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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
BIOLOGIA DOS AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS
ATIVIDADE ANTIPLASMÓDICA E TOXICIDADE DOS ÓLEOS DE ANDIROBA (CARAPA GUIANENSIS Aubl.) e PIMENTA-DE-MACACO (PIPER ADUNCUM L)
EM MURINOS.
RAIMUNDO NONATO CARDOSO MIRANDA JÚNIOR
Belém – Pará 2014
RAIMUNDO NONATO CARDOSO MIRANDA JÚNIOR
ATIVIDADE ANTIPLASMÓDICA E TOXICIDADE DOS ÓLEOS DE ANDIROBA (CARAPA GUIANENSIS Aubl.) e PIMENTA-DE-MACACO (PIPER ADUNCUM L)
EM MURINOS.
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia dos Agentes Infecciosos e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários. Orientadora: Profa. Dra. Marinete Marins Póvoa. Co–Orientadora Profa. Dra. Maria Fâni Dolabela.
,
Belém – Pará 2014
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
Miranda Júnior, Raimundo Nonato Cardoso , 1978-
Atividade antiplasmódica e toxicidade dos
óleos de andiroba (Carapa guianensis aubl.) e
pimenta-de-macaco (Piper aduncum l) em murinos
/ Raimundo Nonato Cardoso Miranda Júnior. -
2014.
Orientadora: Marinete Marins Póvoa.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal do
Pará, Instituto de Ciências Biológicas, Programa
de Pós-Graduação em Biologia de Agentes
Infecciosos e Parasitários, Belém, 2014.
1. Malária. 2. Antimaláricos. 3. Óleo de
andiroba. 4. Piperaceae. 5. Plasmodium berghei.
I. Título.
CDD 22. ed. 616.9362
RAIMUNDO NONATO CARDOSO MIRANDA JÚNIOR
ATIVIDADE ANTIPLASMÓDICA E TOXICIDADE DOS ÓLEOS DE ANDIROBA (CARAPA GUIANENSIS Aubl.) e PIMENTA-DE-MACACO (PIPER ADUNCUM L)
EM MURINOS.
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia dos Agentes Infecciosos e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará como requisito para a obtenção do grau de Doutor em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários. Orientadora: Profa. Dra. Marinete Marins Póvoa.
Instituo Evandro Chagas
Banca examinadora: Prof. Dr. José Guilherme Soares Maia
Instituto de Exatas e Naturais – ICEN/UFPA.
Profa. Dra. Giselle Maria Rachid Viana. Instituto Evandro Chagas
Profa. Dra. Eloisa Helena de Aguiar Andrade. Instituto de Exatas e Naturais – ICEN/UFPA.
Prof. Dr. Ricardo Luiz Dantas Machado Instituto de Ciências Biológicas – ICB/BAIP.
Belém, 11 de Junho de 2014.
Belém – Pará 2014
“A mente que se abre a uma nova ideia
jamais voltará ao seu tamanho original”
Albert Einstein.
Dedicado aos meus queridos pais:
Dolores e Nonato Miranda
A minha filha e esposa:
Beatriz e Nathália Miranda
Com amor e gratidão
AGRADECIMENTO
A Deus por tudo que me concede na vida.
A minha orientadora Professora Dra. Marinete Marins Póvoa pela força, sabedoria e
grande ajuda durante o transcorrer do projeto.
Ao meu querido Professor Dr. José Guilherme Soares Maia pela orientação, apoio,
conhecimento, oportunidade de executar o projeto e por ter acreditado no meu
trabalho.
A minha Co-orientadora Professora Dra. Maria Fâni Dolabela pela ajuda durante o
trabalho.
Ao Professor Dr. Rommel Burbano e ao também Professor Dr. Marcelo Bahia pela
colaboração e apoio nos testes in vitro.
A minha amiga Natasha Rocha pela ajuda indispensável e fundamental nos testes in
vitro. Muito obrigado.
A farmacêutica Adreanne Oliveira pela ajuda e atenção.
Aos meus pais, Dolores e Nonato Miranda, por toda dedicação, amor e incentivo
durante toda a minha vida.
A minha esposa Nathália Miranda pelo amor, afeto e incentivo ao longo desses anos
de convivência e por te me dado o maior presente da minha vida, minha filha Beatriz
Miranda.
Ao meu irmão Charles Miranda por toda compreensão e carinho.
A minha família: Maria, Fyamma, Felipe Gabriel, Lisbella, Conceição e Cláudia, pelo
respeito e amor de sempre.
A Universidade Federal do Pará pela formação acadêmica
A Fundação Amazônia Paraense de Amparo à Pesquisa – FAPESPA pela
concessão da Bolsa.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico. – CNPQ pelo
patrocínio do projeto Bionorte.
Ao Instituto Evandro Chagas, por permitir o desenvolvimento dos testes
antimaláricos na referida instituição.
Aos técnicos do Instituto Evandro Chagas José Maria, José Mário e Rodrigo pelo
apoio e ajuda nos testes antimaláricos.
A todos que contribuíram de alguma forma para realização e concretização de mais
essa etapa.
SUMÁRIO
Página
LISTA DE TABELAS 1
LISTA DE FIGURAS 2
RESUMO 3
ABSTRACT 4
1. INTRODUÇÃO......................................................................... 12
1.1 CICLO EVOLUTIVO EM HUMANOS....................................... 14
1.2 EPIDEMIOLOGIA DA MALÁRIA.............................................. 16
1.3 CONTROLE DA MALÁRIA NO BRASIL................................... 18
1.3.1 Diagnóstico laboratorial da malária...................................... 18
1.3.2 Tratamento da malária humana............................................ 19
1.4 RESISTÊNCIA DA MALÁRIA HUMANA.................................. 29
1.4.1 Mecanismos moleculares associados à resistência do Plasmodium falciparum aos compostos quinoleicos e antifolatos................................................................................ 33
1.5 BUSCA POR NOVAS DROGAS.............................................. 36
1.6 Espécie Carapa guianensis...................................................... 39
1.7 Espécie Piper aduncum............................................................ 43
1.8 ÓLEO DE ANDIROBA (OA)..................................................... 45
1.9 ÓLEO DE PIMENTA-DE-MACACO (OPM).............................. 47
1.10 MODELOS EXPERIMENTAIS.................................................. 49
1.10.1 Modelos Murino para Atividade Antimalárica...................... 49
1.10.1.1 Ciclo biológico do Plasmodium berghei.................................... 49
1.10.2. Avaliação da Citotoxicidade.................................................. 51
1.10.3 Ensaio do Micronúcleo.......................................................... 51
1.10.4 Ensaio Cometa........................................................................ 53
2. OBJETIVOS............................................................................. 55
2.1 OBJETIVO GERAL.................................................................. 55
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.................................................... 55
3. MATERIAL E MÉTODOS......................................................... 56
3.1 OBTENÇÃO DO ÓLEO DE ANDIROBA (OA) E FRAÇÃO RICA EM LIMONÓIDES (FRL)................................................. 56
3.2 OBTENÇÃO DO ÓLEO PIMENTA-DE-MACACO (OPM)........ 56
3.3 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA.................................. 56
3.4 ATIVIDADE ANTIMALÁRICA IN VIVO..................................... 58
3.4.1 Ensaios em camundongos com Plasmodium berghei....... 58
3.5 AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE........................................ 61
3.5.1 Teste de viabilidade celular (MTT)........................................ 61
3.6 MICRONÚCLEOS COM BLOQUEIO DE CITOCINESE.......... 62
3.7 ENSAIO COMETA.................................................................... 64
3.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA.......................................................... 66
4. RESULTADOS......................................................................... 67
4.2 ENSAIO ANTIMALÁRICO COM Plasmodium berghei............. 70
4.3 TESTE DE VIABILIDADE CELULAR (MTT)............................. 73
4.4 TESTE DO MICRONÚCLEO COM BLOQUEIO DE CITOCINESE........................................................................... 73
4.5 ENSAIO COMETA..................................................................... 75
5. DISCUSSÃO............................................................................ 77
6. CONCLUSÃO............................................................................ 83
7. REFERÊNCIAS......................................................................... 84
ANEXOS.................................................................................... 107
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1 – Pesos dos grupos controles (1 e 2) e grupo tratado (grupo
3), após 14 dias de tratamento com o OA............................................. 67
Tabela 2 – Parâmetros Hematológicos dos grupos controle (1 e 2) e
grupo tratado (grupo 3), após 14 dias de tratamento com o OA........... 68
Tabela 3 – Parâmetros bioquímicos dos grupos controle (1 e 2) e
grupo tratado (grupo 3), após 14 dias de tratamento com o OA........... 68
Tabela 4 – Peso dos grupos controle (1 e 2) e grupo tratado (grupo
3), após 14 dias de tratamento com o OPM.......................................... 69
Tabela 5 – Parâmetros Hematológicos dos grupos controle (1 e 2) e
grupo tratado (grupo 3), após 14 dias de tratamento com o OPM........ 69
Tabela 6 – Parâmetros bioquímicos dos grupos controle (1 e 2) e
grupo tratado (grupo 3), após 14 dias de tratamento com o OPM........ 70
Tabela 7 – Atividade antimalárica dos óleos de andiroba (OA) e óleo
de pimenta-de-macaco (OPM) e da Mistura dos óleos (OA+OPM)
expresso na forma da parasitemia (%) das hemácias infectadas......... 71
Tabela 8 – Atividade antimalárica da Fração Rica em Limonóides
(FRL) e da Fração com óleo de pimenta-de-macaco (OPM) expresso
na forma da Parasitemia (%) das hemácias infectadas obtida em
relação ao grupo controle não tratado................................................... 72
Tabela 9 – Efeito do óleo de andiroba sobre o número e a frequência
de micronúcleos após 24h de exposição à droga................................. 74
Tabela 10 – Efeito do óleo de andiroba sobre o índice de divisão
nuclear após 24h de exposição à droga................................................ 74
Tabela 11 – Efeito da mistura de óleo de andiroba e óleo de pimenta-
de-macaco sobre o número e a frequência de micronúcleos após 24h
de exposição à droga............................................................................ 75
Tabela 12 – Efeito da mistura do óleo de andiroba e do óleo de
pimenta-de-macaco sobre o índice de divisão nuclear com o após
24h de exposição à droga..................................................................... 75
Tabela 13 – Frequência de células com cometas, distribuição das
classes de cometa e índice de dano de DNA, após ser exposta ao
óleo de andiroba.................................................................................... 76
Tabela 14 – Frequência de células com cometas, distribuição das
classes de cometa dano após ser exposta a mistura do óleo de
andiroba e pimenta-de-macaco (OA+OPM).......................................... 76
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1 – Clico evolutivo do Plasmodium em humanos...................... 15
Figura 2 – Distribuição mundial da malária.......................................... 16
Figura 3 – Risco da malária por município de infecção, Amazônia Legal...................................................................................................... 17
Figura 4 – Fármacos que agem sobre as diferentes fases do ciclo da malária................................................................................................... 20
Figura 5 – Fórmula da Quinina............................................................. 22
Figura 6 – Formula da Cloroquina – (A) / Núcleo quinolínico da Cloroquina – (B).................................................................................... 23
Figura 7 – Fórmula da Primaquina....................................................... 23
Figura 8 – Fórmula da Amodiaquina.................................................... 24
Figura 9 – Fórmula Proguanil (1) e Pirimetamina (2)........................... 25
Figura 10 – Estruturas das sulfas: Dapsona (1), Sulfadoxina (2), Sulfadiazina (3) e Sulfaleno (4)............................................................. 25
Figura 11 – Fórmula da Atovaquona.................................................... 26
Figura 12 – Fórmula da Mefloquina...................................................... 27
Figura 13 – Fórmula da artemisinina e seus derivados........................ 28
Figura 14 – Fórmula do lumefrantina.................................................... 29
Figura 15 – Árvore da espécie Carapa guianensis............................... 41
Figura 16 – Folhas da espécie Carapa guianensis.............................. 41
Figura 17 – Limonóides isolados da Carapa guianensis...................... 43
Figura 18 – Espécie Piper aduncum. ................................................... 45
Figura19 – Componentes do óleo de pimenta-de-macaco................... 48
Figura 20 – Formação de micronúcleos após um dano genético. (1) Micronúcleo a partir de um cromossomo inteiro e fragmentos cromossômicos na anáfase; (2) Ponte cromossômica a partir de cromossomos dicêntricos, nos quais os centrômeros se dirigem para os lados opostos da célula. 52
Figura 21 – Formação de micronúcleos com e sem a utilização da Citocalasina-B. 53
Figura 22 – Esquema da placa desenvolvida para o ensaio do MTT... 62
Figura 23 – Demonstração do padrão de escores para análise do ensaio cometa....................................................................................... 65
Figura 24 – Atividade antimalárica dos óleos de andiroba (OA) e óleo de pimenta-de-macaco (OPM) e da Mistura dos óleos (OA+OPM) administrados por via intraperitonial em camundongos infectados com P. berghei expressando a redução da parasitemia no 8° dia........ 71
Figura 25 – Atividade antimalárica da Fração Rica em Limonóides (FRL) e da FRL e óleo de pimenta-de-macaco (FRL+OPM), administrados por via intraperitonial em camundongos infectados com P. berghei expressando a redução da parasitemia no 8°.............. 73
RESUMO
Na busca de novos antimaláricos, duas espécies típicas da região Amazônica
e uma fração rica em limonóides foram objeto deste estudo: Carapa guianensis Aubl.
(Meliaceae), conhecida popularmente como andiroba, utilizada tradicionalmente
como inseticida e no combate da malária. A espécie Piper aduncum L. (Piperaceae),
conhecida popularmente como pimenta-de-macaco, usada para tratar doenças
inflamatórias e a fração rica em limonóides fracionada do óleo de andiroba. Tanto os
óleos brutos como a fração foram submetidos a ensaios de toxicidade aguda,
atividade antimalárica em Plasmodium berghei, teste de citoxicidade e
genotoxicidade. Estes ensaios demonstraram que o óleo de andiroba apresentou
baixíssima toxicidade por não ter causado nenhuma alteração no peso e parâmetros
hematológicos e bioquímicos. Entretanto óleo de pimenta-de-macaco apresentou
baixa toxocidade, por não ter causado alteração no peso e parâmetros
hematológicos e bioquímicos, contudo, causou 20% de morte entre os animais
tratados. Na atividade antimalárica o óleo de andiroba e fração extraída desse óleo
apresentou boa atividade. Já para o óleo de pimenta-de-macaco essa atividade foi
menor. Considerando a mistura dos dois óleos e da a fração limonoídica e óleo de
pimenta aumentou a atividade antimalárica demonstrando o sinergismo.
Palavras-chaves: Andiroba, Limonóides, Pimenta-de-macaco e Plasmodium berghei.
ABSTRACT
In the search for new antimalarials, two typical species of the Amazon region
and a fraction rich in limonoids were the subject of this study: Carapa guianensis
Aubl. (Meliaceae), popularly known as Andiroba, traditionally used as an insecticide
and in combating malaria. The species Piper aduncum L. (Piperaceae), popularly
known as the pepper-jack, used to treat inflammatory diseases and rich fraction
fractional limonoids from Andiroba oil. Both crude oils as the fraction were tested for
acute toxicity, antimalarial activity in Plasmodium berghei, cytotoxicity and
genotoxicity testing. These studies showed that the oil had very low toxicity crabwood
not have caused any changes in weight and hematological and biochemical
parameters. However chili oil-for-monkey showed low toxocidade for not having
caused changes in weight and hematological and biochemical parameters, however,
caused 20% of deaths among treated animals. Antimalarial activity in the oil and
Andiroba oil extracted fraction that showed good activity. As for the oil of pepper-jack
this activity was lower. Considering the mixture of two oils and a fraction limonoídica
and chili oil increased antimalarial activity demonstrating synergism.
Keywords: Andiroba, limonoids, Pepper-of-monkey and Plasmodium berghei.
12
1. INTRODUÇÃO
A malária é uma protozoose causada por protozoários do gênero Plasmodium
e transmitida por mosquitos do gênero Anopheles. Os plasmódios são protozoários
pertencentes ao filo Apicomplexa, classe Sporozoea, ordem Eucoccidiida, família
Plasmodiidae. Esta protozoose em humanos tem como característica clínica os
acessos intermitentes de febre, calafrios, cefaléia e sudorese.
As espécies Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, Plasmodium
malariae e Plasmodium ovale são patogênicas para o homem. (Ferraz, 2002;
Queiroz et al., 2008). Recentemente foi relatado que o Plasmodium knowlesi seria a
quinta espécie a causar malária humana (Sabbatani et al., 2009).
O P. vivax apresenta período de incubação de 12 dias a vários meses, ciclo
eritrocítico de 42 a 48h, invadindo preferencialmente hemácias jovens. Uma
importante característica dessa espécie é a de apresentar esporozoítos que não se
desenvolvem de imediato nos hepatócitos, ficando em estado de dormência no
fígado, chamados hipnozoítas (Price et al., 2007, Hulden & Hulden, 2011).
O P. falciparum apresenta o ciclo tecidual menor, maior produção de
merozoítas tecidual e eritrocitário infectando eritrócitos de qualquer idade; é
potencialmente capaz de produzir hiperparasitemias. A alta parasitemia está
relacionada com a gravidade da doença. (Gomes et al., 2011). Dentre as cinco
espécies é a que causa a doença mais agressiva levando a uma grande morbidade
e mortalidade, com mais de um milhão de mortes por ano (Liu et al., 2010). A
malária severa apresenta um quadro clínico com: anemia grave, complicações
cerebrais, infecção placentária e perda fetal (Mackintosh et al., 2004).
O P. ovale é restrito ao continente africano sendo agente de uma forma
benigna de malária, formam os hipnozoitas, assim como o P. vivax, esporozoítos
latentes nos hepatócitos (Price et al., 2007, Lim et al., 2010).
O P. malariae é encontrado em áreas endêmicas dos continentes africano e
americano, desenvolve o ciclo eritrocítico em 72h e após a invasão dos hepatócitos
os esporozoítos desse parasito amadurem em aproximadamente 15 dias,
13
diferentemente do P. vivax, não apresentam formas quiescentes, por isso não ocorre
recaídas, entretanto o parasito persiste por longos períodos no sangue do
hospedeiro (Collins & Jeffery, 2007).
