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i

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

NAILSON CORREIA DE ARAUJO

Estudo da variação do meio de cultura na produção de metabólitos secundários

pelo fungo endofítico Aspergillus niger

Orientador: Prof. Dr. Geraldo Humberto Silva.

SÃO CRISTÓVÃO - SE

2010

ii

NAILSON CORREIA DE ARAUJO

Estudo da variação do meio na produção de metabólitos secundários pelo fungo

endofítico Aspergillus niger.

Dissertação apresentada ao Núcleo de pós-graduação em

Química da Universidade Federal de Sergipe, como parte dos

requisitos para obtenção do título de Mestre em Química.

Orientador: Prof. Dr. Geraldo Humberto Silva

SÃO CRISTÓVÃO

2010

iii

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus, por sempre iluminar o meu caminho.

Ao orientador, Prof. Dr. Geraldo Humberto, pelo aprendizado, dedicação, paciência e

confiança.

À UFS, pela oportunidade de realizar este mestrado.

A todos os professores, funcionários e alunos do Departamento de Química, que

contribuíram para a concretização deste trabalho.

À Gilenilde, Givalda , Geize, Roberta e Edivaldo, alunos de iniciação científica, pelo

companheirismo e incansável ajuda.

Ao meu parceiro de pós-graduação Mário Ferreira, pela colaboração e parceria em todos

os momentos.

À minha namorada Simone Carvalho, e á minha filha Beatriz, pela compreensão da

minha ausência.

À profa. Dra. Ana Paula Gebelein Gervásio por disponibilizar o Laboratório de

Eletroforose, e ao MSc Marcos Valentin pela colaboração na obtenção dos dados

eletroforéticos.

Aos meus pais, Edison e Helena, e aos demais familiares pelo amor e apoio

incondicional nos momentos mais difíceis.

Aos coordenadores e diretores das escolas onde ministro aula, pelo apoio e incentivo.

iv

“ Sem luta não pode haver vitória. Se não existissem as dificuldades , os

esforços seriam inúteis; se não houvesse

sofrimento e provocações , não existiriam a paciência e a resignação.”

Alberto Montalvão

v

RESUMO

O fungo endofítico Aspergilus niger isolado da espécie vegetal Hancornia speciosa,

conhecida popularmente como mangabeira, foi cultivado nos meios suco de mangaba,

Czapeck e Caldo de Batata Dextrose (CDB) e levou ao isolamento e identificação de

seis substâncias em seus extratos, sendo elas os ácidos oxálico, cítrico, tartárico, p-

acetil-benzóico e hexilitacônico e a substância pirofeno. Visando encontrar a melhor

condição de cultivo para produção de pirofeno foi desenvolvido um método analítico

por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência para análise desta substância. O método

desenvolvido foi eficiente tanto para análise dos extratos quanto para análise do caldo

fermentado e permitiu avaliar o efeito dos diferentes meios e do tempo de cultivo na

produção desta substância. A maior produção de pirofeno foi obtida utilizando suco de

mangaba como meio de cultivo e o período ideal de fermentação para a produção de

pirofeno foi de 12 dias, quando cultivado no meio líquido CDB.

Palavras chaves: Aspergillus niger, fungos endofíticos, ácidos orgânicos e metabólitos

fúngicos.

vi

ABSTRACT

The endophytic fungus Aspergillus niger isolated from specie plant Hancornia

speciosa, commonly known as mangabeira, was cultivated in different culture media

and used for identification of six substances in their extracts, such as oxalic, citric,

tartaric, p-acetylbenzoic, hexylitaconic acids and phyrofen. For quantification of

pyrophen in different extracts, it was developed a method by High Performance Liquid

Chromatography that was efficient for both extract analysis and fermented broth. The

method allowed to evaluate the effect of different media ways and culture time on the

pyrophen. The analyzed media for pyrophen production were mangaba juice, Czapeck

and potato dextrose broth (PDB) and the highest yield was obtained using mangaba

juice. The effect of culture time was evaluated by cultivating the fungus in the PDB

medium, being the ideal period of fermentation for pyrophen production was 12 days.

Palavras chaves: Aspergillus niger, endophytic fungus, organic acid, fungus

metabolites.

i

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS.................................................................................................... iv

LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................... v

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ............................................................ viii

1 INTRODUÇÃO 1

1.1 OS FUNGOS ------------------------------------------------------------------------------------------ 2

1.2 FUNGOS ENDOFÍTICOS ----------------------------------------------------------------------- 2

1.2.1 Diversidade metabólica de fungos endofíticos ----------------------------------------- 3

1.3 Fungos do gênero Aspergillus ------------------------------------------------------------------- 7

2 OBJETIVOS 8

2.1 Objetivo geral ----------------------------------------------------------------------------------------- 8

2.2 Objetivos Específicos ------------------------------------------------------------------------------- 8

3 METODOLOGIA 9

3.1. Especificação dos materiais, instrumentos e reagentes utilizados. ----------------- 9

3.1.1. Meios de cultura ---------------------------------------------------------------------------------- 9

3.1.2. Cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC). ------------------------ 9

3.1.3. Cromatografia em Coluna (CC). ------------------------------------------------------------ 9

3.1.4. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). --------------------------------- 9

3.1.5. Ressonância Magnética Nuclear de 1H e

13C (RMN de

1H e

13C) ------------- 10

3.1.6. Espectrômetro de Massas -------------------------------------------------------------------- 10

3.1.7. Concentração de solvente. ------------------------------------------------------------------- 10

3.1.8. Solventes utilizados ---------------------------------------------------------------------------- 10

3.1.9. Equipamento de eletroforese --------------------------------------------------------------- 10

3.1.10. Outros equipamentos -------------------------------------------------------------------------- 10

3.2. Procedimentos Experimentais ----------------------------------------------------------------- 11

3.2.1. Obtenção do fungo ----------------------------------------------------------------------------- 11

ii

3.2.2. Cultivo do fungo em meio sólido --------------------------------------------------------- 11

3.2.3. Cultivo do fungo em meio líquido. ------------------------------------------------------- 11

3.2.4. Cultivo do fungo para obtenção da curva de crescimento em meio CBD. - 11

3.2.5. Determinação do peso seco do micélio ------------------------------------------------- 11

3.2.6. Obtenção dos extratos AcOEt de A. niger nos meios Czapek, CBD e suco

de mangaba. -------------------------------------------------------------------------------------------------- 12

3.2.7. Fracionamento dos extratos AcOEt em Coluna Cromatográfica (CC) ------ 12

3.2.8. Fracionamento do segundo extrato CBD (CBD2) ---------------------------------- 16

3.2.9. Análise isocrática dos extratos AcOEt por Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência (CLAE). ---------------------------------------------------------------------------------------- 18

3.2.10. Obtenção do padrão pirofeno. -------------------------------------------------------------- 18

3.2.11. Obtenção da curva de calibração do padrão Pirofeno. ----------------------------- 18

3.2.12. Identificação dos ácidos cítrico, tartárico e oxálico no caldo fermentado

pelo fungo A. niger utilizando Eletroforese Capilar de Zona. ----------------------------- 18

3.2.13. Otimização das condições eletroforéticas para a separação dos Ácidos

orgânicos ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 19

3.2.14. Preparo da curva analítica para o ácido oxálico ------------------------------------- 19

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 20

4.1 Obtenção e análise dos extratos de A. niger por RMN-------------------------------- 20

4.2 Isolamento e Caracterização da substância pirofeno nos extratos do fungo A.

niger crescido nos meios CBD, Czapek e suco de mangaba. ---------------------------------- 22

4.2.1. Quantificação da substância pirofeno nos extratos do fungo A. niger

crescido nos meios CBD, Czapek e suco de mangaba. --------------------------------------- 25

4.2.2. Avaliação da produção de massa seca (biomassa) pelo fungo A. niger em

função do tempo de cultivo. ---------------------------------------------------------------------------- 27

4.2.3. Avaliação da produção de extrato em meio BDA em função do tempo ---- 28

4.2.4. Avaliação da produção da substância pirofeno em CBD em função do

tempo. 28

4.3 Caracterização dos ácidos oxálico, tartárico e cítrico nas frações e no caldo

fermentado. ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 30

iii

4.3.1. Caracterização do ácido oxálico ----------------------------------------------------------- 30

4.3.2. Caracterização do ácido cítrico (substância 3) --------------------------------------- 34

4.3.3. Caracterização do ácido tartárico (substância 4) ------------------------------------ 38

4.4 Caracterização das substâncias p-acetil-benzóico e ácido hexilitacônico ----- 40

4.4.1 Determinação estrutural do ácido p-acetil-benzóico (substância 5) --------- 40

4.4.2 Determinação estrutural do ácido hexilitacônico (substância 6). -------------- 42

5. CONCLUSÃO 46

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 47

iv

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Metabólitos Secundários Isolados de Fungos Endofíticos............................... 4

Tabela 2: Frações obtidas no fracionamento do extrato CBD2...................................... 17

Tabela 3. Deslocamento químico RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) da substância 1 e dos

dados da substância na literatura............................................................................. 25

Tabela 4: Quantificação do pirofeno nos diferentes extratos obtidos de A. niger.......... 27

Tabela 5. Deslocamentos químico RMN de 1H da substância 6 e dados da substância

da literatura do ácido hexilitacônico...................................................................... 44

v

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Substâncias isoladas de fungos endofíticos...................................................... 5

Figura 2: Fluxograma do fracionamento do extrato AcOEt do fungo Aspergillus niger

cultivado no meio suco de mangaba........................................................................ 13


cultivado no meio CBD........................................................................................... 14


cultivado no meio CZAPEK ................................................................................... 15

Figura 5: Fluxograma do fracionamento do extrato CBD2........................................... 16

Figura 6: Espectro de RMN do extrato AcOEt em CDCl3/CD3OD obtido no cultivo A.

niger em suco de mangaba...................................................................................... 21

Figura 8: Espectro de RMN do extrato AcOEt em CDCl3/CD3OD obtido do cultivo de

A. niger em CBD..................................................................................................... 21

Figura 9: Espectro de RMN do extrato AcOEt em CDCl3/CD3OD obtido do cultivo de

A. niger no meio líquido Czapek............................................................................. 22

Figura 10: Espectro de RMN de 1H a 500 MHz , do pirofeno ( CDCl3)........................ 23

Figura 11: Espectro de RMN de 13

C a 125 MHz , do pirofeno ( CDCl3)...................... 23

Figura 12: Espectro de massas do pirofeno obtido por electrospray modo positivo..... 24

