas. Possuem núcleo,

mitocôndria e ribossomos que desempenham importante papel no metabolismo oxidativo de

energia e síntese de proteínas. O retículo endoplasmático está associado a secreção de

proteínas (Griffin, 1994). A maioria das espécies fúngicas apresentam complexo de golgi

atípico, constituído de cisternas únicas ou tubulares localizado no ápice das hifas e estão

relacionados a seu cescimento (Bracker et al., 1996). Outras organelas como os vacúlos são

compartimentos intracelulares que podem estar relacionados ao armazenamento de nitrogênio,

empacotamento de enzimas hidrolíticas e síntese e secreção de polissacarídeos extracelulares

(Griffin, 1994; Esposito, 2010). O microcorpo é uma organela que recebe denominação

dependo das enzimas que produzem, quando contêm oxidases produtoras de peróxido de

hidrogênio e catalase são denominados peroxissomos, quando produzem enzimas de beta

oxidação são denominados glioxissomos e ao armazenarem hidrogenases e enzimas

associadas denominam-se hidrogenossomos (Griffin, 1994). Uma organela fúngica que vem

ganhando destaque nos últimos tempos são os corpúsculos lipídicos, que possuem membrana

simples, podem ser observados em esporos e hifas e parecem derivar do retículo

endoplasmático (Esposito, 2010).

Figura 2: Representação esquemática da membrana e parede celular fúngica. Fonte: Kartsonis

et al., 2003 modificado.

16

1.2. ESPÉCIE Curvularia pallescens

O gênero Curvularia pertence ao grupo dos fungos demáceos e está inserido no filo

Ascomycota, classe Euascomycetes, ordem pleosporales e família Pleosporaceae. Habitam

regiões tropicais e subtropicais, e estão presentes no solo e vegetais. Possui cerca de trinta e

cinco espécies, sendo que a maioria é patógeno de plantas (Assunção et al., 2006). Algumas

espécies como C. lunata, C. pallescens e C. geniculata, são patógenos oportunistas podendo

causar infecções em humanos e animais. Estas espécies já foram recuperadas de infecções

humanas como: ceratite micótica, sinusite, endocardite, peritonite, micetoma e infecções do

sistema nervoso central (Ellis et al., 2007; Carter & Boudreaux, 2004; Berbel et al., 2011). As

principais formas de infecção ocorrem através da inalação ou inoculação por soluções de

continuidade da pele (Vachharajani et al., 2005).

A espécie C.pallescens é um patógeno de plantas e animais que apresenta colônias

com bordas irregulares, anverso cotonoso acinzentado e verso variando do castanho ao preto

(Figura 3 A e B). A conidiação é do tipo simpodial, ou seja, brotamento a partir de gemas

laterais (Figura 3 C). Os conídios são retos ou geniculados com três septos e quatro células,

sendo que a segunda é mais volumosa (Freire, 1998).

Figura 3: Características morfológicas de Curvularia pallescens. A) Anverso da cultura; B)

Verso da cultura C) Microcultivo. Fonte: próprio autor.

17

1.3. MELANINA FÚNGICA

A melanina é um pigmento, ubíquo no reino biológico, formado pela polimerização de

compostos fenólicos ou indólicos e apresenta inúmeras funções biológicas (Plonka &

Grabacka, 2006). Em mamíferos a síntese de melanina ocorre em células especializadas

denominadas melanócitos sendo mediada pela enzima tirosinase.

Nos fungos ela ocorre através de duas vias principais, a via DHN (1,8-di-

hidroxinaftaleno) (Figura 4 A) e a via L-dopa (L-3,4-dihidroxifenilalanina) (Figura 4 B). A

melanina da via DHN é catalisada pela enzima policetídeo síntase que tem como substrato

moléculas endógenas provenientes do metabolismo celular como a acetil-CoA e malonil-CoA.

Através de reações de redução e desidratação produz intermediário como o 1,3,8-

trihidroxinaftaleno levando a formação do 1,8-dihidroxinaftaleno o qual sofre polimerização

levando à formação de melanina. A segunda é a via L-dopa, semelhante a dos mamíferos,

mediada pelas enzimas tirosinase e lacase. As precursoras nesta via são moléculas exógenas

como tirosina e L-dopa. Quando L-dopa é a molécula precursora a oxidação para

dopaquinona é feita pela lacase. Quando tirosina é o precursor, esta é convertida em L-dopa e

a seguir em dopaquinona. Estas duas etapas são mediadas pela tirosinase (Eisenman &

Casadevall, 2012).

18

Figura 4: Representação esquemática das vias de síntese da melanina fúngica. (A) Via DHN

(1,8-dihidroxinaftaleno); (B) Via L-DOPA (L-3, 4-dihidroxifenilalanina). Fonte: Eisenman &

Casadevall, 2012 modificado.

O local de síntese de melanina fúngica é bem caracterizado em algumas espécies como

Fonsecaea pedrosoi que ocorre em vesículas semelhantes à melanossomos dos mamíferos

(Franzen et al., 2006). Em Cryptococcus neoformans a melanização ocorre em vesículas

presentes na parede celular (Eisenman et al., 2009; Eisenman & Casadevall, 2012).

A melanina fúngica desempenha um papel essencial na biologia e patogênese dos

fungos (Revankar & Sutton, 2010). A sua característica multifuncional baseia-se em suas

características moleculares, que a torna estável e capaz de resistir a processos físico-químicos.

Em fungos patogênicos humanos a função da melanina é bem descrita atuando através de

vários mecanismos. A melanina protege contra radicais livres, “burst oxidativo” (Schnitzler et

al., 1999) e tem ação antioxidante (Jacobson et al., 1995; Gonçalves & Sponchiado, 2005).

19

Fungos melanizados são menos suscetíveis a fagocitose de neutrófilos e macrófagos

(Hayakawa et al., 2006). Nos fungos endofiticos, produtores de melanina, a presença de

apressórios melanizados são essenciais para penetração destas estruturas nos tecidos do

hospedeiro (Gachomo et al., 2010).

Além disso, fungos melanizados são mais resistentes a terapia antifúngica (Van Duin

et al., 2002; Paolo et al., 2006). Essa resistência pode ser devido à ligação das drogas com a

melanina causando bloqueio do fármaco. A melanina pode ligar-se a anfotericina B, uma

droga antifúngica, provocando uma redução na concentração da droga em solução (Ikeda et

al., 2003). Essa função variada da melanina pode explicar o potencial patogênico dos fungos

melanizados (Revankar & Sutton, 2010).