O P. knowlesi ocorre normalmente em macacos de cauda longa e porco de
cauda (porcos-tailed) que habitam floresta do Sudeste da Ásia. A transmissão
ocorre, também, pela picada de um mosquito infectado, muito embora essa infecção
fosse tida como caso raro. Contudo, após descoberta de um grande foco na Malásia
(ilha de Bornéo), 58% dos casos de malária do hospital Kapit, além de outros casos
na Tailândia, Filipinas e Singapura, considerou-se que esse parasita está se
difundindo entre os seres humanos. (Van Hellemond et al. 2009, Van Den Eede et
al. 2009).
Em um estudo realizado pelos pesquisadores Knowles e Das Gupta ao
infectar três voluntários humanos, dois com P. knowlesi por passagem de sangue de
macaco e o terceiro com passagem de sanguínea de um hospedeiro humano,
observaram que os três pacientes desenvolveram malária. A infecção causada pelo
P. knowlesi apresenta um ciclo biológico curto, cerca de 24h, com episódios de
febres diários, com morfologia semelhante ao P. falciparum nas formas jovens
(trofozoíto) e as demais formas sanguíneas semelhantes ao P. malariae (Cox-Singh
& Singh, 2008, Singh & Daneshvar, 2013)
A principal forma de transmissão da infecção é pela picada da fêmea do
Anopheles. Os Anofelinos são dípteros, família Culicidae, distribuídos pelas regiões
temperada, tropical e círculo polar ártico. O gênero Anopheles é responsável pela
transmissão da malária nos seres humanos (Harbach & Kitching, 2005). O
Anopheles darlingi é a espécie transmissora mais importante tanto no Brasil como
na América do Sul (Deane, 1986) e outras espécies como as do complexo An. (Nys.)
albitarsis e o An. aquasalis, também tem sido consideradas importantes vetores de
malária humana nas Américas. As espécies do complexo albitarsis apresentam
diferentes padrões de transmissão em diferentes localidades dentro de um mesmo
país e entre países e já o An. aquasalis é importante nas áreas litorâneas do
continente americano (Wilkerson et al. 2005, Póvoa et al. 2006; Brochero &
Wilkerson, 2007, Bahia et al., 2010).
14
1.1. CICLO EVOLUTIVO EM HUMANOS.
O Plasmodium é transmitido ao homem durante o repasto sanguíneo. O ciclo
do Plasmodium é heteroxênico (Fig. 1), tendo uma fase assexuada endógena
(esquizogônica) no hospedeiro vertebrado e outra fase sexuada exógena
(esporogônica) no hospedeiro invertebrado.
Durante o repasto sanguíneo o Anopheles inocula os parasitas (esporozoítos)
no tecido subcutâneo e com menor frequência na corrente sanguínea. Há evidências
que estas formas passam por vários hepatócitos, antes do desenvolvimento da
infecção; primeiramente invadem as células de Küpffer (macrófagos) se alojam nos
capilares sinusóides hepáticos para chegar aos hepatócitos (Baer et al., 2007
glaécia). Nas células do fígado os esporozoítos se diferenciam em trofozoítas, que
se reproduzem assexuadamente, por esquizogonia, dando origem aos esquizontes
teciduais e posteriormente aos merozoítas. O ciclo hepático varia entre as espécies
infectantes: o mais curto, 9 – 17 dias, para o P. ovale o mais longo, 15 – 30 dias,
para o P. malariae. O P. falciparum e P. vivax com períodos de 8 – 25 dias e o 8 –
27 dias, respectivamentes. Os merozoítos formados invadem os eritrócitos
terminando o ciclo exo – eritrocítica. Entretanto nas espécies P. vivax e P. ovale,
alguns esporozoítos podem permanecer quiescentes no fígado originando as formas
denominadas de hipnozoítas (Murgatroyd, 1952, Miller et al., 2002, Tuteja, 2007).
A invasão das hemácias ocorre quando os parasitas reconhecem os
receptores destas células. O parasita induz a formação de um vacúolo na membrana
plasmática das hemácias, por onde entram. Quando os merozoítas teciduais
invadem as hemácias, se inicia o ciclo eritrocítico. O desenvolvimento do parasita no
eritrócito também ocorre por esquizogonia, com formação de novos merozoítas que
invadirão outras hemácias (Miller et al., 2002, Tuteja, 2007). O número de
merozoítos nos esquizontes de cada espécie é específico: 8 – 26 para o P.
falciparum, 8 – 24 para o P. vivax, 6 – 12 para o P. malariae e P. ovale. A evolução
da infecção promove o rompimento dos esquizontes sanguíneos culminando com a
liberação de toxinas do parasito no leito vascular o que implica em acessos febris
regulares e depende, também, da espécie infectante, 36 – 48h para o P. falciparum,
15
48h para o P. vivax e P. ovale, 72h para o P. malariae. Após algum tempo estes
merozoítas sanguíneos sofrem diferenciação em estágios sexuados, os gametócitos,
que não mais se dividem, e são injetados no hospedeiro vertebrado pelo mosquito,
durante o repasto sanguíneo, completando o ciclo (Murgatroyd, 1952).
No hospedeiro invertebrado, Anopheles, ocorre o ciclo sexuado. Após o
repasto sanguíneo apenas gametócitos permanecem viáveis diferenciando-se em
gametas masculinos (microgametas) e femininos (macrogametas). Após a
fecundação forma-se o zigoto chamado de oocineto, forma morfológica invasiva e
móvel que se aloja na parede intestinal do mosquito transformando-se em oocisto.
Por esporogonia (assexuado) originam-se os esporozoítos que se deslocam para as
glândulas salivares do inseto (Smith et al., 2014).
Figura 1 – Clico evolutivo do Plasmodium em humanos. Fonte: White, 2004.
16
1.2. EPIDEMIOLOGIA DA MALÁRIA.
Em 2013, cerca de cento e quatro países, nos trópicos e sub-trópicos, foram
considerados áreas endêmicas para a malária (Fig. 2). Em números globais cerca de
3,4 bilhões de pessoas estariam em risco. Calcula-se que em 2012 havia 207
milhões de casos de malária no mundo, sendo que 80% registrados no continente
Africano; e mais de 620 mil mortes, das quais 90% teriam ocorrido na África, sendo
a grande maioria (77%) de crianças menores de cinco anos. Os P. falciparum e P.
vivax são as espécies mais importantes, a primeira é mais letal e predomina na
África e a segunda apresenta ampla distribuição mundial (WHO, 2013).
Figura 2: Distribuição mundial da malária. Fonte: Petersen et al., 2011
Na região das Américas, em 2008, foram registrados mais de 550 mil casos,
sendo os países que compartilham a floresta Amazônica os que apresentam o maior
número de casos, 89% do total, tendo o Brasil com maior proporção desses casos
(56%). O México com os países da América Central formam a sub-região com
menores níveis de transmissão (PAHO, 2010). Segundo a Organização
Panamericana de saúde (OPAS) em 2011 houve redução no número de casos, ≤
17
500 mil, na maioria dos vinte e um países, nos quais a malária é endêmica. Todavia
Guiana, Nicarágua e Venezuela na seguiram a mesma tendência e apresentaram
aumento no número de casos (PAHO, 2012).
O Brasil registrou 241.363 mil casos de malaria em 2012, sendo restrita aos
estados Amazônicos, ou seja, endêmica na Amazônia Legal (Fig. 3). Destes 31.595
(13.09%) foram causados por P. falciparum; 202.457 (83.8%) por P. vivax; 3.663
(1.5%) (P. falciparum e P. vivax) e 89 (aproximadamente 0.03%) por P. malariae e 1
P. ovale (importado da África). Segundo a OMS (2011) 20% da população brasileira
moram em áreas de risco. Apesar da malaria no Brasil ser endêmica na Amazônia, a
distribuição de casos é muito heterogênea entre seus estados e municípios, o que
levou o Ministério da Saúde (MS) a adotar o indicador IPA (Incidência Parasitária
Anual) para classificar o grau de risco de se adoecer de malária em cada um deles:
alto risco (IPA ≥ 50/1.000 habitantes), médio risco (entre 10 – 49/1.000 hab.) e baixo
risco (IPA < 10/1.000 hab.) (Fig. 2) (Brasil, 2009).
Figura 3 – Risco da malária por município de infecção, Amazônia Legal. Fonte: Brasil, 2010.
18
1.3. CONTROLE DA MALÁRIA NO BRASIL.
O Programa Nacional de Controle da Malária (PNCM) do Ministério da Saúde
objetiva: reduzir a letalidade e a gravidade dos casos de malária; a incidência da
doença; eliminar a transmissão em áreas urbanas e manter a ausência da doença
em locais onde a transmissão já não é presente. Dentre os planos adotados, pelo
programa, para atingir os objetivos expostos, tem-se: o diagnóstico precoce, o
tratamento oportuno e adequado dos casos e controle do mosquito transmissor
(Brasil, 2010, Frasson et al., 2009).
O Ministério da Saúde orienta o tratamento e distribui os medicamentos
antimaláricos em toda extensão territorial brasileira, em unidades do Sistema Único
de Saúde (SUS). Com o tratamento se objetiva: a interrupção da esquizogonia
sanguínea, responsável pela patogenia e manifestações clínicas da doença, a
destruição de formas latentes (hipnozoítas) das espécies P. vivax e P. ovale,
evitando as recaídas tardias, e a interrupção da transmissão do parasito, pelo uso de
drogas que impedem o desenvolvimento de formas sexuadas (gametócitos) (Brasil,
2010).
1.3.1 Diagnóstico Laboratorial da malária.
A detecção rápida e precisa dos parasitas da malária é fundamental no
combate e controle da doença, haja vista, que a alta morbidade e mortalidade
podem ser atribuídas ao desenvolvimento da resistência do parasita às drogas
antimalárica, sendo assim, o diagnóstico inadequado ocasiona desperdício de
recurso e prejudica o tratamento imediato (Brasil, 2009, Mouatcho & Goldring, 2013).
O método clássico é feito através da pesquisa microscópica do protozoário da
malária que pode ser feito em distendido sanguíneo como na gota espessa (Brasil,
2009).
19
O método supracitado pouco foi alterado ao longo dos anos, depois das
modificações na coloração promovidas por Romanowsky em 1800. Obtém-se o
distendido sanguíneo de uma gota de sangue do dedo ou lóbulo da orelha, após o
sangue ser espalhado na lâmina é fixado pelo álcool metílico e corado com Giemsa.
A gota espessa é obtida de uma amostra de sangue colhida por punção digital ou
venosa sem anticoagulante. A coloração é feita pelo método de Walker (azul de
metileno fosfatado e Giemsa) (Brasil, 2009, Tangpukdee et al., 2009). É mais
vantajosa por concentrar uma quantidade de sangue maior em uma pequena área,
aumentando a probabilidade de se encontrar o Plasmodium. Esta técnica permite
quantificar a parasitemia sanguínea e o diagnóstico da malária no Brasil. (Brasil,
2009, Tangpukdee et al., 2009).
Outra forma para diagnóstico da malária são os testes de diagnóstico rápido
(TDR), desenvolvidos nos anos 90, utilizados em áreas endêmicas, que se baseiam
na detecção de antígenos presente no sangue dos hospedeiros. A princípio utilizado
para o P. falciparum através da detecção da proteína rica em histidina 2 (PfHRP2),
na detecção da enzima lactato desidrogenase (Pf-pLDH) ou da enzima aldolase de
Plasmodium sp (Mouatcho & Goldring, 2013, Maltha et al., 2014).
1.3.2. Tratamento da malária humana.
No tratamento da malária são utilizados fármacos que atuam nas diferentes
formas do parasito e etapas do ciclo, isto é, interrompem a esquizogonia sanguínea;
podem atuar nas formas latentes do parasito no ciclo tecidual (hipnozoítas) das
espécies P. vivax e P. ovale, evitando assim as recaídas tardias e ainda
interrompendo a transmissão dos parasitos (gametócitos) (Brasil, 2001).
A classificação dos fármacos utilizados no combate a malária baseia-se na
ação sobre as diferentes fases do ciclo biológico do parasito (Fig. 4). Fármacos que
atuam sobre as formas hepáticas, ou em latência – esquizonticidas teciduais. Sobre
os parasitos eritrocíticos são – esquizonticidas sanguíneos. E que atuam nos
gametócitos, impedindo a transmissão para o mosquito (Brasil, 2001).
20
Figura 4: Fármacos que agem sobre as diferentes fases do ciclo da malária. Fonte: Bassat, 2011.
As manifestações clínicas da malária se iniciam com: mal estar, cefaleia,
mialgia, cansaço e febre. Passada a fase inicial, a febre passa a ser intermitente,
variando entre 48 e 72h, dependendo da espécie. Na malária não complicada, a
clínica da fase aguda é comum às quatro espécies clássicas: náuseas, debilidade
física, anemia, palidez e vômitos. Na malária grave e complicada as manifestações
clínicas são mais intensa, como: hipoglicemia, convulsões, edema pulmonar,
icterícia e malaria cerebral, sendo fatal para o Plasmodium falciparum (Brasil, 2001).
O esquema de tratamento recomendado pelo Ministério da Saúde depende
da espécie envolvida. Para as espécies que apresentam forma latente hepática (P.
vivax e P. ovale), em virtude da particularidade do ciclo biológico (formação de
hipnozoítas) é conveniente resaltar a importância das infecções que se repetem
após o tratamento medicamentoso, as quais são classificadas de três formas:
recaída, proveniente de formas latentes do fígado; recrudecência, oriunda de formas
parasitárias assexuadas sanguíneas que sobreviveram ao tratamento
21
medicamentoso e a reinfecção que decorre de uma nova inoculação de esporozoítos
pelo mosquito transmissor (Baird, 2004, Imwong et al., 2007).
A interrupção do tratamento, tipo de tratamento, doses inadequadas, aspectos
farmacocinéticos e casos de resistência, são fatores que podem explicar a falha
terapêutica da malária (Camargo et al., 2009; Garcia, 2010) .
A resistência do Plasmodium, principalmente do P. falciparum, representa um
problema importante de saúde pública. Tanto no Brasil quanto na Ásia e África, o P.
falciparum resistente à cloroquina é muito frequente, onde também já foram
encontrados parasitos multiresistentes. Com isso, preconiza-se o tratamento em
associações de antimaláricos, a fim de melhorar a eficiência do tratamento e tentar
diminuir a resistência (Giao & Vries, 2001).
A quimioterapia da malaria teve inicio no século XVII. Os jesuítas que vieram
para a America do Sul observaram que os índios do Peru utilizavam plantas do
gênero Cinchona spp (Rubiaceae), conhecidas popularmente por quinas, para o
tratamento de doenças febris. No inicio do século XIX, foi isolado o quinina (Fig. 5),
por Pelletier e Caventou, que apresentou atividade antimalárica.
Em 1820 a quinina foi identificada como sendo o princípio ativo da casca da
cinchona, em seguida difundindo-se pela Europa, América e Ásia, sendo a primeira
opção de tratamento da malária. A resistência a essa droga foi relatada na América
do Sul há quase um século, na Tailândia e Cambódia nos anos 60 (Wernsdorfer &
Payne, 1991, França et al., 2008, Pradines et al., 2010).
Esse amino-álcool, quinina, é eficaz contra o P. falciparum, com boa
solubilidade para formulações intravenosas, importante no tratamento de pacientes
que não toleram a medicação por via oral. Devido a alta toxicidade, cardiopatias,
“cinchonismo” (Bateman & Dyson 1986, França et al., 2008), tornou-se necessário
buscar drogas menos tóxicas (Cooper & Magwere, 2008).
22
N
O
OH
N
HCH2
Figura 5: Fórmula da Quinina. Fonte: Vale et al., 2005
No cenário internacional o mundo estava dividido pela Guerra Fria, entretanto
os EUA e a China apresentaram importante destaque na pesquisa e
desenvolvimento de fármacos antimaláricos sintéticos. Na década de 40, os EUA
intensificaram a síntese de medicamentos antimaláricos, com a finalidade de
proteção de suas forças armadas. O Walter Reed Army Institute for Research
(WRAIR), sessão científica dessas forças armadas, foi uma importante liderança na
pesquisa de drogas antimaláricas desde a Segunda Guerra Mundial (Manzali de Sá,
2011).
A história da cloroquina inicia no período entre as I e II guerras, 1934, quando
o químico alemão Hans Andersag desenvolveu e patenteou uma molécula e um
derivado chamado, “resochin” e “sontochin”, respectivamente. Suas estruturas
químicas apresentavam uma base comum, 4-amino-quinolina, responsável pela
atividade farmacológica na fase esquizonte do plasmódio. Posteriormente, a
molécula sintética “resochin” recebeu novo nome, cloroquina (Fig. 6) (Manzali de Sá,
2011). Esse composto, 4-aminoquinolídio, sintetizado após a II Guerra Mundial,
dominou o combate à malária mundialmente. Em 1955, quando o Programa Global
de Erradicação da Malária foi adotado pela Organização Mundial da Saúde (OMS)
havia um clima de otimismo em virtude desse novo medicamento e inseticidas como
o DDT (Manzali de Sá, 2011). A investigação desse derivado sintético foi
fundamental, pois apresenta níveis tóxicos toleráveis e eficácia sobre várias
espécies de Plasmódio (Vale et al., 2005). Este fármaco, esquizonticida sanguíneo,
23
foi amplamente utilizado para o tratamento da malária causado por P. vivax, P.
malariae, P. ovale e P. falciparum (Cravo & Rosario, 2002, Vale et al., 2005).
N
NH
CH3
N CH3
CH3
Cl
N
B
A
Figura 6: A: Formula da Cloroquina; B: Núcleo quinolínico da Cloroquina. Fonte: Manzali de Sá, 2011.
Em meados dos anos 50 foi sintetizado nos EUA a primaquina (Fig. 7), uma
8-aminoquinolina, com atividade anti esquizonte tecidual, além de atividade contra
os gametócitos e todas as formas exoeritrocíticas (Vale et al., 2005, Jonh et al.,
2012).
N
NHNH2
O
Fgura 7: Fórmula da Primaquina. Fonte: Vale et al., 2005.