Figura 13: Estrutura da substância 1 pirofeno............................................................... 24

Figura 14: Cromatograma do padrão pirofeno.............................................................. 26

Figura 15: Curva de calibração obtida por CLAE-DAD para a substância pirofen...... 26

Figura 16: Gráfico da produção de biomassa pelo fungo A. niger crescido no meio

CBD num período de 27 dias................................................................................... 27

Figura 17: Produção de extrato pelo fungo A. niger crescido no meio CBD num

período de 27 dias com intervalo de 3 dias.............................................................. 28

Figura 18: Gráfico da concentração do pirofeno no caldo fermentado obtido no cultivo

do fungo A. niger no meio CBD por um período de 27 dias, análise a cada 3 dias. 29

Figura 19: Concentração do pirofeno do fungo A. niger crescido no meio CBD num

período de 15 dias, com intervalo de 1 dia.............................................................. 30

vi

Figura 20: Espectro de RMN de 1H a 500 MHz , do ácido oxálico ( CDCl3/DMSO)... 30


C a 125 MHz, do ácido oxálico (CDCl3/DMSO-d6). 31

Figura 22: Espectro de massas do ácido oxálico obtido por electrospray modo

positivo.................................................................................................................... 31

Figura 23 : Eletroferograma do ácido oxálico, sendo: A - amostra analisada, B padrão -

na concentração de 0,025g/100mL. Tampão ácido bórico 100mmol/L+CTAB

0,5mol/L pH 10,0, 8kV, 36µA , 15s........................................................................ 32

Figura 24. Curva analítica para o ácido oxálico. A x C. Solução 25,0 mmol/L tampão

borato pH 9,00, modo de injeção hidrodinâmica, 30s, λ=254 nm e ddp de 12kV... 33

Figura 25: Curva de produção de ácido oxálico pelo fungo A. niger crescido no meio

CBD num período de 15 dias, com avaliação a cada de 3 dias............................... 33

Figura 26. Estrutura da substância 2 (ácido oxálico)..................................................... 34

Figura 27: Espectro de RMN de 1H a 500 MHz , do ácido cítrico ( Mistura MeOH +

DMSO-d6)............................................................................................................... 35

Figura 28: Mapa de contorno HMBC do ácido cítrico.................................................. 36

Figura 29: Espectro de Massas do ácido cítrico obtido por eletrospray no modo

positivo..................................................................................................................... 37

Figura 30: Estrutura do ácido cítrico (substância 3)...................................................... 37

Figura 31: Eletroferograma do ácido citrico, sendo: A – amostra analisada, B padrão -

na concentração de 0,05g/100mL. Tampão ácido bórico 100mmol/L+CTAB

0,5mol/L pH 10,0, 8kV, 36µA , 15s........................................................................ 38

Figura 32 : Espectro de RMN de 1H a 500 MHz , do ácido tartárico ( CDCl3)............. 39

Figura 33: Eletroferograma do ácido tartárico, sendo: A – amostra analisada, B padrão

- na concentração de 0,025g/100mL. Tampão ácido bórico 100mmol/L+CTAB

0,5mol/L pH 10,0, 8kV, 36µA , 15s........................................................................ 39

Figura 34: Estrutura da substância 4 (ácido tartárico)................................................... 39

Figura 35: Espectro de RMN de 1H a 500 MHz , do p-acetilbenzoico ( CDCl3).......... 41

Figura 36: Espectro de massas do p-acetilbenzóico obtido eletrospray modo positivo. 41

Figura 37: Estrutura da substância 5 (ácido p-acetil-benzóico).................................... 42

Figura 38: Estrutura do ácido hexilitacônico (substância 6)........................................ 42

vii

Figura 39 : Espectro de RMN de 1H das frações 3070-6............................................. 43

Figura 39 : Espectro de RMN de 13

C a 125 MHz , do hexilitacônico ( CDCl3)............ 43

Figura 40 : Espectro de Massas do ácido hexilitacônico obtido por electrospray modo

positivo..................................................................................................................... 44

Figura 41: Espectro de Massa/Massa do íon 237 do ácido hexilitacônico.................... 45

viii

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

Deslocamento químico

Micra

1J Acoplamento a uma ligação

2,3J Acoplamento a duas ou três ligações

ACN Acetonitrila

AcOEt Acetato de Etila

BDA Meio de Batata Dextrose e Agar

CBD Meio líquido caldo de batata dextrose

C18 Sílica gel de fase reversa tipo C18

CC Cromatografia em Coluna

CCDC Cromatografia em Camada Delgada Comparativa

CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

CLAE-DAD Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detector em Arranjo

de Diodos

d Dubleto

DCM Diclorometano

dd Duplo dubleto

ddd Duplo-duplo-dubleto

DMSO Dimetilsulfóxido

DMSO-d6 Dimetilsulfóxido deuterado

Fig. Figura

ix

grad. Gradiente

j Constante de acoplamento

[M]+ Íon molecular

m Multipleto

MeOH Metanol

m/z Relação massa - carga

ppm Parte por milhão

q Quarteto

RMN de 1 H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

RMN de 13

C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13

s Singleto

Si Sílica

subst. Substância

t Tripleto

tR Tempo de Retenção

UV-Vis Ultra Violeta – Visível

1

1 INTRODUÇÃO

As plantas estão associadas a diversos tipos de organismos e entender os

mecanismos dessas interações tem despertado o interesse de diversos pesquisadores

(KOGEL; FRANKEM; HUCKELHOVEN, 2006). Dentre os vários organismos, os que

mais têm despertado interesse são os microrganismos associados a tecidos internos das

plantas chamados de endófitos, tais microrganismos se associam de forma mutualística,

competindo com patógenos, aumentando a tolerância a estresses abióticos

(SAIKKONEM et al., 1998, SCHARDL; LEUCHTMANN; SPIRRING, 2004) e

bióticos (CLAY, SCHARDL, 2002), recebendo em contra-partida, proteção e

nutrientes do seu hospedeiro. Esta relação entre microrganismos e a planta hospedeira

envolve a produção de metabólitos secundários (ESPOSITO; AZEVEDO, 2004). O

isolamento, caracterização e identificação da bioatividade dessas substâncias podem

conduzir a novos fármacos, pois estudo químico, com microrganismos em geral, levou a

descoberta de vários fármacos, onde se destacam: antibióticos, imunosupressores,

agentes redutores do colesterol sanguíneo entre outros (NEWMAN CRAAG, SNADER

2000, DEMAIN, 1999). Outro dado importante é que dos 974 novos fármacos aprovados

entre 1981 e 2006, 39% são de produtos naturais ou derivados destes (NEWMAN; CRAGG,

2007).

Nas últimas décadas tem-se intensificado a busca de metabólitos secundários

bioativos de fontes renováveis (STROBEL, 2004 e GUNATILAKA, 2006), sendo os

microrganismos, em especial os fungos, uma alternativa nessa busca. Uma das

principais vantagens em se trabalhar com microrganismos é o controle dos processos

operacionais, pois em comparação com as plantas, os fungos crescem mais rapidamente,

num período de tempo e espaço menor onde as condições de cultivo podem ser alteradas

para direcionar a produção de metabólitos de interesse (PEARCE, 1997). Os processos

fermentativos, por exemplo, podem ser otimizados através da mudança de substrato,

controle da temperatura, pH e tempo de cultivo levando a um grande aumento na

produção da substância alvo (ALCANO, 1994).

2

1.1 OS FUNGOS

Os fungos apresentam um conjunto de características próprias que determinam

sua diferenciação das plantas, pois, não sintetizam clorofila, não têm celulose na sua

parede celular, exceto em alguns fungos aquáticos, não armazenam amido como

substância de reserva, sendo organismos quimiorganotróficos, cujo corpo pode ser

unicelular (leveduriforme) ou pluricelular (filamentoso) (SILVA, 2005). São

encontrados em diferentes lugares como água, solo, ar, animais e plantas

(HAWKSWORTH, 2001).

Estudos sugerem que o número de espécies de fungos existentes é muito superior

às espécies já conhecidas, tomando por base a proposta mais aceita de que existam cerca

de 1,5 milhões de espécies de fungos (HAWKSWORTH, 1991), alguns autores

consideram que mais de um milhão de espécies permanecem desconhecidas e que, uma

parte substancial destas são o que consideramos fungos endofíticos (STONE, et al.,

2004).

Os fungos são divididos em vários grupos, tais como, coprófilos, micro-parasitas de

água doce, marinhos, termófilos, epifíticos, endofíticos, entre outros (AINSWORTH;

SUSSMAN, 1996). Entre os diversos grupos, podemos destacar os endofíticos, que

interagem com a planta hospedeira e com o ambiente por meios químicos e biológicos,

produzindo diversas substâncias, que podem, inclusive, ser utilizadas pelas plantas

.(AZEVEDO,1998, SHULTZ et al., 2002, PUPO et al 2006, ZHANG ; SONG , 2006;

FIRAKOVA, STURDICOOVA, MUCKOVA, 2007; GALLO et al., 2008).

1.2 FUNGOS ENDOFÍTICOS

O termo endofítico é utilizado desde o século XIX. (AZEVEDO, 1998, GIMENEZ,

et al., 2007). Atualmente, sabe-se que os endofíticos pertencem a um grupo de

microrganismos que estão presentes nos tecidos internos da planta onde estão

associadas. Nos últimos anos as pesquisas com química de fungos que habitam esses

vegetais, chamados fungos endofíticos, têm demonstrado que alguns compostos de

origem vegetal também são produzidos por estes fungos, indicando haver genes em

comum entre plantas e fungos, sendo que alguns autores propõem a ocorrência de uma

transposição de genes para explicar tal fato (AZEVEDO, 1998). Por exemplo, o taxol,

3

um diterpenóide produzido pela planta Taxus brevifolia e largamente utilizado no

tratamento de câncer mamário e de útero é também produzido por um fungo endofítico,

o Taxomyces andreamae, encontrado associado com T. brevifolia (STIERLE et al.,

1993). A camptotecina, um agente antitumoral que é produzida pela planta

Campthotheca acuminata e pelo fungo endofítico Fusarium solani isolado desta planta

(KUSARI et al. 2009a). Uma outra substância característica do metabolismo vegetal, a

podofilotoxina, foi identificada no extrato do fungo endofítico Aspergillus fumigatus

isolado da planta Juniperus communis (KUSARI et al. 2009b). Ressalte-se, portanto, o

fato de que a ação farmacológica de plantas medicinais pode estar relacionada

substâncias produzidas por fungos endofíticos (AZEVEDO et al. 2000).