1.4. CORPÚSCULOS LIPÍDICOS

Corpúsculos lipídicos (CL) são estruturas esféricas intracitoplasmáticas,

funcionalmente ativas, encontradas em vários tipos celulares (mamíferos, bactérias, fungos e

plantas) (Murphy, 2001, Reue, 2011, Zhang et al. 2010). Classicamente eram vistos apenas

como reservatório do excesso de gordura, contudo novos estudos acerca da biologia dos CL

têm mostrado que proteínas estão associadas a sua monocamada fosfolipídica, conferindo

função semelhante à de organelas (Murphy et al. 2009, Thiele & Spandl 2008; Tauchi-Sato et

al. 2002). Essas organelas compartimentalizam enzimas envolvidas na biossíntese, transporte

e catabolismo de lipídios (Waltermann et al., 2005).

Esses corpúsculos apresentam em sua superfície, algumas proteínas específicas, como

as pertencentes ao grupo PAT (Perilipinas, ADRP e TIP 47), que estão envolvidas no

armazenamento de lipídio, montagem e biogênese dos CL. Algumas proteínas são

encontradas dentro do ambiente hidrofóbico do corpúsculo, contudo suas funções ainda

permanecem sem entendimento (Robenek et al. 2005, Robenek et al. 2009).

Os CL são bem heterogêneos, possuindo tamanhos que variam de 0.1 a 200 μm de

diâmetro e tal característica pode estar relacionada ao estágio de maturação dessas organelas

(Saka & Valdivia, 2012). A constituição lipídica desses corpúsculos consiste principalmente

de triacilgliceróis (TAG), diacilgliceróis (DAG) e ésteres-esteróis, podendo variar

dependendo do tipo celular (Rinia et al. 2008). Adipócitos apresentam em sua constituição o

predomínio de TAG, enquanto que em leveduras, TAG e ésteres-esteróis estão distribuídos

igualitariamente na célula (Bartz et al. 2007, Leber et al. 1994, Tauchi-Sato et al. 2002).

20

1.4.1. Biogênese dos Corpúsculos Lipídicos

O retículo endoplasmático (RE) é a organela que está diretamente envolvida na

formação dos CL devido possuir a maioria das enzimas necessárias para a biossíntese dos

triacilgliceróis, fosfolipídios e esterificação de esteróis (Murphy, 2001). Atualmente existem

vários modelos que explicam a formação dos corpúsculos lipídicos. Segundo Ohsaki et al.,

2009, três modelos principais são descritos na literatura para demonstrar essa formação.

A hipótese mais aceita para a formação dos CL, sugere que lipídios neutros (LN) em

células de mamíferos acumulam-se entre os espaços da membrana do RE, causando uma

curvatura no folheto citosólico da membrana do retículo com posterior liberação do CL

totalmente formado (Figura 5) (Murphy & Vance, 1999, Ohsaki et al., 2009). O segundo

modelo sugere que a gênese ocorra de forma semelhante ao primeiro modelo, exceto pelo

fato, de os CL ficarem fisicamente conectados ao RE gerando um domínio rico em LN (Saka

& Valdivia, 2012). Um terceiro modelo, chamado de escotilha, postula que após os LN

acumularem-se no espaço intermembranar do RE essa região seria clivada e liberada para o

citosol.

Os CL são encontrados próximos a organelas como mitocôndrias, e peroxisomos as

quais acessam esses lipídios para β-oxidação de ácidos graxos e fornecimento de precursores

para lipidação de proteínas, biossíntese fosfolipídica e biogênese de membrana (Murphy,

2001, Binns et al. 2006, Van Meer et al. 2008).

21

Figura 5: Representação esquemática da biogênese dos corpúsculos lipídicos. Fonte: Martin &

Parton, 2006 modificado.

1.4.2. Função dos Corpúsculos Lipídicos

Os CL podem ser considerados como uma organela multifuncional que está envolvida

em vários processos celulares como sinalização celular e autofagia (Murphy et al., 2009;

Shibata et al., 2009). Uma característica que merece destaque é a relação dos CL com a

patogênese. Agentes patogênicos como vírus, bactérias intracelulares e protozoários induzem

o acúmulo de lipídios na célula hospedeira para posterior utilização nas suas necessidades

metabólicas. Vírus da família flaviviridae como da hepatite C e da dengue possuem proteínas

que se ligam aos corpúsculos lipídicos obtendo precursores para a montagem de novos vírus

(Moradpour et al., 1996; Samsa et al., 2009). Os processos inflamatórios desencadeados por

muitos agentes infecciosos induzem o acúmulo de corpúsculos lipídicos em células do sistema

imune inato como macrófagos, neutrófilos e eosinófilos (Melo et al., 2011). Bactérias

intracelulares como M. tuberculosis e M. leprae associam-se aos CL utilizando-os como fonte

de nutrientes (Daniel et al., 2011; Mattos et al., 2010, Mattos et al., 2011). O protozoário

Trypanosoma cruzi induz acúmulo de CL em macrófagos, que são recrutados para o vacúolo

22

parasitóforo (Melo et al., 2006). Evidências sugerem que os CL também possam participar

como mediadores da resposta imune (Saka & Valdivia, 2012).

Além desses microorganismos, que podem acumular corpúsculos lipídicos em seu

citosol, os fungos de um modo geral merecem destaque, pois ultimamente pouco se sabe

sobre os mecanismos de biogênese dos corpúsculos lipídicos nesses organismos. Alguns

fungos patogênicos, como Plasmodiophora brassicae utilizam os CL durante a formação de

suas estruturas reprodutivas (Losel & Sancholle, 1996).

1.5. DROGAS ANTIFÚNGICAS

Segundo Allen (2010) as principais drogas antifúngicas disponíveis atualmente no

mercado são classificadas como azóis, polienos, equinocandinase e inibidores mitóticos

(Figura 6). Os dois primeiros compostos baseiam-se na inibição de ergosterol e as

equinocandinas inibem a síntese de β-1,3-D-glicano da parede celular. Apesar de sua ação de

amplo espectro, esses antifúngicos, apresentam elevada nefrotoxicidade e hepatotoxicidade.

Além de inúmeros efeitos colaterais como: febre, calafrios, vômitos, diarréia, erupções

cutâneas (Allen, 2010; Lewis, 2011).

Figura 6: Representação esquemática dos alvos de ação das drogas antifúngicas. Fonte:

Lewis, 2011 modificado.