24
Da mesma forma que a cloroquina em 1945, outra molécula sintética surgiu, a
amodiaquina (Fig. 8), pró-fármaco, 4–aminoquinolínico, esquizonticida sanguíneo,
apresentava-se muito eficácia no tratamento de malária falcipara e menos tóxica
quando comparada a cloroquina. Contudo, em meados da década de 90 seu uso foi
associado a efeitos de hepatotoxicidade e agranulositose (Gomeset al., 1997, Vale
et al., 2005, França et al., 2008, O´Neill et al., 2012).
N
NH
Cl
N
OH
Figura 8: Fórmula da Amodiaquina. Fonte: Vale et al., 2005.
Os Tetraidrofolatos são fundamentais na síntese do ácido desoxirribonucléico
(DNA) e no metabolismo da metionina. Diferentemente dos seres humanos que
necessitam da dieta para obter o folato, muitos microorganismos, como o
Plasmodium é capaz de sintetizar essas moléculas, desta forma drogas que agem
na síntese do ácido fólico seriam úteis no tratamento da malária (Salcedo-sora et al.,
2011).
Deste modo, ainda durante as décadas de 40 e 50 foi desenvolvido o
proguanil e a pirimetamina (Fig. 9). As duas drogas são inibidoras específicas da
enzima dihidrofolatoredutase (DHFR) e, em combinação com sulfas, foram utilizadas
no tratamento da malária. Entretanto, após o lançamento desse composto, vieram as
falhas no tratamento do P. falciparum. A resistência aos antifolatos tornou-se um
grande problema em regiões endêmicas de todo o mundo, tendo sido relatado o
primeiro caso de resistência a pirimetamina no final dos anos 50, na zona rural da
Tanzânia. (Peterson et al., 1990, falta colocar, Mharakurwa et al., 2011).
25
NH
NH
NH
NH
NHCl
N
N
NH2
NH2
Cl
12
Figura 9: Fórmula Proguanil (1) e Pirimetamina (2). Fonte: Vale et al., 2005.
As sulfas são inibidoras da diidropteroato sintetase (DHPS) que impedem a
formação do ácido di-hidrofólico, necessário para a síntese do ácido nucleico. Os
principais representantes desse grupo são as sulfadoxina, sulfadiazina, dapsona e
sulfaleno (Fig. 10). O uso desses medicamentos foi sendo reduzida, por conta da
baixa eficácia, toxicidade e posteriormente os casos de resistência (França et al.,
2008, Sridaran et al., 2010, Nzila et al., 2011).
S NH2NH2
O
O
S NNH2
O
O
H
NN
O
O CH3
CH3
S NNH2
O
O
H
N
N
S NNH2
O
O
H
N
N
O CH3
1 2
3 4
Figura 10 – Estruturas das sulfas: Dapsona (1), Sulfadoxina (2), Sulfadiazina (3) e
Sulfaleno (4). Fonte: França et al., 2008.
26
A Atovaquona é um hidroxi–1,4–nafitoquinona (Fig. 11) com mecanismo de
ação por inibição do sistema transportador de elétrons no citocromo bc1. Nos
parasitas da malária, os elétrons apresentam uma ligação obrigatória da biossíntese
de pirimidina, anel heterocíclico com dois átomos de nitrogênio, e o de transporte de
elétrons pela via ubiquinona/ubiquinol, que participam do processo de formação de
ATP. O efeito tóxico da atovaquona para o P. falciparum é devido as diferenças
entre a sensibilidade do sistema de transporte de elétrons dos mamíferos e do
Plasmódio para hidroxinaftoquinonas. Alem disso, pelo fato dos Plasmodium spp.
serem dependentes da formação de novos aneis pirimidínicos, diferentemente dos
vertebrados que apresentam a capacidade de recuperar a pirimidina. Desta forma, a
atovaquona impede a síntese de ácido nucléico do protozoário (Fry & Pudney, 1992,
Looareesuwan et al., 1999, Cordel et al., 2013).
Cl
O
O
OH
H
H
Figura 11: Fórmula da Atovaquona. Fonte: Vale et al., 2005.
Na década de 70 foi desenvolvida a molécula da mefloquina (Fig. 12),
derivado sintético da quinina, com atividade esquizonticida sanguíneo do P.
falciparum e P. vivax, contudo sem efeito sobre as formas tissulares. Essa molécula
passou a ser utilizada como alternativa nos casos de parasitos resistentes da época.
Entretanto, a resistência a esse composto, foi observada pela primeira vez no final
dos anos 80 na Tailândia com o Camboja. Na cidade de Manaus foi relatada a
resistência a mefloquina, de 51 crianças atendidas com malária falciparum,
avaliadas entre o 3° e 35° dia de tratamento, foi encontrado uma incidência de
27
resistência de 5,9% (Noronha et al., 2000, Farooq & Mahajan, 2004, Vale et al.,
2005, Nosten et al., 2012).
N
NH
OH
OH
CF3
CF3
Figura 12 – Fórmula da Mefloquina. Fonte: Vale et al., 2005.
Ainda nos anos 70 foi extraído da planta chinesa Artemisia annua L, a
artemisinina (Fig. 13), um sesquisterpeno que era utilizado na China, para o
tratamento de doenças febris. Esse composto como seus derivados
(dihidroartemisinina (2), artemeter (3), artesunato de sódio (4) e artéter (5)) são
esquizonticidas sanguíneos de ação rápida, que também apresentam atividade
gametocitocida, sendo ativos contra cepas de P. falciparum resistentes a todos os
outros fármacos (Vale et al., 2005, França et al., 2008, WHO, 2010).
28
O
O
O
H
H
O
O
O
O
O
H
H
O
OH
O
O
O
H
H
O
O
O
O
H
H
O
OCH3
OC2H
5
(1) (2)(3)
(5)
O
O
O
H
H
O
OCO(CH2)2COONa
(4)
Figura 13 – Fórmula da artemisinina e seus derivados. Fonte: França et al., 2008
Agentes terapêuticos combinados são usados geralmente para acelerar a a
resposta terapêutica e protegendo os componentes ativo dessas drogas de
possíveis casos de resistência. A terapia combinada à base de artemisinina (TCA) é
recomendada pela Organização Mundial de Saúde como tratamento de primeira
linha para malária não complicada por Plasmodium falciparum na África Sub-
Sariana. O Coartem® é a combinação da artemisinina, do composto de ação rápida,
com a lumefrantrina, substância de ação longa (Färnert et al., 2012).
A lumefantrina (Fig. 14) foi sintetizada na China nos anos 70 sendo
classificada como droga dos aril amino-alcoóis semelhante a quinina e mefloquina.
São altamente lipofílicos, de absorção lenta, com meia-vida de 5h, esquizonticida
sanguíneo de ação prolongada e lenta no estágio eritrocítico assexuado do
plasmódio (Pinheiro et al.,2013).
29
NOH
Cl Cl
Cl
Figura 14 – fórmula do lumefrantina. Fonte: Vale et al., 2005.
1.4. RESISTÊNCIA DA MALÁRIA HUMANA.
A malaria é uma grande causadora de morbidade e mortalidade, entretanto a
sua erradicação da doença, na maioria dos países subdesenvolvidos, não foi
possível em razão; da resistência generalizada aos inseticidas, guerras, migração
populacional e por fim o aparecimento da resistência à cloroquina (Hay et al., 2004,
Petersen, et al., 2011).
No final da década de 50 foram relatados os primeiros casos de resistência do
P. falciparum à cloroquina, no Sudeste da Ásia (Tailândia-Cambódia) e
concomitantemente na America do Sul (Colômbia) (Wernsdorfer & Payne, 1991). A
resistência à cloroquina disseminou-se por inúmeros países: America do Sul nos
anos 70, Ásia e Oceania no final dos anos 80. No continente africano a resistência
foi relatada pela primeira vez em 1978, espalhando-se posteriormente para o centro-
sul do continente até ser relatada em meados dos anos 90 na África Sub-saariana.
Atualmente a resistência à cloroquina é predominante em quase todas as regiões
endêmicas de malária (Wongsrichanalai et al., 2002, Farooq & Mahajan, 2004,
Petersen et al., 2011).
Esse fármaco é o de escolha para o tratamento de malária causada por P.
Vivax em alguns países como o Brasil (Yohannes et al., 2011). A cloroquina é
30
associada com a primaquina para evitar a recaida, em quaisquer pacientes não
gravidas e maiores de seis meses com atividade normal da glicose-6-fosfato (G-6-
PD) (Graf et al., 2012). A recorrência do P. vivax pode ocorrer quando há falha no
tratamento com drogas antimaláricas da fase sanguínea, como a cloroquina, ou
quando drogas antimaláricas da fase hepática, como primaquina. Considerando a
sensibilidade à cloroquina, a concentração eficaz mínima (CEM) é de 100 ng/ml que
determina se o P. vivax é sensível ou resistente a essa droga (Baird, 2004). O
aparecimento de casos de P. vivax resistente a cloroquina (PVRC), pode ter uma
das causas o generalizado de cloroquina associado a primaquina. Em um estudo
realizado no Peru, entre 2005 e 2008, com quinhentos e quarenta pacientes tratados
com cloroquina em associação com a primaquina, quatro apresentaram recorrência
dos sintomas no periodo de trinta e cinco dias após o início do tratamento o que
indica uma possível falha. Nas amostras de sangue de um desses pacientes o nível
de cloroquina foi de 95 ng/ml, entretanto segundo critérios para classificar o P. Vivax
como resistente um dos critérios é o nível de cloroquina > 100 ng/ml (Graf, et al.,
2012). Na Etiopa, entre 2004 e 2005, foram avaliados casos de pacientes tratados
para malária vivax com cloroquina, dos 57 casos que completaram o tratamento
ambulatorial, 7,5% apresentaram falha. Sendo que a resistência foi confirmada em
três dos cinco casos de falhas (Yohannes et al., 2011).
Um estudo envolvendo derivados 4-aminoquinolínicos e a quinina foi
realizado para avaliar a resistência do P. falciparum dez pacientes, divididos em dois
grupos, infectados na Amazônia brasileira. Esses pacientes foram submetidos a um
estudo in vivo de sensibilidade a tratamento com cloroquina e amodiaquina (grupo
A) e com quinina (grupo B). No grupo A, três pacientes receberam cloroquina e dois
amodiaquina, e foi demonstrado resistência em todos os pacientes que concluíram o
tratamento. No grupo B, cinco pacientes receberam quinina por via oral por sete
dias, destes, quatro apresentaram diminuição da parasitemia após a primeira
semana de tratamento e um paciente apresentou aumento de parasitemia nos
primeiros três dias de tratamento, com sinais de piora do quadro clínico, exibindo
padrão de resistência R III ao tratamento (Segurado et al., 1997).
Como possível solução para o tratamento de malária resistente a cloroquina,
foi proposta á associação de dois fármacos que agem na formação do folato,
31
entretanto a resistência à combinação de sulfadoxina-pirimetamina foi descrita, pela
primeira vez, na Tailândia e Camboja nos anos 60, posteriormente em outros locais
como no continente africano em e na Índia (Choudhury et al., 1987). Até o final dos
anos 80, a resistência à sulfadoxina, pirimetamina e a mefloquina foi prevalente na
(Tailândia com o Camboja eTailândia-Mianmar) e toda a África. Atualmente, nos
diferentes continentes, tem sido encontrado isolados de P. falciparum multidroga
resistentes (MDR) (Wongsrichanalai et al., 2002).
A artemisinina é utilizada como tratamento de primeira linha, em casos de
malária falciparum não complicada em áreas endêmicas, em substituição a
tratamentos ineficazes com cloroquina, sulfadoxina–pirimetamina. Contudo, falhas
no tratamento com a artemisinina já foi descrita na fronteira da Tailândia-Cambódia
evidenciando a resistência ao fármaco. (Dondorp et al., 2009). Em um estudo, com
94 adultos, com malária falciparum não complicada, os pacientes foram tratados
com doses elevadas de artesunato ou quinina-tetraciclina. Para classificar as cepas
como resistentes, alguns critérios foram adotados: os pacientes que apresentassem
fracasso na redução da parasitemia em sete dias de tratamento ou re-ermêgencia
dos parasitos em vinte e oito dias de acompanhamento e concentrações plasmáticas
inadequadas do medicamento. Dentre os sessenta pacientes tratados com
artesunato dois (3,3%) apresentaram uma redução da parasitemia em 133 e 95h,
entretanto a média era de 52,2h, sendo caracterizada a resistência do parasito
(Noedl et al., 2010).
A combinação de fármacos é uma alternativa para evitar o desenvolvimento
de resistência. A amodiaquina combinada com o artesunato tem sido utilizada em
substituição a cloroquina em países da África.
A associação da atovaquona e proguanil, é utilizada para prevenção e o
tratamento de malária falciparum resistente a cloroquina. Em um estudo foi relatado,
um caso isolado, de um viajante resistente a atovaquona e proguanil que saiu do
Canada para África (Serra Leoa) em 2005. Utilizando a tecnica da reação em cadeia
da polimerase (PCR) confirmou-se a presença de uma mutação pontual (Tyr268Ser)
no gene citocromo b (Kuhnet al., 2005).
32
A terapia com drogas combinadas à base de arteminisinina (TCA) é
recomendada pela OMS como tratamento de primeira linha para malária não
complicada de Plasmodium falciparum na África Sub-sariana (WHO, 2010).
Uma das combinações recomendadas consiste na associação de uma droga
de ação rápida (artemisinina) e outra de longa duração (lumefrantrino) a fim de evitar
a recrudescência e o aparecimento de resistência.
Apesar da eficácia do tratamento combinado (TCA) já foi relatado casos de
resistência a esse tratamento. Segundo Färnert e colaboradores (2012) relataram
que um viajante que retornava da Tanzânia e estava infectado com Plasmodium
falciparum recrusdeceu. A genotipagem para marcadores de resistência revelaram a
presença de pfcrt (alelo 76K) e pfmdr1 (alelo 86N). Na genotipagem da proteína de
superfície do merozoito, msp2, foram detectados dois alelos o 336bp FC27 e 487bp
IC-1. A demonstração de msp2, pfcrt e pfmdr1 confirmam a recrudescência. Além da
genotipagem o estudo avaliou o desbutillumefrantrino, metabólito do lumefrantrino,
sendo constatada uma concentração de 2,96ng/ml, valor abaixo dos encontrados em
crianças com tratamentos bem sucedidos (média de 15,5 ng/ml)
Na fronteira da Tailandia e Mianmar, 134 pacientes com malária falciparum
não complicada apresentaram resistência ao tratamento de três dias com a
mefloquina e artesunato. Visando compreender os fatores genéticos envolvidos
nesta resistência avaliou-se os polimorfismos genéticos do Plasmodium falciparum
transportador de resistência a cloroquina (pfcrt), P. falciparum multirresistência1
(pfmdr1) e P. falciparum ATPase (pfatp6). Mutações para o pfcrt (codons 76, 220,
271, 326, 356 e 371) foram encontradas em 100% das amostras. Contudo, nenhuma
mutação de pfmdr1 (codon86) e pfatp6 (codons 37, 693, 769, 898) foi encontrada
(Muhamad et al., 2011).
Com o aparecimento das cepas de P. falciparum resistente à cloroquina, a
OMS substitui esse medicamento de primeira linha e passa a adotar a terapia
combinada tendo como base a artemisinina; esquizonticida rápido, para malaria não
complicada em áreas de multiresistência, com drogas como o lumefrantrina.
Contudo, como já descrito anteriormente os genes pfmdr1 e pfcrt podem conferir
resistência ao P. falciparum frente a vários fármacos. O pfmdr1 86Y e pfcrt 72-76
33
estão associados a resistência a cloroquina e amodiaquina. Entretanto, parasitos
que apresentam o alelo pfcrt K76 já tem demonstrado tolerância ao lumefrantrina
(Eyase et al., 2013).
1.4.1 Mecanismos moleculares associados à resistência do Plasmodium
falciparum aos compostos quinoleicos e antifolatos.
Após ser sintetizada, a cloroquina foi sucesso no tratamento na malária
falciparum baseado, principalmente, na eficácia clínica, baixa toxicidade e por ser
um composto de fácil síntese. Todavia, em pouco tempo de uso os relatos de
resistência começaram ser de domínio público. O mecanismo de resistência a esse
composto não seja bem entendido, alguns mecanismos já foram propostos (Jensen
& Mehlhom, 2009).
A cloroquina é uma base fraca que acumula no vacúolo digestivo ácido do
parasito, ou seja, sua forma não protonada penetra pela membrana da hemácia
parasitada e no vacúolo digestivo, que devido às características ácidas, sofre
processo de ionização, o que impossibilita sua saída, do vacúolo pela membrana
lipossolúvel, ficando aprisionada neste compartimento ácido do parasito (Geary,
1990, Egan. 2008).
A resistência a esse composto pelo P. falciparum é um processo multifatorial,
pois deve ser levado em consideração: tipo de tratamento, abandono ou tratamento
incompleto, uso excessivo dos fármacos, capacidade de adaptação dos plasmódios
(Zalis, 2000; Hyde, 2005) e principalmente os eventos multigênicos do P. falciparum
resistente (Foote et al.,1990).
O parasito tem desenvolvido meios de contornar a eficácia das drogas com
mutações que conferem resistência. Nas cepas resistentes o acumulo de cloroquina
no interior do vacúolo digestivo é menor ou há um aumento do seu efluxo (Krogstad
et al., 1987; Wellems et al., 1990). Estando envolvidos, principalmente, dois genes,
pfmdr1 (Plasmodium falciparaum multi-droga resistente 1) e pfcrt (Plasmodium
falciparaum resistente à Cloroquina relacionado ao transportador). No P. falciparum
34
o pfmdr1 pertence à superfamília ABC. Ele é homologo a glicoproteína P humana,
composto por um domínio N-terminal e outro domínio C-terminal. O pfcrt contém dez
hélices transmembranares, ambos localizados na membrana do vacúolo do parasito
(Johnson et al., 2004, Ferreira et al., 2011).
Estudos mostram que a resistência à cloroquina está associada com a
mutação pontual no códon 76 do gene do transportador (pfcrt), o que implica em
falência do tratamento. Outras mutações pontuais, N86Y, Y183F, S1034C, N1042D
e D1246Y, no pfmdr1, também se associam essa resistência (Mubjer et al., 2011).