No Brasil, encontramos trabalhos acerca dessa diversidade química dos endofíticos

em PEREIRA, et al., 1993; SOUZA, 1996; ARAÚJO, 1996; RODRIGUES et al., 1996;

AZEVEDO 1998; SOUZA et al., 2004; RUBINI et al., 2005.

1.2.1 Diversidade metabólica de fungos endofíticos

Os metabólitos secundários bioativos isolados de fungos endofíticos pertencem a

diversas classes químicas incluindo alcalóides, fenilpropanóides, peptídeos, esteróides,

xantonas, fenóis, quinonas, terpenóides, citocalasinas, isocumarinas, compostos

alifáticos e clorados (TAN; ZOU, 2001; SCHULZ; BOYLE, 2005). Vários desses

compostos podem apresentar diversas atividades biológicas como antibacteriana,

antifúngica (ZHANG et al., 2009; GUO et al., 2008), antitumoral (WANG et al., 1999 ),

antiviral (GUO et. al., 2008), antioxidante (VALENTOVA et al., 2003), inseticida

(FINDLAY; JOHNSON, 1997), atividades antidiabéticas e imunossupressoras

(DEMAIN, 2000; TAN e ZOU, 2001). Considerando-se a vasta biodiversidade fúngica

e a especificidade nas colonizações das plantas hospedeiras por fungos, pode-se dizer

que a química de microrganismos endofíticos tem sido pouco estudada (SANTOS et al.,

2008). A tabela 1 relaciona alguns metabólitos produzidos por fungos endofíticos com

suas atividades biológicas.

4

Tabela 1 : Metabólitos Secundários Isolados de Fungos Endofíticos

Produtos Naturais Atividade

biológica

Fungo Referência

2-cloro-5-metoxi-3-

metilcicloexa-2,5-

dien-1,4-diona

Antimalárica e

citotóxica

Xylaria sp. BORGES et al.,

2009

Nigerasperona A e B - Aspergillus niger

BORGES et al.,

2009

Nigerasperona C Antioxidante e

antifúngica

Aspergillus niger BORGES et al.,

2009.

3,12-

diidroxicalameneno e

3,12-diidroxicadaleno

Citotóxica Phomopsis cassiae SILVA et al., 2006

1-(2-hidroxi-6-

metoxifenil)-butan-1-

ona

Antifúngica Nodulosporium sp. BORGES et al.,

2009

8α-acetoximultiplolide

A

Antifúngica Phomopsis sp. BORGES et al.,

2009

Chaetopiranina Citotóxica e

antioxidante

Chaetomium

globosum

BORGES et al.,

2009

Diterpeno pimarano Inseticida Fungo não

identificado

isolado de (Abies

balsamea)

FINDLAY et al.,

1995

Ácido rhizoctônico Antibacteriana Rhizoctonia sp. MA et al., 2004

Phomopsolido A Antibacteriana Penicillium sp. STIERLE et al.,

1993

Citosporona D Antibacteriana Cândida albicans BRADY et al. 2000

Auraspirona A Atividade

antioxidante

Aspergillus niger

SONG et al. 2004

Rubrofusarem B Atividade

citotóxica

Aspergillus niger SONG et al. 2004

Ácido Tensiuico Antibacteriana Aspergillus niger

HASEGAWA et

al., 2007

Neoplaeter Citotóxica e

antifúngica

Neoplaconema

napellum

PETRINI, 1991.

Taxol

Anticancerígena Taxomyces

andreanae

GUO et al., 2008

Camptotecina Anticancerígena Entrophospora

infrequens

SPITELLER et al.,

2005.

Brefeldina A Anticancerígena Aspergillus

clavantus

GUNATILAKA,

2006.

Mevicolina Agente redutor de

colesterol

Monascus ruber DEMAIN, 2000

Naftopirona

Inibidores da

enzima HMG

CoA redutase

Chrysosporium

pannorum

OGAWA et al.,

1991

Aurasperona A Antioxidante Aspergilus niger SONG et al., 2004

5

Figura 1: Substâncias isoladas de fungos endofíticos

O

N

SNH

O

O

OH

CH3

CH3

CH3

CH3

Cl

O

O

O

CH3

NH

O

O

OO

O O

O

O

O

OHO

O

CH3

OH

OH

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

O

O

O

OOH

CH3

CH3

CH3

CH3

H

H HO

OO

O

OH

O

CH3

CH3

OH O

CH3

O

CH3

O

CH3

O

OHOH

OH

O

O

O

O

CH3

CH3

CH3

CH3

OH

OH

O

O

C7H15

N

NH

NH

O

CH3

OH

CH3

H

H

H

Penicilina

Taxol

Viridina

Mevicolina

Fomopsolido A

Ergometrina

Ácido rizoctônico

2-cloro-5-metoxi-3-metil-2,5-

dien-1,4-diona

Citosporona D

6

Continuação da Figura 1

O

CH3

OH

CH3 CH3

H

CH3O

O

H

CH3

O

H

H

OH

O

O

CH3

O

O

O

O

OH

CH3

OH

CH3

CH3

O O

OO

CH3

OH

O

CH3

CH3

O O

CH3 CH3

CH3

O

CH3

O

O

O OH

CH2

OOH

CH3

NH

O

O

O

CH3

O

O

OH

OH

NH2O

CH3

OO

CH3

CH3 CH3

O

O

ON

N

O

O

O

OH

CH3

Bicoumanigrina

Ác Tensiuico B

Auraspirona A

Brefeldina A Diterpeno primarano

Camptotecina

Neoplaeter

Naftopirona

7

A produção de tais substâncias promissoras, podem ser otimizadas ajustando o

processo fermentativo, o que leva a uma maior produção do metabólito alvo (DEMAIN,

2000), sendo portanto, uma fonte renovável (STROBEL, 2004 e GUNATILAKA,

2006).

1.3 Fungos do gênero Aspergillus

O gênero Aspergillus, pertence à classe dos Mitospóricos, é largamente

encontrado na natureza, presente em frutas, vegetais e outros substratos em

decomposição capazes de fornecer o alimento necessário ao seu crescimento

(PELCZAR, et al., 1996). Metabolicamente, são versáteis e várias espécies têm sido

descritas como produtoras de metabólitos (GEISER et al., 1996, PELCZAR; CHAN;

KRIEG, 1997, YU; KELLER, 2005).

Em 1893, Wehmer descobriu que alguns fungos possuíam a capacidade de

acumular ácido cítrico durante seu cultivo (SIEBERT e SHULZ, 1979). Dentre estes

fungos os do gênero Aspergillus têm se destacado, principalmente, por sua habilidade

em produzir ácido cítrico. Atualmente, a produção comercial de ácido cítrico é realizada

por processos fermentativos, utilizando fermentação em superfície ou submersa,

empregando o fungo Aspergillus niger (REED, 1991).

O gênero A. niger tem se destacado, principalmente, por sua habilidade em

produzir ácidos orgânicos, por isso o crescente estudo neste campo, onde destacamos o

ácido cítrico e oxálico (BIZUKOJC; LEDAKOWICZ, 2004 e SAYER; GADD, 1997).

Inúmeros mecanismos têm sido propostos, com relação à sua regulação e síntese, dando

ênfase à produção destes ácidos que é influenciada por várias condições ambientais, tais

como, o pH do meio, fontes de carbono (C), nitrogênio (N), e micronutrientes

(PAPAGIANNI et al., 2005 XU et al., 1989; HAQ et al., 2003), despertando estudos

com o objetivo de aumentar a produção dos mesmos, inclusive em presença de álcoois

(SAHA et al., 1999).

Também existem pesquisas sobre a capacidade dos ácidos orgânicos em

influenciar a solubilização de fosfatos inorgânicos (CUNNINGHAM; KUIACK, 1992),

pois estes, secretados pelos microrganismos, podem diminuir o pH ou atuar como

agentes quelantes dos metais dos fosfatos inorgânicos liberando fosfato solúvel (SALIH

et al.,1989; NAHAS, 1991).

8

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Estudar o efeito de diferentes meios de cultura e do tempo de cultivo na produção de

metabólitos secundários pelo fungo endofítico Aspergillus niger isolado de Hancornia

speciosa.

2.2 Objetivos Específicos

Cultivar o fungo Aspergillus niger em diferentes meios de cultura e obter os extratos

brutos;

Fracionamento dos extratos;

Analisar os extratos através de cromatografia líquida de alta eficiência modo analítico;

Isolar as substâncias presentes nos extratos e caracterizá-las por espectrometria de RMN

e Massas;

Quantificar a substância pirofeno nos extratos brutos obtidos em diferentes meios;

Colaborar para o conhecimento da relação planta-fungo visando, principalmente,

contribuir para uma melhor produção de metabólitos.

9

3 METODOLOGIA

3.1. Especificação dos materiais, instrumentos e reagentes utilizados

3.1.1. Meios de cultura

Meios de cultura sólidos

BDA - Batata Dextrose Ágar da Acumedia

39 g/L de água destilada e esterilização (15 min à 121°C)

Meio de cultura líquido

CBD – Caldo de Batata dextrose da Acumedia


CZAPEK- da Himedia


SUCO DE MANGABA- in natura

170 gramas de fruta por litro de água destilada e esterilização (15 min à 121°C)

3.1.2. Cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC)

As análises em CCDC foram feitas usando placas de alumínio para TLC com sílica

gel 60 ALUGRAM® e indicador de fluorescência UV254. As revelações foram

efetuadas com irradiações UV de 254 nm e 360 nm, exposição a iodo sublimado e verde

de bromo-cresol (preparado com 1,5g de KMnO4, 10g de K2CO3 e NaOH 10% 1,25 ml

em 200 ml de água).

3.1.3. Cromatografia em Coluna (CC)

A cromatografia em coluna foi realizada usando sílica de fase reversa

AccuBondIISPE ODS (18) da Agilent technologies, e sílica de fase normal Sílica Gel

60 (0,063-0,200 mm) da Proquimios.

3.1.4. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

As análises por CLAE foram realizadas em aparelho Shimadzu, acoplado ao

detector SPD–M2DA 330 PhotoDiodo-Array Ultra-Violeta (PDA-UV), coluna analítica

de fase reversa Shimpack (ODS, 5 μm, 150 x 4,6 mm) e coluna semi-preparativa de fase

reversa Phenomenex (ODS, 10 μm, 250 X 10,0 mm).

10

3.1.5. Ressonância Magnética Nuclear de 1H e

13C (RMN de

1H e

13C)

Os experimentos uni e bidimensionais foram realizados em espectrômetro Varian

INOVA-500 operando a 500 MHz para o núcleo de 1H e em 125 MHz para o núcleo de

13C. Foi utilizado TMS como referência interna.