23

1.6. METABÓLITO 5-HIDROXI-2-HIDROXIMETIL-GAMA-PIRONA (HMP)

O HMP ou ácido kójico (Figura 7) é um metabólito secundário produzido por fungos

do gênero Aspergillus e Penicillium a partir de várias fontes de carbono (Rukachaisirikul et

al., 2007; Mohamad et al., 2010). É uma substância cristalina solúvel em água etanol e

acetona (Gomes et al., 2001).

Figura 7: Estrutura química do HMP. Fonte: Chang et al., 2009.

O HMP possui aplicabilidade variada, sendo utilizado principalmente como inibidor

da tirosinase (Papagianni, 2004; Chang et al., 2009), agente antioxidante, aditivo alimentar

(Bentley, 2006; Chusiri et al., 2011), no tratamento de melasma como agente despigmentante

(Lin et al., 2007), ação antitumoral (Tamura et al., 2006), atividade radioprotetora (Bryan et

al., 2011) e atividade fungistática (Chee & Lee, 2003). Além disso, apresentam ação ativadora

e proliferativa sobre células do sistema imune, como macrófagos (Rodrigues et al., 2011).

A ação antioxidante do HMP foi observada em cultura de neutrófilos onde houve uma

diminuição significativa das espécies reativas de oxigênio no sobrenadante. Além disso, os

neutrófilos tratados com HMP apresentaram aumento na quantidade de cálcio intracelular, íon

envolvido na produção de mediadores inflamatórios e na ativação celular (Niwa & Akamatsu,

1991). Devido à ação antioxidante o HMP é usado como aditivo alimentar possibilitando que

frutas, verduras e legumes sejam preservados por mais tempo (Burdok et al., 2001).

A ação clareadora do HMP também foi observada em peixes escuros que eram

alimentados com comidas suplementada com HMP e tornaram-se marrons após 49 dias de

tratamento (Bentley et al., 2006). Esta ação deve-se ao fato deste metabólito ser um potente

inibidor da tirosinase, enzima fundamental para síntese de melanina (Bentley et al., 2006; Mi

24

ha et al, 2007). O HMP é utilizado eficientemente como despigmentante, demonstrando ser

tão eficaz quanto à hidroquinona no tratamento de melasma (Lim et al., 1999).

O HMP tem atividade proliferativa em hepatócitos de camundongos que sofreram

hepatotomia e foram tratados por quatro semanas com alimentos contendo 3% HMP (Moto et

al., 2006; Kono et al., 2007). Em camundongos com lesão na tireóide, tratados por oito

semanas com alimentos suplementados com 2% HMP não foi observada proliferação celular

anormal (Tamura et al., 2006).

Outra aplicação recente desse metabólito é o seu uso como radioprotetor contra

irradiação gama. Essa ação pode estar relacionada com a formação de complexos com

manganês e zinco, que passam a possuir grande estabilidade hidrolítica, tornando-se altamente

lipofílicos ou ainda, devido à atividade antioxidante (Emami et al., 2007; Hosseinimehr et al.,

2009).

Sua ação sobre patógenos humanos foi demonstrada recentemente por nosso grupo,

"Rodrigues (Comunicação Pessoal)", em protozoário do gênero leishmania. Em helminto,

como Schistosoma mansoni, foi detectada diminuição da produção de ovos do parasito devido

à inibição da enzima tirosinase, presente nos vermes adultos (Fitzpatrick et al., 2007). Sua

ação fungistática foi descrita por Chee & Lee (2003), em três espécies de fungos produtores

de melanina. Em fungos filamentosos o HMP parece agir sinergicamente com drogas

antifúngicas convencionais potencializando sua ação (Kim et al., 2013). Entretanto, não existe

na literatura nenhum trabalho descrevendo alterações morfológicas em fungos provocadas

pelo HMP.

25

2. JUSTIFICATIVA

O número de infecções fúngicas tem aumentado nos últimos anos acometendo

severamente pacientes imunocomprometidos. Essas infecções, assim como os fármacos

antifúngicos, têm recebido pouca atenção das autoridades competentes e o surgimento de

novas drogas não tem acompanhado o aumento crescente de micoses em humanos (Di Santo,

2010). Os principais quimioterápicos disponíveis atualmente para o tratamento das doenças

fúngicas, apesar de apresentarem amplo espectro de ação, são altamente tóxicos e

desencadeiam inúmeros efeitos adversos (Allen, 2010; Lewis, 2011). Nos últimos trinta anos

a resistência a antifúngicos tem aumentado devido a fatores intrínsecos aos microrganismos

assim como falhas no tratamento dos pacientes (Pfaller et al., 2011; Wandeputte et al., 2012).

Atualmente há uma tendência da análise das propriedades antifúngicas de compostos naturais

bioativos isolados de diversas fontes biológicas (Mayer et al., 2011).

Portanto, torna-se necessário o desenvolvimento de novos compostos antifúngicos que

atuem em novos alvos específicos. Estudos demonstram que o HMP, um metabólito

secundário produzido pelo gênero Aspergillus, atua como um importante inibidor da síntese

de melanina, além de ativar monócitos e macrófagos. Desta forma, considerando que a

melanina fúngica desempenha um papel protetor para os fungos e a inexistência de trabalhos

na literatura que mostre a ação do HMP sobre as alterações morfológicas em fungos

produtores de melanina, o presente estudo buscou elucidar essas questões.

26

3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO GERAL

Analisar a ação do metabólito secundário, 5-hidroxi-2-hidroximetil-gama-pirona

(HMP), sobre o fungo Curvularia pallescens.

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

(1) Analisar a ação do HMP sobre conídios e hifas de Curvularia pallescens;

(2) Comparar a ação do 5-hidroxi-2-hidroximetil-gama-pirona HMP comercial e o

HMP biotecnológico sobre o fungo Curvularia pallescens;

(3) Analisar a viabilidade fúngica após tratamento com HMP;

(4) Observar alterações morfológicas das células fúngicas tratadas com HMP.

27

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. OBTENÇÃO DO METABÓLITO HMP

O HMP comercial foi obtido da empresa (Sigma-Aldrich) e o HMP biotecnológico foi

obtido no laboratório de Desenvolvimento de Fármacos da Universidade Federal do Pará

(UFPA). Fungos do gênero Aspergillus foram cultivados em meio Czapek-Dox sólido. Deste

cultivo foi feita uma suspensão de esporos da qual foram inoculados 5 mL em frascos

contendo 400 mL de meio líquido Czapek-Dox e incubados por 10 dias. Posteriormente,

foram realizados repiques a fim de aumentar o crescimento dessa cultura em frascos contendo

500 mL de meio líquido Czapek-Dox (pH 5,5) suplementados com 6% de amido de mandioca

devidamente esterilizado (121 ºC / 15 minutos). Os frascos foram colocados em incubadora

com agitação e temperatura fixas (120 rpm a 28 ºC). A fase líquida obtida do meio de cultura

foi submetida à filtração e em seguida à liofilização para obtenção do material bruto

concentrado. O conteúdo foi transferido para frascos contendo solução de etanol e água na

proporção de 80:20. Extrações consecutivas foram realizadas e os produtos resultantes foram

concentrados por evaporação. O HMP foi obtido por cristalização.