Um estudo investigou a associação do Plasmodium falciparum transportador
de resistência a cloroquina (pfcrt) T76 e o Plasmodium falciparum multirsistente gene
1(pfmdr1) alelo Y86 em isolados de crianças tratadas com amodiaquina no Sudoeste
da Nigéria em 2005. Após o tratamento, o exame parasitológico demonstrou que
87% das crianças tratadas com amodiaquina ficaram curadas e em 13% houve falha
do tratamento (Happi et al., 2006).
No estudo com quarenta amostras de isolados sanguíneos, da região
Amazônica brasileira, para investigação da base molecular da resistência do P.
falciparum á cloroquina, foi identificado polimorfismos nos códons TYR184PHE,
ASN1042ASP e ASP1246TYR do gene pfmdr1, as regiões kappa e gamma do gene cg2 e
a mutação K76T do gene pfcrt. Neste estudo, foi demonstrada resistência in vitro do
P. falciparum em todos os isolados analisados para os genes pfmdr1, região gamma
do gene cg2 e a mutação K76T do gene pfcrt. (Viana et al. 2006). Na América do
Sul a resistência à cloroquina esta ligada a mutações no pfcrt, (K76T), além de
outras mutações (C72S, M74I, N75E e N75K) (Griffing et al., 2010).
Para os quinolinometanóis, quinina e mefloquina, o mecanismo de resistência
também está relacionado ao gene pfmdr1. O mecanismo de resistência a quinina
não está totalmente esclarecido, porém mutações no gene pfmdr1, contribuem para
a redução da susceptibilidade a essa droga. (Zalis et al., 1998). Múltiplos genes s’ao
candidatos a contribuírem para a resistência a quinina, sendo o pfnhe-1 um deles.
Um polimorfismo de repetição nesses gene está associado com diminuição da
resposta à quinina na Ásia África e America do Sul (Ferdig et al., 2004).
35
Em relação à mefloquina a resistência remete-se, principalmente, as regiões
do Sudeste Asiático e da América do Sul (Wongsrichanalai et al., 2004). Para essa
droga, a amplificação do pfmdr1, ou seja, o aumento do número de cópias desse
gene está relacionado com a resistência a Tailândia e Camboja (Griffind et al.,
2010). Polimorfismos únicos de nucleotídeos no gene pfmdr1 têm demonstrado
relação com resistência a drogas antimaláricas como a mefloquina (Ferreira et al.,
2011). Em um estudo realizado na Tailândia com o P. falciparum (TM036) utilizando-
se marcadores genéticos. Foi observado que a resistência a mefloquina foi adquirida
por exposição continua as concentrações crescentes da droga, sendo demonstrado
que o número de cópias do gene resistente aumentou à proporção que a
susceptibilidade a droga diminuiu (Preechapornkul et al., 2009).
Para os compostos que agem na síntese do folato, como a sulfonamida e
pirimetamina, têm seu mecanismo de ação, relacionado com a inibição das enzimas
diidropteroato sintase (DHPS) e diidrofolato redutase (DHFR), respectivamente.
Mutações em genes dessas enzimas, DHFR e DHPS, apresentam relação com a
resistência no P. falciparum. Uma mutação na enzima DHFR, do tipo Ser108 para
Asn108 (S108N) é suficiente para identificar resistência a pirimetamina in vitro e in
vivo (Peterson et al., 1988, Sridaran et al., 2010). O aumento progressivo de
mutações do tipo Cys50 por Arg (C50R), Asn51 para Ile (N51I), Cys59 a Arg (C59R)
e Ile164 para Leu (I164L) em DHFR estão relacionadas com a produção de níveis
mais elevados de resistência a essas drogas (Basco et al., 1995, Sridaran et al.,
2010).
Para o grupo das sulfonamidas, por exemplo, a sulfadoxina, mutações nos
codons como: Ser436 Ala ou Phe (S436A / F), Ala437 para Gly (A437G), Lys540
para Glu (K540E), Ala581 a Gly (A581G) e Ala613 a Ser ou Thr (A613S/T) DHPS, já
demonstraram afetar a susceptibilidade do parasita as sulfas incluindo sulfadoxina
(Triglia et al., 1997, Sridaran et al., 2010).
Devido a todos os relatos de resistência do Plasmodium falciparum a
diferentes fármacos, o aparecimento e disseminação de cepas resistentes aos
fármacos antimaláricos (Quadro 1), principalmente a cloroquina (fármaco muito
utilizado no tratamento de malária) justifica a busca por drogas, medicamentos ou
tratamentos alternativos. Historicamente as plantas têm contribuído na descoberta
36
de antimaláricos, haja vista que foram isolados, a partir de plantas, a quinina do
gênero Cinchona e a artemisinina da Artemisia annua L.
Quadro 1: Utilização clínica dos fármacos e o aparecimento de resistencia do P.falciparum. Fonte: Wongsrichanalai et al., 2002.
Fármacos Inicio do uso clinico
Surgimento da resistência
Diferença de anos
Quinina 1632 1910 278
Cloroquina 1945 1957 12
Proguanil 1948 1949 1
Sulfadoxina-pirimetamina 1967 1967 0
Mefloquina 1977 1982 5
Atovaquona 1996 1996 0
1.5. BUSCA POR NOVAS DROGAS.
A flora brasileira desperta interesse de estudiosos desde quando botânicos
europeus visitaram o país entre os séculos XVII e XIX para estudar as paisagens e a
flora do Brasil. O Brasil apresenta uma flora muito rica, com expressiva diversidade
de ecossistemas florestais, devido a sua grande área física, climas e solos, com
mais de 56.000 espécies de plantas – cerca 19% da flora mundial (Leitão Filho,
1987; Giuliett et al., 2005).
A utilização de plantas medicinais é uma alternativa na busca de novos
agentes terapêuticos. A medicina tradicional é empregada para a manutenção e
recuperação da saúde desde existência humana, sendo principalmente utilizada em
regiões pobres do mundo. Grande parte dos produtos farmacêuticos foi originada de
produtos naturais. Considerando-se a grande diversidade de plantas, estima-se que
70% dessas plantas ocorram em países como: China, Índia, Peru, México e Brasil
(Brandão et al., 2010; Giraldi & Hanazaki, 2010; Nogueira et al., 2010).
Segundo Nogueira e colaboradores, 2010, nos últimos 25 anos mais de 75%
dos agentes anticancerígenos testados e aprovados provem de produtos naturais.
37
Inequivocamente o uso de plantas medicinais no tratamento de malária é importante,
visto que fármacos importantes foram extraídos de plantas como por exemplo a
quinina e artemisinina.
Neste contexto, estudos demonstram a importância de produtos naturais
como novas substâncias ativas. Carneiro et al., 2012 selecionaram frações e
extratos de Azadirachta eficientes para os ensaios sobre formas amastigotas de
Leishmania amazonensis. O extrato etanólico das folhas e as frações diclorometano
e de clorofórmio apresentaram CI50 de 38, 3,9 e 1,2 µg/mL para promastigotas e CI50
de 9,8, 1,1 e 0,6 µg/mL para amastigotas, respectivamente, após 72h.
Quinze extratos e quatorze compostos (limonóides e triterpenos) e isolamento
de 25 compostos conhecidos, sendo seis limonóides, sugerem que a espécie
Cedrela fissilis (Meliaceae) apresenta atividade tripanocida (Leite et al., 2008).
No caso da malária, parte da população dos países em desenvolvimento
utiliza plantas medicinais para o seu tratamento, sendo assim, a triagem de plantas
medicinais constitui uma estratégia promissora. No Brasil, várias plantas são
utilizadas popularmente para o tratamento da malária. Pela abordagem
etnofarmacológica, já foram identificadas centenas de espécies citadas na literatura
brasileira, para tratamento de febre, malária e problemas hepáticos (Brandão et al.,
2010; Kretlli, 2012).
Vinte e três extratos diferentes de algumas espécies de Aspidosperma
(Apocynaceae), coletadas em Minas Gerais, foram testados in vitro contra os clones
de P. falciparum, W2 e o 3D7 resistente e sensível à cloroquina, respectivamente,
demonstrando atividade com CI50 que variaram de 5 µg/ml a 65 µg/ml (Dolabela et
al., 2012). Em outro estudo a Esenbeckia febrifuga (Rutaceae), utilizada
popularmente na Amazônia brasileira para tratar malária, apresentou in vitro, frente
aos clones de P. falciparum, W2 CI50 15,5 µg/mL) e 3D7 (CI50 21,0 µg/mL) (Dolabela
et al., 2008).
A avaliação farmacológica in vivo de mais de 20 plantas usadas no Brasil
identificou quatro espécies com atividade contra Plasmodium berghei em
camundongos. As espécies: Esenbeckia febrifuga (Rutaceae), Acanthospermum
38
australe (Compositae), Lisianthus speciosus e Tachia guyanensis as duas da família
Gentianaceae. (Brandão et al., 1992).
Outro estudo avaliou duzentos e sete extratos de plantas do cerrado brasileiro
das quais cerca de 30 plantas foram ativas, ou seja, impediram o crescimento do
Plasmodium, sendo as famílias; Flacourtiaceae e Sapindaceae com CI50 0,9 µg/mL e
Apocynaceae e Annonaceae com CI50 4,9 µg/mL mais ativas (De Mesquita et al.,
2007).
A avaliação do potencial antimalárico da espécie Lansium domesticum
(Meliaceae) demonstrou que extrato aquoso e metanólico das folhas e casca do
fruto frente ao plasmódio 3D7 reduziram a parasitemia em mais 50% (Yapp & Yap ,
2003).
O antotecol, limonóide da Khaya anthotheca (Meliaceae) foi avaliado in vitro
contra Plasmodium falciparum (W2) usando o método da [3H] hipoxantina por 24h e o
ensaio de desenvolvimento por 48h. Esse limonóide demonstrou atividade
antimalárica com CI50 os valores de 1,4 e 0,17 µM usando os dois ensaios. Além
disso, gedunina teve atividade antimalárica com CI50 os valores de 3,1 e 0,14 µM. No
entanto, os limonóides, limonina e obacunona não apresentaram qualquer atividade
antimalárica (Lee et al., 2008).
Limonóides isolados da Chisocheton siamensis foram testados frente ao
Plasmodium falciparum (K1) demonstrando atividade com CI50 2,06 – 6,31µg/mL. A
azadiradiona, epoxiazadiradiona e disobina CI50 2,91, 3,18 e 2,06µg/mL,
respectivamente (Maneerat et al., 2008).
Outras famílias também têm espécies que já demonstraram atividade
antiplasmódica, dentre elas a Piperaceae, na qual o gênero Piper apresentou
potencial. No estudo com setenta e seis extratos vegetais obtidos de dezessete
espécies, o extrato clorometileno de Piper capense apresentou atividade
antiplasmódica frente ao clone W2, com CI50 7 μg/mL (Kaouet al., 2008).
Neste contexto, duas espécies que também são promissoras para malária são
a Carapa guianensis e o Piper aduncum. Em estudo in vitro realizado por Miranda
Junior et al. (2012) no estado do Pará foi demonstrado que o óleo da espécie
39
Carapa guianensis inibe o crescimento do clone de P. falciparum resistente a
cloroquina (Dd2) até a concentração de 8,2 µg/mL. O fracionamento deste óleo levou
ao isolamento de uma fração rica em limonóides (FRL), princípio ativo do óleo, que
também inibiu o crescimento do clone de P. falciparum resistente a cloroquina em
uma concentração de 3.1 µg/mL.
Considerando a outra espécie, o Piper aduncum L. (Piperaceae), conhecida
popularmente como pimenta-de-macaco, usada para tratar doenças inflamatórias.
Nos ensaios realizados por Miranda Junior (2012) foi demonstrado que o óleo
apresentava atividade antiplasmódica, sendo que na concentração de 10,3 μg/mL a
inibição foi de 77%, após 72h de exposição, para o Plasmodium falciparum.
1.6. ESPÉCIE CARAPA GUIANENSIS.
A Carapa guianensis Aubl., (Fig. 15) conhecida popularmente como andiroba,
iandiroba, carapa e nandiroba (Fisch et al., 1995; Lorenzi, 1992; Bickii et al., 2000;
Muellner et al., 2003), pertence à família Meliaceae que é composta por cerca de 50
gêneros, (Muellner et al., 2003).
No Brasil é representada por 7 gêneros, Cedrela, Cabralea, Swietenia,
Carapa, Guarea, Trichilia e Khaya (Guimarães et al., 2004). O gênero Carapa,
subfamília Swietenioideae, é composto por duas espécies, C. procera e C.
guianensis (Pennington et al., 1981). A família tem distribuição nos trópicos de todo
o planeta, com pequena penetração nas zonas temperadas (Joly, 1987). A C.
procera ocorre na África e América do Sul, enquanto a C. guianensis ocorre da
América Central até o norte da América do Sul. No Brasil, as duas espécies ocorrem
principalmente no estado do Amazonas (Fisch et al., 1995; Ferraz & Sampaio,
1996).
Plantas pertencentes à Meliaceae, em geral, são arbóreas e de grande porte,
com folhas grandes (Fig. 16), de crescimento apical (da raque), sem estípulas, ás
vezes com pulvinos na base, pinadas, bipinadas ou unifoliadas. Flores pequenas
actinomorfas, em inflorescências paniculadas terminais ou nas axilas superiores,
40
hermafroditas, cíclicas, diclamídeas, de simetria radical. Sépalas e pétalas livres.
Ovário súpero, com 4 a 5 carpelos e outros tantos lóculos, cada qual com 1 ou 2
óvulos. Fruto drupa, baga ou capsular loculicida ou baciforme. Sementes com arilo
ou aladas presas à columela. As não aladas podem ser elipsódes, plano-convexas
ou angulosas, cobertas ou não por 22 sarcotesta ou um arilóide. O embrião é
geralmente reto, com cotilédones planos ou planos-convexos, com eixo radícula-
hipocótilo incluso ou externo. No gênero Carapa, os cotilédones são muito crassos,
fusionados entre si (Gemtchújnicov, 1976; Joly, 1987; Muellneret al., 2003).
A andiroba é constituída por folíolos medindo de 80 a 110 mm de
comprimento, podendo atingir 30 m de altura e 1,20 m de largura, ocorrendo em
toda a região Amazônica, em várzeas secas e alagadiças, beiras de rios e igarapés
do Pará até a Bahia. A madeira moderadamente pesada (densidade de 0,73 g/cm3),
dura, porém fácil de fender, superfície ligeiramente áspera ao tato, textura média,
pouco resistente às intempéries, contudo inatacável por insetos, alburno pouco
diferenciado. Floresce duas vezes ao ano, agosto-setembro e janeiro-fevereiro e os
frutos amadurecem em junho-julho e fevereiro-março (Lorenzi, 1992; Ambrozin et al.,
2006).
Figura 15 – Árvore da espécie Carapa guianensis. Fonte: Lorezzi, 1992.
41
Figura 16 – Folhas da espécie Carapa guianensis. Fonte: Ferraz, 2003.
A casca é cinzenta e grossa e tem folhas impinadas ou abrupto-impinada
composta por inúmeros folíolos subopostos, elíptico-oblongo; apresenta flores
pequenas, amarelas ou vermelhas, axilares; o fruto é capsular ovóide semigloboso,
lenhoso; tem número variado de sementes vermelhas, coriáceas e quase lenhosas,
convexas, angulosas ou irregularmente tetraédricas, achatadas lateralmente
(Corrêa, 1926).
Em termos econômicos, a madeira das Meliaceas possui ótima qualidade, por
isso são bastante usadas na indústria de móveis, construção de barcos e navios
(Mendonça & Ferraz 2007). Por suas propriedades físicas e mecânicas a madeira de
andiroba alcançou o mercado de países como o Japão, EUA e Alemanha. Na
primeira metade da década de 90, a produção de madeira serrada exportada pelo
estado do Pará variou ano a ano, porém alcançando valores superiores a 13.400 m3,
com preço médio de US$ 227,00/m3 (Ferraz et al., 2003). Com a espécie C.
guianensis, além da madeira, as sementes (Fig. 15) são utilizadas para extração do
óleo. As indústrias farmacêuticas e de cosméticos têm grande interesse utilizando-o
em alguns produtos como; shampoos, condicionador, sabonetes e cremes
hidratantes (Boufleuer, 2004; Ferrari et al., 2007).
Diferente da extração madeireira, a coleta das sementes demanda um
pequeno investimento e os subprodutos oriundos do óleo, como sabonetes e velas,
42
são revendidos em feiras livres do Norte do país, tendo um grande impacto na
economia de alguns estados da região (Mendonça & Ferraz 2007).
O óleo é constituído de material saponificável, como ácido palmítico, oléico
(cerca de 50%), esteárico e linoléico (Castro et al., 2006), além de uma fração
insaponificável (2 a 5%) constituída principalmente de substâncias amargas,
chamadas meliacinas ou limonóides.
Os limonóides são tetranortriterpenóides altamente oxigenados, polaridade
moderada, insolúvel em água, todavia solúvel em hidrocarbonetos, álcool e acetona
(Roy & Saraf, 2006, Silva et al., 2009; Mohamad et al., 2009). Esses compostos
ocorrem principalmente em Meliaceae e Rutaceae. São compostos estereoquímicos
homogêneos, tendo como precursor a cadeia 4,4,8–trimetil–17–furanilesteróide. Nos
limonóides cítricos a estrutura química apresenta um anel furano ligado ao anel D no
carbono 17 (C-17), como também grupos funcionais contendo oxigênio nos
carbonos C-3, C-4, C-7, C-16 e C-17. Contudo, as variações estruturais são menos
frequentes nas Rutaceae quando comparados as Meliaceae (Roy & Saraf, 2006).
Alguns limonóides (Fig. 17) presente na Carapa guianensis são: gedunina (1),
6--acetoxigedunina (2), 7-desacetoxi-7-oxogedunina (3), 7-deacetilgedunina (4),
1,2-di-hidro-3--hidroxi-7-desacetoxi-7-oxogedunina (5), andirobina (6), que
provavelmente são responsáveis pela atividade biológica do óleo (Ambrozim et al.,
2006, Silva & Nunomura, 2012, Miranda Júnior et al., 2012).
43
10
5
1
3
9
7
1311
17
O
15
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18
O
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O
OAc
10
5
1
3
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7
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17
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19
H
30
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O
OAc
OAc
10
5
1
3
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7
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17
O
15
O
H
18
O
O
19 30
O
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1 2 3
O
OH
H
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O
O
O
10
5
1
3
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17
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18
O
19 30
O
O
OH
H
4 5
O
O
O
O
O
O
O6 OMe
Figura 17: Limonóides isolados da Carapa guianensis. Fonte: Miranda Júnior, 2010.