3.1.6. Espectrômetro de Massas

Os espectros de massas foram obtidos em espectrômetro QTOF (Micromass) pelo

modo de ionização electrospray (ESI).

3.1.7. Concentração de solvente

Foram feitas sob pressão reduzida, usando rota-evaporador da marca Fisaton

modelo 801.

3.1.8. Solventes utilizados

Os solventes utilizados foram hexano, diclorometano, acetato de etila, metanol,

acetonitrila das marcas Synth, Mallinckrodt e J.T.Baker. Os solventes deuterados

utilizados foram metanol, clorofórmio e dimetilsulfoxido da marca Tedia.

3.1.9. Equipamento de eletroforese

Aparelho constituído de: CE LINEAR modelo 200 equipado com detector UV-Vis,

Capilar de sílica fundida (Polymicro) com diâmetro interno 75μm e externo de 375μm,

sem recobrimento interno com 24 cm efetivos. Estação Cromatográfica (Data Apex

Ltda, USA). Fonte de alta voltagem CZE 100R (Spellman modelo CZE 30PN1000).

Eletrodo de platina do pólo positivo e negativo. Suportes de madeira. Bomba

peristáltica com 13 canais, Ismatec, modelo mp.

3.1.10. Outros equipamentos

Autoclave vertical - Prismatec Ind. e Comercio Ltda

Câmera de fluxo laminar – Filterlux

Balança analítica - Schimadzu AY- 220

11

3.2. Procedimentos Experimentais

3.2.1. Obtenção do fungo

O fungo Aspergillus niger foi isolado das folhas sadias de Hancornia speciosa

coletadas no povoado Parque Santa Rita, em São Cristovão, e encontra-se preservado,

em água estéril, no Laboratório de Química de Fungos do Campus da UFS “Prof.

Alberto Carvalho”, em Itabaiana – SE, sob registro P3P6F2. A pesquisa foi iniciada

com o fungo já isolado.

3.2.2. Cultivo do fungo em meio sólido

O isolado fúngico foi primeiramente repicado em placas de Petri contendo BDA e

incubado por sete dias em temperatura ambiente.

3.2.3. Cultivo do fungo em meio líquido

O isolado fúngico cultivado em BDA foi inoculado nos meios líquidos CBD (2000

mL), Czapek (2000 mL) e suco de mangaba (2000 mL), contidos em frascos tipo

Erlenmeyer de 500 ml com 250 ml de meio. A cultura foi mantida estática em

temperatura ambiente por 28 dias. Sendo que, no meio CBD, o fungo foi crescido

novamente com 4000 mL por 14 dias (CBD2).

3.2.4. Cultivo do fungo para obtenção da curva de crescimento em meio CBD

O meio CBD foi inoculado com um disco de 1,5 cm de diâmetro do meio BDA

contendo o micélio do fungo esporulado. Foram utilizados para este experimento 36

frascos de Erlenmeyer de 500 mL contendo 250 mL de meio, sendo retirados quatro

frascos a cada três dias, sendo realizado em quadruplicata. Em uma segunda etapa, o

fungo foi repicado para frascos Erlenmeyer de 1000 mL contendo 250 mL do meio

líquido CBD, sendo retirada a cada dia uma alíquota de 10 mL por um período de 15

dias, sendo todo o experimento conduzido com três repetições.

3.2.5. Determinação do peso seco do micélio

Para a determinação do peso seco do micélio, as amostras foram filtradas com papel

filtro, separando o micélio do caldo fermentado. O micélio foi seco em estufa ventilada

a 60 °C por 72h.

12

3.2.6. Obtenção dos extratos AcOEt de A. niger nos meios Czapek, CBD e

suco de mangaba

Após o período de fermentação líquida, o caldo foi separado do micélio por

filtração, extraído 3X com acetato de etila e seco em rota-evaporador, fornecendo os

respectivos extratos AcOEt com as massas de 177,3 mg de Czapek, 123,1 mg de CBD e

506,5 mg de suco de mangaba, sendo que no segundo crescimento em CBD (CBD2) foi

retirado com 14 dias, e a massa resultante foi de 1800 mg.

3.2.7. Fracionamento dos extratos AcOEt em Coluna Cromatográfica (CC)

Os extratos brutos de CBD, CZAPEK e SUCO DE MANGABA, foram fracionados

em coluna cromatográfica (coluna de 3,0 cm de diâmetro com 15 cm sílica C18) usando

um sistema de eluição gradiente H2O/MeOH conforme fluxogramas nas figuras 2 ,3 e 4.

Figura 2: Fluxograma do fracionamento do extrato AcOEt do fungo Aspergillus niger cultivado no meio suco de mangaba

CC, C18

MeOH/H2O

Fr 1

(177,6 mg)

FrM 2

(23,5 mg)

FrM 3

(13,9 mg)

FrM 4

(8,7 mg)

FrM 5

(1,3 mg)

FrM 6

(7,8 mg)

FrM 7

(95,3 mg)

FrM 8

( 124,4 mg)

FrM 9

(5,9 mg)

EXTRATO AcOEt

MANGABA

(500 mg)

FrM 10

(9,0 mg)

(5/95) (15/85) (25/75) (35/65) (45/55) (55/45) (75/25) (85/15) (100/0)

FrM 1

(177,6 mg)

(65/35)

Pirofeno

Ácido

oxálico

14

Figura 3: Fluxograma do fracionamento do extrato AcOEt do fungo Aspergillus niger cultivado no meio CBD

(100/0)

CC, C18

MeOH/H2O

FrP 1

(1,6 mg)

FrP 2

(1,7 mg)

FrP 3

6,4 mg)

FrP 4

10,9 mg)

FrP 5

(15,3 mg)

FrP 6

(16,3 mg)

FrP 7

(11,9 mg)

FrP 8

(4,9 mg)

FrP 9

(8,0 mg)

EXTRATO AcOEt

CBD

(100 mg)

(10/90) (20/80) (30/70) (50/50) (60/40) (70/30) (80/20) (90/10)

PIROFENO

15

Figura 4: Fluxograma do fracionamento do extrato AcOEt do fungo Aspergillus niger cultivado no meio CZAPEK

(100/0) (80/20)

CC, C18

MeOH/H2 O

FrC 1

(37,5 mg)

FrC 2

(13,0 mg)

FrC 3

(13,6 mg)

FrC 4

(16, mg)

FrC 5

(21,1 mg)

FrC 6

(17,5 mg)

FrC7

(30,4 mg)

FrC 8

(10,5 mg)

FrC 9

(17,3

mg)

EXTRATO AcOEt

CZAPECK

(200 mg)

(20/80) (30/70) (40/60) (50/50) (60/40)

(70/30) (90/10)

PIROFENO

3.2.8. Fracionamento do segundo extrato CBD (CBD2)

Uma parte do extrato foi fracionada utilizando CC com sílica gel de fase normal e a

outra utilizando fase reversa.

3.2.8.1. Fracionamento do extrato CBD2 utilizando sílica de fase reversa C18.

Uma parte do extrato foi fracionada utilizando CC de sílica de fase reversa C18 e

sistema de eluente H2O/MeOH conforme figura:

Figura 5: Fluxograma do fracionamento do extrato CBD2

A fração FrP2-1 obtida com 80/20 H2O/MeOH foi fracionada em CLAE semi-

preparativa utilizando coluna C-18 da Phenomenex (250 X 10 mm) sendo o sistema de

H2O/MeOH com gradiente linear de 5-50% de MeOH em 30 min, obtendo 3 mg da

substância 1 (ácido cítrico) na fração coletada entre os tR 2,5-3,0 min, identificou-se a

substância 2 (ácido tartárico) 2,5 mg coletada entre os tR 3,0-3,5 min.

A fração FrP2-2 obtida com 40/60 H2O/MeOH foi fracionada em CLAE semi-

preparativa utilizando coluna C-18 da Phenomenex (250 X 10 mm) sendo o sistema de

H2O/MeOH isocrático com 50% de MeOH em 30 min isolando a substância 3 p-acetil-

benzóico (2,8 mg).

CC, C18

H2 O/MeOH

FrP2-1

(64,9

mg)

FrP2- 2

(250 mg)

FrP2- 3

(100 mg)

EXTRATO AcOEt

CBD 2º cresc.

(461 mg)

(80/20) (40/60

)

(0/100)

17

3.2.8.2. Fracionamento do extrato de CBD utilizando fase normal

Uma porção correspondente a 200mg do extrato bruto obtido no segundo

crescimento, ou seja, extrato (CBD2) de A. niger, foi submetido à coluna de fase

normal, inicialmente com o sistema eluente DCM/AcOEt na proporção 30/70 onde

foram coletados 18 frações (Frc 1 a Frc 18 ) de 10 mL cada. O segundo sistema de

solvente foi DCM/MeOH na proporção 90/10 gerando 6 frações ( Frc 19 a Frc 25); o

terceiro sistema de solvente foi DCM/MeOH 50/50, coletando cinco frações; e por

último, lavou-se a coluna com 100% DCM de acordo com a tabela 2.

Tabela 2: Frações obtidas no fracionamento do extrato CBD2

FRAÇÃO

CÓDIGO

SOLVENTE

PROPORÇÃO

MASSA

1-5 ASP-30/70-1 a 5 DCM/AcOEt 30/70 7,5 mg

2 ASP-30/70-6 DCM/AcOEt 30/70 5,3 mg

7-10 ASP-30/70-7 a 10 DCM/AcOEt 30/70 18 mg

14 ASP-30/70-11 a 14 DCM/AcOEt 30/70 12 mg

15 ASP-30/70-15 DCM/AcOEt 30/70 1,68 mg

16 ASP-30/70-16 DCM/AcOEt 30/70 4,2 mg

17 ASP-30/70-17 DCM/AcOEt 30/70 4,4 mg

18 ASP-30/70-18 DCM/AcOEt 30/70 4,8 mg

19 ASP-90/10-19 DCM/MeOH 90/10 0,9 mg

20 ASP-90/10-20 DCM/MeOH 90/10 1,3 mg

21 ASP-90/10-21 DCM/MeOH 90/10 12,8mg

22 ASP-90/10-22 DCM/MeOH 90/10 6,8 mg

23 ASP-90/10-23 DCM/MeOH 90/10 0,5 mg

24 ASP-90/10-24 DCM/MeOH 90/10 27,6 mg

25 ASP-50/50-25 DCM/MeOH 50/50 0,3 mg

26 ASP-50/50-26 DCM/MeOH 50/50 1,1 mg

27 ASP-50/50-27 DCM/MeOH 50/50 0,3 mg

28 ASP-50/50-28 DCM/MeOH 50/50 5,8 mg

29 ASP-50/50-29 DCM/MeOH 50/50 6,2 mg

18

3.2.9. Análise isocrática dos extratos AcOEt por Cromatografia Líquida de

Alta Eficiência (CLAE)

3.2.10. Obtenção do padrão pirofeno

A substância pirofeno, purificada no laboratório por cromatografia, foi

recristalizada apresentando ponto de fusão em 178°C sendo utilizada para preparar a

solução padrão em diferentes concentrações.