A espectroscopia de ressonância magnética nuclear foi utilizada para caracterizar a

substância. A pureza foi avaliada por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE),

sendo considerado puro o material cristalizado com pureza acima de 95%. A estrutura do

HMP foi caracterizada por ultravioleta (UV) utilizando os filtros com comprimentos de onda

de 269 nm (para detecção do HMP).

4.2. OBTENÇÃO, CULTIVO E MANUTENÇÃO DE Curvularia pallescens.

As cepas fúngicas de C. pallescens foram obtidas no Laboratório de Microbiologia do

Instituto Ciências Exatas e Naturais da Universidade Federal do Pará e cultivadas em meio

GPY sólido e líquido (20g glicose, 20g ágar, 5g peptona sódica, 5g extrato de levedura em

1000 mL de água destilada). As amostras foram preservadas em glicerol 5%.

28

4.3. DILUIÇÃO DO METABÓLITO HMP

A solução estoque foi preparada em uma concentração final de 1 mg/mL e diluída em

H2O destilada. As concentrações de 25, 50, 100, 200 µg/mL utilizadas nos experimentos

foram obtidas a partir dessa solução.

4.4. ANÁLISE MICROSCÓPICA

As células de C. pallescens, utilizadas na microscopia, foram obtidas através do

cultivo em meio de cultura GPY sólido e líquido. Em meio sólido foi feito macro e

microcultivo. Para o macrocultivo, fragmentos micelias foram inoculados na superfície do

meio e cultivados por oito dias permitindo o desenvolvimento completo do fungo, enquanto

que para o microcultivo, as células foram cultivadas de acordo com Riddell, 1950. O cultivo

em meio líquido foi feito em placas de 24 poços e mantidos por oito dias em temperatura

ambiente.

4.4.1. Microscopia Óptica de Campo Claro (MOCC)

As células fúngicas cultivadas por oito dias em meio GPY e tratadas com HMP

comercial e biotecnológico, nas concentrações de 25, 50, 100, 200 µg/mL foram coradas com

lactofenol azul de algodão e analisada em microscópio óptico Axiophot Zeiss.

4.4.2. Microscopia Eletrônica Varredura (MEV)

As amostras provenientes do microcultivo foram processadas para MEV. Estas foram

fixadas em uma solução de glutaraldeído 1%, paraformaldeído 4%, sacarose 2,5 % e tampão

PHEM (Pipes, Hepes, EGTA e Magnésio) 0,1 M pH 7,2 por uma hora em temperatura

ambiente e posteriormente colocadas em uma solução contendo glutaraldeído 2,5%,

paraformaldeído 4%, cloreto de cálcio 2,5 mM e tampão cacodilato 0,1MpH 7,4 por uma hora

em temperatura ambiente. Após essa etapa as lamínulas foram lavadas três vezes em tampão

cacodilato 0,1M pH 7.2, pós-fixadas em solução contendo tetróxido de ósmio 1% e

ferrocianeto de potássio1% por uma hora em temperatura ambiente protegidos da luz. As

células aderidas às lamínulas foram lavadas novamente por três vezes no mesmo tampão e

desidratadas em uma série gradual de etanol a 20, 30, 50, 70, 90% (15 minutos cada) com

duas passagens em etanol 100% (20 minutos cada). As amostras foram submetidas ao ponto

crítico de CO2, aderidas em suportes “stubs” com fita de carbono e metalizadas com ouro. As

células foram analisadas em microscópio eletrônico de varredura LEO 1450 VP.

29

4.4.3. Microscopia Eletrônica Transmissão (MET)

C. pallescens foram cultivadas em meio GPY e tratadas com 25, 50, 100, 200 μg/mL

de HMP diluído em H2O destilada. O tratamento foi realizado com 200 μL dessas soluções de

uso, as quais foram inoculadas na superfície do meio de cultura e espalhadas com alça de

Drigalski. Após oito dias de cultivo a superfície das culturas, região intermediária entre o

centro e a periferia, foi raspada com alça “L”, fixadas e pós-fixadas conforme descrito no item

4.4.2. A desidratação foi feita em série gradual de acetona 20, 30, 50, 70, 90% (15 minutos

cada etapa) e duas passagens em acetona 100% (20 minutos cada). Foi feita infiltração em

resina epon/acetona nas concentrações: 1:2, 1:1, 2:1 (12 horas cada). Após infiltração, o

material foi colocado em epon puro com DMP-30 (substância polimerizadora), por 12 horas

em geladeira, emblocados e incubados em estufa a 60 °C por 48 horas para polimerização. Os

cortes ultrafinos foram feitos em ultramicrótomo (Leica EM UC6), posteriormente

contrastados com acetato de uranila e citrato de chumbo e observados em microscópio

eletrônico de transmissão LEO 906 E.

4.5. TESTE DE VIABILIDADE CELULAR EM HIFAS TRATADAS COM HMP

USANDO O FUN®1.

O FUN®1 (2-chloro-4-(2,3-dihydro-3-methyl-(benzo-1,3-thiazol-2-yl)-methylidene)-1-

phenylquinolinium iodide) é uma sonda fluorescente que em células mortas apresenta

fluorescência difusa variando do verde ao amarelo. Em células metabolicamente ativas é

convertida em estruturas cilíndricas intravacuolares entre o vermelho e o alaranjado, com

diminuição da fluorescência verde citoplasmática. Esta conversão ocorre através do

processamento dos compartimentos ácidos da via endocítica que está preservada em células

metabolicamente ativas.

4.5.1. Análise por microscopia óptica de fluorescência

Fragmentos fúngicos, obtidos a partir de cultura sólida foram inoculados em meio

GPY líquido e cultivados por oito dias. Após esse período 100 µL da cultura líquida foram

retirados e inoculados em placas de 24 poços contendo lamínulas e meio de cultura

suplementado com HMP comercial e biotecnológico nas concentrações de 25, 50, 100, 200

µg/mL e incubados a temperatura ambiente por oito dias. Os controles negativos (células

mortas) foram obtidos após fixação com metanol 100%. As lamínulas contendo hifas aderidas

foram incubadas por 1h com FUN®1 na concentração de 6,25 µM à temperatura ambiente,

30

protegidas da luz e lavadas três vezes com PBS por 10 minutos cada, montadas com

ProLong®

Gold antifade e analisadas em microscópio óptico Axiophot Zeiss.