1.7. ESPÉCIE PIPER ADUNCUM.
A espécie Piper aduncum L conhecida popularmente como pimenta-de-
macaco e aperta-ruão (Maia et al., 2000), pertence a família Piperaceae que é da
ordem das Piperales e é composta por 10 a 12 gêneros com cerca de 2000 espécies
distribuídas em todas as regiões tropicais. No Brasil, a família é representada por 5
gêneros, tendo o gênero Piper como um dos maiores, com cerca de 260 espécies,
sendo que a Amazônia abriga próximo de 140 espécies (Maia et al., 1998; Jaramillo
& Manos, 2001; Guimarães et al., 2004). Esta família inclui plantas com hábitos
predominantemente herbáceos (trepadeiras, arbustos e até arvores), de distribuição
pan-tropical. Quanto aos aspectos botânicos, às folhas são inteiras, com predomínio
da disposição alternada, com estípulas, que muitas vezes estão soldadas simulando
uma bainha. Inflorescência em geral espiciforme. Flores muito pequenas,
aclamídeas, hermafroditas, raramente diclinas, protegidas por uma ou duas
bractéolas pediceladas ou sésseis, geralmente petaladas. O caule se apresenta
articulado (com nós e entre nós) com articulações intumescidas. Androceu composto
por 1 a 10 estames livres, com anteras bitecas ou unitecas, risomas. Fruto pequeno,
44
drupáceo, carnoso. Semente com perisperma e endosperma escasso e embrião
reduzido (Gemtchújnicov, 1976; Joly, 1987).
O gênero Piper apresenta boa representatividade comercial e destaque no
cenário econômico, sendo a espécie indiana Piper nigrum, produtora da pimenta-do-
reino, a mais difundida no mundo. O Piper hispidinervum, uma espécie nativa da
Amazônia brasileira, conhecida como pimenta-longa, tem despertado grande
interesse como fonte para obtenção de safrol. As maiores aplicações do safrol é a
sua conversão para piperonal e butóxido de piperolina, sendo o primeiro um fixador
de fragrância e o último um agente sinérgico das piretrinas, na formulação e
estabilização e potencialização de um inseticida biodegradável (Souto, 2006; Nunes
et al., 2007). Este gênero é muito utilizado na medicina popular da America Latina e
Oeste da Índia. O extrato clorofórmio de P. aborescens apresentou significativa
atividade contra cultura de células KB e em culturas de células de leucemia
linfocítica, P–388, e o P. sylvaticum como antídoto eficaz, contra picadas de
serpente na Índia (Parmar et al., 1997).
Na Jamaica foram usadas 11 espécies do gênero Piper dentre elas o P.
aduncum contra dores estomacais e como repelente de insetos, o P. chaba utilizado
contra asma, bronquite e febre e o P. amalago para inflamação (Parmar et al., 1997).
A pimenta-de-macaco (Fig. 18) é um arbusto de 2 a 7 m, bastante nodoso;
folhas membranáceas ou cartáceas, elípticas, elíptico-ovaladas ou elíptico-
lanceoladas ápices curtamente acuminado, base assimétrica arredondada ou
codiforme, opacas em ambas as faces, sendo a inferior finamente pubescente,
nervação com pêlos quase adpressos espigas alongadas, flores minúsculas e frutos
obpiramidais; frutos drupa amarelada, com minúsculas sementes marrons (Maia et
al., 2000).
45
Figura 18: Espécie Piper aduncum. Fonte: Maia, 2000.
No Brasil distribuem-se pelos Estados da região Norte e Nordeste (Maia et al.,
2000). Esta espécie é considerada uma planta oportunista que invade áreas
desflorestadas após exploração de madeira, de alta rusticidade e elevada resistência
às mudanças climáticas (Sousa et al., 2008).
1.8. ÓLEO DE ANDIROBA (OA).
Alguns estudos avaliando o potencial farmacológico deste óleo já foram
realizados. A avaliação da atividade repelente foi realizada utilizando larvas de
Aedes aegypti, onde se observou um elevado potencial (Mendonça et al., 2005).
Em estudo realizado com voluntários, que tiveram seus antebraços recobertos
com óleo de andiroba (100%), óleo de andiroba (15%) óleo de soja refinado, e na
ausência de produto (controle negativo) DEET 50% (N.N-dietil-meta-toluamida)
como controle positivo, contra a picada das fêmeas do Aedes sp. Após aferição do
tempo da primeira e terceira picada, foi observado um discreto efeito repelente do
óleo de andiroba a 100%, quando comparado ao óleo de soja refinado, óleo de
andiroba a 15% e o controle negativo, sendo significativamente inferior ao inseticida
(DEET 50%) (Miot et al., 2004).
46
Em estudos de toxicidade reprodutiva com ratas Wistar, durante 45 dias com
administração oral do óleo de andiroba, após analise dos índices de fertilidade,
viabilidade, lactação, gestação, relação prole/mãe, percentual de natimorto e massa
corpórea da prole, foi visto que o óleo de andiroba não induziu toxicidade materna,
efeito abortivo, assim como não alterou o desenvolvimento normal da prole e seus
parâmetros comportamentais (Costa-Silva et al., 2006). Estes resultados sugerem
que o óleo possui baixo potencial teratogênico.
A atividade antiplasmódica de alguns limonóides presentes no óleo de
andiroba foi avaliada utilizando dois clones de Plasmodium falciparum, o primeiro
sensível à cloroquina (D6) e o segundo resistente a cloroquina (W2). Dentre os
limonóides a gedunina mostrou maior potencial antimalárico, visto possuir menor
concentração inibitória média para o clone Plasmodium falciparum resistente a
cloroquina W2 (CI50 20 ng/mL) (Mackinnon et al., 1997).
Outro estudo avaliou a atividade antiplasmódica da gedunina frente ao
Plasmodium falciparum sendo observada uma CI50 de cerca 1 μM depois de 48h de
exposição e 0,3 μM depois de 96h de exposição (Khalid et al., 1986). Segundo
Rochanakij e colaboradores (1985) a gedunina apresentou atividade antiplasmódica
frente ao clone D6 de Plasmodium falciparum (CI50= 720 ng/mL).
Além da gedunina outros limonóides também demonstraram atividade
antimalárica como os limonóides trichirubina A e B (CI50 0,3 e 0,2 μg/mL,
respectivamente) isolados da Trichilia rubescens. Esses limonóides têm sua
atividade atribuída à presença de grupos fortemente reativos no anel A com a
carbonila no carbono C-3 e à insaturação nos carbonos C-1/C-2 (Kirandeep et al.,
2009).
Além do óleo, alguns extratos obtidos de C. guianensis foram submetidos a
diferentes tipos de ensaios biológicos e farmacológicos. Através do ensaio
fluorimétrico e com Hipoxantina marcada avaliou-se a atividade antiplasmódica do
extrato C. guianensis, onde se obteve CI50 (concentração inibitória 50%) superior a
50μg/mL, sendo considerada pouca ativa para o P. falciparum (Corbett et al., 2004).
47
1.9. ÓLEO DE PIMENTA-DE-MACACO (OPM).
A atividade antifúngica dos óleos essenciais de Piper aduncum, Piper
arboretum e Piper tuberculatum foi realizada por bioautografia em placas de CCD.
Os óleos essenciais dos frutos de Piper tuberculatum e Piper aduncum,
demonstraram alta atividade, com concentração inibitória mínima de10 μg/mL contra
os fungos Cladosporium sphaerospermum e Cladosporium cladosporioides,
respectivamente (Navickiene et al., 2006). O óleo também foi testado contra
Crinipellis perniciosa, fungo patogênico que ataca o cacau, apresentando inibição de
100% nas concentrações de 50 e 100 ppm. (Maia et al., 1998).
Utilizando clone de o P. falciparum resistente a cloroquina, com o teste da
hipoxantina marcada, avaliou-se a atividade antiplasmódica de P. aduncum, sendo
observado alto potencial antimalárico desta espécie (CI50 < 10 μg/mL) (Valadeau et
al., 2009).
Com relação à toxicidade na determinação da dose letal 50% (DL50) do óleo
essencial de Piper aduncum o valor obtido por interpolação semi-logarítmica,
correspondeu a 2.400 ± 191,7 mg/kg de massa corpórea. Segundo a Organização
da Cooperação Econômica e Desenvolvimento (2001) o óleo de P. aduncum
pertence à classe dos agentes xenobióticos, de baixa toxidade.
Dentre as Piperáceas da Amazônia, o P. aduncum é uma excelente produtora
de óleo essencial, de elevado padrão de oxigenação (Maia et al., 1998; Fazolin et
al., 2007). Na investigação fitoquímica da espécie numerosos compostos (Fig. 19)
com atividade biológica já foram isolados como; aduncamida (1) uma nova amida
isolada do P. aduncum com ação bactericida contra o Bacillus subtilis e Micrococus
luteus, fenilpropanóides como o dilapiol (2), miristicina (3) e apiol (4), sendo esses
compostos sinérgicos de inseticidas naturais e sintéticos. Compostos terpênicos
como piperitona (5), com ação inseticida (Vidal et al., 2008). As chalconas como
piperaduncina A (6), B (7) e C (8), com ação bactericida (Parmar et al., 1997). Dentre
os fenilpropanoides, o dilapiol é o composto majoritário do P. aduncum (Parmar et
al., 1997). No óleo de P. aduncum o dilapiol, constituído por um grupo
48
metilenodioxidofenila, varia de 58% a 88,4% (Smith & Kassim, 1979; Maia et al.,
1998; Fazolin et al., 2007).
Outros componentes fazem parte do óleo essencial de pimenta-de-macaco
dentres como: piperitona, terpinen–4–ol, miristicina, (E)–cariofileno, γ–terpineno,
germacreno D, –pineno, –pineno, limoneno, (Z)––ocimeno, (E)––ocimeno e –
terpineno.
O OH
O
OH
O
O
O
O
H
OCH3
OCH3
O
O
O
H
H
OCH3
H
O
O OCH3
H3CO
O
O
O O OH
OH
OH O
O
OH O
O
OH
OO
H
O
OH O
OH
O
OH OH
O
(1) (2) (3)
(4) (5)
(6) (7) (8)
Figura19: Componentes do óleo de pimenta-de-macaco.
A associação do dilapiol, presente no P. aduncum, que contém o grupo
metilenedioxidofenil, funciona como importante inibidor da monooxigenases do
citocromo P–450 (Mukerjee et al., 1979, Belzile et al., 2000). O dilapiol inibindo o
citocromo P–450, permite um incremento na biodisponibilidade de compostos
associados, promovendo um efeito sinérgico com esses compostos.
Neste contexto, as plantas da família Meliaceae, que podem ser utilizadas no
tratamento de malária, como a andiroba, que apresenta limonóides com atividade
antimalárica. A espécie Piper aduncum, pimenta-de-macaco, da qual se extrai o
49
óleo, rico em dilapiol, com moderada atividade antiplasmódica (OMAR et al., 2003)
podem ser associados e apresentar o sinergismo supracitado, justificando a
associação entre ambos os óleos.
1.10. MODELOS EXPERIMENTAIS
1.10.1. Modelos Murino para Atividade Antimalárica.
Quatro espécies de Plasmodium, parasito da malária, infectantes de roedores
africanos foram amoldados para o crescimento em camundongos: P. berghei, P.
chabaudi, P. vinckei e P. yoelii. Estes parasitos tornaram-se interessante devido seu
fácil manejo experimental; além de apresentar características análogas aos
parasitos da malária humana e de outros primatas em alguns aspectos fisiológicos e
do ciclo de vida (Carter & Diggs, 1977).
Uma das formas de avaliação da atividade antimalárica utilizando o modelo
murino é o teste de supressivo por quatro dias, desenvolvido por Peters. Nesse teste
os camundongos são infectados por parasitas de roedores e as doses diferentes de
tratamento, da substância em avaliação, são ministradas logo após a infecção sendo
repetidas por três dias subsequentes. Nos dias 4° e 7° pós-infecção, a parasitemia é
avaliada. Após o dia 7°, nenhuma manipulação é realizada nos camundongos,
observando-se apenas sua sobrevivência (Peters, 1975).
1.10.1.1.Ciclo biológico do Plasmodium berghei
Ciclo assexuado pré-eritrocítico – o ciclo biológico do P. berghei se inicia com
a picada do mosquito infectado que inocula os esporozoítos haploides,
morfologicamente semelhantes aos dos parasitas humanos, na corrente sanguínea
50
do hospedeiro vertebrado, eles invadem algumas células hospedeiras,
posteriormente, migram para o fígado e invadem os hepatócitos (Ménard, 2001,
Copii, et al., 2011). Quando os hepatócitos são invadidos a membrana plasmática da
célula hospedeira sofre uma invaginação para formar o vacúolo parasitóforo que
rodeia o esporozoíto invasor. Dentro do hepatócito, esporozoíto se desenvolvem
diferenciando-se nos estágios de trofozóitos a esquizontes maduros, não tendo
evidência para a fase hipnozoíta, que é encontrada no P. vivax e P. ovale. Após a
ruptura das células do fígado os merozoítos tissulares são liberados na corrente
sanguínea invadindo as hemácias (Mota et al., 2001).
Na fase eritrocítica os merozoítos hepáticos, que são liberados dos
esquizontes tissulares, invadem os eritrócitos preferencialmente os reticulócitos, mas
também podem invadir os glóbulos vermelhos maduros. Dentro dessas células,
inicialmente, os merozoítos se diferenciam em trofozóito que consome a
hemoglobina das hemácias, produzindo os cristais de hemozoína. Posteriormente o
protozoário entra na fase de esquizonte, que por divisão assexuada, formam os
merozoítos sanguíneos semelhantes aos dos parasitos humanos. Essa fase
sanguínea apresenta duração de 22 à 24h (Bannister, et al., 2001).
Em certo momento temos a diferenciação sexual que ocorre com 5 – 25% dos
parasitos, diferente do Plasmodium falciparum que alterna a divisão assexuada com
a produção de gametócitos (Mons, 1986). No Plasmodium berghei os gametócitos
podem ser formados a partir dos merozoítos hepáticos após a invasão das hemácias
(Suhrbier et al., 1987). Acrescente-se também, o tempo de formação desses
gametócitos de 26 – 30h, quando o P. falciparum é cerca de 10 dias (Mons, 1986).
Por conseguinte a fêmea de um mosquito, exemplo Anopheles stephensi, se
alimenta do sangue desse roedor infectado e os gametócitos maduros, de forma
sexuada formarão o zigoto, oocineto e oocisto que irar se diferenciar nos
esporozoítos fechando o ciclo (Sinden, 1997).
51
1.10.2. Avaliação da Citotoxicidade
A avaliação da toxicidade é uma ferramenta rápida para à escolha de
candidatos a novas drogas e/ou medicamentos. A toxicidade consiste no potencial
de um composto induzir morte celular. As culturas de células in vitro são utilizadas
como um método eficaz para a investigação da toxicidade de novos compostos, por
apresentar algumas vantagens como: metodologias rápidas, de fácil execução e
custo reduzido. Nas culturas vários tipos de células podem ser úteis: HepG2, BEL-
7402, HL60, K1; Vero entre outras. Para estudos envolvendo compostos
antimaláricos, pode-se utilizar o teste da função mitocondrial reduzida ou teste do
MTT [(3 - (4,5-dimetil-2-il) -2,5 dimetil-brometo de tetrazolium]. Esse teste pode ser
realizado em microculturas, utilizando múltiplas concentrações de uma amostra em
placas de 96 poços (Nogueira & Rosário, 2010).
Portanto uma nova droga em potencial, não pode apresentar toxicidade às
células do hospedeiro, nessa perspectiva é válido considerar o grau de seletividade
de um composto, pois esse índice sugere o grau de segurança de uma substância.
O índice é calculado através da razão entre CI50% do teste de citoxicidade
(celular) e CI50% da atividade antimalárica in vitro (parasito) [IS = CI50% celular / CI50%
parasitas]. Quanto maior o índice, mais promissor é o composto, devido à sua
seletividade pelo microorganismo (Mitaine–Offer et al., 2002). Dessa forma, pode-se
considerar: IS < 100 – baixo; 100 < IS < 300 moderado e IS > 300 – alto (Wrigth et
al., 1994).
1.10.3. Ensaio do Micronúcleo
A exposição a agentes químicos, como medicamentos, pode promover danos
mutagênicos; que quebram cromossomos (agente clastogênico) ou que interferem
na formação do fuso mitótico (agente aneugênico). O teste do micronúcleo foi
descrito por Schimidt W., em 1975. É um teste citogenético que pode ser
52
desenvolvido com metodologias in vivo e in vitro. O ensaio in vitro é simples e pode
ser utilizado como screening da toxicidade celular, sendo muito útil no rastreamento
de um agente químico com potencial carcinogênico e mutagênico (Flores &
Yamaguchi, 2008).
Os micronúcleos (MN) (Fig. 20) são corpúsculos nucleares, de morfologia
idêntica à do núcleo principal, separados do núcleo inicial como resultado de um
dano genético. Na anáfase mitótica, após a migração das cromátides para os polos,
os dois novos núcleos são reconstituídos, entretanto caso um cromossomo inteiro ou
uma parte (fragmento) cromossômica não esteja integrado ao núcleo principal, este
constituir um micronúcleo (Fig. 19) (Flores & Yamaguchi, 2008, Holland et al., 2008).
A caracterização dos micronúcleos seguem alguns critérios: estrutura da
cromatina similar e mesma coloração ou mais fraca do que a do núcleo principal;
formato arredondado; localização intracitoplasmática; 5. Diâmetro menor do que 1/5
do núcleo principal. (Bonassi et al., 2007).
Figura 20 – Formação de micronúcleos após um dano genético. (1) Micronúcleo a partir de um cromossomo inteiro e fragmentos cromossômicos na anáfase; (2) Ponte cromossômica a partir de cromossomos dicêntricos, nos quais os centrômeros se dirigem para os lados opostos da célula. Adaptada de Fenech, 2000.