3.2.11. Obtenção da curva de calibração do padrão Pirofeno

Da substância pirofeno foi pesado 5 mg, os quais foram solubilizados com MeOH

e adicionados a um balão volumétrico de 5 mL, resultando em uma solução de 1

mg/mL. Esta solução foi utilizada para preparar cinco soluções para obtenção da curva

com concentrações variando entre 0,0625 e 1,0 mg/mL. Tais soluções foram filtradas e

acondicionadas em vails de 2 mL sendo injetado 20 μL no CLAE analítico, no modo

isocrático, utilizando como fase móvel H2O/MeOH 50/50 em 10 min, fluxo de 1

mL/min, obtendo os cromatogramas. A área do pico do padrão pirofeno foi utilizada

para construção da curva de calibração para quantificação da referida substância nos

extratos.

Os extratos foram injetados na concentração de 1 mg.mL-1

, preparados pesando-

se 5 mg do extrato e solubilizando-se em metanol, completando o volume do balão

volumétrico para 5 mL; os caldos fermentados foram somente filtrados para injeção e as

condições analíticas empregadas foram as mesmas utilizadas para construção da curva

padrão, sendo que para análise do caldo fermentado, diretamente, sem extração, o

volume injetado foi de 50 μL, mantendo-se as demais condições cromatográficas.

3.2.12. Reagentes e soluções utilizados na identificação dos ácidos cítrico,

tartárico e oxálico no caldo fermentado pelo fungo A. niger utilizando

Eletroforese Capilar de Zona

Solução de Hidróxido de Sódio 1 mol/L e 0,1 mol/L (F. Maia).

Solução de Ácido Clorídrico 1 mol/L (F. Maia).

19

Soluções padrão

Solução de Ácido Oxálico 1,0000 g /100mL, Ácido Tartárico 0,5000 g /100mL e de

Ácido Cítrico 0,5000 g /100mL.

Soluções-tampão:

Ácido Bórico 100,0 mmol/L + 0,5 mol/L CTAB (Brometo de cetil trimetil amônio) pH

10,00

O valor de pH da solução foi ajustado com hidróxido de sódio 1,0 mol/L em seguida

filtrado com papel quantitativo 12,50 ± 0,10 cm antes de ser utilizado.

3.2.13. Otimização das condições eletroforéticas para a separação dos Ácidos

orgânicos

A detecção foi feita por UV com comprimento de onda em 214 nm para

determinação dos ácidos orgânicos. Para a identificação do sinal dos ácidos orgânicos,

em função do tempo de migração, foi utilizada solução individual do respectivo

composto e, em seguida, foram analisadas as amostras. Para confirmação da identidade

dos picos foi adicionada à amostra uma solução do respectivo ácido e avaliado o

aumento da altura do sinal do pico da seguinte forma:

Ácido tartárico: 0,5 mL extrato + 1 mL da solução estoque ácido tartárico

0,5000g/100mL e diluídos em água destilada a um volume final 3 mL;

Ácido oxálico: 3,0 mL extrato + 1 mL da solução estoque ácido oxálico diluídos em

água destilada a um volume final 6 mL;

Ácido cítrico: 3,5 mL extrato + 1 mL da solução estoque ácido cítrico 0,5000g/100mL

e diluídos com água destilada a um volume final 6 mL.

3.2.14. Preparo da curva analítica para o ácido oxálico

Com todos os parâmetros otimizados para a separação do ácido orgânico, foi

então construída a curva analítica para quantificação do mesmo no caldo fermentado,

considerando a altura do pico versus a concentração da amostra.

Para determinação do ácido oxálico empregou-se curva analítica na concentração

0,01 a 0,03 g/100mL do ácido oxálico.

As amostras foram filtradas diretamente em papel filtro quantitativo para serem

analisadas.

20

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Trabalho anteriorrmente realizado no Laboratório de Química de Fungos por

Santos et al., (2008) mostrou que o fungo A. niger isolado de H. speciosa produzia a

substância pirofeno, quando cultivado no meio de cultivo CBD por 28 dias, como o

metabólito majoritário. Visando entender os fatores que influenciam na produção desta

substância foi proposto neste trabalho o estudo da influência do meio e do período de

fermentação na produção deste metabólito. Os meios escolhidos para o estudo foram

CBD, Czapek e o suco de mangaba, sendo que o meio suco de mangaba foi escolhido

pelo fato do fungo ter sido isolado desta planta.

Durante o decorrer do trabalho notou-se a presença de cristais incolores em alguns

frascos contendo o extrato AcOEt, sugerindo ser ácidos orgânicos; como o gênero

Aspergillus é um conhecido produtor de ácidos orgânicos em escala industrial, foi

proposto o estudo químico destes extratos visando conhecer os demais constituintes dos

mesmos.

4.1 Obtenção e análise dos extratos de A. niger por RMN

Para obtenção dos extratos, o fungo preservado em água estéril foi repicado para

meio sólido, conforme metodologia descrita no item 3.2.2. Em seguida foram inoculados

nos meios líquidos, conforme descrito em 3.2.3, e extraídos com AcOeEt, gerando três

extratos. A análise dos extratos por RMN de 1H (Figuras 6, 7 e 8) evidenciou o grupo

fenila da molécula pelos sinais em torno de δH 7,2 ppm integrando para 5H, característico

de aromático monosubstituído, e o sinal δH 1,8 (s, 3H) característico do grupo acetila da

amida, indicando a presença de pirofeno nestes extratos.

21

SpinWorks 2.5: Extrato Manga

PPM 7.6 7.2 6.8 6.4 6.0 5.6 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4

file: D:\Resultados _espectros\RMN\gehs_08.07.09\11\fid expt: <zg30>

transmitter freq.: 400.203401 MHz

time domain size: 65536 points

width: 4496.40 Hz = 11.235294 ppm = 0.068610 Hz/pt

number of scans: 16

freq. of 0 ppm: 400.201578 MHz

processed size: 32768 complex points

LB: 0.000 GB: 0.0000

Figura 6: Espectro de RMN do extrato AcOEt em CDCl3/CD3OD obtido do cultivo

de A. niger em suco de mangaba

SpinWorks 2.5: Water Suppression

PPM 8.4 8.0 7.6 7.2 6.8 6.4 6.0 5.6 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 -0.0

7

.8834

7

.2605

7

.2467

7

.2085

7

.1941

6

.0008

5

.9968

5

.5482

5

.5441

4

.8684

3

.8118

3

.3151

3

.3119

3

.3086

3

.3054

3

.3021

2

.5640

1

.9054

1

.2787

0

.9766

0

.9708

0

.9632

0

.9471

0

.9335

0

.9262

0

.9199

0

.9137

0

.0989

file: F:\extratoPDBoxalico_H.fid\fid block# 1 expt: "water"



width: 8000.00 Hz = 16.008531 ppm = 0.250000 Hz/pt

number of scans: 32



LB: 0.000 GB: 0.0000


de A. niger em CBD

22

SpinWorks 2.5: CZAPECK - Extrato

PPM 8.0 7.6 7.2 6.8 6.4 6.0 5.6 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 -0.0

file: D:\Resultados _espectros\RMN\gehs_08.07.09\5\fid expt: <zg30>



width: 6313.13 Hz = 15.774874 ppm = 0.096331 Hz/pt

number of scans: 16



LB: 0.000 GB: 0.0000


de A. niger no meio líquido Czapek.

4.2 Isolamento e Caracterização da substância pirofeno nos extratos do fungo A.

niger crescido nos meios CBD, Czapek e suco de mangaba.

A substância 1 (Figura 13) foi isolada dos meios de cultivo Czapek, CBD e suco

de mangaba, como cristais amarelos. O espectro de RMN de 1H mostrou sinais

característicos de um anel aromático mono-substituído com δH 7,03 (dl 6,0 Hz; 2H); δH

7,13 (m, 1H) e δH 7,17 (m, 2H), sinais indicativos de pirona em δH 5,33 (d, 1H; J= 2,5), e

em 5,70 (d, 1H; J= 2,5), um sinal em δH 1,89 (s, 3H) indicando a presença de uma metila

de amida e um sinal em δH 3,69 (s, 3H) característico de metoxila. O espectro de RMN

13C confirmou a presença de um anel aromático mono-substituído com δC 135 (1C);

128,5 (2C); 126,9 e 128,9 (2C), uma metoxila δC 52,4 e duas carbonilas, uma de um

acetato δC 169,8 e outra indicativa de pirona em δC 164,5. A partir da comparação com

dados disponíveis na literatura (VAROGLU , 2000) foi possível a identificação estrutural

da substância 1 como pirofeno.

23

Figura 9: Espectro de RMN de 1H a 500 MHz do pirofeno ( CDCl3).


C a 125 MHz do pirofeno ( CDCl3).

30 Jul 2010

Acquisition Time (sec) 4.0000 Comment Std proton Date Jun 30 2010 Frequency (MHz) 499.73

Nucleus 1H Number of Transients 2 Original Points Count 32000 Points Count 32768 Solvent DMSO Sweep Width (Hz) 8000.00

Temperature (grad C) 25.000

8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

7.9

17.9

0 7.4

7

7.1

87.1

6

7.0

87.0

7

5.7

8

5.3

2

4.8

34.8

2

3.6

8

3.0

53.0

43.0

23.0

12.9

32.9

12.9

02.8

8

1.8

3

30 Jul 2010

Acquisition Time (sec) 1.3005 Comment Std proton Date Jun 30 2010

Frequency (MHz) 125.67 Nucleus 13C Number of Transients 5000 Original Points Count 39215 Points Count 65536

Solvent DMSO Sweep Width (Hz) 30154.54 Temperature (grad C) 25.000

230 220 210 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 -10 -20

170.6

7169.7

5

163.8

7162.4

7

136.3

6

128.6

6128.0

5

128.0

3

126.3

6

104.3

8

104.3

7

99.9

4

87.7

9

77.6

277.3

677.1

0

55.6

5 52.1

0

44.3

9

39.5

738.0

2

22.3

5

-5.9

2

-9.4

7

24

m/z100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380

%

0

100

PIROFENO 221 (4.166) 1: TOF MS ES+ 2.91e3310.0663

215.0078

288.1170

246.1033

236.9982 305.1548

311.1052

326.0863

Figura 11: Espectro de massas do pirofeno obtido por electrospray modo positivo

Figura 12: (Estrutura da substância 1 : pirofeno)

15

NH

O

CH3

O

O

O

CH3

7

89

10

11

12

13

6

14

12

3

164

5

15

NH

O

CH3

O

O

O

CH3

7

89

10

11

12

13

6

14

12

3

164

5

NH

O

CH3

O

O

O

CH3

7

89

10

11

12

13

6

14

12

3

16

NH

O

CH3

O

O

O

CH3

7

89

10

11

12

13

6

14

12

3

167

89

10

11

12

13

6

14

12

3

164

5

4

5

M+H

M+Na

25

Tabela 3. Deslocamento químico RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) da substância 1 e

dos dados da substância na literatura.