4.6. ANÁLISE CITOQUÍMICA PARA DETECÇÃO DE LIPÍDIOS

4.6.1. Marcação de corpúsculos lipídicos pela coloração sudan black B

O Sudan Black B é um corante que se liga a lipídios e triglicerídeos neutros. As

lamínulas provenientes do microcultivo foram fixadas em solução de etanol 70% por 20

minutos e lavadas em H2O destilada. As células aderidas nas lamínulas foram incubadas com

solução filtrada de Sudan Black B em etanol 70% por 15 minutos. Após esse período, o

excesso de corante foi retirado utilizando etanol a 70%. As lamínulas foram lavadas com água

destilada, montadas com Entellan®

e analisadas em microscópio óptico Axiophot Zeiss.

4.6.2. Detecção de corpúsculos lipídicos pelo marcador fluorescente BODIPY®

O BODIPY®

(4,4-difluoro-3a,4a-diasa-s-indacene) é um marcador fluorescente

altamente lipofílico, que marca principalmente lipídios neutros presentes em corpúsculos

lipídicos e membrana celular. O comprimento de onda para análise varia de 500 à 650 nm.

As lamínulas provenientes do cultivo em meio líquido foram fixadas com

paraformaldeído 4% por 20 minutos a temperatura ambiente e lavadas com PBS 3 vezes por

10 minutos cada. Em seguida as lamínulas foram incubadas com BODIPY®

, na concentração

de 1 µg/mL em PBS por 30 minutos à temperatura ambiente protegido da luz, para detecção

dos lipídios neutros presentes nos corpúsculos do microorganismo. Em seguida, as lamínulas

foram lavadas 3 vezes, por dez minutos cada em PBS. Após a secagem das lamínulas, estas

foram montadas em lâminas de vidro com ProLong®

Gold antifade e analisadas em

microscópio confocal a laser LSM 5 Pascal Zeiss.

31

4.6.3. Detecção de corpúsculos lipídicos pelo método ósmio-imidazol (Angermüller &

Fahini, 1982)

O complexo ósmio-imidazol penetra rapidamente nas células facilitando a interação da

molécula de tetróxido de ósmio com os lipídios insaturados contrastando fortemente as

inclusões lipídicas. A contrastação deve-se ao imidazol com forte capacidade de ligar-se a

metais.

As células provenientes do macrocultivo foram fixadas como descrito no item 4.4.2.

Após a fixação, as células foram lavadas por 10 minutos em tampão cacodilato 0,1 M, pH 7,2

e em tampão imidazol 0,1 M, pH 7,5. Posteriormente foram pós-fixadas em uma solução de

tetróxido de ósmio a 2% e tampão imidazol 0,1 M, pH 7,5 por 30 minutos à temperatura

ambiente, protegido da luz. As células foram lavadas duas vezes em tampão imidazol 0,1M,

desidratadas em acetona e incluídas em resina como descrito no item 4.4.3. Os cortes

ultrafinos obtidos foram contrastados durante 20 minutos com acetato de uranila 5%, e

durante 5 minutos com citrato de chumbo. Ao final o material foi observado em Microscópio

Eletrônico de Transmissão, LEO 906 E. Tanto as células tratadas quanto o grupo controle,

sem tratamento, foram submetidas ao mesmo processamento.

32

5. RESULTADOS

5.1. ANÁLISE DAS CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS

A cultura em meio sólido do fungo C. pallescens tratado com HMP comercial e

biotecnológico, em diferentes concentrações apresentou diferenças significativas durante o

período de tratamento. Em relação à morfologia da colônia, houve aparente redução no

tamanho, bem como diminuição na pigmentação do micélio vegetativo, observada

principalmente nas culturas tratadas com HMP na concentração de 200 µg/mL (Figuras 8 E2 e

9 E2), quando comparadas ao grupo controle (Figuras 8 A2 e 9 A2).

Figura 8: Características morfológicas da cultura de Curvularia pallescens, cultivadas com

diversas concentrações de HMP comercial. (A1) controle sem tratamento; (B1-E1) tratadas

com 25, 50, 100, 200 µg/mL de HMP comercial, respectivamente; (A1-E1) anverso da

cultura; (A2-E2) verso da cultura.

33

Figura 9: Características morfológicas da cultura de Curvularia pallescens, cultivadas com

diversas concentrações de HMP biotecnológico. (A1) controle sem tratamento; (B1-E1)

tratadas com 25, 50, 100, 200 µg/mL de HMP biotecnológico, respectivamente; (A1-E1)

anverso da cultura; (A2-E2) verso da cultura.

5.2. ANÁLISE MORFOLÓGICA POR MICROSCOPIA ÓPTICA DE CAMPO CLARO

A análise por microscopia óptica de campo claro de C. pallescens, mostrou algumas

alterações morfológicas, após tratamento com HMP comercial e biotecnológico. Hifas e

conídios sem tratamento apresentaram morfologia característica, como parede íntegra da hifa

e conídio alongado (Figura 10 A e 11 A). As células tratadas com diferentes concentrações de

HMP comercial (Figura 10 B-E) e HMP biotecnológico (Figura 11 B-E) mostraram um

aumento no número de vesículas intracitoplasmáticas nas hifas e conídios. Além disso, foi

observada discreta diminuição na melanização da parede celular, principalmente nas

concentrações de 100 e 200 µg/mL (Figuras 10 e 11 D e E).

34

Figura 10: Microscopia óptica de campo claro de Curvularia pallescens, cultivados com

diferentes concentrações de HMP comercial e coradas com lactofenol azul algodão. (A)

controle sem tratamento; (B-E) tratadas com 25, 50, 100, 200 µg/mL de HMP comercial,

respectivamente. Observar que os cultivos tratados apresentam grande número de vesículas

citoplasmáticas (setas) e redução na melanização da parede celular quando comparados ao

controle.

35

Figura 11: Microscopia óptica de campo claro de Curvularia pallescens, cultivados com

diferentes concentrações de HMP biotecnológico e coradas com lactofenol azul algodão. (A)

controle sem tratamento; (B-E) tratadas com 25, 50, 100, 200 µg/mL de HMP biotecnológico,

respectivamente. Observar que os cultivos tratados apresentam grande número de vesículas

citoplasmáticas (setas) e redução na melanização da parede celular quando comparados ao

controle.