O teste de MN pode ser realizado com bloqueio de citocinese (Fig. 21),
utilizado para mensurar danos ao DNA e a citocinese (Duan et al., 2009). O teste
53
pode avaliar: as pontes nucleoplasmáticas, que sinalizam como sendo rearranjos
cromossômicos que se formam quando os centrômeros de cromossomos dicêntricos
ou cromátides são puxados para os polos da célula durante a anáfase; e brotos, que
ocorrem quando as células removem amplificações de DNA originados de
fragmentos acêntricos terminal ou intersticial (Umegaki & Fenech, 2000). O bloqueio
da citocinese, em cultura celular, é feito com a citocalasina B. Esse composto é um
inibidor da polimerização da actina, indispensável na divisão citoplasmática durante
a citocinese (Fenech et al., 2006).
Figura 21 – Formação de micronúcleos com e sem a utilização da Citocalasina-B.
Adaptado de Decordier, (2009).
1.10.4. Ensaio Cometa
O ensaio cometa é outro modelo para avaliação genotóxica, no qual expomos
as células, in vitro ou in vivo, a um agente químico. É utilizado para análise de dano
e reparos de DNA. Esse teste é eficiente, rápido e utiliza pequeno número de células
que estejam em processo de divisão. Essas céluas individualizadas, lisadas e em
divisão são encaixadas em um gel de agarose, espalhadas em uma lâmina e
submetidas a uma corrente elétrica que favorece a migração dos fragmentos de
54
DNA livres, para fora do núcleo. Após a fase da eletroforese, nas células lesadas os
fragmentos de DNA formam uma cauda semelhante à de um cometa, sendo o seu
tamanho propocional ao dano. O reconhecimento desse dano ao DNA pode ser feita
pela medição do comprimento da cauda ou por classificação em diferentes nivíes
que variam de zero a cinco (Silva, 2007, Spivak et al., 2009).
55
2. OBJETIVOS.
2.1. OBJETIVO GERAL.
Avaliar a atividade antimalárica e toxicidade dos óleos de C. guianensis e P.
aduncum.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
- Estudar a atividade antimalárica dos óleos de C. guianensis e P. aduncum isolados
e associados.
- Determinar a toxicidade aguda dose única dos óleos de C. guianensis e P.
aduncum
- Avaliar a citoxicidade dos óleos de C. guianensis e P. aduncum isolados e
associados.
- Avaliar a mutagenicidade dos óleos de C. guianensis e P. aduncum isolados e
associados.
56
3. MATERIAL E MÉTODOS.
3.1. OBTENÇÃO DO ÓLEO DE ANDIROBA (OA) E FRAÇÃO RICA EM
LIMONÓIDES (FRL).
O óleo de andiroba foi coletado em Belém e obtido por processo artesanal,
após a seleção e o armazenamento das amêndoas por 14 dias. Esse procedimento
foi realizado no Laboratório de Produtos Naturais da Universidade Federal do Pará
(LEPRON).
A Fração Rica em Limonóides (FRL) foi obtida a partir do óleo de andiroba no
Laboratório de Cromatografia da Universidade Federal do Pará (LABCROL).
3.2. OBTENÇÃO DO ÓLEO PIMENTA-DE-MACACO (OPM).
Para obtenção do óleo de pimenta-de-macaco, as partes aéreas (folhas e
talos finos) foram coletadas no Município de Santo Antonio do Tauá, em propriedade
particular. Esse material foi seco e moído, sendo posteriormente submetido à
destilação por arraste a vapor durante 3 horas, usando-se aparato de vidro tipo
Clevenger.
57
3.3. AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA.
Foi realizado o estudo de toxicidade aguda, onde grupos de camundongos
machos e fêmeas suíças foram tratadas com uma dose fixa de 2.000 mg/kg com o
óleo de andiroba (OA) e o óleo de pimenta-de-macaco (OPM) por um período de 14
dias. No teste da toxicidade aguda foram avaliadas alterações de peso,
hematológicas e bioquímicas, tanto para (OA) como OPM; peso, hematológicos e
bioquímicos.
Para os testes de toxicidade oral aguda, foram utilizados os procedimentos de
Dose Fixa da OECD 420, na sua versão revisada adotada em 2001 (OECD 420,
2001), com algumas adaptações.
Foram utilizados 15 animais (camundongos fêmeas) no Biotério do Instituto
Evandro Chagas Ananindeua – PA para um período de aclimatação. Os animais
foram separados em 3 grupos (5 animais/grupo). O primeiro grupo 1, água destilada
(100µL); o segundo grupo 2, água e DMSO no terceiro grupo 3, 100µL emulsão do
óleo, correspondente a uma dose de 2.000 mg/Kg, aplicadas via oral (gavagem) em
dose única. O peso e a avaliação clínica dos animais foram determinados,
diariamente, durante os 14 dias de experimento. No 14º dia o sangue foi coletado e
realizado avaliações hematológicas e bioquímicas, expressos como a Média ±
Desvio Padrão da Média (D.P.M), comparados utilizando-se a análise de variância
(ANOVA), com p < 0.05.
Os animais foram observados durante um período de 14 dias. Para uma
avaliação, que forneceu uma visão geral da natureza farmacológica e toxicológica
da substância teste, como: estado consciente e disposição, atividade e
coordenação do sistema motor, reflexos, atividade sobre o SNC e SNP (Malone e
Robichaud, 1983).
Após o procedimento de administração, os animais foram observados aos 15,
30, 60, 120, 180 e 240 minutos no primeiro dia após o tratamento e uma vez por dia
nos dias subsequentes. Ao final dos 14 dias de observação, os animais foram
submetidos à eutanásia (pela mistura (2:1) cetamina/xilazina; duas partes de
cloridrato de cetamina + Uma parte de xilazina, na dose de 2,5 mL/kg i.p.).
58
Todos os animais, foram pesados diariamente em balança semi-analítica
antes da administração das drogas ou água e durante o período de observação, até
o final dos 14 dias, onde foi calculado o ganho ponderal médio dos animais. O
consumo de água e ração foi avaliado a partir do primeiro dia após o tratamento.
Para avaliar o consumo de água, um volume fixo da mesma, foi adicionado as
mamadeiras de capacidade de 150 mL. No dia seguinte o volume da mamadeira foi
medido e a diferença era registrada. De maneira similar o consumo de ração foi
avaliado. A também foi disponibilizada pesada em porções de 100g/dia/gaiola e no
dia seguinte, a diferença (quantidade consumida) era anotada.
Os parâmetros bioquímicos foram realizados em amostra de soro ou plasma.
Foram determinada, glicose, colesterol total e triglicerídeo, aspartato transaminase
(AST), alanina transaminase (ALT), fosfatase alqualina, ureia, creatinina, realizadas
em analisador bioquímico automatizado.
A hematologia foi feita através do estudo da parte vermelha (eritrograma) e
branca (leucograma) em contador de células automatizado.
3.4. ATIVIDADE ANTIMALÁRICA IN VIVO.
3.4.1 Ensaios em camundongos com Plasmodium berghei.
Os procedimentos realizados com animais seguiram rígidas normas de
experimentação animal, de acordo com os Princípios Éticos na Experimentação
Animal, segundo as Normas da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de
Laboratório – SBCAL (Lei No. 11.794, publicada no DOU de 08/10/2008). O
procedimento experimental foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa com
Animais de Experimentação (CEPAE) da Universidade Federal do Pará – UFPA e
aprovado com parecer de n° BIO039-12.
59
No experimento foram utilizados camundongos (Mus muscullus), linhagem
Swiss (var. albino), machos e fêmeas (nulíparas e não grávidas) com peso corporal
inicial de 25±2g. Os camundongos utilizados foram provenientes do biotério do
Instituto Evandro Chagas (IEC) Ananindeua – PA. Os animais foram mantidos em
ambiente de temperatura controlada (23 ± 3°C), umidade em torno de 50 a 70%,
ciclo de luz claro/escuro de 12 horas, baixo nível de ruídos e com contínuo sistema
de exaustão de ar. Eles foram mantidos com livre acesso a água filtrada e ração
peletizada em caixas de polipropileno com tampa metálica, forradas com palha de
arroz e número máximo de 5 animais que foi devidamente etiquetada.
A cepa de Plasmodium berghei (ANKA) foi mantida em camundongos por
passagens sanguíneas semanais de animal para animal. A manutenção semanal foi
realizada após a confecção dos esfregaços sanguíneos de camundongos infectados.
Os esfregaços foram corados com solução de Giemsa e examinados ao microscópio
ótico (1000x) para a avaliação e determinação da percentagem de parasitemia.
A parasitemia foi determinada por meio de esfregaços sanguíneos
confeccionados, fixados com metanol e corados com solução diluída de Giemsa na
proporção de três gotas para cada 1ml de solução salina tamponada pH 6,8. Após
10 minutos, as lâminas foram lavadas em água corrente, secas ao ar e examinadas
ao microscópio óptico com objetiva de imersão (1000x).
Os animais selecionados foram os que apresentavam a parasitemia no
intervalo de 5% a 15%. Destes o sangue foi coletado da ponta da cauda (em torno
de 4 gotas) e solubilizado em anticoagulante Citrato de sódio 3,8%. O número de
hemácias por microlitros (µL) de sangue era determinada em câmera de Newbauer
ao microscópio óptico (400x). A partir da percentagem de parasitemia e do número
total de hemácias contadas era realizada a padronização do inóculo com sangue
parasitado em RPMI completo com Citrato de sódio 3,8%, de modo que cada animal
recebesse cerca de 105 hemácias parasitadas, via intraperitoneal, em um volume
final de 0,2ml (200µL).
Para esse ensaio com Plasmodium berghei foram preparadas emulsões com
o OA e OPM diluídas em solução de DMSO (5%) q.s.p. em concentrações de 500,
250, 125 e 62,5 (mg/kg/peso) em um volume de 200µL/animal. Também foi testado
60
uma mistura dos óleos de andiroba e pimenta-de-macaco, para também ser testada
nas mesmas concentrações, 500, 250, 125 e 62,5 (mg/kg/peso) em um volume de
200µL/animal. A mistura foi preparada utilizando os dois óleos sempre na proporção
de 1:1. Os resultados, tanto do OA e OPM como da mistura desses óleos, foram
expressos em percentual de hemácias parasitadas. Além dos óleos também foi
analisado uma fração rica em limonóides (FRL), extraída da andiroba, que
representa a parte ativa do óleo. Para a fração as concentrações trabalhadas foram
50, 25, 12,5 e 5 (mg/kg/peso) diluídas em solução de DMSO (5%) q.s.p. e também
administrada em um volume de 200µL/animal, sendo os resultados expressos na
tabela 8. A FRL também foi misturada ao óleo de pimenta-de-macaco na
concentração de 500 mg/kg. O controle positivo foi feito com cloroquina (CQ) a
30mg/kg/peso, solubilizada em água destilada e administrada no mesmo volume por
animal.
Para o ensaio experimental os animais foram divididos em diferentes grupos
(5 animais por grupo): grupo controle não tratado e grupos testes. As amostras
testes selecionadas eram preparadas e diluídas em DMSO 5%. Nesta concentração
o DMSO não interfere no crescimento do parasito in vivo. A cloroquina foi pesada e
depois diluída em água destilada. Os camundongos foram tratados inicialmente por
via oral, caso não se obtivesse resultado satisfatório para essa via foi escolhido a via
intraperitoneal para o tratamento de três dias consecutivos através do “Teste
Supressivo” descrito por Peters (1965;1967). A redução da parasitemia foi avaliada
comparando com o grupo controle não tratado.
A avaliação da atividade dos óleos e fração foi realizada através da
determinação da parasitemia em esfregaços sanguíneos dos animais infectados,
confeccionados no 5° e 8° dias após inoculação do parasito.
O cálculo da percentagem da redução da parasitemia pelas amostras
testadas foi realizado em relação ao grupo controle não tratado após leitura dos
esfregaços. Como critério de atividade in vivo a redução de 30% ou mais do
crescimento do P. berghei foi considerada como indicador de amostra ativa
(Carvalho et al., 1991; Andrade-neto et al., 2003).
61
3.5. AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE.
3.5.1. Teste de viabilidade celular (MTT)
O ensaio de viabilidade celular foi realizado utilizando-se células de
carcinoma hepático humano (HEPG2). Essas células foram cultivadas em placa de
96 poços (Fig. 22) foram cultivadas 0,01x106 células/mL em meio RPMI-1640
suplementado com 10% de SFB, as placas foram incubadas a 37 °C em atmosfera
com 5% de CO2. Passado 24h foi realizado o tratamento com cinco concentrações
em ordem crescente (61,5, 125, 250, 1000 e 2000μg/ml) do óleo de andiroba (AO) e
com a mistura dos óleos de andiroba e óleo de pimenta-de-macaco (OPM),
posteriormente as placas foram incubadas a 37 °C em atmosfera com 5% de CO2.
Depois de 48 horas de tratamento, as amostras foram retiradas poço por poço e foi
adicionado o MTT (brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio]) a uma
concentração de 500μg/mL, posteriormente as placas foram incubadas, novamente,
a 37 °C em atmosfera com 5% de CO2 durante 4 horas. Após este período, foi
adicionado o DMSO (dimetilsulfóxido) a todos os poços para dissolver os cristais
azuis escuros formados. Transcorrido 1 hora, para garantir que todos os cristais
fossem dissolvidos, as absorbâncias dos poços foram lidas em um
espectrofotômetro de varredura de múltiplos poços, utilizando um comprimento de
onda de referência de 570 nm.
62
Figura 22 – Esquema da placa desenvolvida para o ensaio do MTT.
Legenda: Apenas células / Apenas DMSO (branco) / Óleo de andiroba /
Mistura dos óleos de andiroba e pimenta-de-macaco.
Cálculo da viabilidade celular:
%células vivas= Absorbância das células tratadas x 100
Absorbância das células sem tratamento
Ou seja, para o cálculo das células mortas (CM):
% CM= Absor. das céls. sem tratamento – absor. Das céls. Tratadas x 100
Absor. das céls. sem tratamento
3.6. MICRONÚCLEOS COM BLOQUEIO DE CITOCINESE.
O teste foi realizado utilizando-se placas de 12 poços, nas quais foram
semeadas 0,2x106 células/mL (HEPG2) em meio RPMI–1640 suplementado com
10% de SFB, em estufa a 37°C, com atmosfera umidificada contendo 5% de CO2.
63
Transcorrido o período de 20h em cultura, as células foram tratadas com três
concentrações dos óleos: para o OA (163 μg/mL, 81,5 μg/mL e 40 μg/mL), OPM
(280 μg/mL, 140 μg/mL e 70 μg/mL). O controle negativo foi feito com células e meio
de cultura, e no controle positivo as células foram tratadas com 0,02 μg/mL de
doxorrubicina. Após 24h do tratamento, ou seja, 44h de incubação da cultura, foram
adicionados 3 μg/mL de citocalasina-B (CitB). Passado mais 24h com CitB (72h de
incubação), as células foram tripsinisadas e transferidas para tubos de centrífuga
para serem centrifugadas a 1000rpm/5min. O sobrenadante era desprezado
mantendo-se um volume de aproximadamente 0,5 mL para leve homogeneização.
Cuidadosamente, foram adicionados 5 mL de solução hipotônica gelada (KCl
0,075M), em seguida, realizou-se a homogeneização e centrifugação a 1000rpm por
5min. O sobrenadante foi descartado deixando 0,5ml para homogeneização, em
seguida, foi adicionado 5 mL de fixador 5:1 (5 partes de metanol: 1 parte de ácido
acético) recém preparado e 3 gotas de formaldeído, o qual auxilia na preservação do
citoplasma. Após a homogeneização e centrifugação a 1000rpm por 5min, o
sobrenadante foi descartado deixando 0,5 mL para a ressuspensão e adicionado em
leve agitação, 5 mL de fixador 3:1 recém preparado (3 partes de metanol: 1 parte de
ácido acético).
O conteúdo foi novamente homogeneizado e centrifugado a 1000 rpm por 5
min. Por fim, o sobrenadante foi descartado deixando aproximadamente 400 μL de
suspensão no tubo para a preparação das lâminas. Para cada lâmina utiliza-se 3 a 4
gotas dependendo da quantidade de material. As lâminas secaram a temperatura
ambiente e foram coradas com Giemsa 5% por 5min. Por fim, a análise de diversos
parâmetros como o micronúcleo convencional e o índice de divisão nuclear (IDN) foi
realizada em microscópio óptico de luz em aumento de 100X (Fenech e Morley,
1985).
64
3.7. ENSAIO COMETA
Para o ensaio cometa, inicialmente foram confeccionadas lâminas cobertas
por solução de agarose de ponto de fusão normal (1,5%), sendo, posteriormente,
mantidas a temperatura ambiente para que ocorra a solidificação da mesma.
Utilizando placa de 12 poços, foram semeadas 0,15x106 células/mL (HEPG2)
em meio RPMI–1640 suplementado com 10% de SFB, as células foram cultivadas a
37°C numa atmosfera umidificada contendo 5% de CO2. Transcorrido o período de
21h em cultura, as células foram tratadas nas concentrações: OA (163 μg/mL, 81,5
μg/mL e 40 μg/mL) e OPM (280 μg/mL, 140 μg/mL e 70 μg/mL). O controle negativo
foi feito com células e meio de cultura, e o controle positivo com 0,02 μg/mL de
doxorrubicina. O período de exposição das células as drogas foi de 3h.
Após este período foram coletados 450 μL de amostra de cada grupo para
submeter à centrifugação de 1000 rpm por 5 min em microcentrífuga. Após a
centrifugação o sobrenadante foi descartado deixando 100 μL para a ressuspensão.
Deste conteúdo, 30 μL foram acrescentados em 300 μL de agarose de baixo ponto
de fusão (0,8%), e após homogeneização, 100 μL deste conteúdo foram distribuídos
por lâmina (coberta anteriormente por solução de agarose com ponto de fusão
normal).
Cada lâmina foi coberta com uma lamínula (24x60 mm). As lâminas foram
mantidas a 4ºC por 5min até a solidificação da agarose. Após a solidificação, as
lamínulas foram removidas cuidadosamente, após essa fase as lâminas foram
submersas em solução de lise (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA , 10 mM Tris, 1 % Triton
X–100 e 10% DMSO; pH 10) e mantidas a 4 ºC protegidas da luz, por 24h.