Δ 1H do pirofeno δ

13C do pirofeno

Isolado Literatura Isolado Literatura

1 164,5 164,4

2 5,33 sl 5,42 d (2,2) 88,4 88,5

3 170,9 170,5

4 5,7 sl 5,75 d (2,2) 101,1 101,2

5 161,4 161,3

6 4,9 t (8,0) 5,0 t (8,0) 52,4 52,4

7 3,0 d (8,0) 3,08 d (8,0) 38,7 38,9

8 135,8 135,8

9 7,04 m 7,15 m 128,9 129,1

10 7,04 m 7,30 m 128,5 129,7

11 7,13 m 7,22 m 126,9 127,2

12 7,18 m 7,30 m 128,5 129,1

13 7,04 m 7,06 m 128,9 127,2

14 169,8 169,6

15 1,87 s 1,96 s 22,9 23,2

16 3,65 s 3,75 s 55,9 56,0

4.2.1. Quantificação da substância pirofeno nos extratos do fungo A. niger

crescidos nos meios CBD, Czapek e suco de mangaba

Para a quantificação da substância pirofeno nos diferentes meios de cultura foi obtida

uma curva de calibração utilizando o método cromatográfico descrito no item 3.2.11

utilizando padrão externo nas concentrações: 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5 , 1,0 mg/ mL e

injetando 20 μL, obtendo a seguinte equação para a reta Y = 0,000000251379 -

0,003574716871 ( com R2 = 0,999). O Limite de Quantificação (LQ) foi de 0, 002749

mg/mL e o Limite de Detecção (LD) foi de 0,0008248 mg/mL calculados.

26

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 min

-5.0

-2.5

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

22.5

25.0

27.5

30.0

32.5

35.0

37.5

40.0

42.5

45.0

mAU280nm4nm (1.00)

Figura 13: Cromatograma do padrão pirofeno.

CURVA DE CALIBRAÇÃO DO PIROFENO

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000

ÁREA

CO

NC

EN

RA

ÇÃ

O

Série1

Figura 14: Curva de calibração obtida por CLAE-DAD para a substância

pirofeno.

Os três extratos obtidos foram analisados por CLAE e o resultado apresentado na

Tabela 4. Pode-se observar na Tabela 4 que o melhor meio para produção da substância

pirofeno é o suco de mangaba. Tal fato talvez esteja relacionado à interação do fungo na

natureza com a mangabeira (Hancornia speciosa).

H2O/MeOH 1/1

Fluxo de 1 mL/min

λ = 254 nm

27

Tabela 4: Quantificação do pirofeno nos diferentes extratos obtidos de A. niger.

Meios líquidos de cultivo Massa do extrato (g/L) Porcentagem de pirofeno

no extrato

CZAPEK 0,0886 11,5 %

CBD 0,0615 9,5 %

SUCO DE MANGABA 0,2532 23,5 %

4.2.2. Avaliação da produção de massa seca (biomassa) pelo fungo A. niger em

função do tempo de cultivo

Dados cinéticos são importantes no desenvolvimento de estudos para a otimização

das condições de cultivo, planejamento da produção, projeto de bio-reatores, entre

outros. Para obtenção dos parâmetros cinéticos para a produção de biomassa por A. niger

foi realizado um cultivo, conforme descrito em 3.2.4. Os resultados obtidos para

produção de biomassa deste fungo são coerentes com dados da literatura, mostrando que

ocorre um aumento na biomassa de micélio até o décimo quinto dia de cultivo e a partir

deste momento há uma diminuição da mesma até o término do crescimento, como pode

ser observado na curva de produção de biomassa em função do tempo na Figura 15.

0

100200

300400

500

600700

800

9001000

11001200

1300

14001500

1600

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29

Figura 15: Gráfico da produção de biomassa pelo fungo A. niger crescido no meio

CBD num período de 27 dias

Biomassa em

mg/L

Tempo em dias

28

4.2.3. Avaliação da produção de extrato em meio BDA em função do tempo

A produção de extrato pelo fungo segue o padrão da produção de biomassa, sendo

que a massa de extrato atinge o valor máximo no 12° dia de cultivo, enquanto a massa de

micélio aumenta até o 15° dia de cultivo. Tal fato pode ser explicado pelo consumo de

algumas substâncias (como ácidos orgânicos) presentes no extrato, para produção de

biomassa e energia pelo fungo.

0

20

40

60

80

100

120

140

0 5 10 15 20 25 30

Tempo ( dias)

Co

ncen

tração

m

g/l

Série1

Figura 16: Produção de extrato pelo fungo A. niger crescido no meio CBD num

período de 27 dias com intervalo de 3 dias.

4.2.4. Avaliação da produção da substância pirofeno em CBD em função do

tempo.

A produção de pirofeno atingiu o ponto máximo com 12 dias de cultivo, assim

como a produção de biomassa, nos dias seguintes ocorre um decaimento até o final do

cultivo com 27 dias.

29

Produção do Pirofeno

0

2

4

6

8

10

12

14

3,0 6,0 9,0 12,0 15,0 18,0 21,0 24,0 27,0

Número de dias de crescimento

Co

ncen

tração

mg

/L

Figura 17: Gráfico da concentração do pirofeno no caldo fermentado obtido do

cultivo do fungo A. niger no meio CBD por um período de 27 dias, análise a cada 3

dias.

Com os dados cinéticos obtidos na primeira quantificação foi proposto um novo

crescimento para melhor visualizar a produção de pirofeno por A. niger. Neste novo

experimento foi utilizada uma solução de esporos (para controlar a quantidade de inóculo

em cada frasco) inoculada em 4 Erlenmeyer de 1L, retirando diariamente uma alíquota de

aproximadamente 15 mL. As análises de pirofeno foram realizadas por CLAE, sendo

utilizado um método desenvolvido para diminuir as etapas do preparo de amostras e

viabilizar uma análise diária das quatro repetições. Tal metodologia consiste em injetar o

caldo fermentado após filtração no CLAE, eliminando as etapas de extração, secagem e

preparo de soluções para análise. O método utilizado foi semelhante ao descrito para o

extrato AcOEt, diferindo apenas no volume de injeção, que passou de 20 μL para 50 μL,

para aumentar a sensibilidade do método. A análise do gráfico mostra que este método

não permite quantificar a substância pirofeno nos seis primeiros dias, estando sua

concentração, neste tempo de cultivo, abaixo do limite de quantificação. Como foram

utilizados esporos neste crescimento o período para germinação e adaptação do fungo ao

meio de cultivo foi mais longo, caracterizando assim a fase Lag da produção de pirofeno.

A produção da substância aumenta gradativamente do 7º ao 15º dia caracterizando a fase

Log da produção de pirofeno.

O uso deste método diminuiu os gastos com meio de cultura, vidraria, solvente e

tempo. Também diminuiu os erros experimentais e possibilitou uma avaliação diária da

produção da substância pelo fungo.

30

PRODUÇÃO DE PIROFENO

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Tempo ( dias)

Co

ncen

tração

mg

/L

Figura 18: Concentração do pirofeno do fungo A. niger crescido no meio CBD num

período de 15 dias com intervalo de 1 dia

4.3 Caracterização dos ácidos oxálico, tartárico e cítrico nas frações e no caldo

fermentado

4.3.1. Caracterização do ácido oxálico

A fração 1, obtida no fracionamento do extrato AcOEt do fungo A. niger cultivado

no meio suco de mangaba, foi analisada por RMN de 1H e mostrou apenas um sinal em

δH 6,33 (s) sugerindo ser de hidrogênio ligado a heteroátomo. O espectro de RMN de 13

C

mostrou a presença de um sinal em δC 161,1 indicando a presença de uma carbonila,

sendo tal fração denominada como substância 2. Tal substância também foi identificada

na fração 30/70-16.

Figura 19: Espectro de RMN de 1H a 500 MHz do ácido oxálico ( CDCl3/DMSO)

SpinWorks 2.5: Std proton

PPM 13.0 12.0 11.0 10.0 9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 -1.0

6.

3368

file: G:\geraldo 1\mangaba5_h_CDCl3.fid\fid block# 1 expt: "s2pul"



width: 8000.00 Hz = 16.008504 ppm = 0.125000 Hz/pt

number of scans: 32



LB: 0.000 GB: 0.0000

31


C a 125 MHz, do ácido oxálico (CDCl3/DMSO-d6)

A análise do espectro de massas da substância 2 apresentou fragmentos

característicos do ácido oxálico como o pico em 91 [ M+H]+, 113 [ M + Na]

+.

m/z87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114

%

0

100

8020 NP1 284 (5.350) Cm (257:284) 1: TOF MS ES+ 77113.1367

99.1180

91.0566

86.1047

90.060889.0600

86.364888.2412

99.0556

99.0483

99.0409

98.9896

95.084191.5214

94.052198.027897.6087

107.0860

104.0760

104.0685

101.0681 102.0559

106.0475

105.7101

110.1118108.1027

111.0845

114.0675

Figura 21: Espectro de massas do ácido oxálico obtido por electrospray modo

positivo

A análise dos espectros e a comparação com os dados na literatura

(www.nmrshiftdb.org) mostram que a substância 2 é o ácido oxálico (figura 25). Como

este ácido possui valor comercial, resolveu-se identificá-lo e quantificá-lo no caldo

fermentado diretamente, uma vez que, se trata de uma substância polar e processos de


PPM 200.0 180.0 160.0 140.0 120.0 100.0 80.0 60.0 40.0 20.0 0.0

16

0.2

787

file: G:\geraldo 1\mangaba5_C_CDCl3.fid\fid block# 1 expt: "s2pul"



width: 30154.54 Hz = 239.948824 ppm = 0.384477 Hz/pt

number of scans: 232



LB: 0.000 GB: 0.0000

DMSOd6 CDCl3

32

extração baseados em partição líquido/líquido utilizando AcOEt para esta substância não

são eficientes, devido ao seu baixo coeficiente de partição AcOEt/H2O. Para tanto, foram

realizadas análises por Eletroforese Capilar, no Laboratório de Eletroforose Capilar da

UFS campus Prof Alberto Carvalho. O caldo fermentado foi filtrado e analisado por

eletroforese capilar de zona, conforme descrito em 3.12.13, e possibilitou a identificação

do ácido oxálico no caldo, pois o mesmo apresentou pico com o tempo de migração do

padrão e ao realizar a co-injeção houve aumento do pico, evidenciando a fortificação da

amostra com o padrão puro (Figura 22).