36

5.3. ANÁLISE MORFOLÓGICA POR MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA

(MEV)

As culturas de C. pallescens foram analisadas por MEV, para observar mais

detalhadamente as alterações morfológicas de hifas e conídios. Pode-se notar que as células

não tratadas (Figuras 12 A e 13 A) apresentaram morfologia característica, sem alterações. Já

as culturas tratadas com HMP comercial (Figuras 12 B-E) e HMP biotecnológico (Figuras 13

B-E), nas concentrações de 25, 50, 100 e 200 µg/mL apresentaram alterações morfológicas.

Os conídios apresentaram superfície enrugada, característico de desestruturação da parede

celular. Inúmeras vesículas sendo externalizadas foram observadas nas hifas tratadas.

37

Figura 12: Microscopia eletrônica de varredura de Curvularia pallescens, cultivados com

diferentes concentrações de HMP comercial. (A) controle sem tratamento; (B-E) células

tratadas com 25, 50, 100, 200 µg/mL de HMP comercial, respectivamente. Observar a

presença de inúmeras vesículas sendo externalizadas (setas longas B, C e E) e conídios

apresentando superfície enrugada (cabeça de setas B, C e D) quando comparados ao controle

sem tratamento. Imagens coloridas no programa Adobe Photoshop®.

38

39

Figura 13: Microscopia eletrônica de varredura de Curvularia pallescens, cultivados com

diferentes concentrações de HMP biotecnológico. (A) controle sem tratamento; (B-E) tratadas

com 25, 50, 100, 200 µg/mL de HMP biotecnológico, respectivamente. Observar a presença

de inúmeras vesículas sendo externalizadas (setas longas D) e conídios apresentando

superfície enrugada (cabeça de setas B, C e E) quando comparados ao controle sem

tratamento. Imagens coloridas no programa Adobe Photoshop®.

40

41

5.4. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO (MET)

Para detectar as mudanças ocorridas em células de C. pallescens tratados com HMP

comercial (Figura 14) e HMP biotecnológico (Figura 15), nas concentrações de 25, 50, 100 e

200 µg/mL foi feita análise por MET de rotina. Foi observada a desestruturação da parte

fibrilar da parede celular em células tratadas (Figuras 14 e 15 B-E), quando comparadas ao

grupo controle, que não recebeu tratamento com a droga, sugerindo que o HMP está atuando

nos componentes da parede celular fúngica. Além dessa desestruturação, observou-se também

a presença de algumas vesículas no interior das células com aspecto irregular e de tamanhos

variados. No entanto, não foi possível detectar a natureza destas estruturas.

42

Figura 14: Microscopia eletrônica de transmissão de Curvularia pallescens, cultivados com

diferentes concentrações de HMP comercial. (A) controle sem tratamento. (B-E) tratadas com

25, 50, 100 e 200 µg/mL de HMP comercial, respectivamente. Observar a desestruturação da

parte fibrilar da parede celular (setas longas B-E), quando comparados ao controle. Escala da

barra 2 µm.

43

44

Figura 15: Microscopia eletrônica de transmissão de Curvularia pallescens, cultivados com

diferentes concentrações de HMP biotecnológico. (A) controle sem tratamento. (B-E) tratadas

com 25, 50, 100 e 200 µg/mL de HMP biotecnológico, respectivamente. Observar a

desestruturação da parte fibrilar da parede celular (setas longas B-E), quando comparados ao

controle. Escala da barra 2 µm.

45

46

5.5. ANÁLISE CITOQUÍMICA DAS VESÍCULAS DE Curvularia pallescens.

A análise citoquímica é uma técnica que permite definir especificamente estruturas

celulares e sua composição bioquímica. Esta técnica é usada para a identificação de proteínas,

carboidratos e lipídios, permitindo sua identificação e localização (Souza, 2007). Para

detecção de lipídios nós utilizamos três técnicas específicas.

5.5.1. Sudan black B

O sudan black B é um corante lipofílico que marca especificamente lipídios

insaturados, éster colesterol, triglicerídeos e alguns fosfolipídios, através da dissolução do

corantes nestes componentes. Dependendo do tipo de lipídio a ser marcado, a coloração pode

variar do azul ao preto.

A análise das hifas por microscopia óptica de campo claro de C. pallescens tratadas

com HMP comercial e biotecnológico e marcadas com sudan black B, apresentou marcação

específica para lipídios (Figura 16 e 17). As células tratadas com diferentes concentrações de

HMP comercial (Figura 16 B-E) e HMP biotecnológico (Figura 17 B-E) mostraram um

aumento na marcação em toda a extensão das hifas, quando comparadas ao controle sem

tratamento (Figura 16 A e 17 A).

47

Figura 16: Microscopia óptica de campo claro de Curvularia pallescens, cultivados com

diferentes concentrações de HMP comercial e marcado com sudan black B. (A) controle sem

tratamento; (B-E) células tratadas com 25, 50, 100 e 200 µg/mL de HMP comercial,

respectivamente. Observar marcação lipídica em azul em toda a extensão das hifas.

48

Figura 17: Microscopia óptica de campo claro de Curvularia pallescens, cultivados com

diferentes concentrações de HMP biotecnológico e marcado com sudan black B. (A) controle

sem tratamento; (B-E) Células tratadas com 25, 50, 100 e 200 µg/mL de HMP biotecnológico,

respectivamente. Observar marcação lipídica em azul em toda a extensão das hifas.

49

5.5.2. Bodipy

Para confirmar o acúmulo de lipídios, foi utilizado o marcador altamente lipofílico

fluorescente bodipy. Foi possível observar uma intensa marcação dos corpúsculos lipídicos

intracitoplasmáticos bem como externamente às hifas principalmente nas concentrações de

100 e 200 µg/mL de HMP comercial (Figura 18 D e E) e biotecnológico (Figura 19 D e E),

quando comparada ao grupo controle (Figuras 18 e 19 A). Indicando que possivelmente o

tratamento está promovendo uma maior produção desses corpúsculos.

50

Figura 18: Microscopia confocal de Curvularia pallescens, cultivados com diferentes

concentrações de HMP comercial e incubados com BODIPY®. (A) controle sem tratamento;

(B-E) tratadas com 25, 50, 100, 200 µg/mL de HMP comercial, respectivamente. Observar

corpúsculos lipídicos extra e intracitoplasmáticos marcados em verde. Escala das barras 10

µm.

51

52

Figura 19: Microscopia confocal de Curvularia pallescens, cultivados com diferentes

concentrações de HMP biotecnológico e incubadas com BODIPY®. (A) controle sem

tratamento; (B-E) tratadas com 25, 50, 100, 200 µg/mL de HMP biotecnológico,

respectivamente. Observar corpúsculos lipídicos extra e intracitoplasmáticos marcadas em

verde. Escala das barras 10 µm.