Quando as lâminas foram retiradas da solução de lise, foram colocadas na
cuba de eletroforese, previamente preenchida com a solução de eletroforese. A
eletroforese foi realizada a uma tensão (ddp) de 34 V em corrente de 300 mA por um
período de 20 min. Depois deste processo, as lâminas foram retiradas da cuba e
mergulhadas rapidamente em H2O destilada gelada (4ºC), sendo posteriormente
transferidas para um novo mergulho em H2O destilada gelada por 5 min. As lâminas
65
foram fixadas com etanol 100% por 3 min e posteriormente coradas com 50 μL de
solução de Brometo de Etídio (20 μg/mL). Em seguida, foram cobertas com lamínula
(24X60 mm) para a realização das análises (SINGH et al.,1988).
Para a visualização das lâminas foi utilizado microscópio de fluorescência em
aumento de 40X, analisando-se 100 células por grupo. A análise foi realizada pelo
padrão de escores de acordo com Mota e colaboradores (2011) onde se avalia o
grau de lesão sofrido pela célula de acordo com o tamanho e intensidade da cauda
do cometa, que representa o nível de fragmentação de DNA.
Os cometas forma classificados em cinco classes de dano (Fig. 23),
chamadas de classe 0 a classe 4. A classe 0 correspondem aos cometas intactos,
ou seja, sem dano; classe 1 cometas com pequenos danos; classe 2 danos médios;
classe 3 danos intensos e classe 4 danos máximos.
Figura 23 – Demonstração do padrão de escores para análise do ensaio cometa. Legenda: Classe 0 = sem danos (<5%), Classe 1 = baixo nível de danos (5-20%). Classe 2 = médio nível de danos (20-40%). Classe 3 = alto nível de danos (40-95%) e Classe 4 = dano total (95%). Fonte: Mota et al., 2011.
66
A análise foi feita utilizando índices visuais:
Porcentagem de classe de dano: representa a porcentagem de ocorrência de
cada classe (classe 0 a 4) no total contabilizado:
PORCENTAGEM DE CLASSE DE DANO = (n de cada classe X 100) / n total de
cometas.
Índice de dano (ID) foi obtido pelo total do produto da multiplicação entre o
número de cometa de cada classe e o dígito denominador da classe 0 – 1– 2 – 3 –
4.
ID TOTAL = 0 X (n° classe 0) + 1 x (n° classe 1) + 2 x (n° classe 2) + 3 x (n° classe
3) + 4 x (n° classe 4).
A Frequência de dano foi calculada com a porcentagem de todos os cometas
danificados (classe 1 a classe 4) em relação ao total de cometas contados (n total)
FREQUÊNCIA DE DANO = [ n total – n classe 00). 100] / n total.
3.8. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para a avaliação estatística da atividade antimalárica in vivo os resultados
foram expressos como média ± desvio padrão das amostras testadas. As médias de
parasitemia nos grupos tratado e controle foram avaliados pela Análise de Variância
(ANOVA), adotando como critério o nível de significância (p< 0,05), através do
programa BioEstat versão 5.0.
No ensaio de toxicidade aguda oral, para avaliar se houve diferença significante
da evolução ponderal, do consumo de ração e água entre os animais controles e
tratados, os resultados foram expressos como média ± desvio padrão para cada grupo
de animais e avaliados pela Análise de Variância (ANOVA), adotando como critério o
nível de significância (p< 0,05), através do programa BioEstat versão 5.0.
67
4. RESULTADOS
3.1. TOXICIDADE AGUDA DOS ÓLEOS DE ANDIROBA (OA) E PIMENTA-DE-
MACACO (OPM).
Segundo os resultados não foram observados sinais evidentes de toxicidade
nos animais testados com óleo de andiroba (OA), durante o período de tratamento,
pois não houve diferenças significativas no peso (Tabela 1) (p = 0.83) e parâmetros
hematológicos (Tabela 2) (p = 0.99) e bioquímicos (Tabela 3) analisados, para o
grupo tratado com o óleo de andiroba (grupo 3), p = 0,98, quando comparado aos
grupos controles não tratado grupo 1 e 2, utilizando a análise de variância (ANOVA),
após os quatorze dias de teste.
Tabela 1 – Pesos dos grupos controles (1 e 2) e grupo tratado (grupo 3), após 14 dias de tratamento com o OA.
Dias Grupo 1* Controle
(H20)
Variação
de peso
Grupo 2* Controle (DMSO e
H20)
Variação
de peso
Grupo 3* Tratado
Variação
de peso
Peso (g) Aumento
(%)
Peso (g) Aumento
(%)
Peso (g) Aumento
(%)
0 30.4±0.7 0 29.2±0.8 0 29.6±0.9 0
7 33.8±1.1 11 32±1.2 9 31.7±1.3 7
14 37.2±1.1 22 35.6±1.1 21 34.8±1.2 17
* Média ± Desvio Padrão; DMSO – Dimetil-sufóxido (p = 0.83).
68
Tabela 2 – Parâmetros Hematológicos dos grupos controle (1 e 2) e grupo tratado (grupo 3), após 14 dias de tratamento com o OA.
Parâmetros Grupo 1* Controle (H20)
Grupo 2* Controle (DMSO e
H20)
Grupo 3* Tratado
Hemácias (106/mm3) 8.73 ± 0.2 8.35 ± 0.1 8.38 ± 0.3
Hemoglobina (g/dL) 13.7 ± 0.2 13,6 ± 0.2 14.1 ± 0.1
Hematócrito (%) 42.6 ± 0.4 42.2 ± 0.7 42.8 ± 0.3
VCM (fL) 50.6 ± 0.8 49.6 ± 0.9 51.9 ± 1.9
HCM (pg) 17.1 ± 0.7 17.1 ± 0.4 17.5 ± 0.5
CHCM (g/dL) 31.4 ± 0.3 30.8 ± 0.2 31.2 ± 0.2
Leucócitos Totais (103/mm3) 7.74 ± 0.2 7.66 ± 0.2 8.04 ± 0.1
*Média ± Desvio Padrão; VCM: Volume corpuscular médio; HCM: Hemoglobina corpuscular média;
CHCM: Concentração de hemoglobina corpuscular média (p = 0.9).
Tabela 3 – Parâmetros bioquímicos dos grupos controle (1 e 2) e grupo tratado (grupo 3), após 14 dias de tratamento com o OA.
Parâmetros Grupo 1* Controle
(H20)
Grupo 2* Controle (DMSO e
H20)
Grupo 3* Tratado
Glicose (mg/dL) 88.2 ± 4.0 87.2 ± 3.7 83.1 ± 2.7
AST (U/L) 64.4 ± 2.5 64.5 ± 1.8 69.2 ± 2.6
ALT (U/L)
Creatinina
49.8 ± 2.3
0.56 ± 0.02
49.6 ± 1.9
0,62 ± 0.03
51.8 ± 1.7
0.58 ± 0.02
*Média ± Desvio Padrão; AST/TGO: Aspartato aminotransferase; ALT/TGP: Alanina aminotransferase (p = 0.9).
Para o óleo de pimenta-de-macaco também foram analisados o peso (Tabela
4), e os parâmetros hematológicos (Tabela 5), bioquímicos (Tabela 6), sendo que os
mesmos, também, não sofreram alterações significativas quando se comparou o
grupo 3, tratado com o óleo de pimenta-de-macaco aos grupos controles não
69
tratados (1 e 2), utilizando a análise de variância (ANOVA), após os quatorze dias de
teste, entretanto foi observado um discreto aumento na excreção de fezes e urina e
tremores abdominais, logo o óleo foi considerado de baixa toxicidade.
Tabela 4 – Peso dos grupos controle (1 e 2) e grupo tratado (grupo 3), após 14 dias de tratamento com o OPM.
Dias Grupo 1* Controle
(H20)
Variação
de peso
Grupo 2* Controle (DMSO e
H20)
Variação
de peso
Grupo 3* Tratado
Variação de
peso
Peso (g) Aumento
(%)
Peso (g) Aumento
(%)
Peso (g) Aumento (%)
0 30.4±0.7 0 29.2±0.8 0 27.4±0.9 0
7 33.8±1.1 11 32±1.2 9 30.1±1.3 10
14 37.2±1.1 22 35.6±1.1 21 32.0±1.2 17
*Média ± Desvio Padrão; DMSO – Dimetil-sufóxido (p = 0,38)
Tabela 5 – Parâmetros Hematológicos dos grupos controle (1 e 2) e grupo tratado (grupo 3), após 14 dias de tratamento com o OPM.
Parâmetros Grupo 1 Controle
(H20)
Grupo 2 Controle (DMSO e
H20)
Grupo 3 Tratado
Hemácias (106/mm3) 8.73 ± 0.2 8.35 ± 0.1 8.31 ± 0.1
Hemoglobina (g/dL) 13.7 ± 0.2 13,6 ± 0.2 13.2 ± 0.3
Hematócrito (%) 42.6 ± 0.4 42.2 ± 0.7 41.3 ± 0.6
VCM (fL) 50.6 ± 0.8 49.6 ± 0.9 49.7 ± 1.6
HCM (pg) 17.1 ± 0.7 17.1 ± 0.4 17.3 ± 0.5
CHCM (g/dL) 31.4 ± 0.3 30.8 ± 0.2 31.1 ± 0.4
Leucócitos Totais (103/mm3) 7.74 ± 0.2 7.66 ± 0.2 7.90 ± 0.3
*Média ± Desvio Padrão; VCM: Volume corpuscular médio; HCM: Hemoglobina corpuscular média;
CHCM: Concentração de hemoglobina corpuscular média (p = 0,9).
70
Tabela 6 – Parâmetros bioquímicos dos grupos controle (1 e 2) e grupo tratado (grupo 3), após 14 dias de tratamento com o OPM.
Parâmetros Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3
Glicose (mg/dL) 88.2 ± 4.0 87.2 ± 3.7 80.7 ± 3.3
AST (U/L) 64.4 ± 2.5 64.5 ± 1.8 66.1 ± 3.1
ALT (U/L)
Creatinina
49.8 ± 2.3
0.56 ± 0.02
49.6 ± 1.9
0,62 ± 0.03
50.2 ± 3.2
0.65 ± 0.02
*Média ± Desvio Padrão; AST/TGO: Aspartato aminotransferase; ALT/TGP: Alanina aminotransferase. (p = 0.8)
4.2. ENSAIO ANTIMALÁRICO COM Plasmodium berghei
A tabela 7 apresenta os resultados da parasitemia percentual e a redução da
parasitemia percentual, no quinto e oitavo dia de experimento para o óleo de
andiroba (OA), o óleo de pimenta-de-macaco (OPM) e para a mistura desses óleos.
Esses resultados foram expressos em percentual de hemácias parasitadas obtidas
em relação ao grupo controle não tratado. O óleo de andiroba foi ativo no oitavo dia
com redução de 40% da parasitemia na concentração de 500mg/kg. Agora o óleo de
pimenta-de-macaco apresentou pequena redução da parasitemia (< 20%) na maior
concentração. Entretanto, quando o OA e o OPM foram misturados, na
concentração de 500mg/kg, o percentual de redução da parasitemia foi maior (>
50%) o que demonstra um sinergismo dos óleos na atividade antimalárica.
Na figura 24 podemos observar que não houve atividade antimalárica no
quinto dia para nenhuma droga testada, entretanto, no oitavo dia, houve atividade
para as amostras testadas.
71
Tabela 7 – Atividade antimalárica dos óleos de andiroba (OA) e óleo de pimenta-de-
macaco (OPM) e da Mistura dos óleos (OA+OPM) expresso na forma da parasitemia
(%) das hemácias infectadas.
Amostras Parasitemia (%)
Redução da parasitemia (%)
Média ± DP*
5°dia 8°dia 5°dia 8°dia
OA 500mg/kg 1,9 ± 1,7 6.63 ± 3,69 0 40.8
OA 250mg/kg 2,6 ± 2,15 9.02 ± 2,31 0 19.4
OPM 500mg/kg 1,9 ± 1,15 9.09 ± 5,17 0 18.8
OA+OPM 500mg/kg 2,1 ± 1,01 5.42 ± 4,59 0 51.6
OA+OPM 250mg/kg 2,3 ± 2,48 7.97 ± 4.62 0 28.8
Controle Negativo 1.2 ± 0.5 11,2 ± 4,25 - -
CQ** 30mg/kg 0,06 ± 0,05 0 96 100
*Média ± Desvio Padrão / **Cloroquina
Figura 24 – Atividade antimalárica dos óleos de andiroba (OA) e óleo de pimenta-de-
macaco (OPM) e da Mistura dos óleos (OA+OPM) administrados por via
intraperitonial em camundongos infectados com P. berghei expressando a redução
da parasitemia no 8° dia.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
5° dia 8° dia - OA 8° dia - OPM 8° dia - Mistura
% Inib
ição
Determinação da redução da parasitemia no 5° e 8° dia
250mg/kg/peso
500mg/kg/peso
72
Além dos óleos também foi analisada uma Fração Rica em limonóides (FRL)
extraída do óleo de andiroba. Os resultados da FRL demonstram que nas
concentrações de 50 e 25mg/kg a redução da parasitemia foi de 49.6 e 27.8%,
respectivamente (Tabela 8). Quando a FRL foi misturada ao óleo de pimenta-de-
macaco essa atividade antimalárica foi ainda maior, com redução da parasitemia de
55.4 e 32.2% nas concentrações de 50 e 25mg/kg, também expressos na tabela 8.
Na figura 25 pode-se observar que não houve atividade antimalárica da FRL
no quinto dia de experimento, entretanto, no oitavo dia, houve atividade da FRL e
para FRL misturada com o óleo de pimenta essa atividade no oitavo dia foi maior.
Nas tabelas citadas são descritos apenas as concentrações nas quais foi
observada redução da parasitemia, nas demais concentrações testadas à redução
foi inferior a 10%, sendo considerada não significativa.
Os resultados evidenciaram a influência do óleo de pimenta-de-macaco na
atividade do óleo de andiroba e seus derivados, pois o OPM é rico em dilapiol,
composto que promove inibição enzimática hepática, Consequentemente, com a
inibição, o metabolismo hepático das drogas e fármacos desses animais fica
reduzido, aumentando a biodisponibilidade, ou seja, a droga ativa do OA.
Tabela 8 – Atividade antimalárica da Fração Rica em Limonóides (FRL) e da Fração
com óleo de pimenta-de-macaco (OPM) expresso na forma da Parasitemia (%) das
hemácias infectadas obtida em relação ao grupo controle não tratado.
Amostras Parasitemia (%) Redução da parasitemia (%)
Média ± DP*
5°dia 8°dia 5°dia 8°dia
FRL 50mg/kg 2,3 ± 1,81 5.29 ± 3,93 0 49.6
FRL 25mg/kg 2,9 ± 2,3 7.58 ± 2,42 0 27.8
FRL + OPM 50mg/kg 1,7 ± 1,01 4.68 ± 1,29 0 55.4
FRL + OPM 25mg/kg 2,6 ± 1,41 7.11 ± 2.64 0 32.2
Controle Negativo 1.8 ± 0.4 10.5 ± 3,83 - -
CQ 30mg/kg 0,06 ± 0,05 0 96 100
*Média ± Desvio Padrão / **Cloroquina; FRL = fração rica e limonóides; CQ - cloroquina
73
Figura 25 – Atividade antimalárica da Fração Rica em Limonóides (FRL) e da FRL e óleo de pimenta-de-macaco (FRL+OPM), administrados por via intraperitonial em camundongos infectados com P. berghei expressando a redução da parasitemia no 8° dia.
4.3. TESTE DE VIABILIDADE CELULAR (MTT)
Utilizando o teste de viabilidade celular após 48h de tratamento, foi possível
determinar a CI50% do óleo de andiroba e da mistura dos óleos. O óleo de andiroba
apresentou uma CI50% 326.3μg/ml e a mistura CI50% 559,9μg/ml.
4.4. TESTE DO MICRONÚCLEO COM BLOQUEIO DE CITOCINESE.
Os resultados do teste do micronúcleo estão expostos na tabela 9 que
apresenta o número e a frequência de micronúcleos quando as células (HEPG2)
foram expostas ao óleo de andiroba. Os resultados demonstram que não houve
diferença significativa entre o número de micronúcleos observado no grupo tratado e
o grupo não tratado (p = 0,57). Na mesma tabela encontram-se os resultados do
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
5° dia 8° dia - FRL 8° dia - FRL + OPM
% Inib
ição
Determinação da redução da parasitemia no 5° e 8° dia
25mg/kg/peso
50mg/kg/peso
74
índice de divisão nuclear (p = 0.96), os resultados mostram que o óleo de andiroba
não influenciou o índice de divisão nuclear.
Tabela 9 – Efeito do óleo de andiroba sobre o número e a frequência de micronúcleos após 24h de exposição à droga.
Concentrações (µg/ml) Número de Micronúcleos (NMN)
Frequência de Micronúcleos (FMN)
163 45 0.045
81,5 43 0.043
40 37 0.037
Controle Negativo 29 0.029
Controle Positivo 375 0.375
A tabela 10 apresenta o número e a frequência de micronúcleos quando as
células (HEPG2) foram expostas a mistura do óleo de andiroba com o óleo de
pimenta-de-macaco.
Tabela 10 – Efeito do óleo de andiroba sobre o índice de divisão nuclear após 24h de exposição à droga.
Concentrações (µg/ml)
Média de Micronúcleos (MMN ± DP*)
Índice de divisão nuclear (IDN ± DP*)
163 11.25 ± 2.99 1.97 ± 0.46
81,5 10.75 ± 2.06 1.94 ± 0.54
40 9.25 ± 1.29 1.91 ± 0.49
Controle Negativo 11.75 ± 0.9 1.93 ± 0.43
Controle Positivo 93.7 ± 7.2 1.90 ± 0.11
**Média ± Desvio Padrão
Para a mistura dos óleos o teste foi realizado e os resultados estão expostos
nas tabelas 11 e 12. Na tabela 11 encontra-se o número e a frequência de
micronúcleos e observa-se que houve diferença entre os grupos tratados e o
controle (p< 0.01). Na tabela 12 encontram-se os resultados do índice de divisão
nuclear (p = 0.98), que leva em consideração a frequência de células com 1, 2, 3 ou
75
4 núcleos numa população de 500 células analisadas. Sendo que mistura de óleos,
também, não influenciou o índice de divisão nuclear.