2 3 4 5 6

-4

0

4

8

Alt

ura

(m

V)

Tempo (min)

Amostra Pura

Ácido Oxálico (0,025 g/100mL)

Figura 22 : Eletroferograma do ácido oxálico, sendo: A - amostra analisada, B

padrão - na concentração de 0,025g/100mL. Tampão ácido bórico

100mmol/L+CTAB 0,5mol/L pH 10,0, 8kV, 36µA , 15s

O método desenvolvido foi eficiente para separação do ácido oxálico e apresentou

boa resolução para o pico deste ácido. Para otimização deste método de análise para o

uso em estudos cinéticos foi construída uma curva de calibração conforme figura 23.

Ácido Oxálico

B A

33

0,010 0,015 0,020 0,025 0,030

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

[1/11/2010 14:38 "/Graph3" (2455501)]

Linear Regression for Data1_B:

Y = A + B * X

Parameter Value Error

------------------------------------------------------------

A 0,3922 0,3138

B 191,24 14,79277

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0,99114 0,23389 5 9,99095E-4

------------------------------------------------------------

Alt

ura

(mV

)

Concentração (g/100mL)

Figura 23. Curva analítica para o ácido oxálico. A x C. Solução 25,0 mmol/L

tampão borato pH 9,00, modo de injeção hidrodinâmica, 30s, λ=254 nm e ddp de

12kV

A curva analítica construída para os ácidos apresentou valor do coeficiente de

correlação R2 =0,9905, valor do limite de detecção estimado em 0,06 mg/L e limite de

quantificação de 0,22 mg/L, com desvio padrão < 2%; o tempo de análise foi inferior a

4 minutos. Sendo assim, o método proposto foi adequado para as medidas quantitativas

do referido ácido.

Tal método foi utilizado para quantificar o ácido oxálico no caldo fermentado,

permitindo avaliar a produção deste ácido em função do tempo de cultivo, quando o

fungo A. niger foi cultivado em meio CBD (com inoculação somente de esporos) por

um período de 15 dias.

Produção de ácido em função do tempo de cultivo

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 2 4 6 8 10 12 14 16

dias de cultivo

Co

ncen

tração

(g

/L)

Série1

Figura 24: Curva de produção do ácido oxálico pelo fungo A. niger crescido no

meio CBD num período de 15 dias, com avaliação a cada 3 dias.

34

Podemos observar na curva de produção do ácido oxálico em função do tempo que o

máximo de produção é atingido com doze dias de cultivo, sendo este o período

adequado para se obter a maior produção deste ácido, quando se cultiva A. niger nestas

condições.

Figura 25. Estrutura da substância 2 (ácido oxálico)

4.3.2. Caracterização do ácido cítrico (substância 3)

A fração FrP2-1 obtida no fracionamento da fração 80/20 H2O/MeOH por CLAE,

apresentou aspecto cristalino e foi submetida à analise por RMN de 1H, verificando-se

que a mesma apresenta uma substância majoritária em sua composição. O espectro de

RMN de 1H (figura 26), apresentou dois sinais em δH 2, 77 (d, J=15,5 Hz) e 2,88 (d, JH

geminal =15,5 Hz). O espectro de HMBC (Figura 27), mostrou correlações do sinal em

δH 2,77 (d, J=15,5 Hz) com δc 176,0; 173,0; 73,0 e 44, sugeriu se tratar do ácido cítrico

2, pois tal ácido é produzido por várias espécies de A. niger. O espectro de massas

(Figura 28) obtido por electrospray modo positivo, apresentou os íons 193 [M+H]+ e 215

[M+ Na]+ e os fragmentos 175 [M+H-H2O]

+ e 149 [ M+H-CO2]

+ característicos do

ácido cítrico, estes dados estão coerentes com os dados espectroscópicos presentes na

literatura (www.nmrshiftdb.org).

O

OH

OH

O

http://www.nmrshiftdb.org/

35

SpinWorks 2.5: Water Suppression

PPM 6.4 6.0 5.6 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2

6

.7569

6

.7556

4

.5690

4

.5364

2

.9250

2

.8936

2

.8107

2

.7790

2

.7734

2

.5649

1

.2852

file: C:\Documents and Settings\Pimenta\Desktop\mestrado\disertação doc\RMN\amPico1_30_01_H_.fid\fid block# 1 expt: "water"



width: 8000.00 Hz = 16.008531 ppm = 0.250000 Hz/pt

number of scans: 32



LB: 0.000 GB: 0.0000

Figura 26: Espectro de RMN de 1H a 500 MHz do ácido cítrico ( Mistura MeOH +

DMSO-d6)

CD3OD H20 do CD3OD

36

Figura 27: Mapa de contorno HMBC do ácido cítrico

SpinWorks 2.5: Watergate TOCSY

PPM (F1) 170 160 150 140 130 120 110 100 90.0 80.0 70.0 60.0 50.0 40.0 PPM (F2)

4.8

4.6

4.4

4.2

4.0

3.8

3.6

3.4

3.2

3.0

2.8

2.6

2.4

2.2

2.0

file: G:\geraldo 1\pico1_25_05_2010hmbc.fid\fid expt: "gHMBC"


time domain size: 4096 by 256 points

width: 5996.55 Hz = 11.999488 ppm = 1.464002 Hz/pt

number of scans: 16

F2: freq. of 0 ppm: 499.730987 MHz


window function: NONE

shift: 0.0 degrees

F1: freq. of 0 ppm: 125.657427 MHz


window function: NONE

shift: 0.0 degrees

37

m/z130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180 185 190 195 200 205 210 215 220 225

%

0

100

N2SP2 P3 36 (0.685) Cm (33:45) 1: TOF MS ES+ 310149.0294

147.0702129.0598

133.0970143.1068

143.0363

215.0218

167.0412

163.0413

155.0859

159.1410

175.1377

175.0402

190.0925

177.0544185.1064

205.0948193.0402

201.0465211.0850

219.0551

223.0762

Figura 28: Espectro de Massas do ácido cítrico obtido por eletrospray no modo

positivo

O

OO

OH

OH

OH OH

Figura 29: Estrutura do ácido cítrico (substância 3)

O ácido cítrico foi identificado em uma fração obtida do extrato AcOEt, o fato

deste ácido ser uma substância polar e o solvente usado na extração ser o AcOEt que

possui média polaridade, sugeriu que apenas uma pequena quantidade do ácido cítrico foi

extraída e que a maior parte do ácido tenha ficado na fração aquosa. Para análise do ácido

diretamente no caldo fermentado, sem etapas de extração, foi desenvolvido um método

de análise por eletroforese capilar. O método foi capaz de identificar o pico referente ao

ácido cítrico (Figura 30) pelo tempo de migração e co-injeção do padrão puro, mas

precisa ser melhorado para a realização da etapa de quantificação.

38

2 4 6

-2

0

2

4

6

8

10

12A

ltu

ra (

mV

)

Tempo (min)

Amostra Pura

Ácido Cítrico (0,05 g/100mL)

Figura 30: Eletroferograma do ácido citrico, sendo: A – amostra analisada, B


100mmol/L+CTAB 0,5mol/L pH 10,0, 8kV, 36µA , 15s.

O ácido cítrico possui grande interesse comercial e a identificação de novas cepas

com capacidade de produzi-lo podem ser úteis para o melhoramento genético, desde que

preservadas.

4.3.3. Caracterização do ácido tartárico (substância 4)

A terceira fração coletada no fracionamento da fração FrP2-1 do CBD2 por CLAE

apresentou aspecto cristalino e foi submetida à análise por RMN de 1H verificando que a

mesma apresenta uma substância majoritária em sua composição. O espectro de RMN de

1H da substância 4 ( Figura 31) apresentou apenas um sinal δH 4,72 (s), como várias

espécies de A. niger são produtoras de ácidos orgânicos, a comparação destes dados com

valores de ácidos produzidos pelo gênero Aspergillus sugeriu que este ácido seja o ácido

tartárico. A estudo do caldo fermentado por eletroforese capilar (Figura 32) confirmou

que este fungo produz o ácido tartárico, através da análise do pico referente ao ácido bem

como pelo tempo de migração e co-injeção do padrão puro.

A B

Àcido Cítrico

39

Figura 31 : Espectro de RMN de 1H a 500 MHz , do ácido tartárico ( CDCl3)

2 4

-6

-4

-2

0

2

Alt

ura

(m

V)

Tempo (min)

Amostra

Ácido Tartárico (0,025 g/100mL)

Figura 32: Eletroferograma do ácido tartárico, sendo: A – amostra analisada, B


100mmol/L+CTAB 0,5mol/L pH 10,0, 8kV, 36µA , 15s

O

O

OH

OH

OH

OH

Figura 33: Estrutura da substância 4 (ácido tartárico)


PPM 8.0 7.6 7.2 6.8 6.4 6.0 5.6 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 -0.0

7

.1978

4

.7161

4

.7147

4

.7095

4

.7033

1

.5621

file: G:\geraldo 1\an80_20_3.fid\fid block# 1 expt: "s2pul"



width: 8000.00 Hz = 16.008580 ppm = 0.125000 Hz/pt

number of scans: 64



LB: 0.000 GB: 0.0000

A

B

B

A

Ácido Tartárico

40

O trabalho desenvolvido permitiu identificar que o fungo A. niger produz os

ácidos orgânicos, o oxálico, o tartárico e o cítrico, bem como quantificar o ácido

oxálico. Vários trabalhos (MENDES et al. 2003; NAHAS 2008) têm relatado a

importância destes ácidos na solubilização de fosfatos no solo, estando este fungo

associado à mangabeira, uma planta característica de solos pobres. A descoberta de um

simbionte capaz de produzir ácidos orgânicos responsáveis pela solubilização de

fosfatos abre uma nova possibilidade para o manejo desta cultura.