53

54

5.5.3. Ósmio-imidazol

Para confirmar os resultados as células foram marcadas pela técnica citoquímica

ósmio-imidazol para detectar lipídios através de MET. Os resultados obtidos mostraram que

as células tratadas como HMP comercial e biotecnológico (Figura 20 e 21) apresentaram hifas

e conídios com acúmulo de corpúsculos lipídicos intracitoplasmáticos, evidenciados por forte

marcação eletrodensa, assim como vesículas contendo lipídios sendo externalizadas (Figura

20 e 21 B-E). Essas estruturas encontravam-se retidas na porção fibrilar da parede celular das

células controle (Figura 20 e 21 A) evidenciando que o tratamento com HMP está

promovendo a desestruturação da parede com consequente liberação dessas vesículas.

55

Figura 20: Microscopia eletrônica de transmissão pelo método ósmio-imidazol de Curvularia

pallescens, cultivado com diferentes concentrações de HMP comercial. (A) controle sem

tratamento; (B-E) tratados com 25, 50, 100 e 200 µg/mL de HMP comercial, respectivamente.

Observar presença dos corpúsculos lipídicos (*) e vesículas lipídicas com forte marcação

eletrodensa (setas). Escala das barras 5µm.

56

57

Figura 21: Microscopia eletrônica de transmissão pelo método ósmio-imidazol de Curvularia

pallescens, cultivado com diferentes concentrações de HMP biotecnológico. (A) controle sem

tratamento; (B-E) tratados com 25, 50, 100 e 200 µg/mL de HMP biotecnológico,

respectivamente. Observar presença dos corpúsculos lipídicos (*) e vesículas lipídicas com

forte marcação eletrodensa (setas). Escala das barras 5µm.

58

59

6. VIABILIDADE DAS CÉLULAS FÚNGICAS

Para verificar se o tratamento com HMP estava promovendo a morte das células

fúngicas, foi realizado o ensaio fluorescente FUN®1. Este marcador é uma sonda fluorescente

que avalia a capacidade de processamento endocítico dependente da integridade da membrana

celular fúngica. No presente estudo as hifas apresentaram marcação característica de seu

estado metabólico (Figuras 22 e 23) após tratamento com HMP comercial e biotecnológico.

Para controle negativo as células foram mortas com metanol absoluto (Figuras 22A e 23A).

As células viáveis apresentaram vesículas citoplasmáticas apresentando padrão de

fluorescência vermelho-alaranjada semelhante ao controle positivo, células vivas (Figuras

22B e 23B). As culturas tratadas com 25 µg/mL de HMP comercial (Figuras 22C) e 25 e 50

µg/mL de HMP biotecnológico (Figuras 23 C e D), apresentaram fluorescência verde-

amarelada característica de células mortas ou metabolicamente inativas.

60

Figura 22: Microscopia de fluorescência de Curvularia pallescens, cultivados com diferentes

concentrações de HMP comercial e incubados com FUN®1. (A) controle negativo, células

mortas; (B) controle positivo, células vivas; (C-F) tratados com 25, 50, 100, 200 µg/mL de

HMP comercial, respectivamente. Observar vesículas fluorescentes vermelho-alaranjadas no

interior das hifas em (D, E e F). Escala das barras 20 µm.

61

Figura 23: Microscopia de fluorescência de Curvularia pallescens, cultivados com diferentes

concentrações de HMP biotecnológico e incubados com FUN®1. (A) controle negativo,

células mortas; (B) controle positivo, células vivas; (C-F) tratados com 25, 50, 100, 200

µg/mL de HMP biotecnológico, respectivamente. Observar vesículas fluorescentes vermelho-

alaranjadas no interior das hifas em (E e F). Escala das barras 20 µm.

62

7. DISCUSSÃO

A complexa relação entre fungos patogênicos e o hospedeiro envolve diversos

mecanismos que tentam modular o sistema de defesa do hospedeiro. Esses patógenos utilizam

algumas estratégias como produção de pigmentos, enzimas, glicoproteínas e polissacarídeos

que podem estar envolvidos no processo de adaptação do fungo às condições adversas do

hospedeiro, sendo considerados fatores de virulência (Casadevall et al., 2009).

Dentre os pigmentos produzidos, destaca-se a melanina, um pigmento escuro que

apresenta propriedades importantes, atuando como agente antioxidante, antitumoral e inibidor

da mutagênese (Tamura et al., 2006; Chusiri et al., 2011). Apresenta também ação protetora

contra radiações ionizantes, estresse oxidativo e fagocitose, constituindo um dos principais

fatores de virulência envolvidos na interação do patógeno com a célula hospedeira (Schnitzler

et al., 1999; Langfelder et al., 2003; Nosanchuk & Casadevall, 2006; Hayakawa et al., 2006).

Existem substâncias naturais que são capazes de inibir a síntese de melanina, entre elas

destaca-se o ácido kójico ou HMP produzido por fungos do gênero Aspergillus (Ferreira et

al., 2010). O HMP apresenta ação inibidora da enzima tirosinase a qual está envolvida na

síntese de melanina em células de mamíferos e fungos (Papagianni, 2004; Chang et al., 2009;

Ferreira et al., 2010). Substâncias capazes de inibir a síntese de melanina podem promover

importantes modificações na fisiologia e morfologia de fungos patogênicos.

No presente trabalho foi observado, inicialmente, que o HMP comercial e o

biotecnológico, promoveram a inibição da melanização do micélio de culturas do fungo C.

pallescens na concentração de 200 µg/mL do bioproduto, com uma aparente diminuição do

crescimento. Resultados semelhantes foram observados por Chee & Lee (2003) que ao

analisarem a atividade do HMP sobre o fungo patogênico Cryptococcus neoformans,

demonstraram a diminuição no crescimento e pigmentação dessa espécie, atribuindo tal fato à

ação fungistática e despigmentadora da substância. Estudo utilizando o agrotóxico triciclazol,

um inibidor específico da biossíntese de melanina, demonstrou diminuição na melanização e

desestruturação da parede celular do fungo demáceo Fonsecaea pedrosoi (Franzen et al.,

2006). Além disso, outros inibidores da biossíntese de melanina, como carpropamida e

piroquilona, em estudo feito no fungo Diplocarpon rosae, apresentaram uma redução na

melanização com conseqüente diminuição na germinação de conídios e formação de

apressórios (Gachomo et al., 2010).