Tabela 11 – Efeito da mistura de óleo de andiroba e óleo de pimenta-de-macaco sobre o número e a frequência de micronúcleos após 24h de exposição à droga.
Concentrações (µg/ml) Número de Micronúcleos (NMN)
Frequência de Micronúcleos (FMN)
280 159 0.159
140 126 0.126
70 115 0.115
Controle Negativo 29 0.029
Controle Positivo 375 0.375
Tabela 12 – Efeito da mistura do óleo de andiroba e do óleo de pimenta-de-macaco sobre o índice de divisão nuclear com o após 24h de exposição à droga.
Concentrações (µg/ml)
Média de Micronúcleos (MMN ± DP*)
Índice de divisão nuclear (IDN ± DP*)
280 46.5 ± 14.9 1.96 ± 0.42
140 34.7 ± 5.7 1.94 ± 0.49
70 28.2 ± 3.1 1.93 ± 0.52
Controle Negativo 18.0 ± 1.0 1.93 ± 0.43
Controle Positivo 93.7 ± 7.2 1.90 ± 0.31
*Média ± Desvio Padrão
4.5. ENSAIO COMETA
A tabela 13 mostra a porcentagem e a frequência de dano ao DNA em células
HEPG2 causado pelo óleo de andiroba. Comparando os resultados (Tabela 13) da
distribuição das classes de cometa com o grupo controle não tratado foi possível
identificar diferenças significativas entre os grupos (p = 0,06). Além disso, também,
foi identificada alta frequência de dano em todos os grupos tratados.
76
Tabela 13 – Frequência de células com cometas, distribuição das classes de cometa e índice de dano de DNA, após ser exposta ao óleo de andiroba.
Concentrações (μg/mL)
Porcentagem de dano (%) Frequência de dano
Índice de Dano Média±DP*
Classe
(0)
Classe
(1)
Classe
(2)
Classe
(3)
Classe
(4)
163 9 15 37 39 0 92 2.12±0.07
81.5 7 11 45 37 1 91 2.06±0.06
40 17 28 47 8 1 81 1.46±0.17
Controle negativo
58 20 13 5 4 44 0.77±0.13
Controle positivo
3 15 50 20 12 97 2.22±0.04
*Desvio Padrão
Na tabela 14 observamos, também, a porcentagem e a frequência de dano ao
DNA em células HEPG2 causado pela mistura do óleo de andiroba e o óleo de
pimenta-de macaco. Comparando os resultados (Tabela 14) da distribuição das
classes de cometa com o grupo controle não tratado foi possível identificar
diferenças significativas entre os grupos (p = 0,05), Além disso, também, foi
identificada uma alta frequência de dano em todos os grupos tratados.
Tabela 14 – Frequência de células com cometas, distribuição das classes de cometa dano após ser exposta a mistura do óleo de andiroba e pimenta-de-macaco (OA+OPM).
Concentrações
(μg/mL)
Porcentagem de dano (%) Frequência de dano
Índice de Dano
Média±DP*
Classe
(0)
Classe
(1)
Classe
(2)
Classe
(3)
Classe
(4)
280 8 5 48 40 0 96 2.20±0.04
140 3 37 47 11 2 93 1.72±0.04
70 18 39 40 3 2 82 1.27±0.04
Controle negativo
58 20 13 5 4 44 0.77±0.13
Controle positivo
3 15 50 20 12 97 2.22±0.04
*Desvio Padrão
77
5. DISCUSSÃO
A malaria gera graves problemas de saúde pública, principalmente, para os
países tropicais. A existência de cepas resistentes de Plasmodium falciparum
justifica a busca por novas drogas, mais eficazes e menos tóxicas. A medicina
tradicional chinesa contribuiu para a popularidade dos medicamentos fitoterápicos
em todo o mundo. No Brasil, da enorme biodiversidade, existem exemplos [Ilex
paraguariensis (mate), Myroxylon balsamum (bálsamo de Tolu), Spilanthes acmella
(jambu), Tabebuia sp. (lapacho), Uncaria tomentosa (unha-de-gato), Copaifera
sp.(copaíba)] que já são utilizados em tratamentos tradicionais e/ou caseiros.
Todavia, apesar da riqueza da biodiversidade no Brasil, o uso de plantas como fonte
de novos medicamentos ou remédios ainda é pouco explorado (Rates, 2001, Gurib-
Fakim, 2006).
Vale salientar que cerca de 30% de todos os medicamentos modernos são
derivados diretamente ou indiretamente de plantas medicinais (Gurib-Fakim, 2006).
Neste contexto as plantas medicinais apresentam papel de destaque, pois as
principais drogas antimaláricas são de origem vegetal; quina e artemisinina,
Cinchona sp e Artemisia annua, respectivamente, o que ratifica o desenvolvimento
desse trabalho.
O óleo de andiroba é constituído de ácido palmítico, oléico e linoléico (Castro
et al., 2006), além de uma fração insaponificável constituída principalmente de
substâncias amargas, chamadas meliacinas ou limonóides, que provavelmente são
responsáveis pela atividade biológica do óleo (Ambrozin et al., 2000; Ambrozin et al.,
2006). Já foram isolados deste óleo sete limonóides: 17β-hidroxiazadiradiona, 6α-
acetoxi-gedunina, 7-deacetoxi-7-oxogedunia, deacetilgedunina, andirobina,
gedunina, metil-angolesato (Ambrozin et al., 2006; Silva et al., 2009).
No teste de toxicidade aguda o óleo de andiroba foi aplicado por via oral em
dose única para se observar os possíveis efeitos tóxicos. O peso e as avaliações
clínicas foram determinados diariamente, as avaliações hematológicas e
bioquímicas após os 14 dias de experimento. Após o tratamento, os grupos não
apresentaram alterações significativas no peso e parâmetros hematológicos e
78
bioquímicos, quando se comparou o grupo tratado com os grupos controles.
Também, não apresentou alterações clínicas e mortes, mostrando assim não haver
toxicidade aguda.
Esses resultados são ratificados por trabalho, como o de Costa-Silva e
colaboradores (2006), pois em estudo de toxicidade reprodutiva com ratas Wistar,
durante 45 dias com administração oral do óleo de andiroba, após analise dos
índices de fertilidade, viabilidade, lactação, gestação, relação prole/mãe, percentual
de natimorto e massa corpórea da prole, foi visto que o óleo de andiroba não induziu
toxicidade materna, efeito abortivo, assim como não alterou o desenvolvimento da
prole e seus parâmetros comportamentais.
No estudo de toxicidade aguda e subaguda, com o óleo de andiroba, Costa-
Silva e colaboradores (2008), não observaram quaisquer sintomas de intoxicação,
morte, alteração de peso, no consumo de alimento e de água e nos parâmetros
hematológicos e bioquímicos. Estes resultados sugerem que o óleo possui baixo
potencial teratogênico.
O óleo de pimenta-de-macaco tem o dilapiol como constituinte majoritário,
piperitona, terpinen-4-ol, miristicina, (E)-cariofileno, γ-terpineno , germacreno D e
apiol (Miranda Júnior, 2010).
Para a toxicidade aguda do óleo de pimenta-de-macaco, durante as
avaliações clínicas observaram-se, inicialmente, aumento do bolo fecal e contrações
abdominais no grupo tratado, além de ter se registrado um índice de 20% de morte
entre os animais desse grupo. Quando comparado aos grupos controles, o grupo
tratado não apresentaram alterações significativas no peso e parâmetros
hematológicos e bioquímicos. Com esse aumento nas excretas e com o número de
morte ocorrido, além dos índices de peso e parâmetros hematológicos e bioquímicos
podemos considerar o óleo de pimenta-de-macaco de baixa toxicidade. Sousa e
colaboradores (2008) demonstraram que o óleo essencial de Piper aduncum não
alterou de maneira significativa os parâmetros hematológicos e bioquímicos em
relação ao controle. Além disso, o valor da DL50,acima de 2000mg/kg (dose máxima
utilizada no nosso estudo) também ratifica a baixa toxicidade deste óleo.
79
No presente estudo foram avaliadas as atividades antimaláricas do óleo de
andiroba, da mistura dos óleos de andiroba e do óleo de pimenta-de-macaco e da
fração rica em limonóides (FRL).
Neste trabalho, foi avaliada a atividade antimalárica, por via oral, dos óleos de
andiroba, pimenta-de-macaco, assim como da mistura desses óleos. Contudo essa
atividade só foi significativa pela via intraperitoneal, provavelmente por conta da
rápida absorção devido à grande superfície de absorção da cavidade abdominal.
Entretanto, na via oral, pelo fato de ter que atravessar a barreira gastrointestinal,
pode gerar perdas na biodisponibilidade da droga (Zanni & Oga, 1979).
Para a atividade antiplasmódica, o óleo de andiroba apresentou redução
significativa da parasitemia na maior concentração testada. A sobrevida média dos
animais, tratados com esse óleo, foi 32 dias, maior quando comparado ao grupo
controle não tratado. Para o óleo de pimenta-de-macaco a redução não foi
expressiva em nenhuma concentração testada. A sobrevida dos animais foi de 22
dias, similar ao grupo controle não tratado.
Na mistura dos dois óleos foi observada redução acima de 50% da
parasitemia na maior concnetração. Isso se deve ao fato do dilapiol, composto
majoritário do óleo de pimenta-de-macaco, causar uma inibição enzimática hepática
do citocromo P-450 (Omar et al., 2003), permitindo maior biodisponibilidade dos
limonóides presentes no óleo de andiroba, que tem ação antiplasmódica
comprovada como nos estudos de Omar et al., 2003, Lee e colaboradores (2008) e
Miranda Júnior et al., 2010.
Os limonóides das mais diferentes espécies vegetais apresentam atividade
antiplasmódica (Mackinnon et al., 1997, Yapp&Yap , 2003, Maneerat et al., 2008,
Maneerat et al., 2008).
Segundo Mota (2009) a atividade de óleos essenciais de espécies de
Asteraceae, Verbenaceae e Euphorbiaceae da região do Ceará apresentou melhor
atividade antimalárica quando aplicado por via subcutânea do que por via oral.
Com os resultados obtidos também é possível inferir uma relação tempo
dependência da droga, todavia só foi observado redução da parasitemia no oitavo
dia, fato provavelmente associado ao tempo que a droga leva para se ligar ao
80
receptor alvo, ou seja, período para o aparecimento dos efeitos farmacológicos
(tempo de latência). Em estudo realizado por Mota (2009) foi verificado que as
doses administradas foram tempo dependente, ou seja, apresentando melhor
resultado, a partir do sétimo dia com redução de 57% da parasitemia, o que é
semelhante ao encontrado neste estudo.
Para a atividade antimálarica da FRL também se observou redução da
parasitemia, principalmente, na maior concentração testada, a qual foi muito menor
que a concentração do óleo de andiroba in natura, o que justifica as menores
concentrações, pois se trata de um produto isolado. Inclusive quando a fração foi
associada ao óleo de pimenta-de-macaco foi observado o sinergismo na redução da
parasitemia foi ainda maior na parasitemia.
No ensaio realizado com P. berghei utilizando a gedunina e o dilapiol foi
observado que a gedunina isolada produzia redução na parasitemia na ordem de
50%. Entretanto, quando misturado ao dilapiol o percentual de redução da
parasitemia foi superior a 70% (Omar et al., 2003). Entretanto o dilapiol isolado não
apresentou redução significativa da parasitemia. Esses resultados são semelhantes
aos descritos nesse trabalho, pois o OA quando testado sozinho apresentou uma
menor redução da parasitemia e quando misturado ao OPM a redução foi
significativa.
No teste de viabilidade celular foi possível observar a atividade citotóxica dos
óleos de andiroba e da mistura óleos. A fração farmacologicamente ativa deste óleo
é representada pelos limonóides que são comprovadametne citotóxicos por estudos
realizados por Itokawa et al., 1995; Cohen et al., 1996 e Chidambara Murthy et al.,
2011 utilizando diferentes limonóides (nimbolidina, epoxiazadiradiona, salanim,
nimbina, deacetilnimbina, azadiractina, limonina e limonina glicosídeo) originários de
diferentes plantas. Os valores de CI50% mais baixos encontrados nos estudos
relatados acima, provavelmente se devem ao fato desses trabalhos terem sido feitos
com substâncias isoladas e no nosso, o óleo in natura. Esta característica dos
limonóides mostra que este óleo tem possibilidade de se tornar um fármaco para o
tratamento da malária por ser capaz de eliminar o plasmódio.
A segunda droga em teste de viabilidade celular, neste trabalho, foi à mistura
dos óleos de andiroba e o óleo de pimenta-de-macaco. Esse composto também
81
apresentou atividade citotóxica, o que já era esperado devido à comprovação já
existente da citotoxicidade de ambos os óleos (Mendes et al. 2009, Sperotto et al.
2008).
Considerando os resultados obtidos é possível inferir uma relação tempo
dependência no efeito das drogas, OA e a mistura, quanto à ação citotóxica, porque
ao se aumentar o tempo de exposição das células as drogas estudadas, o efeito
citotóxico dos óleos foi mais evidente.
O teste do micronúcleo é um teste citogênico que mede a perda
cromossômica, ou seja, identifica possíveis danos cromossômicos, como aumento
na frequência de mutação de células expostas a agente genotóxico (Flores &
Yamaguchi, 2008).
Os resultados desse trabalho mostram que não houve diferença significativa
entre o número de micronúcleos observado no grupo tratado com óleo de andiroba e
o grupo controle não tratado. No índice de divisão nuclear, também não houve
diferença significativa entre os grupos. Portanto, o óleo de andiroba não interfere na
proliferação celular. Baseado nestes resultados pode-se inferir que o óleo de
andiroba não causou efeito mutagênico. Esses resultados são endossados pelo
estudo de Arrebola e colaboradores (2012), que também não observou diferenças
significantes ao trabalhar com o óleo das sementes de Carapa guianenis em medula
óssea de camundongos. Em outro estudo realizado com o óleo de andiroba não foi
verificado diferença entre os grupos tratados e controle negativo, sugerindo que o
óleo não tem potencial genotóxico (Arrebola et al., 2013).
Utilizando o óleo de Azadirachta indica, chamada popularmente de neem, que
pertence à família Meliaceae, a mesma família vegetal da Carapa guianensis, não foi
observado aumento significativo de hemácias policromáticas micronucleadas
quando comparado ao controle negativo, o que corrobora nossos resultados (Vinod
et al., 2011).
Os limonóides são indutores da glutationa s-transferase, enzima que estimula
a eliminação de componentes tóxicos (Edenharder et al., 2002; Tassaneeyakul et al.,
2000; Franke et al., 2005). Os compostos fenólicos também estão relacionados ao
82
reparo do DNA, através da regulação da transcrição ou estabilização do RNAm
(Abalea et al., 1999).
Relacionado à mistura de óleos os resultados demonstram diferenças
significativas entre os grupos tratados e o controle não tratado e isso muito
provavelmente em decorrência da presença do óleo de pimenta-de-macaco que
pode causar genotoxicidade (Rojas, 2007). Junqueira (2006) mostrou o efeito
clastogênico (fragmentação cromossômica) e genotóxico (alterações no material
genético) do óleo da Piper cubeba, semelhante ao óleo de pimenta de macaco para
as células dos roedores.
O Ensaio Cometa detecta lesões genômicas que, após serem processadas,
podem resultar em mutação. Entretanto diferente das mutações, essas lesões
detectadas pelo ensaio Cometa podem ser corrigidas. Sendo assim para o óleo de
andiroba a análise da genotoxicidade apresentou moderados níveis de danos, sendo
este diferente do grupo não tratado.
Em relação a mistura os resultados também foram semelhantes ao do óleo de
andiroba, ou seja, a mistura dos óleos também apresentou moderados níveis de
danos ao DNA celular, porém passiveis de reparo.
Desta forma, demonstrou-se que os dois óleos estudados separadamente não
são promissores. Porém, quando misturados, demonstram um melhor potencial para
o desenvolvimento de uma nova droga para o tratamento da malária humana.
83
6. CONCLUSÃO
Baseado nos resultados:
O óleo de andiroba apresentou baixíssima toxicidade por não ter causado
nenhuma alteração no peso e parâmetros hematológicos e bioquímicos.
O óleo de pimenta-de-macaco aparesentou baixa toxocidade, apesar de não
ter causado alteração no peso e parâmetros hematológicos e bioquímicos, pois
causou 20% de morte entre os animais tratados.
O óleo de andiroba e fração extraída desse óleo apresentou boa atividade
antimalárica.
A fração rica em limonóides apresentou boa atividade antimalárica em
concentrações menores que o óleo in natura.
O óleo de pimenta-de-macaco apresentou ação antiplasmódica menor do
que a do óleo de andiroba.
A mistura dos dois óleos e da a fração limonoídica e óleo de pimenta
aumentou a atividade antimalárica demosntrando o sinergismo.
O óleo de andiroba não apresentou citotoxicidade e genotoxicidade.
O óleo de pimenta-de-macaco apresentou efeito citotóxico e genotóxico.
84
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Anexo 01
PARECER BIO039-12
Projeto: POTENCIAL ECONÔMICO E USO SUSTENTÁVEL DE PIPERACEAE DA
AMAZÔNIA.
Coordenador: Prof. Dra. Marinete Marins Póvoa
Área Temática: Biologia
Vigência: 03/2010 a 03/2014
N° no CEPAE-UFPA: BIO039-12
O projeto acima identificado foi avaliado pelo Comitê de Ética Em Pesquisa Com
Animais de Experimentação da Universidade Federal do Pará (CEPAE). O tema eleito para a
investigação e de alto teor científico justificando a utilização do modelo animal proposto. Os
procedimentos experimentais utilizados seguem as normas locais e internacionais para
tratamento e manipulação de animais de experimentação. Portanto, o CEPAE, através de seu
presidente, no uso das atribuições delegadas pela portaria N° 1568/2005 do Reitor da
Universidade Federal do Pará, resolve APROVAR a utilização de animais de experimentação
nas atividades do projeto em questão, no período de vigência estabelecido. As atividades
experimentais fora do período de vigência devem receber nova autorização deste comitê.
Belém, 02 de fevereiro de 2010.
Prof. Dr. Walace Gomes Leal
Presidente CEPAE-UFPA
108
Anexo 02: Artigo publicado