4.4 Caracterização das substâncias p-acetil-benzóico e ácido hexilitacônico

4.4.1 Determinação estrutural do ácido p-acetil-benzóico (substância 5)

O espectro de RMN de 1H do extrato bruto do CBD da substância 5 ( Figura 34 )

apresentou sinais em δH 7,62 (d, J=9,0 Hz, 2H) e 8,1 (d, J=9,0 Hz, 2H), caracterizando

um anel aromático dissubstituído em para, e um sinal de metila em δH 2,1 (s, 3H),

indicando ser um derivado do ácido benzóico. A amostra foi analisada por Massas e

apresentou picos para o íon molecular em m/z 181 [M+H]+ e 203 [M+Na]

+ e os

fragmentos m/z 163 [ M+H-H2O]+, 166 [ M+H-CH3]

+ e 172 [ M+Na-CH3O]

+

confirmando a estrutura da substância 5 como ácido p-acetil-benzóico. Este é, até o

momento, o primeiro relato desta substância em fungo endofítico, mas a literatura mostra

que a substância p-hidroxi-benzóico foi isolada de vários fungos (TAN et al., 2001),

corroborando com os nossos resultados.

41


PPM 8.4 8.0 7.6 7.2 6.8 6.4 6.0 5.6 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4

8

.1613

8

.1430

7

.6382

7

.6200

7

.1977

3

.6912

2

.1835

1

.8992

1

.5002

1

.4760

1

.4742

1

.4716

1

.1907

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width: 8000.00 Hz = 16.008580 ppm = 0.125000 Hz/pt

number of scans: 32



LB: 0.000 GB: 0.0000

Figura 34: Espectro de RMN de 1H a 500 MHz , do p-acetilbenzóico ( CDCl3)

m/z156 158 160 162 164 166 168 170 172 174 176 178 180 182 184 186 188 190 192 194 196 198 200 202 204

%

0

100

2510 PICO 11 29 (0.554) Cm (26:37) 1: TOF MS ES+ 372203.0525

181.0679

172.5531

166.0854163.5404162.1158159.0434

167.0365

173.0859180.1024

183.1015

202.1556199.1025

187.0868 189.1336 196.1035

204.0513

Figura 35: Espectro de massas do p-acetilbenzóico obtido eletrospray modo

positivo

42

O

OH

O

O

CH3

Figura 36: Estrutura da substância 5 (ácido p-acetil-benzóico)

4.4.2 Determinação estrutural do ácido hexilitacônico (substância 6)

O espectro de RMN de 1H da fração 30/70-6 do extrato de acetato de CBD

AcOEt/DCM mostrou dois singletos com δH 5,79 (1H) e 6,4 (1H), dois tripletos com δH

3,49 (1H) e 0,83 (3H) e quatro multipletos entre δH 1,0 - 1,8 sugerindo se tratar de vários

sinais de metilenos em uma cadeia carbônica, característicos de ácidos graxos. O

espectro de RMN de 13

C (tabela 5; figura 39) apresentou sinais característicos de uma

grupo metileno terminal em δc 129,8 e 137,4 e sinais de um cadeia alifática entre δc 14,1

- 31,8 bem como um sinal em δc 168 característico de carbonila do ácido carboxílico.

O espectro de Massas obtido por electrospray modo positivo mostrou os picos do

íon molecular 215 [M + H]+ e 237 [M + Na]

+ e dos fragmentos 197 [M + Na – H2O]

+,

281 [M-2H+3Na]+, 259 [M-H+2Na]+. A comparação destes resultados com dados da

literatura (HASEGAWA, et al., 2007; TSUKAMOTO., et al., 2006; KLENKE et al.,

2008), confirmou que a substância 6 é o ácido hexilitacônico (Tabela 5 e Figuras 38 a

41).

Figura 37: Estrutura do ácido hexilitacônico (substância 6)

O

CH2

O

OH

OH

CH3

6’

4’

5’

3’ 2’

1’

4 3

2 1

1’’

43


PPM 6.8 6.4 6.0 5.6 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 -0.0

7

.1979

6

.7312

6

.4634

5

.7929

3

.7650

3

.5310

3

.4960

3

.3993

3

.3943

3

.3937

3

.3790

2

.7415

2

.4460

2

.4307

2

.4150

1

.8633

1

.8493

1

.6714

1

.5527

1

.5507

1

.5365

1

.5216

1

.5213

1

.5192

1

.5186

1

.3022

1

.2965

1

.2960

1

.2955

1

.2939

1

.2919

1

.2913

1

.2908

1

.2896

1

.2868

1

.2787

1

.2781

1

.2771

1

.2700

1

.2693

1

.2687

1

.2647

1

.2560

1

.2480

1

.2422

1

.2352

1

.2348

1

.2314

1

.2288

1

.2261

1

.2255

1

.2198

1

.2180

1

.2153

1

.2055

1

.2041

1

.2006

1

.2000

1

.1994

1

.1907

1

.1813

1

.1802

0

.8355

0

.8280

0

.8270

0

.8218

0

.8147

0

.8045

0

.8007

0

.0059

file: C:\Documents and Settings\Administrador\Desktop\Espectros LNLS\Geraldo\30706.fid\fid block# 1 expt: "s2pul"



width: 8000.00 Hz = 16.008580 ppm = 0.125000 Hz/pt

number of scans: 32



LB: 0.500 GB: 0.0000

Figura 38 : Espectro de RMN de 1H das frações 3070-6


PPM 170.0 160.0 150.0 140.0 130.0 120.0 110.0 100.0 90.0 80.0 70.0 60.0 50.0 40.0 30.0 20.0 10.0

file: C:\Documents and Settings\Administrador\Desktop\Espectro\30_70\30706_C.fid\fid block# 1 expt: "s2pul"



width: 30154.54 Hz = 239.949964 ppm = 0.384477 Hz/pt

number of scans: 9712



LB: 0.000 GB: 0.0000

Figura 39 : Espectro de RMN de 13

C a 125 MHz , do hexilitacônico ( CDCl3)

44

Tabela 5. Deslocamentos químico RMN de 1H da substância 6 e dados da

substância da literatura do ácido hexilitacônico

1H do Hexilitacônico

13C do Hexilitacônico

Isolado

Literatura

Literatura

(KLENKE et al.,

2008)

Isolado

1 171,7 168,0

2 137,2 137,4

3 3,49 (1H, t) 3,44 (1H,t) 46,6 47,1

4 179,7

1’ 1,66 (1H, m)

1,70 (1H, m)

1,67 (1H, m)

1,83 (1H, m)

30,3 30,2

2’ 1,2 -1,3 (2H, m) 1,30 - 1,32 (2H, m)

27,3 27,5

3’ 1,2 -1,3 (2H, m) 1,30 - 1,32 (2H, m) 28,9 31,5

4’ 1,2 -1,3 (2H, m) 1,30 - 1,32 (2H, m) 31,5 31,8

5’ 1,2 -1,3 (2H, m) 1,30 - 1,32 (2H, m) 22,5 22,8

6’ 0,83 (3H, t) 0,89 (3H, t) 14,0 14,1

1’’ 5,79 (1H, s)

6,4 (1H, s)

5,74 s

6,32 s

129,8 129,8

m/z195 200 205 210 215 220 225 230 235 240 245 250 255 260 265 270 275 280

%

0

100

AN 30706 280 (5.276) Cm (279:296) 1: TOF MS ES+ 6.14e3237.1003

197.1179

207.0645

198.1228

230.0779

215.1266

213.0617

223.0950221.0852

229.1009

232.1561

281.0929

276.1418

241.1057

259.0617253.0829

251.1288

249.1823

242.1080

273.0766

267.1963

265.1643

Figura 40 : Espectro de Massas do ácido hexilitacônico obtido por electrospray

modo positivo

45

m/z110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270

%

0

100

AN 30706 MSMS 237 20 (0.383) Sb (2,60.00 ); Cm (14:30) 1: TOF MSMS 237.00ES+ 1.25e3237.1117

197.1179

123.1148

169.1252151.1157

219.0682

215.1266

238.1113

Figura 41: Espectro de Massa/Massa do íon 237 do ácido hexilitacônico

O ácido hexilitacônico isolado do extrato possui relatos de atividade

anticancerígena (TSUKAMOTO et al., 2006), sendo este fungo uma fonte em potencial

para produção desta substância em escala comercial. Outra atividade relatada para esta

substância é a fito-hormonal, (Isogai et al., 1984) onde o ácido foi isolado do fungo

Aspergillus niger e verificou-se que ela acelera o desenvolvimento de raízes em alface

(Lactuca sativa), tal descoberta deu origem a uma patente (SUZUKI et al., 1984).

Fungos endofíticos vivem em constante interação com as plantas e a descoberta

de uma substância com propriedades fito-hormonais produzidas por A. niger, um

endófito de H. speciosa, vem contribuir com o conhecimento desta interação ecológica.

46

5. CONCLUSÃO

O trabalho desenvolvido permitiu identificar que o isolado de A. niger produz

três ácidos orgânicos que podem estar envolvidos na solubilização de fosfato no solo

para a mangabeira durante o período de decomposição das folhas, sendo eles o oxálico,

o tartárico e o cítrico.

O uso de eletroforese capilar permitiu identificar os ácidos oxálico, cítrico e

tartárico no caldo fermentado, bem como quantificar o ácido oxálico. O pico de

produção deste ácido pelo fungo é o 12º dia de cultivo.

A substância pirofeno foi isolada nos três meios de cultura utilizados, CBD, suco

de mangaba e CZAPEK, sendo o melhor meio para sua produção o suco de mangaba.

O período ideal para o cultivo do A. niger em meio líquido CBD é de 15 dias

para produção de biomassa e 12 dias para produção do extrato AcOEt e da substância

pirofeno, quando inoculados com discos de cultura.

O método analítico desenvolvido para quantificar pirofeno se mostrou eficiente,

pois possibilitou identificar e quantificar a substância com intervalo de corrida de

apenas 10 minutos, além de permitir a análise tanto do extrato como do meio

fermentado.

A capacidade deste endófito de produzir ácidos orgânicos oxálico, cítrico e

tartárico, abre uma nova perspectiva para estudos da interação A. niger/mangabeira,

podendo resultar em uma nova tecnologia de manejo da cultura que possui grande

importância comercial para o estado de Sergipe.

47

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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