63

A maioria dos trabalhos descritos na literatura demonstra que a inibição da

melanização causa diferentes alterações fisiológicas em fungos,

entretanto poucos estudos demonstraram alterações morfológicas causadas por estas drogas.

Desta forma, para verificar se o HMP promovia alterações na morfologia de

Curvularia pallescens, primeiramente foram realizadas análises por microscopia óptica. Foi

observado acúmulo de vesículas semelhantes a corpúsculos lipídicos, que posteriormente,

foram confirmadas por técnicas de marcação específica para lipídios como sudan black B e

bodipy. Nosso grupo de pesquisa demonstrou recentemente que o HMP foi capaz de

promover o acúmulo de vacúolos semelhantes a corpúsculos lipídicos em Leishmania

amazonensis (Rodrigues, 2013) e em monócitos humanos (Costa, 2012).

Tendo em vista o acúmulo de vesículas lipídicas, foi realizada também a análise de C.

pallescens por MEV e MET para demonstrar possíveis alterações ultraestruturais relacionadas

ao tratamento com HMP. Foi observado o acúmulo de inúmeras vesículas

intracitoplasmáticas e externalizadas bem como alterações na parede celular fúngica. Além

disso, através da técnica do ósmio-imidazol para MET, foi possível confirmar a presença de

corpúsculos lipídicos no citoplasma das células fúngicas tratadas com HMP. Os resultados

encontrados no presente trabalho são semelhantes aos descritos por Souza (2008), que

verificou aumento no número de corpos eletrodensos no interior das células do fungo

Cunninghamella elegans, quando tratados com o hidrocarboneto aromático sulforado,

dibenzotiofeno.

Além disso, também foi observada a presença de um grande número de vesículas

externalizadas em culturas tratadas com HMP enquanto que nas células sem tratamento essas

vesículas estavam retidas na porção fibrilar da parede celular. A liberação para o meio

extracelular de vesículas por microorganismos pode ocorrer naturalmente ou por ação de

estímulos externos como drogas, temperatura e defensinas de plantas (Rodrigues et al, 2007).

Em fungos, vesículas externalizadas, podem conter uma grande variedade de moléculas que

podem estar associadas a fatores de virulência, entretanto, o processo de externalização ainda

não é bem esclarecido, podendo ocorrer através de exocitose ou através de vias alternativas

como os exosomos que ocorre em células de mamíferos (Rodrigues et al., 2008; Panepinto et

al., 2009).

64

As células tratadas com HMP também apresentaram desestruturação da parede celular

promovendo liberação das vesículas retidas em sua porção fibrilar. Estudos demonstraram que

vesículas presentes na parede celular de C. neoformans podem conter lipídios e uma série de

enzimas como lacase, urease, fosfatase e polissacarídeos como o glucuronoxilomanana

(GSL), um dos maiores constituintes da parede celular do agente causador da criptococose

(Rodrigues et al., 2007; Rodrigues et al., 2008; Casadevall et al., 2009).

Walker et al., 2010 ao estudar cepas mutantes de Candida albicans para o gene que

codifica quitina sintase, observou que a quitina presente na parede parece regular a

externalização de melanossomos. Além de fungos, a liberação de vesículas também foi

descrita para o protozoário Leishmania major e Leishmania donovani (Hosseini et al., 2013).

Hassani et al., 2011 mostraram que Leishmania mexicana submetida à variação de

temperatura apresentou aumento na síntese de proteínas e exovesículas aderidas a superfície

do parasito.

De acordo com Eisenman et al. (2009), vesículas lipídicas de C. neoformans

apresentam melanina em sua composição. Desta forma, podemos inferir que, devido à

presença de vesículas lipídicas observadas por MET (ósmio-imidazol) em culturas de

Curvularia pallescens tratadas com HMP, este metabólito pode estar induzindo a liberação de

vesículas contendo lipídios possivelmente associado à melanina. Além disso, o acúmulo e

externalização destas vesículas podem estar relacionados com a tentativa do patógeno em se

proteger da ação do HMP.

Tendo em vista, as alterações morfológicas observadas no presente estudo, foi

realizado o teste de viabilidade utilizando FUN®1 para determinar se o tratamento com HMP

estava promovendo a morte celular. A viabilidade das hifas de C. pallescens foi alterada

apenas nas culturas tratadas nas concentrações de 25 µg/mL de HMP comercial e de 25 e 50

µg/mL de HMP biotecnológico. Este resultado pode estar relacionado à ação fungistática da

droga em menores concentrações. Nas concentrações de 100 e 200 µg/mL, o HMP parece não

estar alterando a viabilidade das células, tal fato pode estar relacionado ao aumento do

metabolismo celular do fungo na tentativa de se defender da ação do HMP. Resultados

semelhantes foram encontrados por Frazen et al. (2006), que após tratamento do fungo

Fonsecaea pedrosoi com Triciclazol, observaram que a viabilidade do fungo não foi alterada

significativamente com o tratamento, porém foram detectadas várias alterações morfológicas.

Estes autores sugerem que a desestruturação da parede fúngica pode potencializar o efeito do

65

tratamento com drogas antifúngicas como, por exemplo, a Anfotericina B. Recentemente, foi

demonstrado que o HMP tem ação quimiosensibilizante agindo de forma sinérgica com

drogas antifúngicas comerciais (Kim et al., 2012). O HMP parece estar atuando na

desestruturação da melanina e podendo assim ser utilizado como droga antifúngica associada

a potentes fungicidas.

Desta forma, no presente trabalho, foi possível demonstrar que o HMP promoveu

importantes alterações morfológicas na parede celular de C. pallescens, induzindo uma

intensa liberação de vesículas lipídicas que podem estar associadas à melanina, demonstrando

que o HMP pode ser um importante agente antifúngico em fungos produtores de melanina ou

até mesmo atuar de forma sinérgica com drogas antifúngicas convencionais para o tratamento

de doenças fúngicas de importância médica e drogas antifúngicas usadas na agroindústria.

66

8. CONCLUSÃO

Nossos resultados permitem concluir que:

1. O HMP foi capaz de promover diminuição na melanização em C. pallescens,

principalmente nas maiores concentrações.

2. O HMP promoveu alterações morfológicas, uma vez que se observou o acúmulo

de vesículas citoplasmáticas, desestruturações na parede celular e externalização

de vesículas.

3. O HMP comercial e biotecnológico promoveu importantes alterações

morfológicas.

4. O HMP biotecnológico apresentou ação semelhante ao HMP comercial podendo

ser utilizado como um possível agente fungistático já que sua obtenção possui

menor custo.

67

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